Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

СЕРЕГИНА

Татьяна Александровна

Генетическая модификация штаммов Escherichia coli,

направленная на получение 

продуцентов бутирата и  бутанола

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Федерального государственного унитарного предприятия Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИГенетика)

Научные руководители:

доктор биологических наук,  Миронов Александр Сергеевич  профессор ФГУП ГосНИИГенетика

Официальные оппоненты: 

доктор биологических наук, профессор Хмель Инесcа Александровна Институт молекулярной генетики РАН

кандидат биологических наук Березина Оксана Валентиновна ФГУП ГосНИИГенетика

Ведущая организация:  кафедра генетики биологического факультета  .  МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится л 04 декабря  2012 года в 14:00  на заседании Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан л  01    ноября  2012 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета,  Т. Л. Воюшина  кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В связи с ограниченными запасами доступной нефти, ростом парка автомобилей и некоторыми проблемами экологического, экономического и политического характера, возрастает интерес к биотопливу (альтернативным источникам энергии из возобновляемого сырья). Биомасса является четвертым по величине источником энергии после угля, нефти и природного газа. 

Одним из основных  видов биотоплива являются спирты,  прежде всего этанол, который может быть добавлен к бензину, как для его экономии, так и для улучшения его некоторых параметров. Однако, у этанола есть сильный конкурент - бутанол, который полностью заменяет бензин для  двигателей автомобилей. Бутанол может использоваться как в смеси с бензином, так и выступать в качестве ко-растворителя в дизельной топливной смеси. Возможность получения бутанола из биомассы была открыта еще в ранние 1900-е. В течение двух Мировых Войн заводы по производству биобутанола были построены в США, России, Китае, Индии, Южной Африке и т.д. Однако, с развитием нефтяной индустрии, производство бутанола микробиологическим путем отошло на второй план из-за потери рентабельности [He Huang, 2010].

За последние несколько лет возобновился интерес к бактериям рода Clostridia и к подобным микроорганизмам, как к возможным способам получения органических веществ, особенно бутанола, в настоящее время получаемого из нефтяного сырья. Clostridium аcetobutylicum наиболее часто используется для промышленного производства бутанола.

C. acetobutylicum, осуществляет ацетонобутиловое брожение углеводов в две стадии: на первой  накапливаются ацетат и бутират, во второй стадии продолжается утилизация глюкозы, в результате чего кислоты конвертируются в органические растворители н-бутанол, ацетон и этанол [Qureshi N, 2001; Zverlov V.V., 2006]. Такой двухстадийный процесс обеспечивает клетки АТФ как во время интенсивного роста культуры, так и при подготовке к споруляции, однако значительно затрудняет промышленное производство бутанола и делает его нерентабельным, по сравнению с производством из нефтяного сырья. Кроме того, C. acetobutylicum является строгим анаэробом и обладает низкими показателями роста, что приводит к его низкой продуктивности. Недостаточно изученная генетическая система и физиология Clostridia затрудняют модификацию метаболических путей, необходимую для эффективной продукции бутанола [Lee J.Y., 2010]. Известны многочисленные попытки конструирования рекомбинантных штаммов на основе различных микроорганизмов, содержащих чужеродные клостридиальные гены биосинтеза бутанола [Pamela P. Peralta-Yahya, 2012; Yang Gu, 2011; Yan-Ning Zheng, 2009]. Использование E.coli в качестве реципиента генов клостридий позволяет применить разработанную методологию конструирования рекомбиниантных штаммов. Однако конструирование промышленных продуцентов бутанола предполагает не только высокий уровень экспрессии клонированных генов, но и высокую  устойчивость культуры к бутанолу, - качество, которым известные штаммы E.coli и многие другие реципиенты не обладают.

  Попытки конструирования продуцентов бутанола путем клонирование генов клостридий в различных микроорганизмах не привели к  созданию эффективных штаммов, более того,  в результате возникли существенные правовые ограничения в использовании генов клостридий для создания рекомбинантных продуцентов бутанола. Поскольку процесс биосинтеза бутанола может быть представлен как инвертированный процесс -окисления жирных кислот, возникло предположение о возможном биосинтезе бутанола в клетках E.coli без использования чужеродных генов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было выяснение возможности биосинтеза бутанола культурой E.coli без использования чужеродных генов посредством обращенного пути  -окисления жирных кислот. Кроме того, целью настоящей работы было получение штамма E.coli, обладающего повышенной толерантностью к бутанолу и исследование его фенотипических характеристик.

Для достижения указанных целей были сформулированы следующие задачи:

1. Конструирование  штамма E.coli, усваивающего бутанол, как единственный источник углерода, с последующим обращением этого процесса при выращивании мутанта на среде с глюкозой.
2. Оптимизация метода получения бутанол-толерантного мутанта E.coli MG1655 ButR;
3. Проведение экспериментов по изучению различных фенотипических свойств полученного в ходе направленной микроэволюции мутанта MG1655 ButR;
4. Изучение влияния бутанола на экспресию in vivo лидерной области гена ompC у мутанта MG1655 ButR и родительского штамма MG1655;

Научная новизна и практическая значимость

В силу хорошей изученности, способности роста как в аэробных, так и в анаэробных условиях, Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов для конструирования рекомбинантных продуцентов бутанола. В  геноме E.coli присутствуют гены, потенциально способные осуществить все этапы биосинтеза бутирата и бутанола. В рамках настоящего исследования была произведена реконструкция пути биосинтеза бутирата и бутанола на основе естественного метаболического пути -окисления жирных кислот. Впервые была показана возможность обращения этого процесса с целью получения продуцентов бутирата и бутанола. Тем не менее, E.coli обладает высокой чувствительностью к таким токсическим факторам как органические растворители и в частности к бутанолу. Таким образом, вторым не менее важным направлением исследования является решение проблемы толерантности E.coli к бутанолу. В процессе селекции был получен штамм E.coli, толерантный к бутанолу и обладающий рядом фенотипических особенностей: гиперчувствительность к осмотическому шоку, устойчивость к этанолу и изопропанолу, устойчивость к сурфакцину, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом. Определен липидный состав мембраны бутанол-толерантного мутанта. Установлено, что бутанол является фактором регуляции экспрессии основных мембранных белков - поринов. Экспрессия гена ompC, кодирующего порин OmpC, возрастает под действием бутанола. Нуклеотидные замены, обнаруженные в регуляторной области гена ompC мутанта ButR, обуславливают более низкий уровень экспрессии в нормальных условиях и обеспечивают более высокий уровень синтеза в присутствии бутанола. Выявление основных механизмов и ключевых генов, задействованных в повышении толерантности клеток к органическим растворителям, позволит оптимизировать создание штаммов-продуцентов бутанола и других органических растворителей и сделать более рентабельным их производство.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология Наука XXI века (г. Пущино, 16 - 21апреля 2012 года).

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции Генетика микроорганизмов Ученого Совета ФГУП ГосНИИГенетика 12 октября 2012 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы, из них три в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.

Структура работы

Диссертация изложена на  101 странице печатного текста, включая 25  ,  рисунков и 5 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы ( 135 наименования).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Конструирование штамма E.coli, продуцирующего бутират без использования чужеродных генов

В основу конструирования штамма E.coli, продуцирующего бутират и бутанол, было положено представление о биосинтезе бутирата и бутанола, как инвертированном пути -окисления жирных кислот (Рис.1).

Первым шагом было конструирование штамма, эффективно утилизирующего бутанол и бутират, то есть имеющего активированный путь их -окисления. В ранних исследованиях были описаны мутанты E.coli, способные использовать бутират и бутанол в качестве единственных источников углерода [Clark, D. P., 1987]. Такие мутанты должны содержать четыре необходимые мутации в генах fadR, adhC, adhR и atoC.

Рисунок 1. Схема биосинтеза бутирата и бутанола. Гены и соответствующие ферменты: ldhA - лактатдегидрогеназа,  aceEF - субъединицы пируватдегидрагеназы, pta - фосфатацетилтрансфераза , ackA - ацетаткиназа,  atoB  -  ацетил-СоА ацетилтрансфераза (тиолаза II), fadEB - субъединицы оксидативного комплекса жирных кислот, atoAD  - субъединицы  комплекса ацетил-СоА:ацетоацетиЦСоА трансферазы, adhE  - ацетальдегид- алкогольдегидрогеназа.

1. Инактивация гена fadR

В клетках E.coli гены fadBA оперона, кодирующие ключевые ферменты пути -окисления жирных кислот, находятся под негативным контролем белка-репрессора - продукта гена fadR [Nunn, W.D., 1983]. Из литературных данных известно, что мутанты fadR, обладающие конститутивной экспрессией генов деградации жирных кислот, способны использовать жирные кислоты со средней длиной углеродной цепи в качестве единственного источника углерода [Overath, P., 1969; Salanitro, J.P., 1971; Vanderwinkel  E, 1968].

Для инактивации гена fadR были использованы праймеры F1 и F2 (Рис. 2). Праймер F1 содержит на 5Т-конце нуклеотидную последовательность N-концевого участка структурного гена fadR, а также последовательность, гомологичную сайту attR плазмиды pMW118-attL-cat(CmR)-attR. Праймер F2 содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидам С-концевого участка гена fadR, а также последовательность, гомологичную сайту attL плазмиды pMW118-attL-cat(CmR)-attR. Интеграция кассеты attL-cat(CmR)-attR в ген fadR подтверждалась ПЦР-амплификацией с проверочных праймеров F3 (5Т-gtctgctatcagcgtagttag-3Т) и F4 (5Т-aacgttgcccgccaagaatg-3Т), фланкирующих ген fadR (Рис. 2). Выщепление маркера CmR, фланкированного att-сайтами фага , проводилось с помощью плазмиды-помощника pMWts-int/xis. Выщепление маркера подтверждалось ПЦР-амплификацией с использованием тех же проверочных праймеров F3 и F4.

Таким образом, на первом этапе нами был получен штамм TS1 (Рис.3, Табл. 1), несущий делецию гена fadR (fadR) и обладающий конститутивным синтезом ферментов -окисления жирных кислот.

2. Инактивация гена aceF

Фенотип мутаций в гене алкогольдегидрогеназы (adhE) возможно проследить только в штаммах-ауксотрофах по ацетату [Clark, D P., 1980].  Ген aceF кодирует одну из субъединиц пируватдегидрогеназного комплекса, катализирующего превращение пирувата в ацетил-СоА. Таким образом, инактивация гена aceF позволяет получить штаммы, нуждающиеся в источнике ацетата, в данном случае бутирата или бутанола. Инактивацию гена aceF проводили по описанной выше схеме.

Полученный в результате штамм TS16 (fadR aceF) при культивировании на минимальных средах проявлял зависимость от ацетата, плохо рос на среде с глюкозой и был не способен к росту на сукцинате как источнике углерода (Рис.3).

Таблица 1. Штаммы E. coli, использованные в работе.

Штаммы	Генотип	Происхождение
MG1655	Дикий тип	ВКПМ
TS11	Мутант MG1655, толерантный к бутанолу (ButR)	Настоящая работа
TS14	Как MG1655, но ompF::KmR	Настоящая работа
TS16	Как MG1655, но ompC::KmR	Настоящая работа
TS17	Как TS11, но ompF::KmR	Настоящая работа
TS19	Как TS11, но ompC::KmR	Настоящая работа
TS22	Как MG1655, но lacZ::TetR	Настоящая работа
TS32	TS22, содержащий вектор pBR1	Настоящая работа
TS35	TS22, содержащий вектор pBR2	Настоящая работа
TS32-O	TS32, но ompR::KmR	Настоящая работа
TS35-O	TS35, но ompR::KmR	Настоящая работа
TS32-C	TS32, но cpxR::KmR	Настоящая работа
TS35-C	TS35, но cpxR::KmR	Настоящая работа
TS1	MG1655, но fadR	Настоящая работа
TS16	TS1, но  aceF	Настоящая работа, ауксотроф по ацетату
TS113	TS16, но adhC	Настоящая работа, рост на этаноле
TS132	TS113, но adhR	Настоящая работа, рост на этаноле
TS322	TS132, но atoC	Настоящая работа, рост на бутирате и бутаноле
TS324	TS322, но aceF+	Настоящая работа, рост на глюкозе
TS425	TS324, с Ptet-atoB	Настоящая работа
TS421	TS325, но ldhA	Настоящая работа
TS428	TS325, но pta	Настоящая работа

Рисунок 3. Схема конструирования штаммов, продуцирующих бутират и бутанол.

3. Получение adhE мутантов E.coli, способных расти на этаноле в аэробных условиях

В литературе описаны мутанты, обладающие высокой активностью AdhE-фермента (альдегид-алкогольдегидрогеназы) в аэробных условиях [Kaga, N., 2002]. Мы попытались оптимизировать стратегию получения этих мутаций с целью достижения лучших результатов.

Культуру ауксотрофа по ацетату TS16 в поздней экспоненциальной фазе роста обрабатывали нитрозогуанидином. Затем клетки рассевали на минимальную среду с добавлением сукцината и этанола в качестве источников углерода. Таким образом, была получена серия мутантов, которые затем пересевали на минимальную среду, содержащую этанол, как единственный источник углерода. Далее селекцию этанол-утилизирующих мутантов проводили на индикаторной среде MacConkey, в которую в качестве источника углерода добавляли этанол. В процессе селекции был отобран мутант TS113.

       На следующем этапе штамм TS113 подвергали вторичной обработке нитрозогуанидином и высевали на минимальную среду, содержащую 0.1% этанола и 2 mM 4-метилпиразола (специфический ингибитор алкогольдегидрогеназы). В ходе селекции на минимальной среде с добавлением 0.1% этанола и возрастающих концентраций 4-метилпиразола (от 4 мM до 10 мM) был отобран  наиболее  хорошо растущий мутант TS132 (Рис. 3). По-видимому, улучшенный рост мутанта TS132 на этаноле обеспечивается дополнительной регуляторной мутацией adhR [Clark, D. P., 1987].

4. Идентификация мутаций в гене adhE

Секвенирование гена adhE штамма TS132 выявило наличие двух мутаций. Первая обнаруженная нами нуклеотидная замена GA локализуется в положении -257 и затрагивает Cra-бокс - участок связывания регуляторного белка Cra в промоторной области гена adhE (Рис. 4).

Рисунок 4.  Нуклеотидная последовательность регуляторной области гена adhE. Жирным шрифтом и заглавными буквами обозначены -35 и -10 области промототра и сайт связывания регуляторного белка FNR, подчеркнуты сайты связывания белка FIS, жирным шрифтом и прописными буквами - сайт связывания белка NarL. Заштрихован сайт связывания белка FruR (Cra-бокс). Стрелкой показана нуклеотидная замена в Cra-боксе, полученная в геноме мутанта TS132.

Вероятно, эта замена приводит к дерепрессии гена adhE в аэробных условиях вследствие снижения сродства Cra-белка к мутантному Cra-боксу. Вторая мутация (G1701A) приводит к аминокислотной замене Glu568Lys, т.е. затрагивает кодирующую область гена adhE. Нуклеотидные замены в геноме штамма TS132, отобранного нами в ходе мутагенеза и селекции, идентичны мутациям, описанным ранее [Kaga, N., 2002]. Таким образом, нами был получен мутантный аллель гена adhE, обеспечивающий синтез активной альдегид-алкогольдегидрогеназы в аэробных условиях, который предполагалось использовать для аэробной конверсии бутирата в бутанол.

5. Получение мутантов, растущих на бутирате и бутаноле, как единственных источниках углерода

       Для получения вариантов, способных к росту на бутирате и бутаноле суспензию штамма TS132 рассевали на индикаторную среду MacConkey, содержащую 0.5% бутирата или 0.5% бутанола, в качестве источников углерода. В ходе селекции удалось отобрать ярко красные колонии, активно метаболизирующие бутират и бутанол.

       Из литературных данных известно, что рост E.coli на бутирате и бутаноле обеспечивается мутациями в генах fadR и atoC [Clark, D. P., 1987; Nunn, W.D., 1983]. Очевидно, в процессе селекции мутантов, растущих на бутаноле и бутирате, нами были отобраны и  спонтанные мутанты atoC. Наиболее хорошо растущий на средах с бутиратом и бутанолом  мутант TS322  был выбран для дальнейшей работы (Рис.5, Рис. 3).

6. Восстановление функционального аллеля гена aceF

       Для дальнейшего конструирования штамма, синтезирующего бутират и бутанол из глюкозы необходимо присутствие активного пируватдегидрогеназного комплекса, катализирующего превращение пирувата в ацетил-СоА.

       Введение функционального аллеля гена aceF+ в геном штамма TS322 проводилось путем трансдукции фагом Р1/MG1655. Отбор трансдуктантов проводился на минимальной среде с добавлением 0.5% сукцината, в качестве источника углерода. Колонии, выросшие на среде с сукцинатом, проверяли на способность метаболизировать глюкозу, контролем был исходный штамм MG1655. Один из полученных трансдуктантов (TS324) был использован в дальнейшей работе (Рис.3).

7. Подстановка гена atoB под контроль промотора Ptet

Одним из ключевых этапов конструирования штамма, синтезирующего бутират из глюкозы, является преимущественная утилизация ацетил-СоА в ацетоацетил-СоА. Для успешной конкуренции с ЦТК за ацетил-СоА необходима повышенная экспрессия гена atoB,  кодирующего тиолазу II [Atsumi, S., 2008]. Для усиления транскрипции гена atoB был использован промотор Рtet, один из самых сильных промоторов, экспрессирующихся в клетках  E.coli [Lutz R., 1997]. Для подстановки гена atoB под контроль конститутивного промотора Ptet  была сконструирована кассета Ptet-attL-cat(CmR)-attR - Ptet (Рис. 6), которая содержит промотор Ptet, селективный маркер устойчивости к антибиотику и одновременно обеспечивает возможность интеграции промотора перед целевым геном atoB.

Выщепление маркера CmR, фланкированого att-сайтами фага , проводили по схеме, описанной раннее для fadR. В итоге, был получен штамм TS325, содержащий в составе хромосомы ген atoB под контролем конститутивного промотора Ptet (Рис.6). Таким образом, в полученном штамме TS325 была произведена реконструкция пути биосинтеза бутирата и бутанола без использования чужеродных генов (Рис.1).

8. Инактивация генов ldhA и pta, ответственных за синтез побочных продуктов при ферментации глюкозы в бутират и бутанол

Итак, сконструированный нами штамм TS325 fadR aceF+ adhE adhR atoC Ptet-atoB предположительно несет в себе все необходимые модификации для осуществления биосинтеза бутирата и бутанола. Однако, часть ацетил-СоА и NADH, необходимых для синтеза бутирата и бутанола расходуется при образовании побочных продуктов, таких как ацетат, лактат, этанол.  Для блокирования этих процессов в геноме штамме TS325 были  инактивированы гены биосинтеза лактата ldhA и ацетата pta [Causey, T.B., 2004; Eiteman, M.F., 2006]. Инактивацию этих генов производили по описанной выше схеме с использованием плазмиды pMW118-attL-cat(CmR)-attR. В результате получены два производных штамма TS325: TS421 ldhA, содержащий делецию гена  ldhA и TS428 pta, содержащий делецию гена pta (Рис.3). Генотип полученных в ходе работы штаммов представлен в таблице 1, а реализованная схема биосинтеза бутирата в штамме TS325 приведена на рисунке 1.

9. Содержание продуктов ферментации глюкозы в культуральной среде

       Определение продуктов метаболизма штаммов TS325 fadR aceF+ adhE adhR atoC Ptet-atoB, TS421 fadR aceF+ adhE adhR atoC Ptet-atoB ldhA и TS428 fadR aceF+ adhE adhR atoC Ptet-atoB pta производилось методом газовой хроматографии. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание этанола, ацетата, бутирата и бутанола в культуральной жидкости.

Штамм	Аэробное культивирование				Полуаэробное культивирование
	Концентрация метаболитов (мМ):
	этанол	ацетат	бутират	бутанол	этанол	ацетат	бутират	бутанол
MG1655	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1
TS325	1.9	53.4	2.7	0.13	4.3	12.2	7.2	0.65
TS421 ldhA	2.1	36.7	3.1	0.13	6.1	24.1	11.4	0.71
TS428 pta	2.0	5.1	3.5	0.13	<0.1	6.4	5.8	0.39

Как видно из данных таблицы 2, в отличие от родительского штамма MG1655, штамм TS325 его производные накапливают в культуральной жидкости небольшое количество бутанола, более заметные количества этанола, бутирата и, особенно, ацетата в условиях аэробного роста. Важно подчеркнуть, что в условиях полуаэробного роста у штаммов происходит заметное перераспределение пулов ацетата и бутирата, причем последний возрастает за счет первого и достигает 800 мг/л (7.2 мМ) у штамма TS325 и 1.3 г/л (11.4 мМ) у штамма TS421 ldhA. Таким образом, полученные нами мутации, активирующие путь -окисления жирных кислот, позволяют клеткам E.coli  ферментировать глюкозу с образованием бутирата (и бутанола).

 

2. Фенотипические свойства бутанол-толерантного мутанта E.coli
1. Направленная микроэволюция штаммов в средах, содержащих бутанол

Направленную микроэволюцию клеток штамма E.coli MG1655 в средах, содержащих бутанол, проводили с использованием комбинации жидкой и твердой сред и варьированием температурных режимов. В процессе селекции был выделен мутант MG1655, способный расти в жидкой среде, содержащей 1.25% бутанола и на твердой среде с концентрацией бутанола 1.5%. Далее мы протестировали полученный мутант на способность расти в богатой среде при различных концентрациях бутанола (1.25%, 1.5% и 1.75%) и разных температурных режимах (30С и 37С) (Рис.7).

А Б 

Рисунок 7. Оптическая плотность культур штаммов MG1655 (1) и MG1655 ButR (2) после 24 часов культивирования в среде LB c бутанолом при 30С (А) и при 37С (Б).

2. Устойчивость к бутанолу культур E.coli в стационарной фазе

Устойчивость к бутанолу стационарных культур определялась в полуанаэробных условиях. Культуры клеток, находящиеся в ранней стационарной фазе роста, помещали в пробирки с плотными крышками, куда добавляли бутанол в различных концентрациях (1%, 1.25%, 1.5% и 2%) и инкубировали в течении ночи. Выживаемость оценивали в КОЕ/мл. Разница между выживаемостью дикого штамма и его бутанол-толерантного мутанта невелика, однако, она все же присутствует, что может свидетельствовать о некоторых изменениях как в липидном составе мембран, так и в их белковой компоненте. На это указывают результаты эксперимента, представленные на рисунке 8.

В ходе эксперимента была выявлена характерная особенность мутанта MG1655 ButR пониженная способность его клеток к агрегации. Потеря у клеток мутанта MG1655 ButR способности агрегировать является, возможно, следствием изменения белково-липидного состава мембран и, вероятно, связана с их повышенной устойчивостью к бутанолу.

3. Устойчивость к спиртам

Определение устойчивости мутанта MG1655 ButR  к более гидрофильным спиртам (этанолу и изопропанолу) позволило оценить специфичность механизмов толерантности, приобретенных полученным в ходе селекции мутантом. Оценку устойчивости клеток мутанта и штамма дикого типа производили путем измерения OD600 ночных культур этих штаммов. Было показано, что мутант более устойчив к этим спиртам по сравнению со штаммами дикого типа (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние различных стресс-факторов на рост бутанол-толерантного мутанта E. coli и исходного штамма на богатой среде.

Штаммы	MG1655	MG1655 ButR
Антибиотики (на диск)	Диаметр зоны ингибирования роста (мм)
Ампициллин 30 мкг	20	25
Хлорамфеникол 30 мкг	20	26
Рифампицин 30 мкг	15	17
Апрамицин 30 мкг	12	16
Неомицин 50 мкг	8	19
Циклосерин 50 мкг	16	12
Сурфактин 12.5 мкг	14	0
Оксидативный стресс (на диск)	Диаметр зоны ингибирования роста (мм)
3% H2O2 5мкл	15	15
Паракват 50 мкг	10	12
Осмотический стресс	OD600 ночных культур
0.5 M NaCl	1.80	1.54
0.75 M NaCl	1.56	0.475
1 M NaCl	1.496	0.035
Влияние спиртов	OD600 ночных культур
7% Этанол	0.254	1.015
5% Изопропанол	0.305	1.709

4. Чувствительность к антибиотикам

Предполагая, что механизм устойчивости к спиртам у мутанта MG1655 ButR  может иметь достаточно универсальный характер и, возможно, связан с механизмами множественной лекарственной устойчивости [Aono R., 1998; Asako H., 1997; Hayashi S., 2003], мы оценили чувствительность бутанол-толерантного мутанта к разным группам антибиотиков. В ходе исследования было установлено, что бутанол-толерантный мутант обладает повышенной чувствительностью к антибиотикам β-лактамного ряда, а так же антибиотикам ингибирующим синтез белков (хлорамфениколу, рифампицину, аминогликозидам) (Табл. 3). Однако, мутант MG1655 ButR обладал повышенной устойчивостью к антибиотикам, механизм действия которых связан с нарушением синтеза липидов (циклосерин) и дезорганизацией мембраны (сурфактин) (Табл. 3).

5. Оксидативный стресс

Оксидативный стресс является одной из составляющих повреждающего действия органических растворителей, в том числе и бутанола. Оксидативный стресс можно индуцировать такими веществами как H2O2 или паракват [Farr S.B., 1991]. Проверка штаммов MG1655 и MG1655 ButR выявила одинаковый уровень чувствительности к стрессу, вызванному H2O2. Однако мутант MG1655 ButR оказался чуть более чувствителен к параквату по сравнению с контролем (Табл. 3).

6. Чувствительность к осмотическому шоку

Осмотическую резистентность штамма MG1655 и мутанта MG1655 ButR определяли путем сравнения OD600 ночных культур, выращенных в условиях высокой осмолярности среды (0.5-1.0 M NaCl). Было показано, что выживаемость мутанта MG1655 ButR резко снижается под воздействием гиперосмотической среды, по сравнению с родительским штаммом (Табл. 3). Подобная сверхчувствительность, возможно, связана с изменением количества неспецифических трансмембранных транспортеров - поринов.

7. Различия в липидном составе мембран штаммов MG1655 ButR  и MG1655

Для определения возможных изменений мембранной структуры был проведен анализ липидного состава клеток штаммов MG1655 и MG1655 ButR. В таблице 3 приведены изменения в составе жирных кислот (ЖК) клеток родительского штамма и  бутанол-толерантного мутанта. Значимые изменения в составе ЖК штамма MG1655 ButR  состоят в появлении 3-гидрокси-тридекановой кислоты, что может отражать изменение структуры липида А липиполисахарида [Trent M.S., 2004; Zhu K., 2009]. В составе ЖК штамма MG1655 ButR было отмечено появление новых, нехарактерных для MG1655 жирных кислот (выделены жирным шрифтом). В частности у мутанта обнаруживаются тридекановая и два изомера пентадеценовой кислоты. Остальные изменения носят количественный характер (Табл. 4).

Таблица 4. Состав жирных кислот клеток штаммов MG1655 и MG1655 ButR (% от суммы ЖК).

№	Жирная кислота	Символ	MG1655	MG1655 ButR
1	Додекановая	12:0	1.241	1.329
2	Тридекановая	13:0		0.412
3	Тетрадеценовая	14:1	0.188	0.134
4	Тетрадекановая	14:0	6.212	5.056
5	7-пентадеценовая	15:1w8		0.248
6	9-пентадеценовая	15:1w6		0.091
7	Пентадекановая	15:0	1.966	6.405
8	3-гидрокси-тридекановая	13:0 3OH		0.224
9	7-гексадекановая	16:1w9	0.165	0.166
10	9-гексадекановая	16:1w7	6.889	12.07
11	11-гексадекановая	16:1w5	0.244	0.345
12	Гексадекановая	16:0	37.632	30.167
13	3-гидрокси-тетрадекановая	14:0 3OH	3.249	3.298
14	Цикло-гептадекановая	17 cyc	24.905	19.259
15	Гептадеановая	17:0	1.299	3.672
16	11-октадекановая	18:1w7	6.616	13.356
17	Октадекановая	18:0	2.994	0.923
18	Цикло-нонадекановая	19 cyc	6.355	2.843
Сумма ЖК			100	99.98

8. Композиция белков внешней мембраны у бутанол-толерантных мутантов

Сравнение белкового профиля родительского штамма  MG1655 и бутанол-толерантного мутанта ВutR  выявило некоторые отличия в количественном содержании поринов OmpA OmpC и OmpF в мембранной фракции. В наших условиях проведения SDS-гельэлектрофореза нам не удалось добиться разделения фракций белков OmpC и OmpF, которые близки по молекулярной массе (40.36 kDа и 39.33 kDа, соответственно). Поэтому в геном родительского штамма MG1655 и мутанта TS11 ВutR были внесены инсерции ompC::KmR и ompF::KmR,  полностью инактивирующие синтез соответствующих белков,  после чего проводили выделение мембранных белков, их фракционирование и электрофоретический анализ  в полиакриламидном геле (Рис.11).

У мутанта ButR (штамм TS17) можно видеть заметное снижение количества белков OmpC и OmpA в мембранной фракции. Еще более интересный результат получен при анализе мембранных фракций белков OmpC и OmpF, выделенных из бактерий штамма MG1655 и мутанта ButR, которые  выращивали на минимальной среде в присутствии 1.5% бутанола. В обоих контрольных штаммах бутанол полностью подавляет экспрессию поринов OmpC и OmpF и частично порина OmpA (Рис. 11, дорожки 6 и 7).

У мутанта ButR под влиянием бутанола наблюдается практически полное подавление экспрессии порина OmpF (Рис.11, дорожка 8), но экспрессия поринов OmpC и OmpA сохраняется на прежнем уровне,  как и у бактерий,  выращенных на среде без добавления бутанола (Рис. 11, дорожки 5 и 9).

Рисунок 11. 1 - белковый маркер; 2 - TS16 (ompC), 3 - TS14 (ompF), 4 ЦTS19 (ButR ompC), 5 - TS17 (ButR ompF); 6 - TS16 (ompC), 7 - TS14 (ompF), 8 - TS19 (ButR ompC), 9 - TS17 (ButR ompF ). Дорожки 2-5: мембранные белки, выделенные из клеток, выращенных в минимальной среде Адамса; дорожки 6-9: мембранные белки, выделенные из клеток, выращенных в минимальной среде Адамса с добавлением 1.5% бутанола.

Таким образом, ярким отличием мутанта ButR от родительского штамма является изменение содержания порина OmpC в мембранной фракции в ответ на добавление бутанола в среду роста. Такое изменение может быть обусловлено как модификацией самого порина OmpC, ограничивающей  его встраивание в структурно-измененный липополисахарид [Ames G.F., 1974; Koplow J., 1974; Schnaitman C.A.,1993], так и с изменением регуляции экспрессии гена ompC с участием белков активаторов OmpR и CpxR.

3. Исследование изменения регуляции гена ompC под действием бутанола
1. Определение нуклеотидной последовательности генов ompC и ompR у мутанта ButR

Секвенирование хромосомного локуса ompR мутанта ButR не выявило каких-либо мутаций как в структурной, так и в регуляторной области этого гена (данные не представлены).

В то же время, мы обнаружили три нуклеотидные замены: -94CT, -80TA и -62АG в регуляторной области гена ompC, которые расположены, соответственно,  в сайтах связывания C1a, C1b  и С2b белка OmpR (Рис.12).  Выявленные нуклеотидные замены одновременно затрагивают и сайты связывания другого регуляторного белка - CpxR, которые, в свою очередь, перекрываются с сайтами связывания белка OmpR.

  CpxR1 CpxR2  CpxR3

T A G

.-100 .  . -70  .  .-50  .

catttacattttgaAacatctatagcgataaatgaaacatcttaaaagttttagtatcatattc

gtaaatgtaaaactttgtagatatcgctatttactttgtagaattttcaaaatcatagtataag

  C1a C1b C2a C2b C3a C3b

C1  C2 C3

-35  .  .-20  .-10 . +1  . .+20

gtgttggattattctgcatttttggggagaatggacttgccgactgattaatgagggttaatca

cacaacctaataagacgtaaaaacccctcttacctgaacggctgactaattactcccaattagt

  .+30 . .+50  .  .+70  M  K  V 

gtatgcagtggcataaaaaagcaaataaaggcatataacagagggttaataacatgaaagttaa

catacgtcaccgtattttttcgtttatttccgtatattgtctcccaattattgtactttcaatt

Рисунок 12. Нуклеотидная последовательность регуляторной области гена ompC. Старт транскрипции  (+1) обозначен стрелкой; -10 и -35 последовательности промотора обозначены жирным шрифтом. Сайты связывания белка OmpR (C1, C2 и C3) обведены рамкой, жирным шрифтом указаны консервативные нуклеотиды. Сайты связывания белка CpxR подчеркнуты жирной линией. Сайт связывания рибосомы подчеркнут тонкой линией. Нуклеотидные замены, обнаруженные в сайтах связывания белков OmpR и CpxR у мутанта ButR обозначены над нуклеотидной последовательностью.

2. Определение уровня экспрессии гена ompC  в бесклеточных экстрактах мутанта ButR

       Регуляторные зоны гена ompC мутанта ButR (TS11)  и родительского штамма MG1655 клонировали в малокопийный экспрессионный вектор pJEL250.  Вектор pJEL250 содержит структурный ген lacZ, кодирующий синтез -галактозидазы без собственного промотора, что позволяет конструировать транскрипционные слияния исследуемых промоторов с геном lacZ.  Полученные варианты гибридных плазмид, содержащие ген lacZ  под контролем регуляторной зоны гена  ompC  дикого типа и мутанта  ButR  были перенесены с помощью трансформации в реципиентные клетки штамма TS22 lacZ  и у полученных трансформантов определяли активность -галактозидазы. Культуры выращивали на минимальной среде Адамса при 37С. Пробы для определения активности -галактозидазы отбирали начиная с ранней и кончая поздней логарифмической стадией роста (Рис. 13).

  Как следует из данных рисунка 13, у штамма TS32, содержащего регуляторную область гена  ompC родительского штамма в процессе роста наблюдается постепенное нарастание удельной активности -галактозидазы, которое достигает максимума к поздней логарифмической стадии роста (2 часа).

Кривая зависимости удельной активности -галактозидазы под контролем мутантного промотора ButR от стадии роста бактерий штамма TS35 имеет совершенно иной  характер. Во-первых, базальный уровень экспрессии промотора ButR существенно ниже контрольного. Во-вторых, увеличение активности в ходе роста бактерий происходит значительно медленнее. Эти данные согласуются с результатами электрофореза  (Рис. 11), где мы наблюдали явное снижение экспрессии основных мембранных белков OmpC и OmpF в мембранной фракции штамма TS11. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что снижение экспрессии порина OmpC  у мутанта TS11 ButR обусловлено присутствием выявленных нами трех нуклеотидных замен в регуляторной области гена ompC. Исходя из установленной нами локализации этих замен в сайтах связывания белков OmpR и CpxR,  представляется весьма вероятным, что полученные мутации снижают эффективность связывания этих белков-активаторов, результатом чего является наблюдаемое нами уменьшение базального уровня экспрессии гена ompC в мутанте ButR.

3. Влияние бутанола на характер экспрессии гена ompC

В следующей серии экспериментов мы изучили влияние бутанола на характер экспрессии гена  ompC  у мутанта ButR и контрольного штамма. Экспресиия гена ompC возрастает под действием температуры [Lutenburg B., 1976], поэтому эксперименты по измерению активности -галактозидазы проводились в двух температурных режимах: при 30С и 37С (Рис. 14).

Показано, что изменение температурного режима не приводит к значительному увеличению активностей как у мутанта, так и у контроля. Однако, добавление бутанола в случае контрольного штамма приводит к 2-х кратному увеличению уровня экспрессии гена ompC при 30оС и  более чем  к  3-х кратному увеличению при 37оС. У мутанта ButR активирующее действие бутанола выражено еще сильнее: при 37оС активность -галактозидазы под контролем промотора ButR возрастает более чем на порядок (Рис.14).

tC	30		37
Добавка	-	But	-	But

На следующем этапе работы мы решили выяснить, зависит ли увеличение уровня экспрессии  гена ompC  под действием бутанола от регуляторных белков OmpR и CpxR. C этой целью в геном штаммов TS32 и ТS35 были  внесены инсерции  ompR::KmR и cpxR::KmR и у полученных штаммов TS32-О, TS35-O, TS32-C и TS35-C определяли активность -галактозидазы (Рис. 15).

Результаты, представленные на рисунке 15 показывают, что в случае регуляторной области дикого типа, увеличение экспрессии гена ompC под действием бутанола опосредуется  белком-активатором OmpR.  В случае мутантного промотора ButR уровень индукции -галактозидазы бутанолом остается высоким, несмотря на инактивацию гена ompR, однако не достигает максимума, наблюдаемого на фоне интактного гена ompR. Несколько иной эффект на индукцию экспрессии гена ompC бутанолом вызывает инактивация гена cpxR. В случае регуляторной области дикого типа инактивация гена cpxR приводит к примерно 2-х кратному увеличению базального уровня экспрессии гена ompC, причем добавление бутанола не вызывает дополнительного возрастания его активности.

Генотип	Дикий тип		ompR		cpxR
Добавки	-	But	-	But	-	But

У мутанта  ButR на фоне инактивированного гена cpxR базальный уровень экспрессии гена ompC также повышается, однако добавление бутанола приводит примерно к 3-х кратной индукции -галактозидазы и примерно соответствует уровню экспрессии, который наблюдается в случае инактивации гена ompR (Рис. 15). Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что для максимальной индукции бутанолом  экспрессии как мутантного, так и дикого промотора гена ompC необходимо присутствие в клетке интактных белков OmpR и CpxR. Очевидно, что содержащиеся в регуляторной области гена ompC нуклеотидные замены у мутанта ButR влияют на нормальное и, по всей видимости, конкурентное взаимодействие регуляторных белков OmpR и CpxR с перекрывающимися мишенями. Вместе с тем, в случае мутантного промотора в клетке, по-видимому, реализуется и независимый от действия этих регуляторных белков механизм индукции экспрессии гена ompC бутанолом.

Выводы

1. Осуществлено генетическое конструирование штамма E.coli fadR, adhE, atoC, Ptet-atoB, ldhA, способного продуцировать бутират. Тем самым впервые показана возможность обращения этапов  процесса -окисления жирных кислот в E.coli  и использование этого процесса для биосинтеза бутирата - предшественника бутанола.
2. Методом направленной микроэволюции получен штамм E.coli MG1655 ButR, способный расти  в присутствии 1.5% бутанола в питательной среде.
3. Впервые показано, что содержание в мембранной фракции клеток E.coli белка OmpC зависит от присутствия в среде такого гидрофобного агента, как бутанол. У мутанта ButR существует прямая корреляция между уровнем экспрессии гена ompC и содержанием порина OmpC в мембранной фракции клеток.
4. В регуляторной области гена ompC у мутанта ButR выявлены три нуклеотидные замены, которые локализуются в перекрывающихся сайтах связывания  белков-активаторов OmpR и CpxR. Присутствие этих мутаций в регуляторной области гена ompC у мутанта ButR обусловливает снижение уровня экспрессии гена ompC в нормальных условиях роста, однако обеспечивает более высокий уровень синтеза порина OmpC при добавлении бутанола.
5. Определен ряд фенотипических характеристик штамма MG1655 ButR (устойчивость к этанолу и изопропанолу, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом, устойчивость к сурфактину, измененный состав жирных кислот, а также гиперчувствительность к осмотическому шоку), свидетельствующих о структурных перестройках клеточных мембран, затрагивающих, как липидную, так и белковую компоненты.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Т.А. Серегина,  Р.С. Шакулов, В.Г. Дебабов, А.С.Миронов. Конструирование штамма E.coli, продуцирующего бутират без использования чужеродных генов. // Биотехнология. 2009. № 6. Стр. 24-35.

2. Т. А. Серегина, Г. А. Осипов, Р. С. Шакулов, А. С. Миронов. Получение и фенотипическая характеристика мутантов E.coli,  толерантных к бутанолу. // Микробиология. 2012. Том 81. № 2. Стр. 227-235

3. Т. А. Серегина, Г. А. Осипов, Р. С. Шакулов, А. С. Миронов. Фенотипические свойства мутанта E.coli, толерантного к бутанолу. Материалы 16-ой Международной школы-конференции молодых ученых Биология Наука XXI века Пущино, 16-21 апреля 2012 г. С. 145.

4. Т. А. Серегина, Р. С. Шакулов, А. С. Миронов. Бутанол  как  фактор  регуляции  экспрессии  гена ompC  в клетках  E.coli. // Генетика. 2012. Том 48. № 11. Стр. 1-9.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии