Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ЖУКОВА ОЛЬГА ВАДИМОВНА
ФОРМИРОВАНИЕ КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ПРОИЗВОДСТВ ОРГАНИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ОТ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ
Специальность 03.02.08 - Экология (в химии и нефтехимии)
03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Казань Ц 2012
Работа выполнена на кафедре ботаники и зоологии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский (Приволжский) федеральный университет
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Морозов Николай Васильевич
Официальные оппоненты: Шулаев Максим Вячеславович, доктор
технических наук, доцент кафедры
химической кибернетики ФГБОУ ВПО
Казанский национальный исследовательский
технологический университет, г. Казань
Азимов Юсуф Исмагилович,
доктор технических наук, профессор кафедры
статистики, эконометрики и естествознания
Института экономики и финансов
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский)
федеральный университет , г. Казань
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Башкирский государственный
университет, г. Уфа
Защита состоится л31 октября 2012г в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при ФГБОУ ВПО Казанский национальный научно-исследовательский технологический университет по адресу: 420015, г Казань, Карла Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета, А-330
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского национального исследовательского технологического университета
Автореферат разослан л______ сентября 2012г.
Ученый секретарь Степанова
диссертационного совета Светлана Владимировна
Актуальность темы. Загрязнение природной среды нефтью и продуктами её переработки - одна из наиболее сложных проблем, угрожающих безопасности среды обитания живых существ [Квасников Е.И., Клюшникова Т.М., 1981; Зобов В.В. и др., 1997; Ильинский В.В., 2000; Барышникова Л.М., 2001; Морозов Н.В., 2001; Fergusson S., 2003; Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И. и др., 2010; Ягафарова Г.Г. и др., 2011]. Ни один другой загрязнитель, как бы опасен он не был, не может сравниться с нефтепродуктами по качественному составу, широте распространения, числу источников загрязнения, единовременной нагрузке на все компоненты природной среды [Аренс В.Ж. и др., 1997; Морозов Н.В., 2001, 2003; Мочалова О.С., Антонова М.Н. и др., 2002; Надеин А.Ф., 2010]. По мере накопления опыта восстановления естественных свойств нефтезагрязненных объектов становится очевидным, что для их обезвреживания наиболее приемлемы способы, основанные на применении разнообразных гетеротрофных микроорганизмов, в том числе нефтеокисляющих [Bos R.,1999; Данянь Ч., Ботвинко И.В., 2001;Van Hamme, 2003; Хасанов И.Ю., Габитов Г.Х. и др., 2003; Куликова А.К., 2008, 2010; Музипов Х.Н., Ерка Б.А. и др., 2009; Хохлова А.Р. и др., 2009; Мишанина О.Е. с соавт., 2012]. Выделение и идентификация штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов на основе изучения их морфологических, физиолого-биохимических свойств, выявление основных типов взаимоотношений между ними в искусственно сформированных ассоциациях и создание на этой базе исследований отселектированного консорциума со спектром окисления различных фракций нефти, его широкое применение для биологической деструкции аварийных и локальных нефтяных загрязнений, биоремедиации углеводородсодержащих природных и сточных вод представляет особую актуальность.
Настоящая разработка актуальна еще и тем, что решает глобальную экологическую задачу. Образующаяся в процессе очистки углеводородсодержащих сточных вод в струйно-отстойном аппарате биомасса микроорганизмов в количестве 3-5% от общего объема очищаемого стока, утилизируется повторно в технологическом цикле. Этим обеспечивается рекуперация вторичных материалов, удешевляются технологические и эксплуатационные расходы, связанные с выращиванием биомассы для обеспечения непрерывной работы биотехнологической схемы очистки. В традиционных очистных сооружениях с биохимическим окислением нефтезагрязнений биоценозом прирост активного ила доходит до 25% на единицу очищенной воды. Утилизация его связана с большими экономическими затратами и экологически не решена.
Цель исследования - раскрытие основных параметров нефтеокисления отселектированными штаммами углеводородокисляющих микроорганизмов, выбор условий для создания высокоэффективного консорциума промышленного образца, обеспечивающего быструю ликвидацию нефтяных загрязнений при аварийном или ином поступлении, и в управляемом снятии углеводородов в природных и производственных сточных водах.
Задачи исследования:
1. Выделить и идентифицировать из производственных технологических сточных вод ОАО Казаньоргсинтез углеводородокисляющие микроорганизмы, исследовать эффективность способов их стимуляции и характерные особенности развития в различных условиях функционирования: в модельных экосистемах и очистных сооружениях, применяемых для очистки и доочистки углеводородсодержащих сточных вод с последующим отводом их в открытые водные объекты без ущерба их экологическому состоянию.
2. Исследовать основные типы взаимоотношений между углеводородокисляющими микроорганизмами с учетом их дальнейшей совместимости в консорциуме.
3. Определить эффективность окисления нефти, нефтепродуктов в воде монокультурой и сообществом углеводородокисляющих микроорганизмов и создать на этой базе высокоэффективный в окислении нефти и нефтепродуктов отселектированный консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов.
4. Выяснить пути интенсификации деструктивных процессов очистки и разработать усовершенствованные технологии использования культур штаммов для управляемого снятия нефтяных загрязнений в условиях модельного эксперимента.
5. Апробировать консорциум в биотехнологической схеме очистки смешанных нефтесодержащих сточных вод ОАО Казаньоргсинтез с использованием специально созданного для этой цели струйно-отстойного аппарата (СОА) и выведение всей технологии на режим очистки и доочистки технологических производственных вод.
Научная новизна работы:
1.Впервые сформирован новый консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов, обладающий широким спектром окисления различных классов углеводородов нефти, применяемый в управляемом режиме очистки углеводородсодержащих сточных вод в специально созданном для этой цели струйно-отстойном аппарате (СОА), а на его базе технологической схемы очистки и глубокой доочистки нефтесодержащих производственных сточных вод.
2.Изучены основные типы взаимоотношений в ассоциативной культуре для благоприятной совместимости выбранных штаммов и достижения высокой активности в окислении нефти и нефтепродуктов (новый подход). Консорциум может быть применен как на стадии основной очистки, так и доочистки для наиболее полной биодеструкции нефти и её производных в технологических стоках.
3.Показано, что комплексный подход использования углеводородокисляющих микроорганизмов с биогенными элементами и индуцирующими веществами способствует интенсификации процессов очистки и является основой управления качеством нефтезагрязненных природных и сточных вод нефтедобывающих, нефтеперерабатывающих, нефтехимических производств и др.
Практическая значимость результатов
Получены девять штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов из многочисленных аборигенных видов (35 культур), объединенные в ассоциацию с высокой деструктивной активностью. В результате научных исследований сформирован консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов для биодеградации нефти и нефтепродуктов в разнообразных углеводородсодержащих производственных стоках.
Изучены основные типы взаимоотношений между микроорганизмами данной группы, подобраны оптимальные соотношения при совместном использовании их в консорциуме. Выявлены условия развития углеводородокисляющих микроорганизмов, составляющих основу консорциума, при которых достигается максимальная их численность и высокая эффективность деструкции нефти и нефтепродуктов.
Разработана и испытана в полупроизводственных условиях технологическая схема очистки производственных сточных вод ОАО Казаньоргсинтез, позволяющая в управляемом режиме достигнуть увеличения скорости и эффективности окисления смешанных углеводородсодержащих сточных вод до норм оборотного водоснабжения.
Результаты исследований могут быть использованы для мониторинга уровня загрязнения природной среды нефтяными поллютантами, а также проведения профилактических мероприятий по ликвидации нефтяных загрязнений при их локальном или аварийном поступлении в водоемы и почвы.
Внедрены в промышленных условиях:
1) Способ очистки технологических производственных сточных вод от нефти и нефтепродуктов, включающий в себя применение бактериального консорциума, структуирующие и питательные добавки (биогенное питание и индуцирующие соединения).
2)Консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), состоящий из девяти штаммов: Alcaligenes sp. Г0401ВТ (№17), Micrococcus nishinomiyaensis Г0402ВТ (№16), Brevibacterium iodinum Г0403ВТ (№15), Pseudomonas aeruginosa Г0404ВТ (№14), Pseudomonas facillis Г0405ВТ (№13), Brevibacterium linens Г0406ВТ (№12), Bacillus subtilis Г0407ВТ(№11), Flavobacterium aquatile Г0408ВТ(№10), Clostridium butyricum Г0409ВТ (№9) для предварительной подготовки смешанных углеводородсодержащих производственных сточных вод с проведением полупроизводственных испытаний обезвреживания стоков в цехе нейтрализации и очистки производственных сточных вод ОАО Казаньоргсинтез. Акт полупроизводственных испытаний утвержден техническим директором, главным инженером ОАО Казаньоргсинтез.
Результаты исследований использованы для чтения лекционного материала в Казанском (Приволжском) федеральном университете по курсам Микробиология, Биотехнология, Экология и Социальная экология и природопользование.
ичное участие автора. Автором проведен аналитический обзор литературы, спланированы и выполнены лабораторные опыты, полупроизводственные испытания, в результате которых получена экспериментальная база данных и проведена их интерпретация, написаны статьи и тезисы докладов, подготовлены две заявки на изобретения к патентам РФ.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях Глобальные проблемы экологизации в европейском сообществе (Казань, 2006), Международная молодежная научная конференция. XV Туполевские чтения (Казань, 2007), Фундаментальные и прикладные исследования в системе образования (Тамбов, 2008), Фундаментальные науки и практика (Томск, 2010), на Конгрессе Чистая вода. Казань (Казань, 2010), Фундаментальные исследования (Москва, 2011), Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2011), на Всероссийских конференциях и съездах Поволжская научно-практическая конференция Эколого-географические исследования в среднем Поволжье (Казань, 2008), Инновационные подходы к естественно-научным исследованиям и образованию (Казань, 2009), Окружающая среда и устойчивое развитие регионов: новые методы и технологии исследований (Казань, 2009), Известия Казанского государственного архитектурно-строительного университета (Казань, 2009), на Межвузовских конференциях лВестник Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета (Казань, 2007,2010,2011), Современные проблемы органической и биологической химии, молекулярной биологии, экологии и биотехнологии, (Москва, 2009), 17th International Environmental Bioindicators Conference: Global Indicators (Moscow, 2009), Современный мир, природа и человек (Томск, 2009), Актуальные вопросы естествознания начала 21 века (Казань, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 4 - в изданиях рекомендованных ВАК РФ.
Аналитические работы проводились на кафедре ботаники и зоологии К(П)ФУ, научно - исследовательской лаборатории Биотехнология с основами микробиологии Управления научной работой и послевузовского образования ТГГПУ, в лаборатории цеха нейтрализации и очистки сточных вод завода ОАО Казаньоргсинтез и в лаборатории Бионанотехнология с основами микробиологии ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка используемых источников литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками, содержит 11 таблиц, 3 приложения. Список используемой литературы включает 210 отечественных и 110 иностранных наименования.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Современное состояние загрязнения водных ресурсов нефтью и нефтепродуктами и восстановление их естественных качеств (обзор литературы). Рассмотрены вопросы загрязнения природных и сточных вод нефтью и нефтепродуктами, влияния их на состояние среды и организмы водных экосистем, пути биодеградации нефтяных загрязнений разнообразными гетеротрофными микроорганизмами; выделение, выбор и селекция высокоактивных видов углеводородокисляющих микроорганизмов и на их базе создание новых консорциумов, бактериальных препаратов и составов, обладающих широким спектром окисления различных классов углеводородов в изменяющихся условиях среды.
Глава 2. Объекты и методы исследования
Объектами исследований выбраны углеводородокисляющие микроорганизмы (УОМ), выделенные и идентифицированные из смешанных производственных углеводородсодержащих сточных вод ОАО Казаньоргсинтез. Основные исследования включали изучение состава гетеротрофной микрофлоры, участвующей в биоокислении нефтепродуктов в аэробных и факультативно анаэробных условиях, выявление и идентификация активных нефтеокисляющих микроорганизмов из разнообразных гетеротрофных видов.
Идентификацию выделенных штаммов-нефтедеструкторов проводили после многократных исследований на чистоту, изучения их морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств в соответствии с требованиями определителя Берги [Bergey, 1997] и с привлечением дополнительной литературы [Нестеренко О.А. и др., 1985; Аристархова В.И., 1989; Теппер Е.З. и др., 2004].
В дальнейших исследованиях использовали девять штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов (из 35 ранее выявленных), объединенные в новый консорциум по принципу их совместимости между собой. Депонированы штаммы в музее штаммов в Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ), где им присвоены следующие обозначения и номера: Alcaligenes sp. Г0401ВТ (№17), Micrococcus nishinomiyaensis Г0402ВТ (№16), Brevibacterium iodinum Г0403ВТ (№15), Pseudomonas aeruginosa Г0404ВТ (№14), Pseudomonas facillis Г0405ВТ (№13), Brevibacterium linens Г0406ВТ (№12), Bacillus subtilis Г0407ВТ(№11), Flavobacterium aquatile Г0408ВТ(№10), Clostridium butyricum Г0409ВТ (№9).
Изучение основных типов взаимоотношений между комбинациями ассоциаций (смеси из 2-х, 3-х и 9-ти штаммов), а также явления антагонизма между ними проводили на МПА с высевом бактериальной суспензии и с использованием тест-культур [Балашова Н.В., 1974; Егоров Н.С., 1986; Леонов А.В., Чичерина О.В., 2011].
Культивирование бактерий проводили в статических условиях при температуре 28-33С на агаровой питательной среде, колбах объемом 1000 см3, либо в аппарате непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКУМ-2М).
Критериями суждения о биологическом окислении нефти и нефтепродуктов (бензина, керосина, солярового, веретеного и вазелинового масел, нигрола, фенола, бензола, нитробензола, толуола, мазута) в воде служили следующие параметры: изменение динамики общего количества УОМ прямым счетом [Герхард Ф., 1983], оптической плотностью на фотоэлектрокалориметре (КФК-3), БПК5 и БПК полное, растворенный кислород [Лурье Ю.Ю., Рыбникова А.И., 1984, Теппер Е.З. и др., 2004], ХПК, общее количество неорганических форм азота (NO2-, NO3-, NH4+) [МетодикаЕ,2004; УнифицированныеЕ,1977; Чернокальский Б.Д., 1980]. Количественный состав остаточных углеводородов определяли гравиметрическим (весовым) методом [Лурье Ю.Ю., Рыбникова А.И., 1984], а качественный хроматографически на ГХ модели Кристалл-5000.2 .
При разработке технологии использования консорциума микроорганизмов для интенсификации биодеградации нефти использовали торф, золу, древесные опилки, речной песок, а также суспензии 2-х суточных культур УОМ в разных видовых соотношениях ассоциативных культур. Опыты проводили в модельных микроэкосистемах, которыми являлись аквариумы объемом 50 дм3.
С целью интенсификации процессов биологической очистки сточных вод в очистных сооружениях ОАО Казаньоргсинтез от смешанного потока углеводородов (с начальным содержанием до 186 мг/дм3 и нагрузке загрязнений по ХПК до 1860 мг/л) применяли вновь разработанную биотехнологическую схему с использованием струйно-отстойного аппарата (СОА) с заданным числом клеток микроорганизмов консорциума (4-х часовая суспензия, выращенная в хемостатных условиях в АНКУМ-2М) и необходимых биогенных и индуцирующих веществ [Морозов Н.В., 2001, 2003; Жукова О.В., Морозов Н.В., 2009].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ STATISTICA V 4.5 Microsoft Office 2003 для Windous xp, в стандартной компьютерной программе Microsoft Excel. При оценке статистической достоверности средних полученных данных использовали парный и непарный t-критерий Стьюдента. Группу данных считали однородной, если среднее квадратичное отклонение Q в группе не превышало 13%. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности р<0,05.
Глава 3. Выделение и идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов
Выделение углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов из сточных вод ОАО Казаньоргсинтез осуществляли двумя методами: методом накопительных культур и прямым высевом на агаризованные среды (МПА и др.). Доминирующие формы бактерий, использующие нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии были подвергнуты более глубокому изучению их морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств в соответствии с требованиями определителя Берги (Bergey, 1997].
Углеводородокисляющие микроорганизмы объединены в новый консорциум по принципу их совместимости между собой и включают девять штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. Штаммы представлены как грамположительными, так и грамотрицательными подвижными и неподвижными, аэробными и факультативно анаэробными формами. Физиологическая активность (температурный диапазон, рН среды) штаммов вариабельна, высока их ферментативная активность. Установлено, что интенсивность биодеструктивных процессов нефти и её персистентных соединений протекает в диапазоне от +5С до +35С, рН 2,5-10, оптимальными являются интервал температур 25С-30С и рН среды 5,8-7,1, что подтверждается динамикой роста бактериальной популяции и эффективностью деструкции нефти и нефтепродуктов.
Штаммы непатогенны и невирулентны, не обладают способностью к транслокации и диссеминации во внутренние органы и кровь животных после 30-дневного испытания. Наблюдения за животными (белые мыши) в течение 30-ти суток не выявило каких-либо клинических признаков заболевания, а изучение внутренних органов не выявило патологических изменений, регистрируемых морфологически.
Глава 4. Исследование взаимоотношений углеводородокисляющих микроорганизмов в ассоциациях для создания консорциума промышленного образца
Опытами выявлено, что основными видами взаимоотношений между изученными микроорганизмами в ассоциации являются: конкуренция, изоляция и кооперация.
Культуры Clostridium butyricum и Flavobacterium aguatile в вариантах, объединенных в искусственно созданные сообщества взаимодействуют друг с другом по типу конкуренция, что говорит об их несовместимости в данной бинарной комбинации. Один из микроорганизмов в комбинации входящий в данный тип взаимодействия полностью перекрывает при росте и подавляет развитие конкурирующей колонии микроорганизмов. Остальные изученные культуры взаимодействуют друг с другом по типу лизоляция и кооперация. Процент окисления нефти при росте штаммов по типу конкуренция составляет 33%, лизоляция в пределах 43-54%, кооперация - 55-59%. На примере замкнутой модельной экосистемы созданной искусственно, показано, что ассоциация углеводородокисляющих бактерий способна противостоять отрицательному воздействию нефтяного загрязнения, но в определенных комбинациях бактерий.
Путем целенаправленной селекции нами создан консорциум штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов, работающих во взаимосвязи направленного действия, конечная цель которого - достижение полноты биодеструкции нефти и разнообразных углеводородов. Консорциум представляет собой, сформированные в ассоциацию углеводородокисляющие микроорганизмы со следующими свойствами: окислительная активность консорциума по конечному продукту окисления составляет 2041 мг СО2 за 20 суток; способен расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть, включая ароматические углеводороды, содержащиеся в парафинах широкой фракции и тяжелой нефти, при 5-35С; устойчив в длительном непрерывном процессе очистки от нефти, растет в широком диапазоне рН от 2,5 до 10 единиц. Простота технологии изготовления, широкая вариабельность температурного режима и рН среды позволяет использовать его в разных климатических зонах, окислять широкий класс углеводородов в короткие сроки.
На производственной сточной воде продуктивность биомассы составляет 2-31010 кл/мл. Максимальная биодеградация нефти на среде Раймонда на 5-е сутки отмечается с разведением 101-1010. Степень разложения по сырой нефти под воздействием консорциума в течение 7-10 дней составляет 90-95%.
Глава 5. Исследование активности консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов в окислении нефти и нефтепродуктов в модельных экосистемах
Биодеструкции подвергали товарную нефть Елховского месторождения Республики Татарстан, включающую до 42% легких углеводородов, 27-31% ароматики и в пределах 1,4-7% тяжелые фракции; из нефтепродуктов - бензин, керосин, вазелиновое, соляровое, веретенное масла, нигрол, бензол, нитробензол, фенол, толуол, мазут в концентрации 0,5% по объему.
Исследованиями установлено, что все штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов в качестве единственного источника углерода и энергии используют нефть и нефтепродукты.
По мере микробиального окисления нефти и нефтепродуктов содержание кислорода в воде уменьшается, а углекислого газа возрастает в 1,5-2 раза, что является результатом видимой минерализации нефтяных загрязнений до конечных продуктов окисления - СО2 и Н2О. В контрольных вариантах без внесения углеводородокисляющих микроорганизмов процесс очищения воды от нефти не наблюдался. В вариантах с внесением монокультуры и ассоциации из трех культур, процесс очищения среды от нефтяных загрязнений происходил медленнее по сравнению с ассоциацией из девяти штаммов (табл.1).
Таблица 1. Эффективность деструкции углеводородных загрязнений сообществами углеводородокисляющих микроорганизмов в стационарных условиях, %
Нефть, нефтепродукты | Варианты опытов | |||
контроль | Монокультура Alcaligenes sp. | Три культуры Alcaligenes sp., Clostridium byturicum, Pseudomonas facilis | Ассоциация из 9-ти штаммов | |
Товарная нефть | 1,70,08 | 59 0,05 | 770,02 | 970,04 |
Бензин | 1,90,09 | 520,06 | 900,03 | 940,06 |
Соляровое масло | 1,20,07 | 390,05 | 510,04 | 830,04 |
Вазелиновое масло | 1,00,06 | 370,03 | 470,05 | 780,07 |
Веретенное масло | 1,10,06 | 310,04 | 340,04 | 560,04 |
Нигрол | 1,20,06 | 370,03 | 470,05 | 780,07 |
Керосин | 1,40,06 | 470,03 | 470,05 | 760,05 |
Мазут | 1,00,06 | 230,03 | 270,05 | 380,04 |
Бензол | 1,900,6 | 270,04 | 470,05 | 680,07 |
Нитробензол | 1,40,06 | 250,03 | 370,04 | 490,07 |
Фенол | 1,30,05 | 290,03 | 350,04 | 520,07 |
Толуол | 2,40,06 | 260,04 | 470,05 | 580,06 |
Примечание: исходное количество нефти и нефтепродуктов 0, 138 г/дм3
Увеличение степени окисления товарной нефти наблюдалось при внесении консорциума, состоящего из 9 штаммов УОМ до 97%, солярового масла до 83%, вазелинового масла до 78%. Максимум БПК20 и численность бактерий совпадают в период интенсивного разложения нефтяной пленки в опытных сосудах. Наибольшую активность в окислении углеводородов обнаружили ассоциации из девяти культур до 97%, в комбинациях из трех культур в пределах 47-90%, монокультуре до 59 %, а в контроле не превышала 3 %.
Таким образом, показано, что разрушение углеводородов нефти протекает за счет биологического окисления и активности, участвующих в окислении нефти штаммов консорциума.
Глава 6. Разработка технологии применения консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов в очистке природных вод от локального нефтяного загрязнения
В качестве сорбентов для закрепления клеток УОМ применяли: золу, опилки древесные, речной песок, торф. Видовое соотношение суспензии УОМ варьировали в разном соотношении: монокультура, три вида, четыре вида, девять видов УОМ и контроль (без внесения УОМ).
При культивировании исследуемых штаммов микроорганизмов, в ассоциациях в свободном и адгезированном состояниях с использованием сорбентов в течение двух недель выяснено, что скорость разложения нефти находится в прямой зависимости от количества видового состава УОМ, численности микроорганизмов и вида сорбента. В процессе культивирования монокультур и смешанных видов в водной среде с внесением товарной нефти происходило постепенное возрастание плотности бактериальной массы. Численность микроорганизмов при этом увеличилась в 1,5- 3 раза на 2-3-сутки культивирования, что связано с адаптацией их к исходному субстрату и началом его разложения. В дальнейшем на 8-12 сутки, число бактерий постепенно снижалось. В контроле наблюдалась низкая эффективность биодеструкции нефтяной пленки.
В ходе эксперимента было показано, что наибольшая эффективность деструкции нефти наблюдается в варианте со смесью 9-ти адгезированных культур УОМ на торфе и составляет 86,4%, с тремя штаммами - 56,8%, четырьмя - 64,2%, с монокультурой Аlcaligenes sp. 44,5%; на древесных опилках при тех же соотношениях - 76,4, 46,6, 54,3 и 34,2% соответственно; на золе - 66,6, 46,9, 54,2 и 34,3%; на речном песке - 46,1, 41,2, 34,5, и 32,4% соответственно. Во всех контрольных вариантах степень окисления не превышала 3%. При этом максимальное значение показателя углекислого газа и количества микроорганизмов во всех вариантах наблюдается на 4 день эксперимента (0,2 опт. ед. по оптической плотности, что соответствует 100 тыс.-130 тыс. кл/мл). Численность УОМ при вводе в опытные варианты с нефтяной пленкой сорбентов торфа и угля поддерживается на высоком уровне в течение 5-8 дней. Максимальное возрастание количества микроорганизмов во всех вариантах наблюдается на 6-8 дни эксперимента (рис.1).
Показатель растворенного кислорода О2 после некоторого возрастания медленно убывает ввиду вовлечения его в окислительные процессы, что говорит об эффективности процесса дыхания микроорганизмов в данных условиях культивирования соответственно вариантам опыта.
Рис. 1 - Окисление нефти адгезированными клетками УОМ
В вариантах с монокультурой, тремя, четырьмя и ассоциацией из девяти штаммов биодеструктивная активность в окислении нефти свободных клеток, внесенных в виде суспензии путем распыления её на поверхность нефтяной пленки - 33,6, 43,9, 58,2, 61,2% соответственно (рис. 2).
Рис. 2 - Окисление нефти суспензионными клетками УОМ (распыление)
Таким образом, в процессе окисления нефти применение адсорбированных клеток УОМ более эффективно, по сравнению с распылением бактериальной массы на поверхности среды, т.к. прикрепленные к твердому носителю клетки - это возможность достижения высокой концентрации биомассы микроорганизмов на единицу поверхности системы. Наилучшая биодеструкция нефти была достигнута клетками микроорганизмов, адгезированными на торфе и древесных опилках. Присутствующие в составе консорциума нефтеокисляющие микроорганизмы начинают усиленно расти в данной среде за счет использования органических и минеральных солей, содержащихся в применяемых сорбентах и, следовательно, разлагать нефтяные загрязнения, используя их в качестве углеводородного питания [Шарапова И.Э. и др., 2011]. На основании проведенных экспериментальных данных можно считать целесообразной возможность создания управляемой по составу видов смешанную культуру УОМ с разнообразными технологиями их применения, которые позволяют полно и экономично решать ликвидацию любых проявлений загрязнения нефтью и нефтепродуктами в окружающей среде.
Глава 7. Применение бактериального консорциума для интенсификации процессов биологической очистки и доочистки углеводородсодержащих производственных сточных вод ОАО Казаньоргсинтез в управляемом режиме
Наиболее перспективными в области очистки технологических углеводородсодержащих сточных вод является применение чистых, отселектированных штаммов микроорганизмов, способов и установок с вселением микроорганизмов, обеспечивающих высокие показатели очистки воды. Нами была проверена способность комплекса вновь созданного бактериального консорциума окислять различные фракции углеводородов нефти с применением биотехнологической схемы очистки, включающей в себя созданный струйно-отстойный аппарат (СОА), позволяющий провести глубокую очистку и доочистку углеводородсодержащих сточных вод ОАО Казаньоргсинтез в управляемом режиме.
Предварительными опытами установлено, что в интенсификации процессов биологической деструкции нефти гетеротрофной микрофлорой существенная роль отводится соотношению штаммов в консорциуме, их биологической активности и наличию в среде биогенных элементов (азота, фосфора и калия), индуцирующих соединений. Последние играют роль биостимуляторов жизнедеятельности УОМ, а, следовательно, участвуют в интенсивности биоокисления углеводородов в сточных водах. В результате проделанных серий экспериментов определено соотношение штаммов бактерий в консорциуме, которое соответствует следующему количеству (%): Alcaligenes sp. Г0401ВТ (№17) - 14%, Micrococcus nishinomiyaensis Г0402ВТ (№16) - 6%, Brevibacterium iodinum Г0403ВТ (№15) - 6%, Pseudomonas aeruginosa Г0404ВТ (№14) - 25%, Pseudomonas facilis Г0405ВТ (№13) - 25%, Brevibacterium linens Г0406ВТ (№12) - 6%, Bacillus subtilis Г0407ВТ(№11) - 6%, Flavobacterium aquatile Г0408ВТ(№10) - 6%, Clostridium butyricum Г0409ВТ (№9) - 6%, что составляет титр жизнеспособных клеток 51010-71010 кл/мл в жидкой среде или в твердом субстрате с наполнителем.
Испытана новая биотехнологическая схема очистки нефтесодержащих сточных вод с консорциумом УОМ с заданными параметрами по видовому составу, которая включала (рис. 3): 1 - приемник сточных вод с выделением грубых примесей; 2 - насосная станция для подачи сточной воды со сборника в нефтеловушку; 3 - нефтеловушка; 4 - усреднитель; 5 - первичный отстойник; 6- нефтесборник; 7 струйно-отстойный аппарат (СОА); 8 - струйные элементы; 9- блок - дозатор биогенных элементов; 9.1 - блок - дозатор индуцирующих соединений; 9.2 - блок - дозатор нефтеокисляющих микроорганизмов; 10- накопитель очищенной воды с насосной станцией (12) оборотного водоснабжения и подачи образованного УОМ в 9.2; 11- шламонакопитель.
Рис. 3 - Технологическая схема блочной установки очистки и доочистки сочных вод
Процесс очистки углеводородсодержащих сточных вод осуществляется в пилотном струйно-отстойном аппарате (рис.3) (поз.7), выполненным в виде колонны цилиндрической формы диаметром 500мм и высотой 2800мм. В верхней части колонны расположен струйный элемент (поз.8), служащий для подачи смеси воды с микроорганизмами и соединениями, обеспечивающими биодеструкцию углеводородов. Струйный элемент представляет собой заглушенный с обоих торцов цилиндр высотой 800 мм, диаметром 150 мм с перфорированной боковой поверхностью. В верхнем торце цилиндра установлен приточный патрубок (рис.4).
Рис. 4 - Струйно-отстойный аппарат (СОА): V- объем аппарата (м3); D-диаметр аппарата (м); F-площадь поперечного сечения (м2); H=h1+h2+h3-высота аппарата (м); V1-объем зоны смещения (м3); V2-объем зоны оседания частиц потока (м3); V3-объем зоны отстоя (м3).
Технологический режим очистки стоков предварительно подготовленной сточной жидкости на опытной установке осуществляли следующим образом: сточная вода центробежным насосом через приемный патрубок подается в струйный элемент СОА. В момент подачи стока в струйно-отстойный аппарат туда же одновременно из дозатора направляются биогенные элементы (азот в виде сульфат аммония, фосфор в виде суперфосфата), индуцирующие соединения (глутаминовая, янтарная кислоты, валин, аланин, глюкоза, мальтоза) в различных соотношениях и расчетное количество суспензии консорциума углеводородокисляющих бактерий из расчета в среднем 130 млн. кл/мл или по биомассе в пределах 0,3-0,5 г/л.
В струйном элементе (рис.4) сточная жидкость со всеми добавленными компонентами смешивается и образует в нем прямой и обратный поток и из-за значительных градиентов скорости и сдвиговых напряжений разбрызгивается, разрывает капли эмульгированных нефтепродуктов на мелкие диспергированные частицы, насыщенные пузырьками воздуха. В результате образуется значительная площадь поверхности, где микроорганизмы и углеводороды контактируют на границе фаз (среда-воздух). Благодаря этому создаются оптимальные условия для атаки и деструкции микроорганизмами рассеянных нефтяных загрязнений.
Окисление углеводородов нефти идет максимально в зоне струйного элемента и внешнего рецикла и продолжается далее по всей длине СОА, ослабевая по мере снижения концентрации нефтепродуктов к зоне отстоя. Образующаяся при этом биомасса микроорганизмов в пределах 3-5% по мере уплотнения откачивается насосом во вторую ступень СОА и используется во второй ступени очистки для обеспечения деструкции остаточных концентраций углеводородов в сточной жидкости до норм оборотного водоснабжения или отвода в природные водоемы без ущерба их экологическому состоянию. Сбор биомассы искомой численности осуществляется на выходе из СОА, а далее насосом (поз. 12) подается в дозатор для восполнения бактерий, используемых для очистки и доочистки сточных вод (рис.3). При отсутствии в схеме второй ступени СОА, очищенная сточная вода поступает в накопитель очищенной воды. После 1,5 - 2 часового осветления она может быть отведена в биологические очистные сооружения для доочистки от остаточных углеводородов. В серии испытаний технологическая схема очистки применена для обезвреживания сточных вод смешанного потока ОАО Казаньоргсинтез со следующими показателями (среднее из 9-ти штаммов): ХПК 780,4-1048 мг/дм3, О2 в пределах 1,0-5,6 мг/дм3, сумма неорганических форм азота (NH4+, NO2-, NO3-) - 15-35, фосфор (Р2О5) - 1,4-15,3, нефтепродукты от 34 до 186 мг/дм3, фенол в пределах 10-20 мг/дм3, гликоли до 250 мг/дм3, СПАВ 10-20 мг/дм3. Общая численность УОМ на входе в СОА от 104 млн. кл/см3 до 150 млн. кл/см3.
Длительность биоокисления углеводородов нефти в сточной жидкости, подаваемой в СОА, в непрерывном режиме принималась: 1) при концентрации нефтепродуктов 20 - 186 мг/дм3, скорость потока 0,015-0,03 м/сек, время пребывания от 1,0 до 1,5 часа; 2) при концентрации, превышающей 200 мг/дм3 или нагрузке по ХПК 1000 мг/л и более, скорость сточной жидкости в пилотной установке при этом приближалась 0,031-0,045 м/сек, время пребывания 1,3-3,0 часа.
Интенсификация процесса очистки обеспечивалась добавлением в поток биогенных элементов - азота и фосфора (азот в виде нитрата аммония, фосфор в виде суперфосфата кальция), соотношение которых к основной нагрузке загрязнений принято БПКполное:N:Р: 100:5:1 (установлено опытным путем из следующих вариаций - 2,5;0,5;5;10;20;40). Принятое соотношение биогенов в сточной жидкости стимулировало рост популяции УОМ консорциума в 2 раза (325106 против 150106 кл/мл), а эффективность деструкции углеводородов нефти за время контакта 1,2 часа до 75%. В варианте без добавления биогенов степень очистки воды от загрязнения не превысила 25-36%.
Корректировка биогенных элементов (N,Р) в сточной жидкости в работе СОА позволяет повысить нагрузку по ХПК до 1000 мг/л и выше. Последний факт является положительным в процессе подготовки первичных углеводородсодержащих сточных вод до норм отвода для дальнейшей глубокой очистки и доочистки. С целью достижения более высокой эффективности интенсификации процесса биоокисления в последующих сериях испытаний в очищаемую воду добавляли комплекс индуцирующих веществ. В их составе: глутаминовая кислота, янтарная кислоты, аланин, валин, глюкоза и мальтоза при равных количествах (1:1:1:1:1:1) с общей дозой 3510Ц6М. Внесение индуцирующих соединений в поток очищаемой воды в СОА при тех же условиях и режимах очистки увеличивает количество углеводородокисляющих микроорганизмов более чем в два раза (от 150106 кл/мл до 325106 кл/мл), что повышает эффективность процесса биоокисления до 75-78%, а в контроле степень окисления остается на уровне и 32-40%. С целью стабилизации остаточного углеводородного загрязнения предварительно очищенная сточная жидкость подается дополнительно во вторую ступень СОА и подвергается доочистке длительностью от 30 минут до 1,0 часа. При этом эффективность очистки достигает 92-96%, т.е. концентрация углеводородов снижается до 0,12-0,17 мг/дм3.
Динамика изменения БПК, ХПК, численность УОМ, а также азота и фосфора свидетельствуют о том, что в процессе очистки сточных вод производства органического синтеза в технологической схеме двух ступеней очистки достигается микробиальная деструкция углеводородов нефти до конечных продуктов окисления - СО2 и Н2О. На выходе из II ступени СОА количество нефтепродуктов в сточной воде укладывается в санитарные нормы отвода в открытые водные источники или использования в оборотном водоснабжении (рис. 5).
Рис. 5 - Окисление нефтепродуктов в СОА (1 и 2 ступень)
Для решения практических задач в достижении более весомого эффекта в очистке и доочистке углеводородсодержащих сточных вод производств органического синтеза целесообразнее применение биотехнологической схемы с включением двух последовательно расположенных струйно-отстойных аппаратов (СОА). Это позволяет обезвреживать сточные воды с исходной концентрацией углеводородов в пределах 20-300мг/л до норм отвода в открытые водные источники без ущерба их экологическому состоянию. В условиях дефицита пресной воды, используемой в производственном процессе, разработанная биотехнологическая схема обеспечивает полноту рекуперации отработанных вод в промышленном хозяйстве.
Таким образом, в результате лабораторных исследований и полупроизводственных испытаний выявлено, что бактериальный консорциум включающий: Alcaligenes sp., Micrococcus nishinomiyaensis, Brevibacterium iodinum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas facillis, Brevibacterium linens, Bacillus subtilis, Flavobacterium aquatile, Clostridium butyricum обладает всеми необходимыми качествами для биореагента, способствует деструкции нефти и её производных в изменяющихся условиях среды. В традиционных очистных сооружениях биологическим окислением нефтезагрязнений 80-85%-ый эффект достигается от 16 до 20 часов, а с применением консорциума УОМ в схеме СОА и вторичного отстойника за 1,2 - 1,5 часа, с применением двух ступеней очистки в СОА 92-96% за 2,0-2,5 часа. Этим открывается путь использования очищенных вод до норм оборотного водоснабжения.
Основные результаты и выводы по работе
1.Внесение выделенных и идентифицированных из высококонцентрированных сточных вод производства Органического синтеза многочисленных нефтеокисляющих микроорганизмов с широким спектром биодеструкции в очищаемом стоке ускорило разложение углеводородов и способствовало снижению токсичности продуктов переработки нефти до норм оборотного водоснабжения или отвода очищенных вод в природные водоемы без ущерба их экологическому состоянию.
2.Отселектирован и сформирован на базе изученных гетеротрофных микроорганизмов высокоэффективный в окислении нефти и нефтепродуктов консорциум промышленного образца, включающий девять штаммов: Alcaligenes sp. Г0401ВТ (№17), Micrococcus nishinomiyaensis Г0402ВТ (№16), Brevibacterium iodinum Г0403ВТ (№15), Pseudomonas aeruginosa Г0404ВТ (№14), Pseudomonas facillis Г0405ВТ (№13), Brevibacterium linens Г0406ВТ (№12), Bacillus subtilis Г0407ВТ(№11), Flavobacterium aquatile Г0408ВТ(№10), Clostridium butyricum Г0409ВТ (№9) и характеризуется следующими параметрами жизнедеятельности: рН среды от 2,5 до 10,0 в температурном интервале 5-35С, нагрузка загрязнений по ХПК до 1800 мг/л при аэробной фазе окисления.
3.Изучены основные типы взаимоотношений нефтеокисляющих микроорганизмов в процессе совместного их развития в среде с углеводородами, которые представлены изоляцией, конкуренцией и кооперацией.
4.В натурных опытах произведена оценка эффективности биодеструкции углеводородов нормального строения, ароматических и изопреноидных фракций монокультурой и сообществом консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов. Использование консорциума для биоремедиации ведет к снижению БПКполное, (до 3,2 мг/л) и ХПК (в пределах 40-85 мг/л), усиливает окислительно-восстановительные процессы и, тем самым, интенсифицирует очищение воды от нефти и нефтепродуктов.
5. В условиях модельного эксперимента предложены технологии применения консорциума на адгезированной поверхности для клеток углеводородокисляющих микроорганизмов - древесные опилки, торф и др. являющихся дополнительными источниками питания в виде легкоокисляемых органических веществ, одновременно и сорбентами для клеток микроорганизмов, способствующих детоксикации и биодеструкции нефтяных поллютантов до 87%. Показана целесообразность использования данных сорбентов совместно с консорциумом в управляемом режиме для снятия нефтяных загрязнений в природных, производственных сточных водах, а также при локальном или технологическом поступлении.
6. Разработаны биотехнологии использования консорциума штаммов УОМ для очистки и доочистки: 1)смешанных высококонцентрированных технологических нефтесодержащих стоков до норм поступления в биологические очистные сооружения для дальнейшей их доочистки; 2) нефте- и углеводородсодержащие сточные воды с нагрузками от 20 до 200 мг/л до норм оборотного водоснабжения или отвода очищенных вод в водоемы без ущерба их экологическому состоянию. Биотехнологическая схема очистки, с включением основного струйно - отстойного аппарата (СОА) позволяет очистить углеводородсодержащие сточные воды с исходной нагрузкой нефтяного загрязнения до 180 мг/л, соотношением БПК: N:Р 100:5:1, количеством индуцирующих соединений 3510-6 и с численностью УОМ до 162106 млн. кл/см3 -325106 млн. кл/см3 за 1,2 часа контакта до 78%, а при вводе в схему двух ступеней СОА с увеличением времени контакта 0,5 -1 час в пределах 92-96%.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
в изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Жукова О.В., Морозов Н.В., Хузаянов Р.Х., Кудряшов В.Н. Технологическая схема биоочистки нефтесодержащих производственных стоков, основанная на применении отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов// Известия КазГАСУ.-2009.- №1 (11). - С.214-220.
2. Жукова О.В., Морозов Н.В. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями - сорбентами при снятии локального нефтяного загрязнения//Вестник Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.- 2010.-№ 3 (21).- С. 99-106.
3. Жукова О.В., Морозов Н.В. Выявление и идентификация антибиотических веществ при росте углеводородокисляющих микроорганизмов в ассоциативных культурах// Вестник Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.-2011.-№ 1(23). - С.61-67.
4. Морозов Н.В., Хуснетдинова Л.З., Жукова О.В. Использование иммобилизованных на органическом сорбенте нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти//Фундаментальные исследования.-2011.- №12. - С. 576-579с.
В других изданиях
1. Морозов Н.В., Жукова О.В. Бактериальные препараты-деструкторы углеводородов, их разработка и использование для биоремедиации водоемов и почв от нефтяных загрязнений//Глобальные проблемы экологизации в Европейском сообществе.- Казань:МИЭП РТ, 2006.- С. 209-210.
2. Жукова О.В., ыкова Е.В., Сидоров А.В. Консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки земель и вод, загрязненных нефтью//Материалы международ. науч.-практ.конф. XV Туполевские чтения.- Казань: Казан. гос. техн. ун-т, 2007.-Т.1.- С.384-385.
3. Жукова О.В., Морозов Н.В. Исследование взаимоотношений углеводородокисляющих микроорганизмов в ассоциациях, используемых для управляемой очистки природных и сточных вод от нефтяных загрязнений //Вестник Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета. Ц2007. -№ 2-3 (9-10). - С.100-107.
4. Морозов Н.В., Жукова О.В. Экологическая защита окружающей среды от нефтяных загрязнений, технологическая схема биоочистки нефтесодержащих стоков// Фундаментальные и прикладные исследования в системе образования. - Тамбов: изд-во Першина Р.В, 2008.-Т.3.-С.58 -60.
5.Жукова О.В., Морозов Н.В. Антибиотические вещества в антагонистических взаимоотношениях углеводородокисляющих микроорганизмов в ассоциативных культурах//Эколого-географические исследования в Среднем Поволжье.- Казань: ЗАО Новое знание, 2008.- С. 123-132.
6. Zhukova O.V., Khusnetdinova L.Z. The group of sour carbon hydrogen microorganisms participating in biopreparatus for soil and water manage cleaning from oil pollution//17th International Environmental Bioindicators Conference.-Mосква: Всероссийское масс-спектрометрическое общество, 2009. - С. 97.
7. Жукова О.В. Биоремедиация нефтяных загрязнений в природных водоемах, технологических сточных водах и почвах отселектированными штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов//Современные проблемы органической и биологической химии, молекулярной биологии, экологии и биотехнологии. - 2009.- №2.- С.111-113.
8. Хуснетдинова Л.З., Жукова О.В., Морозов Н.В. Создание бактериальных препаратов-деструкторов углеводородов и их использование в восстановлении качества поверхностных вод//Материалы Всеросс. науч.-практ. конф. Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию.- Казань: ТГГПУ, 2009.- С. 295-297.
9. Жукова О.В., Морозов Н.В.. Биопленка - микробный консорциум, участвующий в биохимических процессах превращения веществ// Природоохранные биотехнологии в 21 веке.- Казань: ТГГПУ, 2010.- С. 96-106.
10. Хуснетдинова Л.З., Жукова О.В., Морозов Н.В. Использование иммобилизованных клеток углеводородокисляющих микроорганизмов для биодеградации нефтяных загрязнений//Актуальные вопросы естествознания начала XXI века.- Казань: Печать-Сервис-XXI век, 2010.- C.133-136.
11. Хуснетдинова Л.З., Жукова О.В., Морозов Н.В. Применение органических субстратов для иммобилизации гетеротрофных микроорганизмов, участвующих в очистке природных и сточных вод от нефти//Сборник материалов Конгресса Чистая вода. Казань.- Казань: Министерство строительства, архитектуры и жилищно-коммунального хозяйства РТ, 2010.-С.110-113.
12.Жукова О.В., Меркушин О.С., Морозов Н.В. Влияние активной ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов и биогенных элементов на деградацию нефтепродуктов в почве//Фундаментальные науки и практика.-2010.- Т. 1, №2.- С.74-77.
13. Жукова О.В., Морозов Н.В. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов в управляемом режиме// Фундаментальные науки и практика.--2010.- Т. 1, №3. -С.19-22.
14. Жукова О.В., Хуснетдинова Л.З. К вопросу о биодеградации и биодеструкции (биоремедиации) нефтяных загрязнений в окружающей среде, как фактор чистой экологии// Актуальные вопросы естествознания начала 21 века: - Казань: Печать-Сервис-XXI век, 2011.- С.110-112.
15. Морозов Н.В., Иванов А.А., Жукова О.В., Чернов А.Н., Степанов В.И. Биопрепараты промышленного образца и их использование для управляемой очистки поверхностных вод от нефтяных загрязнений (при аварийном или локальном поступлении)//Материалы 5-го Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. -2011.Ч.2.- С.20-22.
16. Морозов Н.В., Жукова О.В., Иванов А.В. Биотехнология ликвидации нефтезагрязнений аборигенными штаммами углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованными на сорбентах разной природы//Материалы Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. -2011.-Ч2.- С.302- 304.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии