Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Романов Роман Александрович
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОМ ВКУСОВОМ ОРГАНЕ. МЕХАНИЗМЫ ЭЛЕКТРОГЕНЕЗА, ВОЗБУДИМОСТИ И АФФЕРЕНТНОЙ НЕЙРОПЕРЕДАЧИ.
Специальность 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРЕАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
ПУЩИНО - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович доктор биологических наук, профессор Годухин Олег Викторович доктор биологических наук, профессор Антонов Сергей Михайлович
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук
Защита состоится 24 мая 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке ПН - РАН по адресу:
142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3.
Автореферат разослан: л________________ 2012г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Смолихина Т.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Современные представления о молекулярных механизмах вкусовой трансдукции практически полностью базируются на данных молекулярно-биологических исследований периферического вкусового органа и на системных физиологических данных, полученных с использованием генетически модифицированных животных (нокаутные (knock-out) и трансгенные мыши). Первые позволили идентифицировать во вкусовой ткани ряд потенциально важных сигнальных белков, а вторые (поведенческие эксперименты и регистрации электрической активности афферентных вкусовых нервов) позволили продемонстрировать ключевую роль ряда из этих белков в восприятии вкусовых стимулов той или иной модальности. В настоящий момент общепризнано, что следующие сигнальные белки играют основополагающую роль в трансдукции вкусовых стимулов - от распознавания во вкусовой поре до передачи информации на нервное окончание:
1) Два семейства гептаспиральных вкусовых рецепторов, включая примерно рецепторов семейства T2R, распознающие горькие вещества, и три рецептора семейства T1R, формирующие один гетеродимерный рецептор сладкого (T1R2/T1R3) и один рецептор аминокислот (T1R1/T1R3).
2) Альфа субъединица G-белка гастдуцина ( -гастдуцин), фосфолипаза С 2, ионный канал TRPM5, knock-out каждого из которых приводит к снижению или даже полному подавлению чувствительности генетически модифицированных животных к горькому, сладкому и умами вкусам.
3) Канальные белки PKD2L1 и субъединицы эпителиального натриевого канала (ENaC). Генетический нокаут PKD2L1 приводит к снижению чувствительности животных к кислому, удаление альфа-субъединицы ENaC приводит к подавлению амилорид-зависимой компоненты физиологических ответов на соленые стимулы.
4) P2X2/P2X3-рецепторы, локализованные на нервных окончаниях, инервирующих вкусовую почку, knock-out которых приводил к полному исчезновению вкусовой чувствительности у мышей.
С использованием иммуногистохимии и гибридизации in situ был проанализирован профиль экспрессии вышеупомянутых белков в популяции клеток вкусовой почки, что позволило сделать довольно убедительные заключения о физиологических функциях вкусовых клеток различных подтипов, идентифицированных ранее на основе ультраструктурных критериев. Выяснилось, что вкусовые клетки типа II включают 3 субпопуляции, ответственные за рецепцию горького, сладкого и умами, соответственно; вкусовые клетки III типа отвечают за восприятие кислого, а клетки I типа выполняют функции глиальных клеток и соленого-чувствующих рецепторных. Таким образом, на сегодняшний день ясны основные функции для клеток каждого морфотипа, однако при всей значимости данных последних лет, полученных методами молекулярной биологии, иммуногистохимии и генной инженерии, существующие представления о процессах возбуждения вкусовых клеток носят в значительной степени гипотетический характер. Характерным в этом отношении является пример гастдуцина и ионного канала PKD2L1.
Ген -гастдуцина был первым геном, относящимся ко вкусовой системе, который был подвергнут генетическому нокауту (Wong et al, 1996). Оказалось, что гастдуцин-нуль мыши в поведенческих экспериментах демонстрируют сильно подавленную чувствительность к горькому и сладкому, но не к кислому и соленому. О том, что такие аномальные поведенческие реакции нокаутных животных обязаны своим происхождением именно изменениям в периферической вкусовой системе, свидетельствуют подавленные реакции вкусового нерва на аппликацию горьких и сладких стимулов в полости рта (Wong et al, 1996). Следует отметить, что -гастдуцин относится к Gi белкам и является близким гомологом -трансдуцина - ключевого G-белка каскада фототрансдукции. На основании этих фактов долгое время считалось, по аналогии с фототрансдукцией, что гастдуцин сопрягает молекулярные рецепторы вкусовых веществ с каскадом циклических нуклеотидов. Однако в 2003 году (Zhang et al) было продемонстрировано, что нокаут фосфолипазы С 2 также приводит к почти полной потере чувствительности у мышей к горькому и сладкому, что заставило пересмотреть роль -гастдуцина. Последний в покое ассоциирован с - и субъединицами в гетеротримерный G-белок, который при активации диссоциирует на гастдуцин и -комплекс. Между тем, для Gi-белков показано, что -комплекс, входящий в их состав, может активировать фосфолипазу С. На основании этого было предположено, что в случае нокаута -гастдуцина сохраняющиеся партнеры по гетеротримеру ( -комплекс) могут поддерживать в покое высокую активность фосфолипазы С 2, что нарушает работу каскада вкусовой трансдукции. После того, как развитие инструментальных методов позволило начать эффективные исследования молекулярных механизмов вкуса на клеточном уровне (Clapp et al, 2008), обнаружилось, что -гастдуцин, вероятно, представляет собой конститутивно активный G-белок, регулирующий уровень циклических нуклеотидов даже в покоящейся рецепторной клетке, что отражается на чувствительности сенсорных клеток к вкусовой стимуляции.
В случае PKD2L было показано, что генно-модифицированные мыши, у которых удалены клетки, содержащие PKD2L1, полностью теряли чувствительность к кислому (Huang et al, 2006). Этот факт был расценен как свидетельство ключевой роли канального белка PKD2L в трансдукции кислого, поскольку PKD2L является субъединицей протон-активируемого катионного канала. Используя другие генно-инженерные подходы, позже было установлено, что PKD2L не имеет такого принципиального значения для трансдукции кислого - полученные Хуангом и соавторами результаты связаны, скорее всего, с тем, что именно PKD2L-положительные клетки, относящиеся к типу III, являются кисло-чувствующими, и их разрушение естественно должно было подавить чувствительность животных к кислому.
Отметим также, что все больше накапливается фактов, которые свидетельствуют о том, что генетическое выключение одного гена может существенно влиять на активность экспрессии других генов. Таким образом, обсуждаемые в литературе механизмы вкусовой трансдукции необходимо проверять в физиологических экспериментах на уровне одиночных идентифицированных вкусовых клеток. Это целесообразно еще и потому, что именно при использовании такого подхода был достигнут заметный прогресс в области исследования сенсорных клеток других типов - фоторецепторных, обонятельных и механочувствительных клеток.
Совершенно неизученными остаются механизмы афферентной нейропередачи во вкусовых клетках типа II. Хотя эти клетки являются основными рецепторными для горького и сладкого вкуса, для них характерно отсутствие синаптических структур и других атрибутов классических химических синапсов, включая отсутствие пресинаптических белков комплекса SNARE и потенциал-зависимых Са2+ каналов. Еще одна проблема заключается в том, что вкусовые клетки типа II электрически возбудимы, но в отсутствии аксонов и классических Са2+-зависимых синапсов совершенно непонятна необходимость генерации ими потенциалов действия. Надо отметить, что физиологическая роль электрической возбудимости во вкусовых клетках других типов также не ясна. Во многом остаются неизученными механизмы электрогенеза во вкусовых клетках и природа их ионной проницаемости. Крайне мало известно и о функциональных свойствах клеток типов I-III, что делает актуальным анализ физиологических особенностей каждого из них, поскольку ранее немногочисленные физиологические исследования проводились преимущественно с использованием неидентифицированных клеток вкусовой почки. Это делает целесообразным всеобъемлющее физиологическое исследование популяции клеток вкусовой почки млекопитающих.
Цель исследования.
Провести комплексный физиологический анализ гетерогенной популяции клеток вкусовой почки млекопитающих (на примере мыши) из желобоватого, листовидного и грибовидного вкусовых сосочков, используя современные методы клеточной и молекулярной физиологии, и тем самым решить ряд проблем физиологии периферического органа, включая выяснение механизмов афферентной нейропередачи вкусовой информации, механизмов электрогенеза вкусовых клеток и роли электрической возбудимости в их физиологии.
Основные задачи исследования.
1. С использованием методов флуоресцентной микроскопии провести анализ гетерогенной популяции одиночных вкусовых клеток и охарактеризовать функционально клетки различных морфотипов. В частности, проанализировать агонист-зависимую Са2+ сигнализацию во вкусовых клетках и исследовать механизмы Са2+ сигнализации.
2. Установить корреляции между фармакологическими, а также обнаруженными нами ранее электрофизиологическими портретами индивидуальных вкусовых клеток и профилем экспрессии генов определенных сигнальных и маркерных белков. Целесообразность выявления таких корреляций диктуется необходимостью установления функциональных критериев для идентификации и последующего исследования индивидуальных вкусовых клеток, применимых в физиологических экспериментах.
3. Провести сравнительный анализ механизмов электровозбудимости идентифицированных вкусовых клеток и, в частности, очертить спектр и охарактеризовать биофизические свойства ионных каналов, вовлеченных в генерацию потенциала действия во вкусовых клетках типа II и типа III.
4. Изучить механизмы афферентной нейропередачи во вкусовых клетках идентифицированных морфотипов.
5. Отработать методы исследования рекомбинантных канальных белков для создания биосенсоров и для сравнительного анализа ионных каналов вкусовых клеток in situ и в экспрессионной системе с целью изучения их биофизических свойств.
Исследовать селективность, потенциалзависимость, термочувствительность, чувствительность к блокаторам некоторых из них.
6. Отработать методы мониторинга высвобождения сигнальных молекул из вкусовой почки и одиночной вкусовой клетки с использованием метода биосенсора - культивируемых клеток, эндогенно/экзогенно экспрессирующих молекулярные рецепторы к исследуемым агонистам.
Научная новизна работы.
На основе статистически репрезентативной серии экспериментов впервые предложены неинвазивные критерии для идентификации морфофункциональных типов вкусовых клеток. Впервые показано, что для клеток различных морфотипов, идентифицированных на основе специфических маркеров, характерен специфический спектр агонистов, способных стимулировать Са2+ сигнализацию. Ранее предложенные нами электрофизиологические критерии с учетом новых результатов по экспрессии специфических белков во вкусовых клетках, исследованных методом пэтч-кламп, позволили нам применить данные критерии для идентификации 3 известных морфофункциональных типов клеток вкусовой почки.
Впервые исследованы механизмы секреции АТФ вкусовыми клетками в ответ на вкусовую стимуляцию. Показано, что для нейропередачи используется АТФ митохондриального, а не гликолизного происхождения. Показано, что одиночные вкусовые клетки типа II высвобождают АТФ через потенциал-зависимые АТФпроницаемые ионные каналы в ответ на деполяризацию плазматической мембраны - ключевого явления вкусовой трансдукции, опосредованного активацией катионного канала TRPM5. На основании экспериментов с животными с нокаутированным геном Panx1, ингибиторного анализа, а также исследования свойств рекомбинантного Panxвпервые получены свидетельства, что канальный белок Panx1, который рассматривался в качестве основного претендента на роль АТФ-проницаемого канала, не вовлечен в секрецию АТФ во вкусовых клетках типа II. Эти данные, а также ингибиторный анализ АТФ-проницаемых каналов вкусовых клеток свидетельствуют о том, что такие каналы формируются белками щелевых контактов - коннексинами.
Впервые исследована роль потенциалов действия (ПД) в афферентной нейропередаче во вкусовых клетках и, в частности, показано, что ПД обеспечивают квантовый характер высвобождения афферентного нейромедиатора АТФ из клеток типа II.
Впервые разработана математическая модель потенциал-зависимой секреции АТФ при участии АТФ-проницаемых ионных каналов.
Исследована чувствительность вкусовых клеток к различным агонистам. Впервые показано, что в клетках III типа функционально активен гептаспиральный рецептор внеклеточного кальция (CaSR), обеспечивающий чувствительность этих клеток к аминокислотам (глутамату, фенилаланину и аргинину) и дивалентным катионам. Показано, что клетки I типа отвечают на нейроактивные вещества (АТФ, АДФ, УТФ, ацетилхолин и карбахол, глутамат в микромолярных концентрациях) и горькое вещество денатоний мобилизацией внутриклеточного кальция и стимуляцией Са2+активируемых Сl--каналов.
Научно-практическая ценность.
Полученные результаты позволили сформировать совершенно новое представление о механизмах афферентной нейропередачи и межклеточных коммуникаций во вкусовой почке. Значительно расширены существующие представления о механизмах электрогенеза и возбудимости клеток вкусовой почки. В частности, впервые рассмотрена и экспериментально обоснована новая физиологическая функция потенциалов действия - регуляция и дискретизация невезикулярного высвобождения нейромедиатора. Методические разработки, использовавшиеся в работе, особенно метод биосенсора для мониторинга первичных медиаторов, включая АТФ и серотонин, могут представлять интерес для исследования других клеточных систем. Данные, полученные при исследовании рекомбинантного паннексина 1, могут быть использованы при выяснении физиологической функции этого канала в различных системах.
ичный вклад автора.
Все результаты по функциональному анализу вкусовых клеток с использованием широкого спектра методов (пэтч-кламп; флуоресцентная микроскопия, мониторинг внутриклеточного кальция, загрузка флуоресцентных зондов и красителей; математическое моделирование) были получены лично Р.А. Романовым. Результаты экспериментов, выполненных при использовании сочетания биофизических методов с методами молекулярной биологии и культуры клеток, были получены совместно с О.А.
Рогачевской и М.Ф. Быстровой.
Апробация диссертации.
Материалы диссертации были представлены на X международном Съезде по биосенсорам (Шанхай, Китай, 2008г.); на международном симпозиуме по TRPканалам (Стокгольм, Швеция, 2009); на международной конференции Новые горизонты в кальциевой сигнализации (Пекин, Китай, 2010); на XXI съезде Европейской организации хеморецепторных исследований (Манчестер, Англия, 2011); на международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 2007, 2009, 2011гг.); на международной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем (Минск, Беларусь, 2008); на международной конференции Ионные каналы: структура и функции (С.Петербург, 2009); на 20-том и 21-ом съездах физиологического общества им. И.П.
Павлова (2008, 2010); на V съезде Украинского общества нейронаук (Киев, 2011).
Публикации.
Основные результаты диссертации представлены в 42 печатных работах, в числе которых 15 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в книге, включенной в систему цитирования Web of Science, 5 статей в сборниках.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 213 страницах с использованием рисунков, 3 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 299 ссылок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клеточный материал. Основные эксперименты проводились на одиночных вкусовых клетках, изолированных из желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков языка мыши дикого типа. В ряде экспериментов использовались линии генетически модифицированных мышей с нокаутированным геном гастдуцина (предоставлены Р.Ф.Маргольским), с нокаутированным геном паннексина(предоставлены В.И.Шестопаловым).
Электрофизиология. Электрическая активность вкусовых клеток регистрировалась методом patch clamp (voltage-clamp, current clamp) в конфигурациях whole-cell и perforated patch clamp, cell-attached и inside out с помощью усилителя Axopatch 200 B (Axon Instruments), ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1322A и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все Axon Instruments, США).
Эксперименты проводились при температуре 23-25 С. Система перфузии обеспечивала смену экстраклеточного раствора со скоростью 0,1-1 мл/с. При регистрациии в конфигурации whole-cell клетки диализовались раствором в составе (мМ): 140 KCl/CsCl, 2 MgATP, 0.5 EGTA или 10 BAPTA, 10 HEPESЦKOH. При использовании конфигурации perforated patch clamp регистрирующий электрод содержал (мМ): 140 KCl/CsCl, 1 MgCl2, 0.5 EGTA, 10 HEPESЦKOH (CsOH), и 4мкг/мл амфотерицина Б. Базовый внеклеточный раствор содержал (мМ): 140 NaCl, CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH. Когда было нужно, раствор модифицировался так что ионы Na+, K+ и/или Cl- эквимолярно замещались на другие катионы и/или анионы. Для всех растворов pH 7,4.
Фотометрия. Для мониторинга внутриклеточного кальция в клетках использовали проникающие флуоресцентные зонды Fluo-4АМ и Fura-2AM.
Изменение концентрации цитозольного кальция визуализировали при помощи EMCCD-камеры Andor Ixon (Andor Technology) с использованием микроскопа Axioscope-2 (Zeiss). Флуоресценция возбуждалась при помощи программируемого осветителя на сверх-ярких излучающих полупроводниковых диодах с волоконнооптическим выходом (Хохлов и др., 2007). Эмиссионное излучение фильтровалось интерференционными узкополосными фильтрами (Chroma) и последовательные флуоресцентные изображения регистрировались при помощи программы ImagingWorkBench 6.0 (INDEC Biosystems).
Биосенсоры. С целью создания клеточных биосенсоров было протестировано (совместно с Рогачевской О.А.) 8 эукариотических клеточных линий (COS-1, HEK293, CHO, нейробластома SK-N-SH, нейробластома IMR-32, глиобластома T98G, глиобластома E PNT-5 и глиома С6), а также клетки CHO, трансфицированные одновременно P2X2/P2X3-рецепторамми, на чувствительность к ряду нейромедиаторов, включая АТФ, серотонин, ацетилхолин, глутамат, норадреналин, ГАМК. Полученные данные показали, что клетки линии COS-1 с эндогенными P2Y-рецепторами и CHO c экзогенными P2X2/P2X3-рецепторамми могут выступать в качестве высокочувствительных и специфичных сенсоров для АТФ, а клетки линии глиомы С6 - для серотонина. Поэтому клетки линии COS-1 и CHO, трансфицированные P2X2/P2X3рецепторамми, использовались для изучения механизма высвобождения АТФ, а клетки линии глиома С6 - для анализа высвобождения серотонина.
Фотолиз химических групп (uncaging). Осуществлялся за счет кратковременного (0.1-3с) облучения ультрафиолетом ( =355нм) при помощи лазера LCS-DTL374QT (УLaser-exportФ, РФ) клеток в исследовательской камере через объектив микроскопа. Для этого клетки предварительно загружались кальций-хелатирующим агентом NP-EGTA AM (лInvitrogen, США). Для контроля изменений внутриклеточного уровня кальция клетки также загружали кальциевым зондом Fluo-4 AM; кальциевые сигналы визуализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Axioscope-2.
Гетерологическая система. При работе с рекомбинантными ионными каналами 1,6 мкг плазмиды pIRES2-EGFP с интересующим нас геном (trpm5, p2x2/p2x3, panx1) и 4 мкл липофектамина (лGibco, США) добавляли к клеткам HEK-293 и нейробластоме (в концентрации 3-5103 клеток на 35 мм чашку Петри). Для трансфекции клеток линии CHO использовался трасфекционный агент Унифектин (Унифект, Россия). Регистрации проводились через 24-72 ч после трансфекции. Качество трансфекции предварительно оценивалось по интенсивности свечения GFP, либо по уровню кальциевых ответов на агонист (для P2X2/P2X3). Генно-инженерные конструкции были получены и предоставлены М.Ф. Быстровой. Клетки CHO, трансфицированные P2X2/P2X3 рецепторами, оказались удобным клеточным АТФ-сеносором и наряду с клетками линии COS-1 применялись для исследования выброса АТФ из вкусовых клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация вкусовых клеток различных морфофункциональных типов с использованием электрофизиологических критериев. Ранее методом patch clamp мы проанализировали интегральные токи более чем в 1000 веретенообразных вкусовых клетках мыши и установили, что в псевдофизиологических условиях регистрации (n=564) (Рис.1), как и в условиях диализа 140 мМ CsCl (Рис.3A-C,d) в ответ на импульсную стимуляцию для вкусовых клеток характерны 3 различных набора потенциал-зависимых (ПЗ) клеточных токов (Романов Р.А., канд. дисс., Пущино, 2007).
Кроме того, электрофизиологический анализ клеток из трансгенных мышей, у которых -гастдуцин-положительные клетки экспрессировали зеленый флуоресцентный белок (GFP) свидетельствовал, что гастдуцин-положительные клетки являлись субпопуляцией одной из 3 обнаруженных нами групп вкусовых клеток, идентифицированных на основе электрофизиологических критериев (Романов Р.А., канд. дисс., Пущино, 2007).
В рамках данной работы были выполнены эксперименты, в которых одиночные вкусовые клетки анализировались с использованием метода patch clamp, далее аккуратно засасывались в кончик регистрирующей микропипетки и предоставлялись для молекулярно-биологических экспериментов, в которых М.Ф. Быстровой анализировались транскрипты в полученных таким образом препаратах, содержащих мРНК одиночных вкусовых клеток (single cell ОТ-ПЦР). Совокупность полученных данных, а также некоторые специфические морфологические особенности регистрируемых клеток, позволили нам сформулировать однозначные электрофизиологические критерии для идентификации морфофункциональных типов клеток вкусовой почки (Рис.1). Так, клетки типа I, экспрессирующие NTPD-азу2 и характеризующиеся микровиллярным аппаратом с множеством микровилл (различимого при использовании 63x объектива), демонстрировали ПЗ К+-токи и отсутствие ПЗ Na+-токов. Клетки типа II, экспрессирующие -гастдуцин, T1R3-рецептор, TRPM5 и фосфолипазу С 2, характеризовались наличием ПЗ Na+токов, относительно небольшой фракцией ПЗ К+-токов и заметных по амплитуде выходящих токов, транспортируемых неселективными ионными каналами. Для клеток типа III были характерны ПЗ Na+-каналы, выходящие ПЗ К+-токи задержанного выпрямления, а также ПЗ Ca2+-каналы и токи, активирующиеся длительной гиперполяризацией (HCNтоки). В этих клетках обнаружены транскрипты SNAP25 и PKD2L1. В множестве экспериментов хорошо определялась единственная микровилла - характерный морфологический критерий для идентификации клеток III типа.
Рисунок 1. На основании ионных токов, регистрируемых от вкусовых клеток в ответ на ряд последовательных, ступенчатых поляризаций от -1мВ до 50 мВ, можно идентифцировать, к какому морфофункциональному типу относится исследуемая клетка. В псевдофизиологических условиях регистрации для клеток типа I характерны лишь ПЗ выходящие токи K+ природы; для клеток типа II - входящий, быстро инактивирующийся ток через ПЗ Na+-каналы, относительно медленно активирующийся ток через неселективные каналы и значительные по амплитуде хвостовые токи, генерирующиеся при реполяризации клетки до Vh=-70 мВ; для клеток типа III характерны ПЗ Na+-каналы и K+-каналы задержанного выпрямления. Верификацией предложенной электрофизиологической идентификации служила корреляция экспрессии указанных на рисунке маркерных белков с электрофизиологическими характеристиками клеток.
Неинвазивная идентификация вкусовых клеток. Полученные выше критерии весьма удобны для идентификации вкусовых клеток 3 известных типов, однако, клетки, тестируемые методом patch clamp, оказываются менее чувствительными к агонистам метаботропных рецепторов, чем в случае применения неинвазивного подхода, в частности, связанного с применением кальциевого имиджинга. Поэтому мы попытались найти корреляции между электрофизиологическими характеристиками и способностью клеток задействовать кальциевую сигнализацию на тот или иной химический стимул. Выяснилось, что поскольку Ca2+-каналы присутствуют лишь в III типе и не функциональны в других, деполяризация вызывает хорошо-выраженные кальциевые ответы лишь в клетках III типа, тогда как наблюдаемый ПЗ кальциевый вход в клетках I и II типа очень мал или полностью отсутствует (Рис.2).
Рисунок 2. Деполяризация вкусовых клеток сопряжена с повышением цитозольного кальция только в клетках III типа за счет активации ПЗ кальциевых каналов. A, B - репрезентативные одновременные записи ионных токов и флуоресценции клеток III типа, загруженных Fluo-(n=24). Деполяризация вкусовых клеток этого типа до -мВ на 100 мс вызывает активацию ПЗ Ca2+-тока (A, пунктир), который приводит к генерации кальциевого пика (B); С - репрезентативная запись кальциевого сигнала в клетках I типа в ответ на деполяризацию (n=11); D и E - репрезентативные записи ионных токов (средняя панель в D) и флуоресценции Fluo4 (D и E) в клетках II типа (n = 21). В отличие от иономицина, 2-с деполяризация не влияла на уровень свободного внутриклеточного кальция в 17 из 21 клетки (D). В 4 случаях деполяризация вызывала небольшое увеличение во флуоресценции клеток II типа (E).
Поэтому, клетки III типа могут быть неинвазивно идентифицированы по резкому увеличению цитозольного кальция в ответ на увеличение концентрации экстраклеточного калия до 50 мМ, приводящего к деполяризации клеток (Рис.3C,D).
Рисунок 3. Ответы вкусовых клеток различных типов на KCl и АТФ. (А-С) - последовательные изображения 3 клеток, загруженных Fluo4, полученные: (a) в контрольных условиях (b) после аппликации 50 мМ KCl и (с) после аппликации 10 мкМ АТФ. A-C,d - электрофизиологические характеристики клеток из А-С в условиях Cs+-диализа. D, E Цответы вкусовых клеток идентифицированных типов на 50 мМ KCl и на 10 мкМ АТФ, соответственно; вставка на правой панели в Е - усредненные ответы на 10 мкМ АТФ только АТФ-чувствительных клеток.
С другой стороны выяснилось, что из 49 клеток, электрофизиологически идентифицированных как тип I, 40 клеток (82%) генерировали ( F/F0>1) кальциевые ответы на 10 мкМ АТФ (~EC70 для клеток I типа) со средними ответами F/F0=1.180.15 (Рис. 3A,E). 9 клеток типа I и подавляющее большинство клеток других типов были не способны отвечать на АТФ, либо отвечали слабо (Рис.3Е, правая панель). Таким образом, 50 мМ KCl и 10 мкМ АТФ позволяют идентифицровать одиночные вкусовые клетки I и III типов, а также предварительно очертить популяцию клеток II типа в препарате.
Для идентификации клеток типа II, а также субпопуляции функционально активных горько-чувствующих клеток данного типа была разработана оригинальная методика, основанная на способности данных клеток поглощать внеклеточные флуоресцентные красители при деполяризации (Рис.9). Данный подход представлен на Рис.10 с соответствующими комментариями в тексте.
Функциональный анализ клеток I типа. Известно, что тип I наиболее представлен в составе вкусовой почки, и по данным морфологических исследований этих клеток в составе вкусовой почки более 40% (Finger, 2005). Помимо соленорецепторной функции эти клетки наделяют глиальными функциями в связи с некоторыми особенностями: 1) наличием крыловидных отростков, изолирующих клетки других типов вместе с нервными окончаниями; 2) экто-АТФ-апиразы NTPD-азы2, гидролизующей экстраклеточный АТФ, высвободившийся в межклеточное пространство в акте афферентной нейропередачи; 3) специфического для глии глутамат/аспартат транспортера (GLAST), утилизующего внеклеточный глутамат, который, по-видимому, выполняет функцию эфферентного нейромодулятора (Vandenbeuch et al, 2010). В экспериментах на одиночных клетках I типа мы показали, что АТФ и глутамат, а также ацетилхолин и ряд агонистов P2Y рецепторов вызывают мобилизацию внутриклеточного Ca2+ с последующей стимуляцией Са2+активируемых Сl--каналов (Рис.4). Предполагается, что данные сигнальные пути связаны с реализацией обратных связей, в частности при афферентной нейропередаче.
Учитывая, что АТФ выполняет функцию вкусового афферентного нейромедиатора, мы сосредоточили внимание на исследовании пуринергической сигнализации в клетках I типа. Выяснилось, что эффективными агонистами являлись АТФ, УТФ, АДФ, а также Bz-АТФ в субмиллимолярных концентрациях (Рис.4A-E), тогда как агонист P2X-рецепторов, -Methiylene-D-АТФ не вызывал ответов. Анализ данных позволил заключить об участии в клеточных ответах P2Y рецепторов P2Y2, P2Y1 и, предположительно P2Y4 изоформ, действие которых опосредовано активацией фосфоинозитидного каскада, выходом кальция из депо и его входом через SOC-каналы, что приводит к активации кальций-активируемого хлорного канала, чувствительного к блокатору анионных каналов 9-AC.
Рисунок 4. (A-E) - АТФ, УТФ, АДФ и BZ-АТФ индуцируют входящий анионный ток в клетках I типа, сопряженный с активацией P2Y-рецепторов и фосфоинозитидного каскада. A - токовые, ответы клетки типа I на аппликацию ATФ и их наложение друг на друга. B - АТФ и УТФ в насыщающих концентрациях вызывают одинаковые по амплитуде ответы; C - АДФ вызывает меньший ответ, чем АТФ; В Ц - в некоторых клетках АТФ и АДФ активируют ток с примерно равной эффективностью; E - Bz-ATФ активирует входящий ток в клетках I типа, хотя ответ на смесь Bz-АТФ и АТФ меньше по амплитуде, чем только на АТФ, что свидетельствует о частичном антагонизме Bz-АТФ; F - генерация входящего тока и повышение концентрации свободного Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток типа I в ответ на аппликацию карбахола; G - аппликация 50 мкМ глутамата, как и АТФ, вызывает Са2+ответы и активацию входящего тока во вкусовых клетках типа I.
Анализ вкусовых клеток на чувствительность к горькому выявил особенность, ранее не отмеченную в литературе: горькое вещество денатоний в миллимолярных концентрациях вызывало кальциевые ответы преимущественно в клетках I типа, где стимулировало активацию фосфоинозитидного каскада, мобилизацию цитозольного кальция и активацию Cl--канала (Рис.5). Данные ответы наблюдались и в клетках I типа из животных с нокаутированным -гастдуцином, что исключало возможность того, что данные ответы являются вторично сгенерированными, так как клетки II типа в этих животных десенситизированы и вряд ли могли вызвать последующую реакцию у клеток типа I, например, за счет высвобождения АТФ. Роль данной чувствительности не ясна, однако сам факт говорит о невозможности использования денатония в качестве вкусового стимула для исследования трансдукционных механизмов на неидентифицированных клетках, что является достаточно распространенной исследовательской практикой.
Рисунок 5. Ответы популяции клеток типа I на денатоний. А - репрезентативные ответы клеточной популяции на 10 мкМ АТФ и смесь горьких веществ, включающую 0,1 мМ циклогексимида, 1 мМ денатония, 1 мМ октаацетата сахарозы. Из 44 одновременно регистрируемых клеток 12 оказались чувствительны к АТФ и 9 из них отвечали на горькую смесь веществ; B - в репрезентативной популяции из 36 клеток, выделенных из желобоватого сосочка гастуцин-/- мышей, 7 клеток отвечали на 10 мкМ АТФ (слева). 5 из них также отвечали на смесь горьких веществ (правая панель). АТФ-нечувствительные клетки з данного препарата не реагировали на стимуляцию горькими веществами. С - последовательные ответы клеток I типа на смесь горьких веществ в контроле (слева) и после 5 минутной предъинкубации с 8 мкМ U73122 (справа). Клетки I типа идентифицировались по значительным ответам на 10 мкМ АТФ перед стимуляцией горькими веществами; D - кадры с клеткой типа I, прокрашенной Fluo-4, в проходящем свете (a), в контроле (b), после аппликации 10 мкМ АТФ (с) и 1 мМ денатония (d); E - последовательные кальциевые ответы клетки, изображенной в A; F - нормированная кривая доза-ответ для денатония, аппроксимированная при помощи уравнения Хилла с h=1,3 и концентрацией полуэффекта 2,6 мМ. G - одновременная регистрация от 4 клеток I типа, стимулированных АТФ, денатонием и смесью сладких веществ. Клетки были частью популяции из 21клетки, включающей 6 АТФ-отвечающих, 4 из которых, представленных на рисунке, были также чувствительны к смеси горьких веществ.
Функциональный анализ клеток II типа. Клетки II типа представляют наибольший интерес для исследователей, поскольку включают в себя 3 субпопуляции - горько-чувствующие, сладко-чувствующие и клетки, рецептирующие аминокислоты (вкус лумами). Согласно данным по генетическому нокауту TRPM5 и свойствам рекомбинантного канала гипотетическая схема трансдукции для вкусовых стимулов категорий лгорькое, лсладкое и лумами включает в себя активацию TRPM5 и клеточную деполяризацию как абсолютно необходимый этап, однако исследование физиологической активности TRPM5 во вкусовых клетках фактически отсутствовало, поскольку долгое время не было известно ни одного специфического блокатора TRPM5. Ранее нам удалось зарегистрировать иономицин-стимулируемый катионный ток с выраженной термочувствительностью и выходящим выпрямлением в клетках, которые по электрофизиологическим характеристикам могут быть отнесены к типу II.
На основании катионной селективности и высокой термочувствительности исследуемых каналов, а также факта экспрессии гена TRPM5 во вкусовых клетках (Perez et al, 2002), иономицин-стимулируемые ионные каналы вкусовых клеток были отнесены к TRPM5 (Романов Р.А., канд. дисс.).
Данная работа подтверждает наличие функционально активных ионных каналов TRPM5 в клетках типа II. Так, ток, активируемый увеличением цитозольного кальция вследствие добавления иономицина, ингибировался недавно обнаруженным блокатором TRPM5-каналов оксидом трифенилфосфина (Рис.6А), который в наших экспериментах эффективно ингибировал рекомбинантный TRPM5, клонированный из вкусовых клеток, в аналогичных концентрациях.
Поскольку кальциевый ионофор иономицин обладает рядом артефактных свойств, связанных, например, с активацией некоторых эффекторных молекул, в наших экспериментах мы использовали альтернативный инструментарий для увеличения концентрации цитозольного кальция - фотолитическое высвобождение кальция в клетках (uncaging) (Рис.6С), которое вызывало активацию аналогичного тока, ингибируемого оксидом трифенилфосфина. Регистрируемые каналы были неселективны по отношению к Na+ и Cs+, но непроницаемы для NMDG+ (Рис.6В); имели вольтамперную характеристику выходящего выпрямления и высокую термочувствительность (Q10 = 6.7 0.5) (Рис.6В). Существенно, что TRPM5 были специфичными для клеток II типа: повышение внутриклеточного уровня кальция при помощи фотолиза вызывало появление хлорного тока в клетках I типа и не оказывало влияния на базовый ток в клетках III типа (Рис.6E,F).
Трудно объяснимым фактом было отсутствие в клетках II типа классических синаптических структур, то есть не было ясно, каким образом клетки II типа передают вкусовую информацию на вкусовые нервные окончания. В связи с этим, мы исследовали секрецию АТФ вкусовыми почками и одиночными идентифицированными вкусовыми клетками с использованием метода клеточных АТФ-биосенсоров - клеток линий COS1 (Рис.7) и P2X2/P2X3-трансфицированных клеток линии CHO).
Рисунок 6. Активность ионных каналов TRPM5 во вкусовых клетках II типа. А - иономицин-стимулируемая активация TRPM5 и его блокирование 100 мкМ оксидом трифенилфосфина (ТФФО) во вкусовых клетках типа II; B, слева - TRPM5-токи в условиях 140 мМ Na+ во внеклеточном растворе и при его замене 140 мМ NMDG+, справа - температурная зависимость активности TRPM5 каналов во вкусовых клетках II типа; C - активация TRPM5 с помощью фотовысвобождения (uncaging) кальция во вкусовых клетках из кальциевого хелатора NP-EGTA; D - вольт-амперные характеристики интегрального тока в клетках II типа дo (1) и после (2) активации в (С). E,F Цотсутствие активации ионных каналов TRPM5 под действием кальция во вкусовых клетках I и III типов (серые линии - изменение кальция, черные - ток). E - активация входящего анионного ТФФО-нечувствительного тока в клетках I типа с помощью фотовысвобождения кальция; F - вход кальция в клетки III типа через потенциалзависимые кальциевые каналы в условиях деполяризации (1) и отсутствие влияния фотолитического высвобождения кальция (2) в клетках III типа на базовый ток в этих клетках.
Согласно ранее проведенным нами экспериментам на электрофизиологически идентифицированных клетках, когда высвобождение АТФ из вкусовых клеток электрически стимулировалось с использованием метода patch clamp, лишь клетки типа II высвобождают АТФ в ответ на деполяризацию до потенциалов 0-50 мВ. Как оказалось, выброс АТФ клетками типа II не зависел от кальция, что свидетельствовало против классического Са2+-зависимого везикулярного механизма - диализ вкусовых клеток быстрым кальциевым хелатором BAPTA (10мМ) и снижение концентрации свободного Ca2+ в экстраклеточной среде до 100 нМ не вызывало подавления кальциевых ответов COS-1 клеток в ответ на стимуляцию вкусовых клеток II типа. В то же время АТФ-высвобождение строго зависело от потенциала с порогом около -10 мВ, что служило свидетельством в пользу высвобождения АТФ через ионные каналы с заметной нелинейной вольт-амперной характеристикой (Романов Р.А., канд. дисс., Пущино, 2007).
Дополнительным подтверждением против везикулярного высвобождения АТФ вкусовыми клетками типа II является то, что деполяризация этих вкусовых клеток до потенциалов, при которых наблюдается выброс АТФ, в большинстве случаев не сопровождается повышением внутриклеточного уровня кальция (Рис.2D,E).
Высвобождение АТФ, даже более выраженное, наблюдалось нами в экспериментах, в которых мы не использовали метод patch clamp для электрической стимуляции, так что вкусовые клетки не подвергались процедуре образования гигаомного контакта, связанной с частичным разрушением цитоскелета и клеточной декомпартментализации. В данных опытах, где вкусовые почки (n=34), а также вкусовые клетки типа II (n=28) стимулировались деполяризующим раствором, содержащим 50-100 мМ KCl, практически во всех случаях наблюдался выброс АТФ в межклеточное пространство, детектируемый клетками АТФ-сенсорами (Рис. 7). При регистрации данного явления от вкусовых почек мы использовали также их вкусовую стимуляцию - горьким веществом (0,1 мМ циклогексимид) и смесью сладких (1 мМ аспартам, 0,1 мМ неотам, 0,мМ SC45647). Из 18 протестированных почек 5 ответили на вкусовые стимулы высвобождением вкусового афферентного нейромедиатора (Рис. 7). Отметим, что ни раствор с повышенной концентрацией KCl, ни вкусовые вещества не вызывали сами по себе реакции в тестируемых клетках-сенсорах.
Рисунок 7. Высвобождение АТФ из вкусовой почки в ответ на деполяризующий и вкусовой стимулы. Слева вверху - фотография в проходящем свете вкусовой почки и рядом расположенных 2 клеток COS-1; нижний ряд - псевдоцветные изображения, полученные при регистрации флуоресценции кальциевого зонда Fluoот клеток COS-1. Справа вверху - запись изменения кальция при стимуляции в верхней клетке АТФсенсоре, представленной на фотографиях. Цифры отражают время, когда были получены кадры нижнего ряда.
В случае если вкусовые клетки действительно используют неселективные каналы с крупной порой для высвобождения АТФ в ответ на деполяризующий и вкусовой стимулы, то такие каналы должны быть проницаемы не только для АТФ, молекулярная масса которого ~600Да, но и для других более мелких молекул. Так, например, для каналов, формируемых коннексинами, показана проницаемость для молекул весом до 1 кДа, включая АТФ, сАМР, IP3 и ряд флуоресцентных трейсеров.
Поэтому свидетельством в пользу канальной гипотезы высвобождения АТФ из вкусовых клеток был бы вход в клетки крупных отрицательно заряженных флуоресцентных молекул, находящихся в наружном растворе. Действительно, красители Lucifer Yellow, флуоресцеин и карбоксифлуоресцеин аккумулировались во вкусовых клетках II типа при их деполяризации, что выражалось в появлении яркого свечения клеток данного типа во флуоресцентном микроскопе (Рис.8 для LY). Зависимость от потенциала выброса АТФ и входа в клетки флуоресцентных красителей, а также факт, что деполяризация необходима для адекватной вкусовой трансдукции, но сама по себе не приводит к увеличению цитозольного кальция в отличие от клеток III типа (Рис.2), подтверждают гипотезу о том, что АТФ во вкусовых клетках высвобождался через специфические ПЗ ионные каналы.
Способность клеток типа II засасывать из наружной среды отрицательно заряженные флуоресцентные красители при активации потенциал-зависимого АТФпроницаемого ионного канала была использована при разработке неинвазивной идентификации клеток типа II. Для этого покровное стекло с иммобилизоваными клетками на 30 с помещалось в раствор c повышенной концентрацией KCl (деполяризующий раствор), содержащий карбоксифлуоресцеин, а затем после отмыва клетки исследовались во флуоресцентном микроскопе. При возбуждении синим светом (4нм) в препарате наблюдались зеленые клетки, которые можно отнести к типу II (Рис.9B-F).
Рисунок 8. Аккумуляция Lucifer Yellow (LY) вкусовыми клетками. A - протокол загрузки LY. Вверху: потенциал вкусовой клетки во времени;
после деполяризации до 50 мВ клетки реполяризовались в 2 стадии (верхняя вставка) для уменьшения выхода отрицательно заряженного LY через деактивирующиеся каналы.
Внизу - концентрация LY в камере;
B - Клетка типа II в проходящем свете перед инкубацией с LY (i), в эпифлуоресцентном свете после инкубации с LY при поддерживаемом потенциале Ц70 мВ (ii), и после инкубации с LY при серийной деполяризации. С - интегральные токи, записанные от клетки, представленной в B до и после загрузки LY. D - вкусовые клетки типов III (i) и I (ii) не аккумулировали LY в ответ на серийную деполяризацию (темные вставки - фото во флуоресцентном свете).
Для контроля на мертвые клетки покровное стекло с данными вкусовыми клетками предварительно помещали в стандартный внеклеточный раствор, содержащий бромид этидия, так что некротические клетки идентифицировались по ярко красным ядрам, а, предположительно, апоптотические, с активизированными неселективными каналами можно идентифицировать по слабому красному свечению во всем объеме клетки. При использовании эмиссионного фильтра, пропускающего зеленый и красный цвета, неповрежденные, физиологически интактные клетки типа II идентифицировались по зеленому цвету без примеси красного. Для идентификации популяции горько-чувствующих клеток типа II раствор c карбоксифлуоресцеином содержал не повышенную концентрацию калия, а горькое вещество циклогексимид (Рис. 9H).
Идентифицированные таким образом клетки могут быть использованы в качестве мишени в дальнейшем исследовании вкусо-зависимых кальциевых сигналов при помощи кальциевого зонда Fura-2, спектрально отличающегося от карбоксифлуоресцеина (Рис.9G). Мы обнаружили также, что помимо карбоксифлуоресцеина и Lucifer Yelow могут использоваться флуоресцентные зонды, в частности, Mag-fura-2.
Рисунок 9. Неинвазивный подход, позволяющий идентифицировать вкусовые клетки типа II. A,G - фотография в проходящем свете вкусовых клеток из грибовидных (A) и желобоватого (G) сосочков. B-F - флуоресцентные изображения клеток из грибовидных (B), листовидных (C,D) и желобоватых (E,F,H) сосочков.
В (B-F) клетки cтимулировали деполяризующим раствором, содержащим карбоксифлуоресцеин (зеленая флуоресценция без примеси красной). В качестве контроля на неспецифическое окрашивание, характерное для поврежденных и мертвых клеток использовали стандартный внеклеточный раствор, содержащий бромид этидия (красная флуоресценция). В (G-H) для идентификации горько-чувствующих клеток типа II стандартный внеклеточный раствор с карбоксифлуоресцеином содержал 0.1 мМ циклогексимид. I - псевдоцветное изображение клеток из (G,H) полученное при регистрации флуоресценции кальциевого зонда Fura-2 (ex=380 нМ).
Итак, вкусовые клетки типа II при деполяризации с одной стороны высвобождают АТФ в межклеточное пространство, а с другой - засасывают непроникающие флуоресцентные красители из наружного раствора. В клетках типа II функционируют относительно медленно активирующиеся ионные каналы, природа которых не была установлена. С учетом того, что для этих каналов характерна зависимость от потенциала (в-частности, порог активации), сходная с таковой для высвобождения АТФ, вполне можно предположить, что ПЗ выходящие токи в клетках II типа могут быть ответственны за транспортировку молекул АТФ в экстраклеточное пространство, как и за вход флуоресцентных трейсеров. Согласно данному предположению, регистрируемые в клетках типа II ионные каналы должны быть проницаемы для крупных молекул (включая АТФ) и характеризоваться высокой проводимостью одиночного канала.
Данные, представленные на Рис.10А и В, в которых анализировалась селективность каналов путем замены наружного аниона Cl- (Mw=35,5г/моль) на глюконат (Mw=195г/моль), а также внутриклеточного Cs+ (Mw=133г/моль) на NMDG+ (Mw=195г/моль) было бы сложно объяснить, если не допустить, что ток во вкусовых клетках типа II транспортируется неселективными ионными каналами, которые проницаемы для катионов и анионов, включая Cs+, Na+, Cl-, NMDG+ и глюконат.
Рисунок 10. Оценка селективности и проводимости медленно активирующихся каналов клеток типа II. A - замена наружного Cl- () на глюконат- () в условиях диализа клеток CsCl (левая панель) и NMDG-Cl (правая панель) не приводила к исчезновению выходящей компоненты тока. При этом средние амплитуды ПЗ выходящих токов при Vc=50 мВ сопоставимы в условиях 140 мМ CsClin и 140 мМ NMDGClin (B); С - экспериментальная зависимость дисперсии тока () от средней величины интегрального тока, оцененная по хвостовым токам, генерируемым в ответ на реполяризацию клеточной мембраны от 30 мВ до -70 мВ. Непрерывная кривая соответствует D iI I N при N = 151 и i = 10.8 пА.
Используя нестационарный флуктуационный анализ (Sigworth, 1980) хвостовых токов, регистрируемых в Csin/Naout градиенте, мы оценили проводимость одиночного канала i=178 21 пСм (Рис.9С). Более того, мы продемонстрировали в прямом эксперименте проницаемость ПЗ каналов клеток типа II для АТФ. Так, в симметричных условиях регистрации, когда внутрипипеточный и наружный растворы включали в состав только магниевую соль АТФ, оттитрованную до нейтрального значения pH (7.2) при помощи водного раствора MgO, а затем отфильтрованную от нерастворенных частичек MgO, мы наблюдали соответствующие медленно активирующиеся токи при деполяризации, а при реполяризации - хвостовые токи, характеризующиеся по сравнению с нескомпенсированными емкостными явлениями более медленной кинетикой (Рис.11А). Поскольку среди основных носителей заряда в растворе присутствовали лишь Mg2+ в качестве катиона и MgАТФ2- в качестве аниона, очевидно, что Mg2+ и/или MgАТФ2 транспортируют регистрируемые токи. Когда состав наружного раствора менялся на таковой, но разбавленный водой в 4 раза, мы наблюдали снижение амплитуды и смещение потенциала реверсии в более положительную область потенциалов (Рис.11В). Согласно известному уравнению Голдмана следовало, что данные каналы проницаемы для MgАТФ2- и Mg2+, при этом использование разных методов обработки результатов давало оценку PATФ/PMg в диапазоне от 1.8 до 5.
Рисунок 11. ПЗ токи в клетках II типа, диализованных и перфузируемых MgATФ+Mg(OH)2. A - репрезентативные интегральные токи (n=4), записанные от одной клеткив растворе с 50 мМ MgATФ+50 мМ Mg(OH)2 (вверху) и 12,5 мМ MgATФ + 12,мМ Mg(OH)2 (внизу). В пипетке - 50 мМ MgATФ+50 мМ Mg(OH). При образовании whole cell в наружном растворе было 140 мМ NaCl, который затем заменялся на 50 мМ MgATФ+50 мМ Mg(OH)2. B - I-V характеристики токов в (А). Изза краткого времени жизни данного препарата, последовательное сопротивление и клеточная емкость не компенсировались.
Следующей нашей задачей было выяснить молекулярную основу АТФпроницаемых каналов, ответственных за афферентную нейропередачу в клетках типа II. Среди данных каналов - некоторые анионные каналы, а также коннексиновые и паннексинновые полупоры. Отсутствие значительных эффектов блокаторов анионных токов исключило возможность участия анионных каналов в выбросе АТФ (Рис.
12B), делая наиболее вероятными кандидатами полупоры, сформированные множеством различных коннексинов (Cx) или паннексином1 (Panx1).
Для того, чтобы определить наиболее вероятного претендента из оставшихся, мы охарактеризовали фармакологический профиль АТФ-проницаемых каналов вкусовых клеток, протестировав ряд веществ, ингибирующих активность различных полупор, включая лантаноиды, хинин, октанол, а также специфические пептиды GAP27 к коннексину 32, 43GAP26 к коннексину 43, 10Px1 к паннексину1. 100 мкМ La3+, Gd3+ и хинин не действовали на выходящие токи клеток типа II (Рис.12С), 1 мМ хинин оказывал слабо выраженный блокирующий эффект на ПЗ ток этих клеток. Октанол (3мМ), неспецифичный ингибитор коннексинов, и GAP26 сильно подавляли выходящий ток (Рис.12A,D,E), тогда как 500 мкМ 32GAP27, 300 мкМ 10Px1, 20 мкМ карбеноксолон фактически не влияли на выходящие токи во вкусовых клетках (Рис.
12A,D,E, 13C).
Рисунок 12. Действие блокаторов на ПЗ выходящие токи во вкусовых клетках II типа. А - репрезентативные записи ПЗ токов в контроле (верхние панели) и после 10 мин инкубации с Cx-специфическим пептидом GAP26 (0,5 мМ, n=21), 3 мМ октанолом (n=11), Panxспецифическим пептидом 10Px1 (300 мкМ, n=9) и 20 мкМ карбеноксолоном. Записи зарегистрированы от 4 разных клеток. B - действие блокаторов Cl- каналов на ПЗ АТФпроницаемые токи клеток типа II. С,D ЦI-V характеристики интегральных токов клеток типа II в контроле и в присутствии ингибиторов полупор на интегральные токи. Для пептида GAP26 - инкубация 10 мин, для 10 мкМ КБХ - 30 мин. D - ПЗ токи, регистрируемые при 100 мс деполяризации до 20 мВ в контрольных клетках (n=32) и клетках, пре-инкубированых в течение 30 мин с 10Px1 (300 мкМ, n=7) и 43GAP26 (300 мкМ, n=12).
GAP26 подавлял выход АТФ в той же временной шкале, что и ПЗ ток (Рис.13А,В). В то же время, присутствие 300 мкМ 10Px1, как и 5 мкМ карбеноксолона в исследовательской камере одинаково слабо влияло и на ток, и на выброс АТФ (Рис.13B,C). Согласно ингибирующему эффекту 43GAP26, можно было бы предположить, что АТФ-проницаемые каналы клеток типа II являются Cx43. Однако рекомбинантные коннексоны Cx43 блокируются NPPB, La3+ и Gd3+ - такие данные плохо согласуются с гипотезой, что Cx43 один в виде гомогексамера ответственен за ПЗ выходящие токи и высвобождение АТФ в клетках II типа. Потенциально, Cx43 с другими коннексинами может образовывать гетеромультимерные полупоры, либо 43GAPингибирует коннексины, содержащие аминокислотный мотив SHVR, на основе которого и был сконструирован пептид 43GAP26.
Рисунок 13. Действие блокаторов полупор одновременно на интегральный ток и АТФвысвобождение в клетках II типа. A - действие 43GAP26 на выходящий ток и ответы клеток АТФ-сенсоров, вызванные деполяризацией вкусовой клетки до 10 мВ; B - сравнение действия 43GAP26 (300 мкМ, ,, n=14) и 10Px1 (300 мкМ, ,, n=9) на ПЗ выходящие токи (,) и ответы АТФ-сенсоров (,); C - выходящий ток и АТФ-высвобождение не чувствительны к 5 мкМ КБХ.
С учетом широко распространенного мнения, что именно паннексин1 может быть основным транспортером АТФ во вкусовых клетках, мы в попытке оценить относительный вклад коннексиновых и паннексиновых полупор в высвобождении АТФ из вкусовых клеток типа II разработали математическую модель, чтобы описать ответы клеток АТФ-сенсоров, которые использовались для мониторинга внеклеточного АТФ, секретируемого клетками типа II. В модели постулировалось, что АТФ может высвобождаться через каналы двух кинетически различных типов - Cx- и Panx1подобных. В соответствии со свойствами рекомбинантных каналов для коннексиновых полупор постулировалась медленная активация, отсутствие инактивации и относительно медленная деактивация, приводящая к генерации хвостовых токов. Для Panx1-каналов предполагалась медленная инактивация и практически мгновенные активация и деактивация. Поэтому для паннексина1 и при длительной, и при кратковременной стимуляции характерна колоколо-образная зависимость количества высвободившегося АТФ от потенциала, так как, несмотря на увеличение проводимости, с усилением деполяризации падает электродвижущая сила для АТФ. В то же время для коннексиновых каналов характерно, что при длительной стимуляции (когда время стимуляции во много раз превышает время полу-деактивации каналов) эта зависимость будет иметь вид колокола, а при повторяющейся кратковременной стимуляции (когда время стимуляции сопоставимо со временем полу-деактивации каналов) - Sобразный вид, так как больший вклад в количество высвободившегося АТФ начинают вносить хвостовые токи, высвобождающие АТФ в условиях многократно возросшей электродвижущей силы (V= -70 мВ). Когда в качестве параметров в модель были введены характеристики ионных каналов во вкусовых клетках типа II, полученные нами результаты в физиологических экспериментах с повторяющейся кратковременной (100 мс) и длительной (2с) стимуляцией вкусовых клеток фактически совпали с предсказанием модели для случая, когда через данный тип ионных каналов переносится молекула с зарядом 2- (Рис.14).
Рисунок 14. Зависимость АТФ секреции от мембранного потенциала. A, B - расчетное для z = 2 (линии) и экспериментально наблюдающееся (,) количество АТФ, высвободившеея при 2 с (А) и 100 мс (В) стимуляции вкусовых клеток типа II.
В предложенной выше модели были использованы кинетические характеристики паннексина 1 из литературных источников - свойства рекомбинантного Panx1, экспрессированного в ооцитах Xenopus laevis (Bruzzone et al, 2005). Данная система на наш взгляд не совсем адекватна для исследования свойств белков млекопитающих.
Поэтому чтобы ответить на вопрос, может ли Panx1 вс-таки соответствовать по биофизическим свойствам АТФ-проницаемым каналам вкусовых клеток типа II, мы исследовали свойства рекомбинантного Panx1, клонированного из желобоватого сосочка в нескольких эукариотических линиях (CHO, HEK-293, нейробластома SK-N-SH), и сравнили их с таковыми каналов вкусовых клеток (Табл.3). Среди полученных данных следует особо отметить то, что: 1) мы не смогли зарегистрировать высвобождение АТФ на деполяризацию через рекомбинантный Panx1 при помощи клеток АТФсенсоров; 2) наблюдалась принципиально различная селективность АТФпроницаемых каналов вкусовых клеток и рекомбинантного Panx1, а также чувствительность к блокаторам; 3) при отрицательных потенциалах рекомбинантный Panxбыл активен, что делает его непригодным осуществлять функцию потенциалзависимого высвобождения нейромедиатора. В целом, наши данные свидетельствовали о том, что либо Panx1 не основной транспортер АТФ, либо АТФ-проницаемые каналы в клетках типа II образованы гетеромером Panx1 с другимим белками.
Таблица 3. Сравнение свойств каналов клеток типа II и рекомбинантного паннексина1 в клетках HEK-293.
ПЗ неселективные Рекомбинантный каналы вкусовых клеток Panxтипа II 1. Выпрямление интеграль- выходное, не активен выходное, активен при ного тока при отрицательных по- отрицательных потентенциалах циалах 2. Выпрямление тока через отсутствует выходное одиночные каналы 3. Селективность анион-катионная анионная 4. DIDS, NPPB слабо ингибирует ингибирует 5. La3+, Gd3+ не ингибирует не ингибирует 6. Пептид 10Px1, карбенок- не ингибирует ингибирует солон, АТФ 7. Пептид 43 GAP26 ингибирует частично ингибирует 8. U73122 ингибирует ингибирует* 9. Высвобождение АТФ есть нет 10. Флуоресцеин проникает не проникает** * - Ma et al., 2009; ** - Huang et al, 20Чтобы полностью прояснить ситуацию, участвует ли Panx1 в высвобождении АТФ в виде какого-то гетероолигомера, по биофизическим характеристикам не соответствующего рекомбинантному белку, мы провели серию экспериментов с использованием генетически модифицированных животных, у которых отсутствовал Panx(предоставлены проф. В.И. Шестопаловым, Университет Маями, США). Так, оказалось, что у данных мышей полностью сохраняются выходящие АТФ-проницаемые токи в клетках II типа (ср. Рис.15A с Рис.1). Более того, вкусовые почки и одиночные вкусовые клетки типа II высвобождали АТФ и при деполяризации, и при стимуляции вкусовыми веществами. (Рис.15B). Таким образом, можно заключить, что Panx1 не играет существенной роли в высвобождении вкусового афферентного нейромедиатора, что с учетом полученных нами фармакологических данных свидетельствует в пользу коннексонов, как основного АТФ-транспортирующего механизма в клетках типа II.
Рисунок 15. Функциональный анализ вкусовых клеток, выделенных из паннексин1отрицательных мышей. A - ионные токи в клетках типа II (активны и ПЗ натриевые, и ПЗ АТФ-проницаемые каналы); B- высвобождение АТФ из клетки типа II в ответ на 5 секундную деполяризацию до 20 мВ, регистрируемое при помощи клеток COS-1; C - регистрируемое клеткой-сенсором высвобождение АТФ из вкусовой почки при деполяризующей и вкусовой стимуляции; слева - изображение вкусовой почки и клетки COS-1 в проходящем свете; справа - регистрация от клетки COS-1, подписанной на фотографии слева.
Тем не менее, оставалась неясной роль генерации ПД в афферентной нейропередаче. Обычно вторичные сенсорные клетки, не имеющие аксонов не используют ПД для кодирования и передачи сенсорной информации и даже не способны их генерировать.
Что касается вкусовых клеток, то на сегодняшний день нет сомнений в том, что вкусовые клетки млекопитающих генерируют ПД в ответ и на электрическую, и на вкусовую стимуляцию. Мы предполагаем, что во вкусовых клетках типа II ПД управляют афферентной нейропередачей, поскольку важным свойством секреции АТФ является ее сильная зависимость от мембранного потенциала, которая характеризовалась крутой S-образной кривой с порогом ~ -10-0мВ. При такой крутой пороговой характеристике градуальные рецепторные потенциалы, индуцируемые активацией TRPM5, не способны вызывать высвобождение афферентного нейромедиатора в широком диапазоне рецепторных потенциалов. Действительно, при характерном для клеток типа II потенциале покоя в диапазоне -55Е-40мВ генерация градуальных потенциалов до 30-45мВ не способна стимулировать высвобождение ATФ. Но если стимул-зависимая деполяризация сопровождается генерацией ПД, частота или количество которых пропорциональны величине рецепторного потенциала, количество высвободившегося ATФ пропорционально интенсивности вкусового стимула, что обеспечивает адекватное кодирование сенсорной информации. Однако при сильной деполяризации, вызванной ПД, электродвижущая сила для выхода АТФ существенно падает. Более эффективно было бы использовать медленно деактивирующиеся АТФпроницаемые каналы для высвобождения большой порции АТФ при реполяризации.
На Рис.16 действительно видно, что через хвостовой ток, генерируемый в клетках типа II при возвращении к поддерживаемому потенциалу высвобождается количество АТФ, сопоставимое с таковым высвободившимся за предыдущие 10 с.
Рисунок 16. Деполяризация вкусовой клетки типа II приводит к высвобождению АТФ в межклеточное пространство и реакции АТФ-сенсора - клеток CHO c экзогенными P2X2/P2X3-рецепторами. Сверху - мембранный потенциал, поддерживаемый во вкусовой клетке; деполяризация вкусовой клетки вызывает активацию выходящего тока (в середине) и высвобождение АТФ, детектируемого клетками АТФсенсорами (внизу). На рисунке видно, что при реполяризации вкусовой клетки генерируются большие по амплитуде хвостовые токи и хорошо заметный импульсный выброс АТФ (за счет резкого увеличения электродвижущей силы для АТФ), приводящий к удвоению амплитуды ответа клетки АТФ-сенсора.
Однако такой модели, на первый взгляд, препятствуют электровозбудимые свойства клеток II типа. В то время как клетки типа III на ступенчатую деполяризацию способны генерировать от 1 до пачки ПД, частота и количество которых пропорциональны интенсивности стимуляции (Рис. 17B,C), клетки II типа способны генерировать лишь один ПД на ступенчатую деполяризацию и всего лишь 2-4 при увеличивающейся величине индуцированного тока (Рис.17С,D). Поэтому не получается объяснить кодирование информации клетками типа II лишь электровозбудимыми свойствами.
Рисунок 17. Электрическая возбудимость вкусовых клеток III и II типов. А - семейства ПЗ токов регистрируемых от исследуемых клеток III (вверху) II (внизу) типа. В обоих случаях использовался метод perforated patch clamp. Клетки перфузировались раствором, содержащим 140 мМ NaCl, и диализовались 140 мМ KCl. B - пачка ПД, генерируемая клеткой III типа в ответ на 500 мс импульсы деполяризующего тока различной амплитуды. С - ПД, генерируемые клеткой II типа в ответ на 800 мс градуальную стимуляцию деполяризующим током. D - одиночные ПД, генерируемые клеткой III типа (слева) и клеткой II типа (правая панель). В B-D использовался режим фиксации тока.
В то же время, анализ электрофизиологических ответов клеток типа II выявил, что аппликация смеси горьких веществ вызывает активацию с неярко, но достаточно хорошо выраженными осцилляциями, природа которых остается не ясной (Рис.18A).
При регистрации мембранного потенциала было видно, что на фоне деполяризации, индуцированной горьким веществом, осцилляционные явления приводили к генерации серии ПД (Рис.18B). Мы предполагаем, что наличие данного стимулиндуцированного осцилляционного механизма позволяет кодировать вкусовую информацию в виде дискретных квантов ATФ пропорционально количеству сгенерированных ПД, хотя природа явления не ясна.
Возможность высвобождения ATФ во время генерации ПД была продемонстрирована нами в экспериментах, где стимулирование кратковременными деполяризационными импульсами, сопоставимыми по длительности с ПД, приводило к детектируемому высвобождению ATФ из клеток II типа (Рис.18С).
Рисунок 18. Ответ клетки типа II на горькую стимуляцию. Градуальный ответ на горькие вещества сопровождается осцилляцией тока (А) и генерацией серии ПД в режиме регистрации лнулевой ток (B). C - ответ АТФ-сенсора, вызванного серией 7мс деполяризаций вкусовой клетки II типа до 10мВ (200 повторов).
Один из главных фундаментальных вопросов вкусовой афферентной нейропередачи - источник АТФ для высвобождения через каналы. Мы предполагали, что данный вопрос не существенен - уровень цитоплазматического АТФ достаточно высок в клетках и достигает 1-10 мМ, поскольку в клетке множество биохимических реакций используют энергию макроэргических связей молекул АТФ. В одном из наших опытов было продемонстрировано, что диализ клеток внутриклеточным раствором с мМ АТФ позволяет создать внутриклеточные условия, при котором мы могли хорошо детектировать выброс АТФ из вкусовых клеток, а при диализе вкусовых клеток в режиме whole cell раствором без АТФ выброс АТФ не регистрировался. Kinnamon et al, 1988 обнаружили, что в районе нервных окончаний в клетках типа II имеются крупные митохондрии в непосредственной близости от плазматической мембраны. Однако роль данных митохондрий до сих пор оставалась не ясной, поскольку информация о АТФ как нейромедиаторе появилась лишь в 2005 году. Мы предположили, что специфические для клеток типа II митохондрии выполняют функцию создания локально высокой концентрации АТФ, аналогичную синаптическим пузырькам возле пресинаптической мембраны. Если это так, то следовало ожидать, что в результате ингибирования митохондриальной АТФ-азы должен нарушиться выброс АТФ из вкусовых клеток.
Действительно, блокатор митохондриальной АТФ-азы олигомицин (3 мкМ) подавлял ответы, индуцированные высвобождением АТФ из вкусовых клеток после добавления в среду 100 мМ KCl, в клетках АТФ-сенсорах на основе клеток CHO со встроенными P2X2 и P2X3 рецепторами (Рис.19A-C). При этом, когда в качестве сенсорных клеток выступала линия COS-1, чувствительная и к АТФ, и к АДФ (АТФ/АДФ-сенсор), мы наблюдали лишь частичное снижение ответов клеток сенсоров при использовании аналогичного протокола стимуляции рядом расположенных вкусовых клеток в случае.
Рисунок 19. Ингибитор митохондриальной АТФ-азы подавляет выброс АТФ из вкусовых клеток II типа. A - изображение в проходящем свете клетки типа II и клетки АТФ-сенсора.
Вкусовая клетка II типа подведена на микроэлектроде к прикрепленной к дну камеры клетке CHO, экспрессирующей экзогенные рецепторы P2X2 и P2X3 и прокрашенной Fluo-4. Вкусовая клетка не подвергалась большим приложенным давлениям для получения гигаомного контакта и потому сохраняется морфология и, предположительно, клеточная компартментализация. B - репрезентативный эксперимент (n=7), в котором KCl-стимуляция вкусовой клетки II типа вызывала ответ в клетке АТФ-сенсоре. Инкубация с олигомицином приводила к исчезновению ответов клеток АТФ-сенсоров при KCl-стимулируемой деполяризации вкусовых клеток; D-F - эксперимент с использованием клеток COS-1 в качестве АТФ/АДФ сенсоров; D - изображение в проходящем свете клетки типа II и клетки сенсора. Манипуляции аналогичны описанным в А;. E - репрезентативный эксперимент (n=5), в котором KCl стимуляция вкусовой клетки II типа вызывала ответ в клетке АТФ-сенсоре в контроле и после инкубации с олигомицином. С,F - усредненные ответы клеток CHO (C) и COS-1 при KCl стимуляции вкусовых клеток типа II в контроле и после инкубации с олигомицином.
В контрольных опытах было проверено, что 100-300 нМ АТФ вызывает хорошо воспроизводимые кальциевые ответы у клеток обоих используемых линий даже после длительной инкубации с олигомицином (n=52). Также АТФ индуцировал ответы у P2X2/P2X3-положительных клеток CHO и после того, как стимуляция высокой концентрацией хлорида калия переставала индуцировать ответы в клетке-сенсоре (Рис.
20B).
Результаты опытов с олигомицином, представленных на рис.19, с учетом данных о наличии в клетках типа II крупных митохондрий в непосредственной близости от плазматической мембраны, мы склонны рассматривать как свидетельство функционирования АТФ-обогащенного компартмента для секреции АТФ (Рис.20). Функцию поставщика АТФ и, возможно, создания определенных физических барьеров выполняет специфическая митохондрия. Вполне вероятно, что данное место обеднено другими внутриклеточными молекулами из-за физических и, возможно, химических барьеров. Это позволяет создать специфические локальные концентрации клеточных метаболитов, в частности высокую концентрацию АТФ, но пониженную концентрацию других веществ, секреция которых в межклеточное пространство физиологически нецелесообразна, несмотря на их способность проникать через ионные каналы клеток типа II.
Рисунок 20. Гипотетическое устройство АТФ-обогащенного компартмента в клетках типа II. АТФ поставляется к полупорам, образованным коннексинами, из рядом расположенной митохондрии. Кальций, попадающий из внеклеточного пространства, частично связывается АТФ, концентрация которого повышена локально, а частично по электрохимическому градиенту через кальциевый унипорт заходит в митохондрии.
Цепь предполагаемых событий в клетках типа II можно представить в виде гипотетической схемы (Рис.21).
Функциональный анализ клеток типа III. Анализ профиля ионных токов в идентифицированных вкусовых клетках показал, что клетки III типа напоминают нейроны: для этих клеток помимо ПЗ Na+-каналов характерны K+-каналы задержанного выпрямления и А-токи, формирующие форму ПД и межспайковый интервал, HCN каналы, участвующие в деполяризации и пейсмейкерной активности, ПЗ Ca2+каналов L-типа, ответственные за вход в клетки кальция (Рис.2A,B), необходимого для экзоцитоза, K+-каналов входящего выпрямления. Для потенциалов действия в клетках III типа характерно перекодирование интенсивности приложенного при электростимуляции тока в частотные характеристики серии ПД, выраженная стадия глубокой гиперполяризации (Рис. 17B), а ПД значительно быстрее, чем в клетках типа II (t1/2=1.5-1.8 мс против t1/2=3.5-4.2 мс, соответственно).
Рисунок 21. Гипотетическая схема событий при рецепции вкусовых веществ клетками типа II. Вкусовые молекулы связываются с вкусовыми GPCR рецепторами (T1R и T2R), локализованными на апикальной мембране клети II типа.
Стимуляция рецепторов приводит к активации G-белков, повидимому, Gi/Go (гастдуцин, трансдуцин, Gi2), после чего комплекс Gi-белков активирует фосфолипазу С 2, что приводит к мобилизации внутриклеточного кальция, скорее всего при участии IP3 рецептора III типа на эндоплазматической сети. Кальций активирует кальций-зависимый ионный канал TRPM5, что приводит к осцилляционной деполяризации и генерации серии ПД. При насыщающих концентрациях вкусовых агонистов предполагается тотальная активация TRPM5 и длительный сдвиг мембранного потенциала к 0 мВ. Деполяризация и ПД вызывают активацию ПЗ ионных каналов, проницаемых для АТФ - коннексонов и высвобождению АТФ. Генерация серии ПД позволяет закодировать сигнал об интенсивности стимуляции. Высвободившийся АТФ активирует P2X2/P2X3 рецепторы нервных окончаний афферентного нерва. Экто-апираза (NTDase2) рядом расположенной клетки типа I гидролизует экстраклеточный АТФ. Тем самым морфологически и биохимически клетка типа I выполняет глиальную функцию. Кроме того АТФ приводит к мобилизации кальция в клетках типа I при участии P2Y-рецепторов и фосфоинозитидного каскада и активации кальций-активируемого анионного канала. Предположительно данная сигнализация играет роль в обеспечении обратной связи.
При исследовании высвобождения серотонина клетками типа III мы, как и ожидалось, зафиксировали воспроизводимую реакцию клеток глиомы С6 в ответ на длительную деполяризацию вкусовых клеток типа III (10-20 с) (Рис.22В), а также на циклическую деполяризацию (Рис.22В,С), но, несмотря на высокую чувствительность серотонинового сенсора, амплитуда ответов была крайне мала и не превышала F/F0=0,15. Хотя данный тип ответов глиомы С6 блокировался ингибитором 5HT2рецепторов кетансерином, мы полагаем, что, такая низкая амплитуда ответов (по сравнению, например с высвобождением АТФ из клеток типа II) связана с локальностью экзоцитозного аппарата и сильным разбавлением высвободившегося серотонина в исследовательской камере. Отметим, что в случае наблюдаемого нами произвольного увеличения кальция в клетках типа III, превышающего достигаемый уровень посредством деполяризации и активации кальциевых каналов, регистрировалась хорошо детектируемая реакция клеток-сенсоров (Рис. 22, D). Поскольку клетки поддерживались при фиксированном потенциале, это свидетельствовало, что для экзоцитоза имеет значение лишь повышение кальция, а не деполяризация, которая в этих клетках, в отличие от типа II, является не следствием, а причиной высокого уровня кальция в клетках.
Рисунок 22. Исследование выброса серотонина из вкусовой клетки типа III. А - изображение, в проходящем свете. B - записи флуоресцентных сигналов от вкусовой клетки (черная кривая) и глиомы С6 (серая кривая). Во вкусовой клетке повышается уровень внутриклеточного кальция в ответ на деполяризацию - циклическую (С) - первый пик, и продолжительную - второй пик, что сопровождается секрецией серотонина вкусовой клеткой. В ответ на это в клетке глиомы С6 повышается концентрация внутриклеточного кальция. Пик, достигающий максимума на 170 секунде - ответ клетки глиомы на 100 нМ серотонина. D - самопроизвольное увеличение концентрации цитозольного кальция во вкусовой клетке типа III приводило к заметному увеличению флуоресценции в клеточных сенсорах на серотонин.
Гипотетическая схема событий представлена на рисунке 23.
В поисках агонистов рецепторов клеток типа III мы обнаружили, что эти клетки генерируют кальциевые ответы на аминокислоты и на повышение экстраклеточного кальция - результаты, свидетельствующие о вероятном функционировании в этих клетках недавно открытого кальций-чувствующего рецептора (CaSR), который был обнаружен и во вкусовых клетках.
Так клетки III типа отвечали на агонисты CaSR, NPS R-568 и неомицин, повышением цитозольного кальция, в то время как подобные ответы не наблюдались в клетках I, II типов (Рис.24).
Согласно данным экспериментам, аминокислоты (Phe~Glu>Arg) стимулировали кальциевую сигнализацию (Рис.25) при участии фосфоинозитидного каскада, выхода депонированного кальция и входа кальция через Mn2+-проницаемые каналы.
Рисунок 23. Гипотетическая схема событий в клетках типа III при стимуляции кислыми веществами: кислые вещества вызывают активацию ионных каналов PKD2L и других протон-чувствующих каналов клеток типа III. Активация входящего тока вызывает генерацию серии ПД, частота ПД зависит от величины активируемого тока, который в свою очередь пропорционален концентрации протона во вкусовой поре. Генерация ПД вызывает активацию ПЗ кальциевых каналов и вход кальция в клетку. Повышение цитозольного кальция включает кальций-зависимый экзоцитоз и высвобождение нейромедиатора на вкусовое нервное окончание.
Рисунок 24. Репрезентативные ответы вкусовых клеток типа III (A и B), типа I (C) и типа II (D) на агонисты кальций-чувствующего рецептора (CaSR). Клетки были загружены кальциевым красителем Fluo-4. В А и B представлены 2 различные клетки типа III.
Рисунок 25. Эффекты аминокислот (фенилаланина, аргинина и глутамата) в присутствии нормального (1мМ) и повышенного (3,5 мМ) эктраклеточного кальция на изменение концентрации свободного цитозольного кальция во вкусовых клетках типа III. А- записи флуоресцентных сигналов от 3 разных клеток III типа. B - сводные результаты по чувствительности к аминокислотам клеток типа III при разных концентрациях наружного кальция.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Итак, данное исследование было посвящено анализу механизмов функционирования периферического вкусового анализатора на клеточном уровне. Одна из основных трудностей такого анализа состояла в том, что популяция клеток вкусовой почки гетерогенна и включает клетки нескольких морфологически различных типов: тип I - темные, тип II - светлые, тип III - промежуточные. Морфологические подтипы клеток отражают их функциональное различие. На сегодняшний день известно, что клетки типа II являются рецепторными для вкусовых категорий горького, сладкого и умами (вкус аминокислот); вкусовые клетки III типа ответственны за восприятие кислого, а клетки I типа, помимо глиальной функции, участвуют в рецепции соленого. Поэтому нам представлялось, что адекватное исследование молекулярных механизмов вкуса на клеточном уровне возможно только с использованием идентифицированных вкусовых клеток. Поскольку в физиологических и других экспериментах с одиночными клетками морфологические критерии обычно ненадежны и поэтому практически неприменимы, нами была поставлена задача разработать функциональные критерии для идентификации клеток различных типов. Мы проанализировали методами patchclamp, Ca2+-imaging и флуоресцентной микроскопии более 1000 одиночных вкусовых клеток, включая клетки из генетически модифицированных животных, что позволило разработать: а) простые электрофизиологические критерии; б) неинвазивные критерии для идентификации клеток типов I, II и III, включая популяцию горькочувствующих клеток типа II. В идентифицированных вкусовых клетках были охарактеризованы ионные каналы, включая потенциал-зависимые ионные каналы и каналы, активность которых контролируется при участии внутриклеточных сигнальных каскадов. Проанализирована специфическая химическая чувствительность клеток с использованием широкого набора агонистов.
Основной упор в работе был сделан на функциональный анализ клеток II типа, которые считаются основными хемосенсорными клетками вкусовой почки, поскольку ответственны за восприятие горького, сладкого и умами. Поэтому исследование этих клеток представляло серьезный научный интерес.
В этих клетках нами впервые электрофизиологически зарегистрирован и исследован ионный канал TRPM5, нокаут которого приводит к потере чувствительности к горькому, сладкому и умами. Подтверждена необычная термочувствительность канала, ранее продемонстрированная лишь на рекомбинантном TRPM5, которая вносит существенный вклад в зависимость вкусовых ощущений от температуры.
Долгое время оставалось неясным, каким образом клетки II типа осуществляют передачу информации о вкусе на нервные окончания, ведь в этих клетках отсутствуют классические синаптические структуры, пресинаптический белок SNAP-25 и потенциал-зависимые кальциевые каналы. Данное исследование позволило ответить на этот вопрос. С использованием метода клеточного АТФ-биосенсора мы выяснили, что клетки типа II высвобождают афферентный нейромедиатор, АТФ, в ответ на деполяризацию. Выброс АТФ клетками типа II не зависел от кальция, что свидетельствовало против классического Са2+-зависимого везикулярного механизма. Исследования с применением методов флуоресцентных трейсеров и электрофизиологического анализа селективности каналов показали, что секреция АТФ обеспечивается АТФпроницаемыми ионными каналами. Ингибиторный анализ, сравнение свойств нативных ПЗ АТФ-проницаемых каналов во вкусовых клетках с рекомбинантным паннексином1, эксперименты на мышах, нокаутных по паннексину1, а также математическое моделирование кинетических свойств этих каналов свидетельствовали о том, что во вкусовых клетках II типа АТФ-проницаемый канал формируется канальными белками из семейства коннексинов.
Важным свойством клеток II типа является их способность генерировать потенциалы действия (ПД). В то же время другие вторичные сенсорные клетки, не имеющих аксонов, например фоторецепторы позвоночных и волосковые клетки органа Корти не используют ПД для кодирования и передачи сенсорной информации и не способны их генерировать. Поэтому целесообразность генерации ПД для вкусовой трансдукции была не вполне ясна. При исследовании потенциал-зависимости выброса АТФ из вкусовых клеток типа II с применением метода клеточного АТФ-биосенсора мы обнаружили, что зависимость АТФ-секреции от мембранного потенциала характеризуется крутой S-образной кривой с порогом ~ -10-0мВ. При такой крутой пороговой характеристике, градуальные рецепторные потенциалы не способны вызывать высвобождение афферентного нейромедиатора в широком диапазоне рецепторных потенциалов. Однако, если стимул-зависимая деполяризация сопровождается генерацией ПД, частота или количество которых пропорциональны величине рецепторного потенциала, то тогда количество высвободившегося ATФ будет пропорционально интенсивности вкусового стимула. Это обеспечивает адекватное кодирование сенсорной информации, а за счет высокой крутизны зависимости высвобождения ATФ от потенциала фактически происходит квантовый (т.е. унифицированный по кинетике и величине) выброс ATФ в ответ на каждый ПД через неселективные ионные каналы.
С использованием 2 типов АТФ-сенсоров (АТФ- и АТФ/АДФ- специфичного) мы показали, что при потенциал-зависимой нейротрансмиссии основной пул АТФ для высвобождения имеет митохондриальное а не гликолизное происхождение. С учетом литературных данных, полученных с помощью электронной микроскопии, о локализации в непосредственной близости к плазматической мембране специфической митохондрии во вкусовых клетках типа II, а также наших косвенных свидетельств о падении интенсивности выброса АТФ и индукции входа кальция при деполяризации клеток II типа с деградировавшей ультраструктурой, мы предполагаем, что в клетках типа II функционирует специальный компартмент, включающий коннексоны плазматической мембраны и локализованную рядом митохондрию, служащий для высвобождения АТФ в акте вкусовой нейропередачи.
Мы также показали, что приложенный ток при электростимуляции вкусовых клеток типа III перекодировался ими в частотные характеристики серии потенциалов действия пропорционально интенсивности стимула. Сопровождающая данное явление деполяризация клеток типа III приводила к резкому подъему уровня цитозольного кальция за счет активации ПЗ Ca2+-каналов, что стимулировало высвобождение серотонина. Такие свойства клеток III типа позволяют хорошо объяснить то, как эти клетки кодируют и передают сенсорную информацию о кислом.
Удивительно было обнаружить, что клетки типа III также чувствительны к наружному кальцию и широкому спектру аминокислот: фенилаланин, аргинин и глутамат, а также высокий экстраклеточный кальций вызывали в клетках данного типа кальциевые ответы, опосредованные выходом в клетку депонированного кальция и входом через кальций-проницаемые ионные каналы. Анализ при помощи специфических агонистов (NPS R-568, неомицин) позволил нам утверждать, что данная чувствительность обеспечивается функциональной активностью в этих клетках кальцийчувствующего рецептора (CaSR). Возможно, данное свойство вкусовых клеток типа III связано напрямую с вкусовой чувствительностью, поскольку глутамат вызывает негативную реакцию у мышей с нокаутом T1R3-рецептора (Yasumatsu et al, 2011), а повышение кальция характеризуется горьким ощущением. Хотя также остается вероятным, что данный рецептор опосредует модуляцию клеток типа III эфферентными нервными окончаниями, так как недавно были получены свидетельства в пользу участия глутамата в эфферентной нейромодуляции клеток вкусовой почки.
Исследование функциональных свойств популяции клеток типа I показало, что эти клетки обладают уникальными для вкусовой почки рецепторными свойствами - именно среди клеток данного типа оказались клетки, чувствительные к ряду агонистов: АТФ и УТФ, АДФ, ацетилхолин и глутамат в микромолярных концентрациях стимулировали мобилизацию кальция и активацию кальций-активируемого хлорного канала в клетках этого типа. Как известно, клетки I типа несут на плазматической мембране экто-АТФ-азу NTPDase2, гидролизующую экстраклеточный АТФ до АМФ, и глиа-специфичный глутамат/аспартат транспортер (GLAST), закачивающий экстраклеточный глутамат в клетки. Кроме того, эти клетки имеют крыловидные отростки, которые создают физический барьер между клетками вкусовой почки и, повидимому, ограничивают межклеточное пространство с нервными окончаниями от растекания нейромедиатора. В апикальной части этих клеток имеются электронплотные гранулы, которые, возможно, секретируются во вкусовую пору. Мы полагаем, что уникальная для вкусовой почки чувствительность клеток типа I к различным нейроактивным веществам позволяет им регулировать выполнение глиальных функций и запускать различные адаптационные механизмы при наличии нейромедиаторов в межклеточном пространстве, например, модулируя активность NTDазы2 и GLAST, а также индуцируя секрецию во вкусовую пору.
Интересно, что клетки типа I оказались хорошо отвечающими на денатоний повышением уровня цитозольного кальция. Роль данной сигнализации остается не ясной, однако сам факт говорит о том, что денатоний не следует использовать в качестве вкусового стимула для исследования трансдукционных механизмов на неидентифицированных клетках, что пока является достаточно распространенной исследовательской практикой.
ВЫВОДЫ.
1. Проведен функциональный анализ гетерогенной популяции вкусовых клеток в препаратах диссоциированных желобоватых, листовидных и грибовидных вкусовых сосочков с использованием методов электрофизиологии и флуоресцентной микроскопии. Показано, что вне зависимости от типа исследуемого вкусового сосочка для популяции вкусовых клеток характерны три функциональных инварианта. Установлено, что каждый функциональный клеточный инвариант соответствует определенному морфологическому подтипу (тип I - тип III), идентифицируемому по профилю маркерных белков. Полученные корреляции позволили сформулировать функциональные критерии для идентификации индивидуальных вкусовых клеток при их исследовании физиологическими методами.
2. Изучены механизмы электрогенеза и электрической возбудимости в идентифицированных вкусовых клетках. В частности, показано, что по своим электрическим характеристикам вкусовые клетки типа III сходны с нейрональными клетками и способны генерировать пачки потенциалов действия в ответ на деполяризацию. Показано, что в клетках типа III функционируют Са2+ каналы L- типа, которые обеспечивают вход наружного Са2+ и выброс серотонина в ответ на деполяризацию.
3. Установлено, что клетки типа II имеют недостаточный набор ПЗ каналов и поэтому генерируют лишь одиночные потенциалы действия в ответ на электрическую стимуляцию. Между тем, вкусовые стимулы вызывают генерацию пачки потенциалов действия, за счет осциляторного характера генераторного тока.
4. Клетки типа I по своим электрорфизиологическим свойствам сходны с глиальными клетками. Показано, что в клетках типа I функционируют метаботропные рецепторы к таким нейроактивным веществам, как АТФ, АДФ, УТФ, ацетилхолин и карбахол, глутамат, которые сопряжены с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией внутриклеточного Са2+. Са2+-мобилизация сопровождается стимуляцией входящего тока через Са2+-активируемые Сl--каналы. Субпопуляция клеток типа I оказалась способной детектировать горькое вещество денатоний, которое вызывало мобилизацию цитозольного кальция при участии фосфоинозитидного каскада и активацию Са2+-активируемых Сl--каналов.
5. Отработана оригинальная методика мониторинга секреции нейроактивных веществ (АТФ, серотонина) из одиночных клеток с использованием клеточных биосенсоров на основе экзогенных/эндогенных рецепторов, сопряженных с Са2+ мобилизацией.
6. С использованием метода биосенсора впервые показано, что в желобоватых листовидных и грибовидных сосочках клетки вкусовой почки высвобождают афферентный нейромедиатор, АТФ, в ответ на вкусовую и электрическую стимуляцию. Исследованы клеточные источники и механизмы секреции АТФ вкусовыми клетками типа II. Установлено, что в секрецию вовлечен АТФ митохондриального, а не гликолизного происхождения, и что АТФ высвобождается через потенциал-зависимые АТФ-проницаемые ионные каналы без участия экзоцитоза. Впервые проанализирована роль потенциалов действия в афферентной нейропередаче во вкусовой почке и показано, что спайки обеспечивают квантовый характер высвобождении афферентного нейромедиатора АТФ из клеток типа II. Впервые разработана математическая модель потенциал-зависимой секреции АТФ при участии АТФ-проницаемых ионных каналов.
7. Проанализирована возможная роль в секреции АТФ вкусовыми клетками типа II канального белка Panx1, рассматриваемого в качестве основного претендента на роль АТФ-проницаемого канала. С использованием совокупности методов, включая животных с нокаутированным геном Panx1, ингибиторный анализ, сравнительный биофизический анализ рекомбинантного Panx1 и АТФ-проницаемых ионных каналов вкусовых клеток, впервые получены свидетельства, что канальный белок Panx1 не вовлечен в секрецию АТФ во вкусовых клетках типа II. Это, в сочетании с другими данными, указывает на то, что АТФ-проницаемые каналы во вкусовых клетках типа II формируются не Panx1, а белками щелевых контактов - коннексинами.
8. Исследованы биофизические характеристики ионного канала TRPM5 in situ и в экспрессионной системе, являющегося ключевым элементом в каскаде вкусовой трансдукции в клетках типа II. Показано, что в условиях in situ повышение уровня цитозольного кальция ведет к активации TRPM5, блокируемого оксидом трифенилфосфина (ТФО), эффективно ингибирующего токи через рекомбинантный TRPM5, клонированный из вкусовых клеток. Подтверждена высокая термочувствительность TRPM5 in situ (Q10>6).
9. Впервые показано, что в клетках типа III функционально активен гептаспиральный рецептор внеклеточного кальция (CaSR), который сопряжен с фосфоинозитидным каскадом. Используя ингибиторнвый анализ, установлено, что полимодальный рецептор CaSR обеспечивает чувствительность клеток типа III к ряду аминокислот (глутамат, фенилаланин и аргинин), которые стимулируют мобилизацию депонированного Са2+ и вход наружного Са2+ через Са2+/Mn2+проницаемые каналы. Высказано предположение, что остаточная чувствительность к аминокислотам, наблюдаемая у животных с генетически инактивированным умами рецептором T1R1/T1R3, может быть обусловлена присутствием рецептора CaSR в субпопуляци клеток типа III.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Jiang P., Margolskee R.F., Kolesnikov S.S. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells. // EMBO J. 2007. 26(3), 657-67.
2. Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Яценко Ю.Е., Колесников С.С. Мониторинг выброса ATP из одиночных клеток методом биосенсора. // Биологические мембраны. 2007. Т. 24(4). С. 309-315.
3. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Khokhlov A.A., Kolesnikov S.S. VoltageDependence of ATP Secretion in Mammalian Taste Cells // J. Gen. Physiol. 2008. V. 132. P. 731744.
4. Шутов А.А., Лебедева О.В., Романов Р.А., Рогачевская О.А., Кабанова Н.В., Колесников С.С., Сафарова Э.Р. Клеточная тест-система, экспрессирующая К+-канал hERG, для исследования кардиотоксичности лекарственных препаратов. Получение и анализ // Биологические мембраны. 2008. Т. 25(4). С. 322-328.
5. Романов Р.А., Кабанова Н.В., Малкин С.Л., Колесников С.С. Неселективные потенциал-зависимые каналы во вкусовых клетках типа II // Биологические мембраны. 2009.
Т.26(1), с.64-74.
6. Романов Р.А., Яценко Ю.Е., Кабанова Н.В., Быстрова М.Ф., Колесников С.С.
Потенциал зависимые Сa2+ каналы вкусовых клеток типа III // Биологические мембраны.
2009. Т.26(4), с.258-264.
7. Хохлов А.А., Романов Р.А., Рогачевская О.А., Садовников В.Б., Колесников С.С. Возможная роль гастдуцин-положительных сенсорных клеток обонятельного эпителия в восприятии 2-гептанона/ / Сенсорные системы. 2009. Т.23.№2, С.164-171.
8. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Яценко Ю.Е., Колесников С.С. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке мыши. Ацетилхолин как возможный посредник. // Биологические мембраны. 2010. Т.27(1), С.114-120.
9. Bystrova M.F., Romanov R.A., Rogachevskaya O.A., Churbanov G.D., Kolesnikov S.S. Functional expression of the extracellular calcium-sensing receptor in mouse taste cells. // J.
Cell Sci. 2010. V. 123(Pt 6). P. 972-982.
10. Романов Р.А., Колесников С.С. Первичные медиаторы. Методы и подходы для исследования секреции // Биологические мембраны. 2011. Т.28(1). С.3-13.
11. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Канальная активность рекомбинантного паннексина1. // Биологические мембраны. 2011. Т.28. №5 С.374381.
12. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Идентификация ионных каналов TRPM5 во вкусовых клетках II типа. // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2011. T.43(3). С.201-210.
13. Rogachevskaya O.A., Churbanov G.D., Bystrova M.F., Romanov R.A., Kolesnikov S.S.Stimulation of the extracellular Ca2+-sensing receptor by denatonium. // Biochem. Biophys. Res.
Commun.. 2011. V. 416 (3-4), 433-436.
14. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке: АТФ и ацетилхолин как первичные медиаторы. // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2011. T.43(6). С.543-515. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. Electrical excitability of taste cells. Mechanisms and possible physiological significance. // Биологические мембраны. 2012. Т.29. №1-2. Принята в печать.
Статьи в книгах:
1. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. Afferent Output in Mammalian Taste Cells: A Role of Electrical Excitability in Mediating Transmitter Release. // pp.
133-157 in УAction Potential Biophysical and Cellular Context, Initiation, Phases and PropagationФ. Ed. M.L. DuBois. 2010. Nova Science Publishers, New York, 207 p.
Статьи в сборниках:
1. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Хохлов А.А., Колесников С.С. Механизм афферентной трансмиссии во вкусовых рецепторных клетках II типа/ / Сборник статей по материалам Международной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем (25-27 июня 2008 г.Минск, Беларусь), часть I, С.260-261.
2. Хохлов А.А., Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Осветитель на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах для флуоресцентной микроскопии одиночных клеток/ / Сборник статей по материалам Международной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем (25-июня 2008 г.Минск, Беларусь), часть II, С.336-338.
3. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Яценко Ю.Е., Колесников С.С.
Межклеточные коммуникации во вкусовой почке мыши. Ацетилхолин как возможный посредник. // Международная конференция Рецепция и внутриклеточная сигнализация.
Пущино. 2009. Сборник статей, Том 1, С.262-264.
4. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Афферентная нейропередача во вкусовых клетках. Роль электрической возбудимости клеток II типа. // Международная конференция Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2011. Сборник статей, Том 1, С.251-257.
5. Рогачевская О.А., Кабанова М.Ф., Быстрова М.Ф., Романов Р.А., Королькова Ю.В., Гришин Е.В., Колесников С.С. Исследование P2X2 и P2X3ецепторов в гетерологической системе. // Международная конференция Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2011. Сборник статей, Том 1, С.246-251.
Тезисы:
1. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Маргольский Р.Ф., Колесников С.С. Хеморецепторные клетки вкусовой почки млекопитающих. // Цитология. 2007. (9). Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института Цитологии РАН. С. 789.
2. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Маргольский Р.Ф., Колесников С.С. Механизм афферентной сигнализации во вкусовой почке. // 20-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 2007. Материалы съезда. С. 79.
3. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Роль потенциалов действия в кодировании вкусовой информации. // 20-ый съезд физиологического общества им. И.П.
Павлова. 2007. Материалы съезда. С. 393.
4. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Функциональный анализ вкусовых рецепторных клеток типа II. // Международная конференция Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2007. Материалы конференции. С. 160.
5. Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Исследование секреции АТР методом биосенсора. // Международная научнопрактическая конференция Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине.
Ростов-на-Дону. 2007. Материалы конференции. С. 36.
6. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Яценко Ю.Е., Хохлов А.А., Колесников С.С.
Межклеточные коммуникации во вкусовой почке млекопитающих. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008 г. Материалы съезда, с.185.
7. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. ATP release from taste cells/ Monitoring with ATP biosensor. // The tenth world congress on biosensors, Shanghai, China, May 14-16, 2008, Delegate manual, P3, 102.
8. Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Хохлов А.А., Малкин С.Л., Чурбанов Г.Д., Осокин Н.Н., Кабанова Н.В., Романов Р.А. Использование методов флуоресцентной микроскопии для исследования мембранной проницаемости вкусовых клеток мыши. // Материалы Международного семинара Современные методы микроскопии в исследовании живых систем. 17-21 ноября 2008, С.-Петербург. С.29.
9. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Хохлов А.А., Колесников С.С. Механизмы межклеточных коммуникаций во вкусовой почке при участии внеклеточного АТФ. // Всеукраинская научная конференция с международным участием Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии. 30-31 октября 2008 г. Днепропетровск, Украина. Сборник трудов, С.34.
10. Кабанова Н.В., Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С., Лебедева О.В. Исследование К+каналов в экспрессионной системе методом patch-clamp // 11-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2008. Материалы конференции, С.174.
11. Романов Р.А., Кабанова Н.В., Малкин С.Л., Быстрова М.Ф., Колесников С.С.
Исследование активности ионного канала TRPM5 в идентифицированных клетках вкусовой почки. // Биологические мембраны. 2009. Т. 26(4). Материалы научной конференции Ионные каналы: структура и функции. 17-18 марта 2009г. С.-Петербург.С. 326-327.
12. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. ATP-проницаемые ионные каналы вкусовых клеток. // Биологические мембраны. 2009.
Т. 26(4). Материалы научной конференции Ионные каналы: структура и функции. 17-марта 2009г. С.-Петербург. С. 327-328.
13. Romanov R.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. Identification of taste cells functionally expressing TRPM5. // Abstracts of TRP-meeting, Sep 26-27, 2009. Stockholm. P.12.
14. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Хохлов А.А., Колесников С.С. Электрическая возбудимость вкусовых клеток и афферентная нейропередача. // 21-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 2010. Тезисы докладов. С. 520.
15. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Роль гептаспиральных рецепоров семейства С в физиологии вкусовых клеток. // 21-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 2010. Тезисы докладов. С. 521.
16. Рогачевская О.А., Кабанова Н.В., Шевченко А.В., Малкин С.Л., Чурбанов Г.Д., Кабанова Н.В., Романов Р.А. Клеточная тест система, экспрессирующая гомомерные P2X2, P2X3 и гетеромерные P2X2/P2x3 рецепторы. Получение и анализ. // Психофiзiологiчнi та вiсцеральнi функцii в нормi i патологii.Украна, Кив. 2010. Тези доповiдей. С.170.
17. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Механизмы афферентной нейропередачи во вкусовой почке. Роль потенциалов действия. // Психофiзiологiчнi та вiсцеральнi функцii в нормi i патологii.Украна, Кив. 2010. Тези доповiдей. С.173.
18. Romanov R.A., Rogachevskaya O.A., Bystrova M.F., Churbanov G.D., Kolesnikov S.S. Functional Activity of the Extracellular Calcium-Sensing Receptor in Mouse Taste Cells of the Type III. // New Horizons in Calcium Signaling. Meeting program, poster abstract. Beijing, China, October 10-13, 2010, p.59.
19. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке: АТФ и ацетилхолин как первичные медиаторы. // V Congress of the Ukranian Society for Neuoscience, Kyiv, June 6-10, 2011. С.58.
20. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Идентификация TRPM5 во вкусовых клетках II типа. // V Congress of the Ukranian Society for Neuoscience, Kyiv, June 6-10, 2011. С. 103.
21. Romanov R., Bystrova M., Rogachevskaya O., Kolesnikov S. Afferent output in type II cells. // ECRO XXI Congress. Manchester, 2011. Abstracts. P.83-84.