Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

  На правах рукописи

Осипова Светлана Владимировна

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ SS/SH РЕДОКС СТАТУСА ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ И КАЧЕСТВА КЛЕЙКОВИНЫ ПШЕНИЦЫ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Иркутск - 2011

Работа выполнена в лаборатории технической биохимии Учреждения Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск

Научный консультант: доктор биологических наук  В.А.Труфанов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н.Новиков

доктор биологических наук, профессор Д.Ю.Щербаков 

доктор биологических наук Н.В.Озолина

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г. Москва

Защита состоится 2 июня 2011 г. в  10 ч.  на заседании диссертационного совета  Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510а754; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Г.П.Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования молекулярной подоплеки вязкоэластичных свойств клейковины пшеницы проводятся давно и во многих лабораториях мира. Было установлено, что различия сортов пшеницы по признаку Укачество клейковиныУ связаны в основном с нерастворимой фракцией глютенина, образующейся путем полимеризации субъединиц глютенина в процессе созревания зерновки (Payne et al., 1987, Shewry and Halford, 2002). Ключевыми взаимодействиями, стабилизирующими трехмерную структуру глютениновых полимеров, являются межмолекулярные дисульфидные связи.

Вместе с тем известно, что вариабельность качества клейковины в большей степени зависит от физиологических факторов, связанных с нестабильностью условий среды во время созревания зерновки, нежели от вариабельности количества высокомолекулярных субъединиц глютенина (Lemelin et al., 2005).

Решающая роль межмолекулярных дисульфидных связей в формировании структуры клейковины предполагает, что процесс полимеризации глютениновых полипептидов при созревании зерна может регулироваться различными клеточными редокс агентами. Однако роль редокс окружения в формировании реологических свойств клейковины остается слабо изученной и спорной (Li et al., 2004; Every et al., 2006).

В связи с этим изучение в зерновке пшеницы активности ферментных систем, катализирующих тиол-дисульфидный метаболизм белков, их роли в процессах полимеризации запасных белков при созревании зерновки и в формировании технологического качества клейковины является актуальным как в теоретическом, так и в практическом аспектах.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение роли ферментативного регулирования полимеризации запасных белков в формировании надмолекулярных белковых структур зерна пшеницы и установление механизмов высокой вариабельности качества клейковины в разных условиях среды.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: 1) изучить в созревающей зерновке пшеницы сопряженность баланса SS/SH и активностей ферментов тиол-дисульфидного метаболизма; 2) изучить вариабельность содержания и физических свойств клейковины у различных генотипов мягкой пшеницы в разных условиях выращивания; 3) выявить взаимосвязь параметров качества клейковины с активностью ферментов тиол-дисульфидного метаболизма; 4) провести очистку и изучить биохимические характеристики тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерна пшеницы; 5) изучить влияние экзогенной дисульфидредуктазы из зерновки пшеницы на физические свойства клейковины; 6) картировать локусы количественных признаков, ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы; 7) изучить соотношение фракций по Осборну в белковом комплексе семян реликтового злака перловник Турчанинова (Poaceae) из различных ценопопуляций Восточного Забайкалья.

Положения, выносимые на защиту

1. Полимеризация субъединиц глютенина в процессе созревания зерна  регулируется эндогенными оксидоредуктазами, катализирующими реакции тиол-дисульфидного метаболизма в запасных белках.

2. Высокая вариабельность качества клейковины в разных условиях среды обусловлена вариабельностью активности ферментов, катализирующих SS/SH редокс превращения в запасных белках созревающей зерновки.

3. В созревающей зерновке пшеницы функционирует высокомолекулярный глутаредоксин подобный белок с тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазной активностью (КФ 1.8.4.2), катализирующий редукцию межмолекулярных дисульфидных связей полимерных белков эндосперма пшеницы, что приводит к ослаблению белковой решетки клейковины.

Научная новизна. Впервые установлено, что в созревающей зерновке пшеницы присутствуют активности тиол:кислород оксидоредуктазы (ТО, КФ 1.8.3.2) и GSH-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (ТПДО, КФ 1.8.4.2), катализирующие соответственно образование и восстановление дисульфидных связей в запасных белках. GSH-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза зерна пшеницы была выделена, очищена до электрофоретической гомогенности и охарактеризована. Фермент имеет молекулярную массу около 167 кДа и состоит из двух субъединиц, около 73 и 77 кДа. Установлено, что дисульфидредуктаза зерна пшеницы по энзиматическим характеристикам имеет сходство с ферментами из животных тканей, принадлежащими к суперсемейству тиоловых оксидоредуктаз. Влияние дисульфидредуктазы на физические свойства клейковины указывает на специфичность фермента к межмолекулярным SS связям глютенина, что отличает его от известного в зерновке тиоредоксина h.

Динамика активности ферментов тиол-дисульфидного метаболизма в созревающей зерновке, синхронность изменения соотношения SS/SH и баланса ферментативных активностей свидетельствуют, что ферменты вовлечены в процесс полимеризации глютениновых субъединиц на первом (при образовании разветвленного глютенина) и втором (образование нерастворимых полимеров клейковины) уровнях агрегации белков. Впервые показана взаимосвязь между балансом ферментативных активностей, регулирующих SS/SH статус запасных белков, и физическими свойствами клейковины.

  Впервые на хромосомах мягкой пшеницы картированы локусы количественных признаков, ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы, положение которых совпало с положением локусов, ассоциированных с параметрами физических свойств клейковины.

Высокая активность дисульфидредуктазы, обнаруженная в прорастающей зерновке, свидетельствует об участии фермента в подготовке протеолитической деградации глютениновых агрегатов при прорастании. Предполагается, что редуцирующие системы, подобные системе ТПДО, играют важную роль в прорастании семян злаков из филогенетически древних таксонов, так как среди запасных белков в семенах реликтовых злаков преобладают труднорастворимые полимерные глютелины.

Научная и практическая значимость работы. Установлено, что

ферменты тиол-дисульфидного метаболизма, присутствующие в созревающей зерновке пшеницы, вовлечены в процесс полимеризации запасных белков и формирование физических свойств клейковины, вариабельность качества зерна связана с функционированием этих ферментных систем. Изучение GSH-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы зерновки пшеницы позволило оценить роль редуцирующей системы глутаредоксина в созревающем и прорастающем зерне. Результаты картирования локусов количественных признаков для активности дисульфидредуктазы могут служить основой для выявления кандидатных генов, контролирующих процесс полимеризации запасных белков и качество клейковины пшеницы. Полученные результаты вносят значительный вклад в познание процессов формирования надмолекулярных белковых структур в созревающей зерновке, расширяют и углубляют понимание природы высокой вариабельности качества клейковины в меняющихся условиях среды и могут быть использованы в селекции пшеницы на конечное использование. Разработан и защищен патентом способ получения тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из растительного сырья.

Публикации и апробация работы. Основное содержание и защищаемые положения диссертации отражены в 40 работах, в том числе 15 из них опубликованы в изданиях из перечня ВАК. Результаты исследований по теме диссертации были доложены и обсуждены на 3 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988); на 2-ом (Минск, 1990), 3-ем (Санкт-Петербург, 1993) и 4-ом (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений; на ежегодном симпозиуме ВОФР (Пенза, 1996), на 2-ом съезде ВОГИС России (Санкт-Петербург, 1999), на международной конференции УБиотехнология на рубеже двух тысячелетийУ (Саранск, 2001); на 11-ой (Новосибирск, 2000), 12-ой (Норидж, Англия, 2002), 13-ой (Прага, Чехия, 2006) и 14-ой (Стамбул, Турция, 2007) международных конференциях EWAC (Европейского общества по анеуплоидии пшеницы); на 10-ом (Paestum, Италия, 2003) и 11-ом (Brisbane, Австралия, 2008) международных симпозиумах по генетике пшеницы, на 4-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), а также на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений (Иркутск, 1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004, 2006).

Декларация личного участия автора. В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором, а также совместно с коллегами лабораторий технической биохимии и физико-химических методов исследования СИФИБР СО РАН, сотрудниками ИЦИГ СО РАН (Новосибирск), КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко (Краснодар),  Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) (Gatersleben, Germany)

и Читинской государственной медицинской академии. Автору принадлежит разработка планов исследований, организация и ведение экспериментов, анализ опытного материала и обобщение результатов. Суммарное личное участие автора ~ 85%. В диссертацию включены некоторые данные из кандидатской диссертации А.В.Пермякова УПротеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SS/SH-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспектыУ (2004), в планировании, получении и обсуждении которых автор диссертации принимала личное участие.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 265 страницах, содержит 42 рисунка и 31 таблицу, состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (456 источников). Приложение содержит 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работу были вовлечены сорта яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum L.: Скала, Ангара, Тулунская 12, Омская,  Салют, Светояр, Спектр, Ферругинеум, Свободар, Трансдункант, Пиротрикс 28/33, Пиротрикс 28/14, Лютесценс 750Н4, Лютесценс 851Н1, Лютесценс 851Н5, Лютесценс 616Н5, Лютесценс 34Н5, Эритроспермум 674Н27, Дружина,  Мироновская 808, Саратовская 29, Ладе, сорт озимой пшеницы Иркутская, а также:

- 6 межсортовых замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1-ой и 6-ой гомеологичных групп и их родители, а также двойная замещенная линия Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1А и 6D;

- 63 рекомбинантные инбредные линии ITMI (International Mapping Triticieae Initiative) картированной популяции и их родители. Всего 97 различных генотипов мягкой пшеницы.

Растения выращивали в полевых условиях на базе Иркутской сельскохозяйственной академии, Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко (г. Краснодар), ИЦИГ СО РАН (г. Новосибирск), IPK (Gatersleben, Germany) и на экспериментальном участке СИФИБР СО РАН. Растения выращивали также в условиях фитотрона СИФИБР СО РАН.

При изучении ферментативной активности в процессе созревания зерновки образцы семян отбирали в разные сроки налива и созревания, замораживали жидким азотом и лиофильно высушивали.

Кроме того, материалом исследования служили семена дикого злака  перловник Турчанинова (M. turczaninowiana Ohwi), собранные в 2007 и 2008 гг в разных ценопопуляциях на территории двух ботанико-географических районов Восточного Забайкалья - Даурии Ононской и Даурии Яблоновой.

Методы исследования. Для получения ферментных экстрактов 2 г муки грубого помола из зерна полной спелости гомогенизировали с 0.1 М трис-НСl буфером рН 7.5 + 1 мМ ЭДТА (рабочий буфер) в соотношении 1:3 в течение 20 мин. Гомогенат последовательно центрифугировали при 5000 и 30000 g в течение 20 мин. Полученный ферментный экстракт диализовали в течение ночи против исходного буфера и использовали для определения тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активностей. Зерновки более ранних фаз спелости гомогенизировали в фарфоровой ступке. Растворимые семенные липоксигеназы получали экстракцией муки грубого помола с рабочим буфером в отношении 1:10 (V/V) в течение 20 мин. Экстракт центрифугировали при 8000g в течение 30 мин. Все операции по выделению ферментных экстрактов проводили при 4С.

Для определения активности дисульфидредуктазы (TПДO) использовали модифицированный метод Minoda et al. (1973). В типичном случае в рабочий буфер вносили инсулин (4 мг/мл), БСА (19 мг/мл) или уксуснорастворимые белки клейковины (4 мг/мл) в качестве субстратов. Кроме субстратов в инкубационную среду добавляли ферментный экстракт с известным содержанием белка, либо очищенный фермент (20-30 мкг) и кофактор GSH (1 мM). Аликвоты инкубационной среды по 0.2 мл вносили в пробирки, содержащие 3 мл подкисленного ацетона для осаждения белка. Через 2 часа осажденный белок дважды промывали подкисленным ацетоном, растворяли в рабочем буфере рН 8.0, содержащем 1 % ДДС-Na и 0.27 % реактива Эллмана и измеряли содержание SH-групп при 412 нм. Единицу активности (Е) определяли как количество фермента, катализирующее увеличение содержания SH-групп на 1 микромоль в минуту при 37 и рН 7.5.

Активность тиолоксидазы определяли по скорости окисления SH-групп дитиотреитола (10 М), восстановленного глутатиона (10 М) (Lash, Jones, 1986) или уксуснорастворимых восстановленных белков клейковины (4 мг/мл). За единицу активности (Е) принимали количество фермента, катализирующее уменьшение содержания SH-групп в минуту при 37 и рН 7.5.

Активность липоксигеназы определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение коньюгированных пероксидов при 234 нм по модифицированной методике Zimmerman and Vick (1970). Для субстрата эмульсию линолевой кислоты в этаноле (1:1) растворяли в 0.1 М трис-HCl буфере, рН 6.8. За единицу липоксигеназной активности принимали изменение оптической плотности на 0.01 за 1 мин в сравнении с контрольным вариантом опыта, не содержащим ферментного экстракта.

Удельную активность ферментов выражали в единицах на мг белка ферментного экстракта. Содержание белка в экстрактах определяли по Lowry (1951) или Bradford (1976) используя БСА как стандарт.

Очистку тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы проводили с использованием тиол-активированной сефарозы 4В или тиопропилсефарозы 6В (аффинная хроматография), сефадексов G-25 (гель-фильтрация) и ДЭАЭ-А-50 (ионообменная хроматография).

Электрофоретические методы. Нативные белки ферментных экстрактов анализировали в щелочной буферной системе по Davis (1964). Восстановленные белки анализировали в щелочной буферной система по Laemmli (1970). Определение молекулярной массы нативного белка проводили по методу Колесниченко и соавторов (2000). Для проверки гомогенности очищенной ТПДО использовали систему капиллярного электорофореза 3D CE Agilent Technologies.

Для селективного окрашивания глутатионредуктазы в пластинках ПААГ использовали метод Ye et al. (1997), липоксигеназы - Heydeck et al. (1985).

Константу Михаэлиса определяли по методу Лайнуивера-Бэрка (Диксон, Уэбб, 1982) рН- и температурный оптимумы ТПДО - с БСА (40 мг/мл) в качестве субстрата.

Ингибиторный анализ проводили с 0.5 и 1 мМ N- этилмалеимидом и 0.5 и 1 мМ п-хлормеркурибензоатом, а также с 0.5 и 1 мМ растворами ZnSO4 и CuSO4. Определяли остаточную активность ТПДО после прединкубации фермента с ингибиторами в течение 30 мин.

  Выделение уксуснорастворимой фракции клейковины проводили по методике Василенко и Комарова (1987).

Параметры агрегации определяли по методу, предложенному японскими исследователями (Arakava and Yonezawa, 1975; Arakawa et al., 1976).

  Содержание SH групп и SS связей  определяли в экстрактах, полученных гомогенизацией образцов зерна с 0.1М натрий-фосфатным буфером, рН 7.5, содержащим 7М мочевину. SH группы алкилировали 4-винилпиридином Friedman et al. (1970) и после гидролиза белков проводили количественное определение пиридилцистеина на аминокислотном анализаторе. О содержании SS связей судили по разнице между содержанием пиридилцистеина до и после восстановления SS связей -меркаптоэтанолом.

Содержание небелковых тиолов определяли по методу Труфанова и соавторов (1993).

Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы проводили по методу Miflin et al. (1981).

Технологические показатели качества муки, теста и хлеба определяли в лабораториях Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко и Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) с применением методик Государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур (МетодикаЕ, 1988).

Фракционирование белков семян дикого злака Melica turczaninowiana проводили по методикам, стандартным для фракционирования белков зерна пшеницы (Конарев, 1980).

  Статистическая обработка. Все биохимические определения проводили не менее чем в двух биологических и 3-4 аналитических повторностях. При определении технологических показателей зерна число повторностей было 4- 5. Расчеты средней, ошибки средней, достоверности различий признаков, а также корреляционный и дисперсионный анализы проводили с использованием пакета программ STATISTICA, версия 5.0 (StatSoft) и MExcell. QTL-анализ проводили с использованием программы QGENE (Nelson, 1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

GSH-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктазная и тиолоксидазная активности в зерновке пшеницы

Физические свойства клейковины зависят от размеров нерастворимых полимерных агрегатов глютенина. Ключевая роль в образовании и стабилизации глютениновых полимеров принадлежит межмолекулярным дисульфидным связям (Shewry, 2009).

Одна из задач первого этапа исследований заключалась в поиске в зерновке пшеницы ферментативных активностей, подобных тиолоксидазам и протеиндисульфид оксидоредуктазам, катализирующим тиол-дисульфидный метаболизм в секреторных белках тканей животного происхождения, и изучение их специфичности по отношению к SS связям и SH группам глютениновых белков.

Под воздействием ферментного экстракта, полученного из зерновок на стадии поздней молочной спелости и очищенного от низкомолекулярных примесей диализом в течение 16 часов при 4 С, в зависимости от присутствия GSH SS/SH редокс равновесие уксуснорастворимых белков клейковины пшеницы, представляющих главным образом низкомолекулярные субъединицы глютенина, менялось в ту или другую сторону (Табл. 1). В этом эксперименте использовали лиофилизированные уксуснорастворимые белки клейковины пшеницы сорта Скала. В реакционную смесь 1 вносили клейковинные белки, растворимые в 0.1 М трис-НСl буфере, рН 7.5, содержащем 10 % салицилата натрия (4 мг/мл). Из данных таблицы 1 следует, что внесение в инкубационную среду ферментного экстракта (2) приводило к снижению количества SH групп на 20.8 % за 60 мин инкубации в аэробных условиях. Поскольку низкомолекулярные редокс партнеры отсутствовали в инкубационной среде, а спонтанное окисление SH групп было незначительным (1), логично предположить, что окисление осуществляют ферменты, подобные тиол:кислород оксидоредуктазам животных тканей (тиолоксидазы, ТО, КФ 1.8.3.2), окисляющим SH группы тиоловых соединений путем прямого переноса электронов от тиола на молекулярный кислород (Lash, Jones, 1984). Редуцирующие системы в этих условиях были неактивны.

Таблица 1. Изменение содержания SH групп (мкмоль/мл) в уксуснорастворимых белках клейковины пшеницы при действии ферментного экстракта из зерновок молочной спелости.

Время инкуба-ции, мин	Клейковина     1	Клейковина+ ферментный экстракт 2	Клейковина + GSH (1мМ) 3	Клейковина+ ферментный экстракт+GSH(1мМ) 4
0 234.3 6.0 256.1 5.7  239.5 5.0 292.6 1.0 30 236.4 2.0 234.9 1.0  254.2 6.3 366.9 4.3** 60 225.9 4.6 202.9 7.5***  258.2 2.0** 408.5 15.0***

Приведены средние значения из трех аналитических повторностей. * - достоверность различий с содержанием SH групп в нулевой точке. ** - P < 0.01; *** - P < 0.001.

В реакционной среде, содержащей белки клейковины и GSH (3), количество SH групп за 60 мин инкубации увеличилось на 7.7 %. Дополнительное внесение ферментного экстракта (4) привело к существенному (в 6.2 раза) возрастанию скорости реакции, в результате за 60 мин инкубации количество SH групп увеличилось на 39.6 %.

Данные, представленные в этом разделе, свидетельствуют, что в созревающей зерновке пшеницы присутствуют ферментные системы, катализирующие как окисление белковых SH групп, так и редукцию SS связей белков клейковины. Для  функционирования тиолоксидазы не требовались низкомолекулярные кофакторы, однако в анаэробных условиях активность не проявлялась. Активность ТПДО проявлялась только в присутствии GSH, что характерно для GSH- зависимых протеиндисульфид оксидоредуктаз (ТПДО, КФ 1.8.4.2), известных в различных животных тканях (Varandani, 1973; Carmichael et al., 1979).

Активность тиолоксидазы, дисульфидредуктазы, содержание SS связей и SH групп в развивающихся зерновках пшеницы сорта Скала. Динамика активности дисульфидредуктазы в зерне разнокачественных сортов пшеницы

Из данных рисунка 1А, видно, что максимум активности ТПДО в зерне пшеницы сорта Скала проявлялся в конце молочной- начале восковой спелости зерновок (содержание воды 55 - 45 %) с последующим снижением ее к концу созревания. Тиолоксидазная активность была достаточно высокой в течение всего периода созревания зерна от ранней молочной до полной спелости (Рис. 1А). В период восковой спелости в зерновках возрастало соотношение активностей ТО/ТПДО (Рис. 1С), одновременно увеличивалось суммарное количество SS связей (Рис. 1В) и соотношение SS/SH  (Рис. 1С). В период с конца молочной (55 % влажность) до полной спелости  отношение активностей ТО/ТПДО и баланс SS/SH в зерновках были связаны тесной положительной корреляционной связью (r = 0.90, P < 0.05). Эти данные  свидетельствуют о вовлеченности ферментов в регуляцию SS/SH статуса белков зерновки.

Рисунок 1. ТО и ТПДО (А) активности (мкмоль SH/мин/мг белка 10 ), содержание SS-связей и SH-групп (В), отношение активностей ТО/ТПДО и SS/SH (С) в созревающих зерновках пшеницы сорта Скала. Представлены средние значения из трех независимых опытов.

На рисунке 2 отображена динамика активности ТПДО в развивающихся зерновках шести сортов яровой пшеницы разного качества и

скороспелости (Osipova et al., 2007). В этом опыте пшеницу выращивали в течение двух лет в полевых условиях в окрестностях Иркутска. Активность ТПДО у сортов в независимых экспериментах различалась, однако

динамика активности для каждого сорта была сходной.

У большинства сортов активность ТПДО в зерновках достигала максимума на третьей и четвертой неделях после цветения, в последующем снижалась в разной степени у различных сортов. Эти данные показывают, что в период максимального синтеза белков клейковины, который начинается со второй недели после цветения (Grunwade et al., 1996), и интенсивного образования надмолекулярных структур глютенина (Abonyi, 2010) в зерновке высока активность ТПДО, катализирующей разрушение белковых дисульфидов. В тот же период развития зерновки, как было установлено Every и соавторами (2006), в зерновке высока активность протеин дисульфид изомеразы, катализирующей изомеризацию дисульфидных связей белков. Начиная с ранней молочной спелости и на протяжении всего периода созревания в зерновке активна тиолоксидаза (Рис. 1). Эти данные свидетельствуют, что редокс окружение в клетках эндосперма в период синтеза запасных белков и формирования полимеров клейковины определяется балансом как низкомолекулярных редокс агентов, так и активности эндогенных оксидоредуктаз, способных регулировать интенсивность полимеризации запасных белков.

 

Рисунок 2. Активность ТПДО (мкмоль SH/мин/зерновка 10) и содержание воды (%, гистограммы) в развивающихся зерновках пшеницы сортов: а) Лютесценс 616Н5, б) Эритроспермум 674Н27, в) Дружина, г) Скала, д) Пиротрикс 28/14, е) Свободар

Представлены результаты определения активности ТПДО как среднее значение из двух повторностей в рамках одного независимого эксперимента ошибка средней.

 

Взаимосвязь активностей тиолоксидазы и дисульфидредуктазы с качеством клейковины в зерновках яровой мягкой пшеницы сибирской и кубанской селекции

Наиболее чувствительными к изменениям структуры глютениновых полимеров являются реологические тесты, которые используют в качестве индикаторов состояния макромолекулярных белковых комплексов

(Dobraszczyk and Morgenstern, 2003). Показатели альвеографа и фаринографа, использующиеся в технологических лабораториях для оценки качества клейковины, хорошо отражают реологические (альвеограф) и смесительные (фаринограф) свойства теста.

Чтобы установить взаимосвязь активности эндогенных ТПДО и ТО с физическими свойствами клейковины от 7 (в Иркутске) до 15 (в Краснодаре) сортов яровой мягкой пшеницы были выращены в период с 1986 по 1988 годы в разных почвенно-климатических условиях на опытных полях Иркутского НИИСХ и Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко. Умеренно-континентальный климат Краснодарского края благоприятен для возделывания зерновых, а в Предбайкалье созревание зерна происходит при постоянном нарастании дефицита тепла, который в фазе восковой спелости достигает 10С (Илли, 2010). Всего в этой серии экспериментов были проанализированы технологические характеристики 78 образцов зерна мягкой пшеницы.

Анализ генотипической вариабельности параметров качества зерна и клейковины показал, что содержание белка и клейковины у пшениц, выращенных как в Краснодаре, так и в Иркутске, характеризовались незначительной вариабельностью (коэффициент вариации V - от 1.5 до 5 %).

Генотипическая вариабельность показателей, характеризующих физические свойства клейковины, была средней как в условиях Иркутска, так и в условиях Краснодара (коэффициенты вариации  для различных показателей составляли от 5 до 22%).

Модификационная изменчивость содержания белка и клейковины также была незначительной, и для всех изученных сортов пшеницы коэффициенты вариации этих показателей не превышали 10 % (Табл. 2). По объемному выходу хлеба наиболее стабильными оказались сорта Скала (V = 1.9%) и Пиротрикс 28/14 (V = 3.6 %), у других сортов коэффициенты вариации колебались в пределах 13 - 17 %. Необходимо отметить, что лабораторные выпечки производили только из муки пшеницы, выращенной в Краснодаре.

В то же время показатели качества теста характеризовались значительной модификационной изменчивостью. Коэффициенты вариации для устойчивости теста составили у разных сортов от 11 до 56 %, для разжижения теста - от 20 до 54 %. По валориметрической оценке коэффициенты внутрисортовой изменчивости у разных сортов колебались от 5 до 19 %. Столь же значительной модификационной изменчивостью  характеризовались активность тиолоксидазы (V = от 8 до 49 %)  и дисульфидредуктазы (V = от 7 до 67 %) в зерне на стадии поздней молочной спелости.

Сравнение по t-критерию (Табл. 3) показателей качества для семи сортов, выращенных в разных географических регионах и представленных в таблице 2, показало, что в условиях Иркутска существенно снижалось время образования и устойчивости теста, валориметрическая оценка и более чем в 3 раза возрастало разжижение теста. Анализ активности ферментов в зерне тех же сортов на стадии поздней молочной спелости выявил, что в Иркутске была снижена тиолоксидазная активность, повышена активность ТПДО, и более чем в два раза снижено отношение активностей ТО/ТПДО (Табл. 3).

Приведенные данные не только отражают высокую модификационную изменчивость удельной активности ферментов и фаринографических показателей качества теста, но и свидетельствуют о существовании вполне определенной взаимосвязи между ними. Корреляционный анализ дает

Таблица 2. Изменчивость активности ТО и ТПДО (Е/мг 10 ) и показателей качества у отдельных сортов пшеницы в разных условиях выращивания (стационары КНИИСХ и ИрНИИСХ, 1986-1988 гг)

Сорт	Удельная активность ферментов			Мука		Тесто			Хлеб
	ТО	ТПДО	ТО/ТПДО	Белок, %	Клейковина, %	Устойчи-вость, мин	Разжиже-ние, е.ф.	Вало-риметр, е.ф.	Объем-ный выход	Общая хл.-пек. оценка, баллы
Спектр n = 4 Светояр n = 4 Скала n = 5 ютесценс 615Н5 n = 4 Свободар n = 5 Эритроспермум 674Н5 n = 5 Пиротрикс 28/14 n = 3	9.5 2.1 22.0 7.1 2.0 28.0 9.7    0.8   8.2 8.1 1.5 18.5 4.7 2.3 49.0 7.2 2.2 30.6 7.6 1.1 14.5	4.0 1.5 37.5 3.0 0.5 16.7 2.9 0.2 6.9 2.0 0.3   15.0 2.1 0.2 9.5 1.8 1.2   66.7 1.5 0.2   13.3	3.1 0.7   22.6 2.8 1.0 35.7 3.4   0.3   8.8 4.0 0.5   12.5 2.0 0.9   45.0 4.3 1.4   32.6 5.7 1.3   23.0	16.8 0.6 3.6 15.7 0.7 4.5 15.1 0.9 6.0 15.9 1.4 8.5 15.7 1.1 7.0 15.0 0.4 2.6 17.3 1.4 8.1	33.5 1.3 3.9 32.0 1.1 3.4 32.0 2.6   8.1 34.2 2.3   6.7 32.7 1.9   5.8 31.7 0.8 2.5 34.2 2.3   6.7	8.3 0.9 10.8 10.1 5.7 56.4 15.5 7.1 45.8 15.6 4.7   30.1 15.6 6.4 41.0 14.6 2.4   16.4 24.5  8.5 34.7	81.8 16.3 20.0 101 27.7 27.3 78 21.7 27.8 130 61.5 47.3   75 18.6 24.8 53 19.5 36.8 51.7 28   54.2	70 3.6 5.1 64 12 19.1 79 7.1 9.0 79 3.6 17.6 79 8.6 11.0 90 5.6 6.3 96 9.5 9.9	647 52.5 8.1 629 94 15   652 12.5 1.9   630  105 17.0 593 77.5 13.1 645 85 13.2 618 22.5 3.6		4.7 0.3   6.4 4.6 0.5 10.9   4.6 0.1   1.0 4.7  0.3 6.4 4.7 0.2   6.4 4.8 0.2   4.2 4.8  0.2   4.2

В числителе - средние значения показателей станд. откл., в знаменателе жирным шрифтом - коэффициенты вариации.

Таблица 3. Изменчивость активности тиолоксидазы (ТО), дисульфидредуктазы (ТПДО) и показателей качества в зависимости от условий выращивания.

Признаки	Краснодар,   1986-1987 гг	Иркутск,   1986-1988 гг
Удельная активность   ТО, Е/мг 10   ТПДО, Е/мг 10 ТО/ТПДО Масса 1000 зерен, г Содержание клейковины, % ИДК, единицы прибора Время образования и устойчивости теста, мин Разжижение теста, е.ф. Валориметрическая оценка, е.ф.	9.2 0.7 2.0 0.2 4.9 0.5 32.9 1.5 31.8 0.4 66.4 5.9 21.4 3.1 40.0 6.7 92.1 5.5	6.3 1.1*   2.9 0.4   2.3 0.4***     32.7 1.3   34.4 0.8   71.1 4.5   8.8 0.8** 135.7 17.6*** 67.7 4.0**

Приведены средние значения станд. откл. для сортов Свободар, Скала, Спектр, Светояр, Лютесценс 616Н5, Пиротрикс 28/14, Эритроспермум 674Н27.

* - достоверность различий признаков в разных климатических условиях. * P < 0.05;

** P < 0.01; *** P < 0.001.

е.ф. - единицы фаринографа

представление о количественной стороне этой взаимосвязи (Табл. 4). Отрицательные корреляционные связи между разжижением теста, показателем ИДК-1 и тиолоксидазной активностью вполне логичны, так как с увеличением SS связей в запасных белках тесто должно быть более

устойчивым, а для более упругой клейковины сильных пшениц характерны низкие значения показателя ИДК-1. Сильные положительные достоверные корреляционные связи обнаружены между силой муки, растяжимостью, устойчивостью теста, и активностью тиолоксидазы. Можно ожидать, что у сортов с более высокой тиолоксидазной активностью технологические характеристики муки, теста и качество хлеба будут лучше.

Активность дисульфидредуктазы проявляла противоположную связь с показателями качества (Табл. 4). С первого взгляда дисульфидредуктазная активность не играла существенной роли в определении технологических свойств клейковины, но она оказывала непосредственное влияние на баланс активностей ТО/ТПДО и, тем самым, на SS/SH равновесие в белковом комплексе клейковины и его реологические параметры.

Несмотря на общую высокую оценку качества хлеба у всех изучаемых сортов, между активностью ферментов и отдельными показателями качества хлеба обнаружились корреляционные связи - средние отрицательные связи между расплывчатостью хлеба, цветом мякиша и активностью тиолоксидазы, средние положительные - с активностью дисульфидредуктазы, и тесные достоверные корреляционные связи - между показателями качества хлеба и ТО/ТПДО (Табл. 4).

Таблица 4. Корреляционные связи между активностью тиолоксидазы (ТО), дисульфидредуктазы (ТПДО), отношением ТО/ТПДО и технологическими показателями качества пшениц

Показатель	ТО	ТПДО	ТО/ТПДО
	n = 12 n = 20	n = 12 n = 20	n = 12 n = 20
Мука: - белок - клейковина - сила муки - ВПС - ИДК-1	-0.09  -0.27 -0.58*  -0.78*** 0.53  0.51* -0.41  -0.69** -0.25  -0.64**	-0.34  -0.13 0.16  -0.12 0.42 0.05 0.25 0.24 0.16 0.04	0.14  0.10 -0.58* -0.59**   0.64*  0.56** -0.62* -0.60** -0.58* -0.58**
Тесто: - растяжимость - устойчивость - разжижение - валориметр	0.75**  0.49* 0.60*  0.35 -0.51  -0.05 0.59*  0.23	-0.07 0.11 -0.56  -0.18 0.31 -0.04 -0.39 -0.01	0.76**  0.31 0.92***  0.58* -0.67*  -0.20 0.77**  0.42
Хлеб: - расплывчатость - цвет мякиша - объем хлеба - общая х.п.   оценка	-0.37 -0.27 -	0.34 0.34 -0.51* -0.42	-0.46* -0.49* 0.67**

Примечание. Приведены значения коэффициентов корреляции для пшениц, выращенных в 1987 г (n = 12) и в  1986-1987 гг (n = 20);

* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.

Тесные корреляционные связи между отношением активностей ферментов (ТО/ПДО), регулирующих SS/SH статус запасных белков, и технологическими показателями муки, теста и хлеба свидетельствуют об участии этих ферментов в формировании надмолекулярных структур клейковины пшеницы.

Активность дисульфидредуктазы, липоксигеназы и качество клейковины в зерне межсортовых замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1-ой и 6-ой гомеологичных групп.

Межсортовые замещенные линии (ЗЛ) Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1-ой и 6-ой гомеологичных групп были созданы в Институте цитологии и генетики СО РАН под руководством О.И.Майстренко. Реципиентом служил низкокачественный, но высокобелковый сорт Диамант 2 (содержание клейковины в зерне 40-50 %), а донором хромосом - высококачественный сорт Новосибирская 67 (содержание клейковины 30 %). Родительские сорта различались по составу почти всех запасных белков эндосперма (Пшеничникова, Майстренко, 1999; Obukhova et al., 2001).

Линии Диамант 2/Новосибирская 67 были проанализированы по 16 технологическим параметрам (Пшеничникова и др., 2006). Все ЗЛ сохранили присущее реципиенту высокое содержание клейковины, однако качество клейковины улучшились только у ЗЛ по хромосомам 1A и 6D и у двойной ЗЛ по хромосомам  1A, 6D.

Замещенные линии и родительские сорта были выращены в 1997 на экспериментальном участке СИФИБР СО РАН (Иркутск, опыт I) и в 1999 г в двух повторностях на экспериментальном поле ИЦИГ СО РАН (Новосибирск, опыты II и III). В зерновках полной спелости из каждого независимого опыта активность ферментов определяли в двух биологических и 3- 4 аналитических повторностях.

Из данных таблицы 5 видно, что родительские сорта не различались по активности ТПДО. У ЗЛ этот признак варьировал, в 1997 г наиболее значительно, от 0.8 до 5.3. Уровень активности липоксигеназы (ЛОГ) в 1997 г варьировал меньше, поэтому вариабельность отношения ЛОГ/ТПДО определялась в основном вариабельностью уровня активности ТПДО.

Таблица 5. Удельная активность ТПДО и липоксигеназы в зерновках межсортовых замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 (Дм.2/Нов.67) и их родителей

Сорт, линия	Удельная активность ТПДО, Е/мг 10	Удельная активность ипоксигеназы, Е/мг 10
	Независимые опыты  I  II III	Независимые опыты I  II III
Диамант 2 Новосибирская 67 Дм. 2/Нов. 67  1А Дм. 2/Нов. 67  1В Дм. 2/Нов. 67  1D Дм. 2/Нов. 67  6A Дм. 2/Нов. 67  6B Дм. 2/Нов. 67  6D Дм. 2/Нов. 67 1A, 6D Коэффициент вариации у линий, %	1.6 0.1 2.1 0.1  1.9 0.1 5.8 0.2 6.6 0.6 5.3 0.2 1.8 0.6 2.5 0.1 1.6 0.1 4.9 0.1 4.7 0.3* 3.4 0.7 0.8 0.1* 2.0 0.1 1.4 0.1* 5.9 0.2 7.2 0.3  5.3 0.2 2.6 0.6* 1.8 0.1 1.9 0.1 4.9 0.3 8.8 0.5*  5.3 0.2 2.5 0.6 2.4 0.3 1.9 0.2 5.1 0.1 8.5 0.5  5.5 0.1 2.0 0.1 2.2 0.2 1.5 0.1* 5.2 0.1 7.0 0.1  4.9 0.5 3.6 0.3* 2.5 0.2 2.1   0.1  5.4 0.2 7.2 0.3  4.8 0.3 5.3 0.5* 2.3 0.1 2.3   0.2  5.5 0.1 7.7 0.5  5.5 0.1 -  1.8 0.1* 1.4 0.1* -  8.7 0.4*  5.1 0.1   13.2 6.7  6.0  5.1  4.7 4.0

*- достоверность различий с сортом-реципиентом, P < 0.05

Корреляционный анализ выявил в опыте I достоверные корреляционные связи между отношением ЛОГ/ТПДО в зерне и физическими свойствами теста по данным фаринографа: положительные со временем образования и устойчивости теста (r = 0.78, P < 0.05) со стабильностью теста (r = 0.74, P < 0.05) и валориметрической оценкой (r = 0.83, P < 0.05), и отрицательную связь с разжижением теста (r = - 0.79, P < 0.05), высокие значения которого характеризуют клейковину плохого качества.

В опытах II и III г изменчивость по уровню активности  ТПДО была невысокой (Табл.5). Активность липоксигеназы достоверно и отрицательно коррелировала с силой муки (r = - 0.83, P < 0.01), упругостью теста (r = - 0.87, P < 0.01), объемом хлеба (r = - 0.76, P < 0.05) и общей хлебопекарной оценкой (r = - 0.86, P < 0.01).

Пермяковой и соавторами (2010) было показано, что влияние эндогенной ЛОГ зерновки пшеницы на качество муки и теста может быть как положительным, так и отрицательным, в зависимости от уровня активности фермента. Ухудшение качества клейковины под влиянием высокой активности ЛОГ, вероятно, может быть следствием уменьшения поверхностной гидрофобности  глютенинов, вызванного связыванием продуктов окисления ЛОГ (Shiiba et al., 1991).

В общей выборке, включающей данные трех независимых опытов, линии были сгруппированы по уровню активности ТПДО, и в группах были сопоставлены показатели физических свойств теста по t-критерию (Табл. 6). В группе линий с относительно низкой активностью ТПДО (ТПДО 1.6 Е/мг), в которую вошли замещенная линия по хромосоме 1A и двойная замещенная линия по хромосомам 1A и 6D , наблюдали лучшие показатели физических свойств теста.

Таблица 6. Активность ТПДО, ЛОГ и показатели физических свойств

теста в зерне замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67,

сгруппированных по уровню активности ТПДО.

Показатель	1 группа ТПДО 1.6	2 группа ТПДО > 1.6
Активность ТПДО, Е/мг 10 1.3 0.1 2.3 0.2*** Активность ЛОГ, Е/мг 10  4.9 0.3 6.2 0.3* Сила муки, е.а.  275 48.1  174 14.1* Упругость, е.а.  87.1 10.4 71.7 2.2* Время устойчивости теста, мин 4.9 1.0 2.3 0.5* Сопротивление теста, мин  9.9 1.6 6.3 0.7* Разжижение теста, е.ф.  38.5 11.9  65.8 5.0* Валориметрическая оценка, е.ф. 78.1 5.7  65.5 2.2*

* - достоверность различий по t-критерию между группами, * - P < 0.05, *** - P < 0.001.

е.а. -  единицы альвеографа; е.ф. - единицы фаринографа

 

Таким образом, в наборе замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 замена неактивного в отношении реологических свойств аллеля глютенина на активный не всегда приводила к улучшению параметров качества, однако прослеживалась связь физических свойств клейковины с активностью ТПДО и ЛОГ.

Представленные в предыдущих разделах данные свидетельствуют, что формирование физических свойств клейковины зависит не только от генетически детерминированных характеристик сорта - состава субъединиц глютенина и содержания белка, но и прочих факторов, среди которых существенное влияние на процессы полимеризации белков при созревании зерновки  может оказывать редокс окружение клеток эндосперма. Помимо низкомолекулярных редокс агентов в формировании SS/SН редокс окружения эндосперма участвуют оксидоредуктазы, специфически катализирующие тиол-дисульфидные превращения в запасных белках. Высокая активность ТПДО в развивающейся зерновке приводит к редукции межмолекулярных SS связей и деполимеризации субъединиц глютенина, снижению устойчивости белковой решетки клейковины и ухудшению её реологических параметров - снижению времени образования и устойчивости теста и повышению разжижения теста. Высокая активность ТО способствует полимеризации субъединиц глютенина и укреплению клейковины. Влияние ЛОГ неоднозначно, в популяции замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 и их родителей высокая активность ЛОГ приводила к ухудшению качества клейковины. Эндогенные оксидоредуктазы, сохраняющие высокий уровень активности в зрелой зерновке, могут быть вовлечены в окислительно-восстановительные реакции при гидратации запасных белков во время замеса теста.

Очистка и определение молекулярной массы

тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерновки пшеницы.

Очистка и характеристика  тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерновки пшеницы представляли большой интерес, так как в литературе  не было обнаружено сведений о подобных ферментах у растений.

Очистка ТПДО из зерна пшеницы Тулунская 12 полной спелости была проведена с использованием ионообменной хроматографии на сефадексе ДЭАЭ А-50. Аналитический вариант эксперимента (из 50 г муки) позволял получить фракции с высокой степенью очистки ТПДО за один цикл ионообменной хроматографии (Табл. 7, Рис. 3).

В препаративном варианте очистку вели из 150 г муки. Вероятно, из-за значительного увеличения нагрузки на колонку с сефадексом, пик активности ТПДО в препаративном варианте ионообменной хроматографии сместился в область белкового пика (Рис. 4). Фракции с активностью ТПДО анализировали на наличие глутатион редуктазы и липоксигеназы методом селективного окрашивания в пластинах ПААГ  (Ye et al., 1997; Heydeck et al., 1985) после нативного электрофореза

Таблица 7. Основные этапы очистки ТПДО из зерновки пшеницы полной спелости сорта Тулунская 12

Процедура	Объем фракций, мл	Е/мл 10	Белок, мг/мл	Е/мг белка 10	Очистка
Экстракция, Центрифугирование 75  6.6  10.8 0.6  1 Высаливание, 20-80 % (NH4)2SO4 , 20 10.1 14.2  0.7 1.2 Диализ или гель-фильтрафия на сефадексе G-25  Ионообменная хроматография на сефадексе ДЭАЭ A-50
Номер фракции 49 15 7.8  0.3  26.0  43.3 50 15 3.5  0.1  31.7  52.9 51 15 0.9  0.07  13.3  22.2 54 15 17.4  0.03 646 1077 55 15 12.5  0.02 660 1100  58 15 27.3  0.04 719 1158 62 15 2.3  0.07 32.5 54.2

Рисунок 3. Ионообменная хроматография на сефадексе ДЭАЭ

А-50 экстракта из зерновки пшеницы Тулунская 12

На рисунках 3-5 - 1 - кривая десорбции белка линейным градиентом NaCl; 2 - активность ТПДО

Рисунок 4. Препаративная ионообменная хроматография на

сефадексе ДЭАЭ А-50 экстракта из зерновки пшеницы Тулунская 12

по Davis (1964) (Рис. 6). В препаративном варианте хроматографии липоксигеназа элюировала раньше ТПДО. Начиная с 25-ой фракции (Рис. 4) липоксигеназной активности мы не обнаруживали. Наибольшую сложность представляло очистить ТПДО от глутатион редуктазы. Для достижения этой цели  провели рехроматографию частично очищенных фракций с активностью ТПДО (Рис. 5). Степень чистоты ТПДО во фракциях контролировали ПААГ-ДДС-Na

электрофорезом (Рис.7).

Рисунок 5. Ионообменная рехроматография

на колонке с сефадексом ДЭАЭ А-50

частично очищенной ТПДО

 

22 23  24   а 1 25  26  27  28  29  30 31 32 33 34 б

Рисунок 6. Селективное окрашивание в пластинах ПААГ на липоксигеназу (а) и глутатион редуктазу (б): а - 22-24 - белковые фракции с активностью ЛОГ, полученные при ионообменной хроматографии; б - фракции с активностью глутатион редуктазы, 1 - исходный экстракт, 25-34 - фракции, десорбированные градиентом концентраций NaCl (Рис. 4).

Фракции с высокой степенью очистки (например, фракции № 54-58, Рис. 3 или фракция № 8, Рис. 5 и 7) проверяли на электрофоретическую гомогенность капиллярным электрофорезом, который показал присутствие в некоторых из этих фракций единственного белкового пика (Рис. 8).

В результате процедур очистки мы получили два препарата, содержащих активность ТПДО: первый - электрофоретически гомогенный препарат - использовали для изучения молекулярной массы и энзиматических характеристик ТПДО; второй - частично очищенный препарат - не содержащий примесей других ферментов тиол-дисульфидного метаболизма, использовали в дальнейших опытах по влиянию экзогенной ТПДО на реологические свойства клейковины и агрегацию запасных белков.

  6  7  8

Рисунок 7. ДДС-Na-ПААГ электрофорез (по Laemmli, 1970) белковых фракций, полученных при рехроматографии. 6-8 Ц белковые фракции элюата (Рис. 5).

Рисунок 8. Денситограмма очищенного ферментного препарата ТПДО, полученная в результате капиллярного электрофореза.

Для определения молекулярной массы гомогенной нативной ТПДО использовали метод неденатурирующего электрофореза в присутствии ДДС-Na по методике А.В.Колесниченко и соавторов (2000). Неденатурирующим электрофорезом было показано, что нативная молекула  ТПДО имеет молекулярную массу около 167 кДа (Рис. 9).

Для определения субъединичного состава и молекулярной массы субъединиц ТПДО использовали ДДС-Na-ПААГ электрофорез по Laemmli (1970). Гомогенный препарат ТПДО был восстановлен в присутствии 2 % ДДС-Na и 5 % 2-меркаптоэтанола и проанализирован в 10 % ПААГ. Было выявлено, что ТПДО состоит из двух субъединиц с молекулярной массой около 73 и 77 кДа, которые вероятно, связаны между собой SS мостиками, поскольку они восстанавливались 2-меркаптоэтанолом (Рис. 10).

Протеиндисульфидредуктаза, выделенная нами из зерновки пшеницы, имела более высокую молекулярную массу нативного белка и отдельных субъединиц по сравнению с ранее описанными глутатион-зависимыми протеиндисульфидредуктазами из животных тканей (Chandler, Varandani, 1975; Freedman, 1979), а также более высокую молекулярную массу по сравнению с уже известными в зерновке пшеницы ферментами SH-метаболизма.

 

  1  2  1  2

Рисунок 9. Рисунок 10.

Неденатурирующий ДДС-NaЦэлектрофорез ДДС-NaЦэлектрофорез ТПДО  зерновки

ТПДО зерновки пшеницы в 7 %-ном ПААГ;  пшеницы по Laemmli в 10% -ном

1 Ц  маркеры (ферритин -440 кДа, каталаза Ц  ПААГ; 1 - маркеры ( - глобулин -

223 кДа, лактатдегидрогеназа -140 кДа, 160 кДа; овальбумин - 45 кДа,

БСА -67 кДа); цитохром с - 12 кДа);

2 - нативная ТПДО  2 - ТПДО, восстановленная

-  меркаптоэтанолом

Протеин дисульфид изомераза, очищенная Shimoni et al. (1995) из созревающей зерновки пшеницы, имела молекулярную массу 60 кДа. Тиоредоксинредуктаза пшеницы, по данным разных авторов, 35 или 65 кДа (Suske et al., 1979; Kobrehel et al., 1992). Тиолтранcфераза, состоящая из двух субъединиц с молекулярной массой около 23 кДa - около 50 кДа (Pascal et al., 1998). Хлоропластная глутатионредуктаза листьев пшеницы состояла из двух субъединиц с молекулярной массой 56 кДа и ассоциированным полипептидом 32 кДа, при общей молекулярной массе 150 кДа (Lascano et al., 2001). Известно, что типичные тиоредоксины и глутаредоксины представляют собой низкомолекулярные белки с молекулярной массой 11-14 кДа (Buchanan, Balmer, 2005; Rouhier, 2010).

Субстратная специфичность протеиндисульфидредуктазы,  сродство

к инсулину и БСА

Субстратную специфичность определяли для стандартных субстратов: инсулина, имеющего три SS связи, две из которых - межмолекулярные и бычьего сывороточного альбумина (БСА), имеющего 17 внутримолекулярных SS связей, а также для уксуснорастворимых белков клейковины, в состав которых входят преимущественно низкомолекулярные глютенины.

В таблице 8 показано восстановление SS связей различных белков эндогенной гомогенной ТПДО зерновки пшеницы. В отсутствие GSH восстановления SS связей не происходило вовсе (1). Количество SH групп в инкубационной среде несколько снижалось, очевидно, за счет спонтанного окисления. Добавление к раствору инсулина восстановленного глутатиона в концентрации 1 мМ приводило к восстановлению SS связей инсулина, количество SH групп в инкубационной среде возрастало в течение часа со скоростью 12 10 мкмоль SH/мин (2).

Объединение в одной инкубационной среде инсулина, ТПДО и GSH приводило к десятикратному повышению скорости восстановления SS связей, до 138 10 мкмоль SH/мин (3). Подобные закономерности наблюдали при восстановлении дисульфидредуктазой SS связей БСА и уксуснорастворимых белков клейковины. GSH восстанавливал SS связи этих белков, однако добавление в инкубационную среду дисульфидредуктазы существенно повышало скорость реакции, в инкубационной среде с БСА - в 2 раза (5), с белками клейковины - почти в 4 раза (7).

Таблица 8. Содержание SH групп (мкмоль/мл) в аликвотах реакционной смеси (3, 5, 7) и контрольных вариантах (1, 2, 4, 6) в процессе инкубации ТПДО (0.02 мг/мл) с инсулином (4 мг/мл), БСА (19 мг/мл) и белками клейковины (4 мг/мл).

	Состав инкубационной смеси	Время инкубации, мин 0 30 60
1    2   3   4   5   6   7	Инсулин, ТПДО Инсулин, GSH Инсулин, ТПДО, GSH БСА, GSH БСА, ТПДО, GSH Белки клейковины, GSH Белки клейковины, ТПДО, G SH	3.1 0.0   2.1 0.2   3.3 0.2 14.4 0.2 15.5   0.2   5.3 0.1   6.1 0.0	- - - 17.5 0.2 20.5 0.2   5.5 0.5   6.9 0.4	2.7 0.1   2.8 0.2   11.6 0.2   19.2 0.9   24.5 0.3   6.3 0.8   9.7 1.0

Представлены средние значения стандартное отклонение, n = 3 

Максимальная скорость реакции восстановления SS связей инсулина наблюдалась при концентрации инсулина 3.1 мкМ, Km при этом составила 2.18 0.2 мкМ, что в 5-10 раз меньше, чем значения Km для инсулина аналогичных ферментов из животных тканей (Shomburg et al., 1994). Для БСА при тех же условиях максимальная скорость реакции проявлялась при концентрации 700 мкМ, а Km составила 570 15.7 мкМ. Сравнительно высокое сродство к инсулину делает ТПДО зерновки пшеницы сходной с протеиндисульфидредуктазами из животных тканей (Ansorge et al., 1973; Carmichael et al., 1979; Srivastava et al., 1991). Определение Km для запасных белков пшеницы затруднено из-за их плохой растворимости в средах, пригодных для определения активности ферментов, однако в таблицах 1 и 8 показано, что ТПДО специфична в отношении SS связей уксуснорастворимых белков клейковины.

Взаимосвязь активности дисульфидредуктазы и содержания низкомолекулярных тиолов в развивающейся зерновке

На рисунке 12 показана сопряженность активности ТПДО и  содержания низкомолекулярных тиолов в развивающихся зерновках пшеницы. Средние данные для четырех сортов пшеницы приведены в % от суммарного содержания низкомолекулярных тиолов и суммарной активности ТПДО в зерновке на протяжении созревания.

Относительное содержание низкомолекулярных тиоловых соединений достигало максимума на стадии молочной спелости (примерно 30 день после цветения, влажность семян около 50 %), а с наступлением фазы тестообразной спелости снижалось. Максимум активности ТПДО совпадал с максимальным содержанием небелковых тиолов в зерновке (Рис. 12). Наличие достоверной корреляционной связи (r = 0.76, P < 0.05) между содержанием тиолов и активностью ТПДО в созревающей зерновке свидетельствует о важной роли низкомолекулярных тиолов, которые в зерновке пшеницы представлены в основном глутатионом (Httner, Wieser, 2001) в регуляции активности ТПДО. Судя по коэффициенту детерминации, примерно 60 % вариабельности активности ТПДО обусловлено содержанием небелковых SH групп и около 40 % - другими факторами.

Рисунок 12. Активность ТПДО (1) и относительное содержание небелковых тиолов (2) в развивающихся зерновках пшеницы в зависимости

от влажности зерна. Приведены средние данные для сортов Скала, Ангара 86, Лютесценс 616Н5 и Эритроспермум 674Н27. Бары - стандартное отклонение.

 

Поскольку пул GSH в клетке поддерживается глутатионредуктазой, логично предположить, что обнаруженный нами фермент с протеиндисульфид редуктазной активностью относится к редуцирующей системе глутаредоксина. Нетипично высокая для глутаредоксинов молекулярная масса нативного белка ТПДО позволяет отнести дисульфидредуктазу из зерновки пшеницы к классу высокомолекулярных глутаредоксин подобных белков (Buchanan, Balmer, 2005), функционирующих в редуцирующей системе НАДФН/глутатионредуктаза/GSH/ТПДО.

Оптимумы рН, температуры и ингибиторный анализ тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы  из зерновки пшеницы

Оптимальные для активности ТПДО значения температуры были определены в диапазоне 33-38 С, максимальная активность наблюдалась при 36 С. В этом у ТПДО из пшеницы больше сходства с ферментами тиол-дисульфидного метаболизма из животных тканей (Varandani, 1973), нежели с  тиоредоксином h из зерновки пшеницы, имеющим температурный оптимум при 25 С (Suske et al., 1979). Оптимальные значения рН - в интервале 6.5-7.5, с максимальной активностью при рН 7.0. Значения рН оптимума для ТПДО пшеницы в целом сходны с таковыми для дисульфидредуктаз животных (Ansorge et al., 1973).

Для ингибиторного анализа мы использовали специфические реагенты на SH-группы (Табл. 9). Двухвалентные ионы меди и цинка, связывающие SH-группы с образованием меркаптидов, на 100 % ингибировали активность ТПДО. Алкилирующие агенты N- этилмалеимид (N-ЭМ) и п-хлормеркурибензоат (ПХМБ) также ингибировали активность ТПДО, причем N-ЭМ сильнее, что, вероятно, можно объяснить разной доступностью для этих соединений, SH групп активного центра (Табл. 9).

Таблица 9. Влияние ингибиторов на активность ТПДО из зерновки пшеницы.

Ингибитор	Концентрация, мМ	Ингибирование, %
CuSO4	0.5	100
	1.0	100
ZnSO4	0.5	100
	1.0	100
N-ЭМ	0.5	70
	1.0	100
ПХМБ	0.5	20
	1.0	53

Представлены средние значения из трех независимых экспериментов, стандартное отклонение меньше 10 %.

На основании ингибиторного анализа можно предположить, что ТПДО из зерновки пшеницы, является представителем суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз, имеющих в активном центре два цистеиновых остатка в тиоредоксинподобном домене ЦCys-Х-Х-Cys- .

Влияние ТПДО из зерновки пшеницы на агрегирующую способность уксуснорастворимых запасных белков

Способность запасных белков к агрегации является одним из важных показателей, характеризующих реологические свойства теста и качество клейковины. Параметры агрегации белков сильных пшениц заметно выше по сравнению с таковыми слабых пшениц, причем в случае высококачественной клейковины процесс образования белковых агрегатов интенсивнее на начальных этапах и более продолжителен по времени (Arakawa, Yonezawa, 1975). На рисунке 13 А представлены результаты экспериментов, проведенные при рН 5.6, согласно стандартной методике (Arakawa et al., 1975, 1976). Агрегирующая способность запасных белков в присутствии ТПДО снижалась по сравнению с контролем. Различие в величине показателей агрегации 10 /C между контролем и опытом составляло в среднем от 15 до 22 %. Так, 10 /C за 10 мин составлял в контроле 134.1 4.6, в опыте - 114.6 1.2. В следующие 25 мин (до прекращения агрегации) соответственно 143.6 5.1 и 119.4 1.2. При оптимальной для активности ТПДО рН 7.5 (рис.13 (В)) показатель агрегации 10 /C в присутствии фермента снижался ещё больше, на 25-30 %, что, очевидно, связано с усилением диссоциации SS связей запасных белков под влиянием ТПДО.

 

Рисунок 13. Влияние ТПДО зерновки пшеницы на агрегацию уксуснорастворимых белков клейковины.

А-рН 5.6; В- рН 7.5. 1 - контроль  (без ТПДО), 2- опыт (+ТПДО). Представлены средние данные из трех независимых экспериментов, ошибка не превышала 5%.

Заметное влияние ТПДО на агрегирующую способность запасных белков свидетельствует о важной роли дисульфидных связей в агрегации белков зерновки и потенциальной возможности регулирования агрегации белков с помощью ТПДО.

Влияние добавок экзогенной дисульфидредуктазы на физические свойства теста разнокачественных сортов пшеницы

На рисунке 14 представлены результаты определения силы муки, упругости и растяжимости теста на альвеографе Шопена до и после добавления в муку препарата очищенной дисульфидредуктазы. В муку до замеса теста добавляли частично очищенный из зерновки пшеницы (не содержащий примесей других ферментов тиол-дисульфидного метаболизма) препарат ТПДО  в соотношении 5мг/50г муки.

Как видно из рисунка, добавление ТПДО не влияло на упругость теста ни одного из трех изученных сортов, но значительно увеличивало растяжимость теста - на 17 % у сорта Мироновская 808, имеющего высокую растяжимость, на 11 % у сорта Омская, клейковина которого отличалась очень высокой упругостью и малой растяжимостью, и почти на 50 % у озимого сорта Иркутская. У последнего сорта отношение упругости теста к растяжимости  приближалось к единице, но сила муки была довольно низкой. Соответственно, для  сортов Омская и Иркутская достоверно снижалось отношение упругость/растяжимость теста.

Таким образом, добавление к муке препарата очищенной ТПДО заметно изменяло физические свойства теста, увеличивая его растяжимость, что свидетельствует о специфичности  ТПДО в отношении не только внутри- , но и межмолекулярных дисульфидных связей.

 

 

 

Рисунок 14. Влияние добавок ТПДО на физические свойства теста различных сортов пшеницы: 1- Мироновская 808, 2 Ц Омская, 3 Ц Иркутская. Представлены средние значения из трех повторностей стандартное отклонение.  *  - P < 0.05, ** - P < 0.01

Картирование локусов количественных признаков (QTLs), ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы в зерне мягкой пшеницы популяции рекомбинантных инбредных линий ITMI

Для картирования локусов количественных признаков, ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы, мы использовали 63 случайно отобранные рекомбинантные инбредные линии (РИЛ) картирующей популяции ITMI (международный проект УInternational Triticeae Mapping InitiativeФ), в состав которой вошли РИЛ, полученные от скрещивания мягкой пшеницы мексиканского сорта Опата 85 и синтетической гексаплоидной пшеницы W7984. Синтетик выделен при скрещивании твердой пшеницы сорта Altar 84 и Aegilops tauschii CIGM 86.940 (Nelson et al., 1995). РИЛ и родительские генотипы были выращены в г. Гатерслебен (Германия) в течение двух полевых вегетаций - в 2000 и в 2003 гг. В 2000 г линии высевали в озимом посеве, при этом погодные условия в июле и августе были благоприятны по температурному режиму и осадкам. В 2003 г линии выращивались при яровом посеве, период налива зерна был жарким и засушливым. Каждая из этих вегетаций считалась повторностью.

По полученным нами данным сорт Опата 85 имел более высокую активность ТПДО по сравнению с Синтетиком W7984, это соотношение сохранялось в разных условиях среды. Среднее значение активности ТПДО у линий было ниже, чем у родителей за счет линий, имевших очень низкую активность (Табл. 10). Двухфакторный дисперсионный анализ изменчивости активности ТПДО выявил, что вклад генотипа составил -54 %,  вклад средовых факторов - 29 %. Велик был вклад в изменчивость иных неучтенных факторов, среди которых, по нашему мнению, ключевым является содержание в зерновке несвязанного с белками восстановленного глутатиона, кофактора ТПДО. Данные дисперсионного анализа свидетельствуют о сложном характере контроля активности ТПДО и зависимости ее полиморфизма от большого числа факторов.

Таблица 10. Средние значения удельной активность (мкмоль SH/мин/мг 10 ) дисульфидредуктазы (TПДО) у рекомбинантных инбредных линий ITMI и их родительских форм в различных условиях среды

Биохимические признаки	Родительские формы		инии ITMI
	Опата 85	Синтетик W7984	Среднее значение	Стандарт-ное откло-нение	Размах изменчи-вости
Удельная активность TПДО, I II	179.02.9 103.02.1	123.43.7 85.5010.4	67.44.9 59.33.5	36.0 26.1	0.1-175.2 0.1-124.0

I Ц  2000 год; II - 2003 год

В таблице 11 и на рисунке 15 представлены результаты картирования QTLs для удельной активности ТПДО.

Таблица 11. Обозначения QTLs, выявленных в популяции РИЛ ITMI для активности ТПДО

Признак	Ассоциированный QTL
Удельная активность ТПДО	QDsr.ipk - 7D; QDsr.ipk-4A; QDsr.ipk-5D; QDsr.ipk-6A

Обозначения даны в соответствии с рекомендациями Каталога генных символов (McIntosh et al., 1998).

Рисунок 16. Локусы количественных признаков, выявленные  на хромосомах 4A, 5D, 6A и 7D для активности ТПДО в популяции РИЛ ITMI в контрастных условиях выращивания.

Для удельной активности дисульфидредуктазы было выявлено четыре QTLs различного уровня достоверности. Наиболее достоверными были локусы, проявившиеся в благоприятных условиях первой повторности. Это локус в хромосоме 7D вблизи маркера Xfba204a (LOD > 3.0), в хромосоме 4А вблизи маркера Xksud9 (LOD < 3.0, но > 2.0) и в хромосоме 5D вблизи маркера Xfba137 (LOD < 3.0, но > 2.0). Донором более высокой активности ТПДО в этих случаях был сорт Опата 85. Четвертый локус Xfba020 в хромосоме 6А имел невысокую достоверность (LOD < 2.0), но проявлялся в обоих повторностях, донором более высокой активности был Синтетик.

На этих же хромосомах и в тех же положениях ранее были маркированы локусы, ассоциированные с различными технологическими показателями качества зерна (Пшеничникова и др., 2006, 2008). В хромосоме 7D вблизи маркера Xfba204a был обнаружен общий QTL для силы муки и упругости теста с максимальной степенью влияния на фенотипическое разнообразие. В хромосомах 5D и 4А это были локусы, связанные с упругостью и силой муки, а также водопоглотительной способностью (4А), в хромосоме 6А - с диаметром частиц муки и ее удельной поверхностью. Эти данные указывают на связь между активностью ТПДО и физическими свойствами клейковины в зерне мягкой пшеницы и имеют практическое значение для поиска кандидатных генов, контролирующих процесс полимеризации запасных белков и качество клейковины.

Соотношение белковых фракций по Осборну в семенах реликтового злака Melica turczaninowiana (Poaceae) из различных ценопопуляций Восточного Забайкалья

Данные о соотношении белковых фракций по Осборну в семенах дикого злака Melica turczaninowiana Ohwi (перловник Турчанинова) приводятся как повод обсудить роль редуцирующих систем тиоредоксина и глутаредоксина в проявлении злаками высоких адаптационных возможностей.

По данным рисунка 17 глютелины составляли  80 - 90 % от суммы  растворимых белков семян перловника Турчанинова.

Рисунок 17. Соотношение белковых фракций в семенах перловника Турчанинова из различных ценопопуляций Восточного Забайкалья

Это значительно больше по сравнению с относительным содержанием глютелиновых белков у других ксерофитных злаков, распространенных в Восточном Забайкалье и других регионах страны (Якимова, 1999; Семихов и др., 2006). Относительное содержание спирторастворимых проламинов в семенах M. turczaninowiana из разных популяций и ценопопуляций колебалось от 3.3 до 7.9 % от суммы всех растворимых белков (Рис.17).

Соотношение белковых фракций в семенах M. turczaninowiana, а именно низкое (10-20 %) суммарное содержание водо- , соле- и спирторастворимых белков, и очень высокое (до 80 - 90 %) содержание труднорастворимых глютелинов характерно для древних родов семейства Poacea, что согласуется с существующим мнением (Семенова, 2007) о реликтовом происхождении M. turczaninowiana.

Наибольшие различия в содержании суммарного белка и относительном содержании отдельных белковых фракций наблюдали в семенах из урочищ УАнгаихатаФ и УИнгодаФ. Место сбора семян в популяции УИнгодаФ отличалось затененностью и высокой влажностью почвы. Территория урочища УАнгаихатаФ, располагающаяся в зоне горных степей Даурии Олонской более южная, характеризуется меньшим количеством осадков и крайней неравномерностью их выпадения по сезонам и годам.

В семенах из популяции УИнгодаФ было обнаружено наибольшее количество суммарного растворимого белка, наибольшее относительное содержание глютелинов (90 %) и самое низкое относительное содержание проламинов (3.3 % по сравнению с 7.9 % в семенах из популяции УАнгаихатаФ) (Рис.17).

Наши данные поддерживают гипотезу В.Ф. Семихова об исключительно важной адаптивной роли спирторастворимых проламинов у злаков. Специфическую адаптивную функцию этих белков связывают с тем, что они легко гидролизуются и в первую очередь расходуются на прорастание. Быстрая утилизация спирторастворимых проламинов при прорастании связана с тем, что эти мономерные белки имеют только внутримолекулярные дисульфидные связи. Способствует быстрой деградации проламинов при прорастании редуцирующая система тиоредоксина h (Kobrehel et al., 1992; Lozano et al., 1996). Таким образом, вероятно, редуцирующая система тиоредоксина h вовлечена в адаптационный механизм, позволивший злакам стать истинно космополитическим семейством. Поскольку запасные белки эволюционно древних злаков преимущественно представлены глютелинами, логично предположить, что белки, подобные  ТПДО, также как и тиоредоксины, играют важную роль в адаптации злаков и их распространении на огромных пространствах планеты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основную сложность в поиске путей направленной регуляции качества

клейковины на уровне генотипа представляет высокая вариабельность ее физических свойств в меняющихся условиях среды. В наших экспериментах при выращивании одних и тех же сортов пшеницы в условиях Иркутска и Краснодара наблюдалась высокая внутрисортовая вариабельность физических свойств теста и низкая вариабельность содержания белка и клейковины. Выращивание сортов пшеницы кубанской селекции в условиях Сибири приводило к существенному (в 2-9 раз) повышению разжижения теста при незначительных изменениях параметра Усодержание клейковиныУ. Сорта, выращенные в Иркутске, имели значения показателя ИДК-1 от 85 до 100 единиц, что характерно для слабых пшениц. В условиях Краснодара те же сорта сформировали сильную клейковину (ИДК-1 от 50 до 80 единиц). Рекомбинантные линии популяции ITMI в условиях жаркого и засушливого лета в 2003 г сформировали более упругую клейковину, чем в комфортных условиях оптимальных температур и достаточном водообеспечении в 2000 г. Эти данные хорошо согласуются с существующим мнением (Lemelin et al., 2005), что вариабельность  молекулярных размеров глютениновых полимеров, определяющих качество зерна, в большей степени зависит от физиологических факторов, обусловленных нестабильностью условий среды во время созревания зерновки, и в меньшей - от вариабельности количества субъединиц глютенина.

Решающая роль межмолекулярных дисульфидных связей в формировании качества клейковины предполагает зависимость её физических свойств от различных клеточных редокс агентов, влияющих на интенсивность полимеризации запасных белков через регуляцию их SS/SH статуса.

Мы показали, что в созревающей зерновке пшеницы функционируют ферменты, подобные тиол:кислород оксидоредуктазам и тиол:протеин- дисульфид оксидоредуктазам, ранее известным для животных тканей. Активность тиол:кислород оксидоредуктаз приводит к окислению непосредственно SH групп уксуснорастворимых запасных белков (представленных в основном низкомолекулярным глютенином), а также низкомолекулярных тиоловых соединений, например, GSH. Последняя реакция в зерновке пшеницы может приводить к образованию окисленного глутатиона, что защищает лабильные белковые SH группы от глутатионилирования и последующего ингибирования полимеризации запасных белков. Перекись водорода, образующаяся наряду с дисульфидом в результате реакции, катализируемой тиолоксидазой, в свою очередь, способна окислять SH группы остатков цистеина (Mller, 2007). Для группы сортов с более высоким уровнем тиолоксидазной активности в период созревания и в зрелом зерне были характерны лучшие фаринографические показатели - более высокое время образования и устойчивости теста, высокая валориметрическая оценка и низкое разжижение теста. Это свидетельствует о взаимосвязи между уровнем тиолоксидазной активности в клетках зерновки и конечным технологическим качеством клейковины.

Влияние на реологические параметры клейковины эндогенной липоксигеназной активности зависит от ее уровня. Превышение некоего оптимального уровня активности липоксигеназы может привести к ослаблению клейковины. Механизмы влияния на реологию теста продуктов липоксигеназного пути не поняты до конца и, по-видимому, не сводятся только к окислению белковых SH групп, как принято считать.

Из двух основных редуцирующих систем клетки на начало наших исследований в зерновке пшеницы была изучена система тиоредоксина h. В нашей работе впервые была выделена и очищена до электрофоретической гомогенности GSH протеиндисульфид оксидоредуктаза (ТПДО), которую на основании изучения ее специфичности и ингибиторного анализа, можно отнести к глутаредоксин подобным белкам суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз.

В условиях in vitro добавление ТПДО в 4 раза повышало скорость редукции SS связей уксуснорастворимых глютениновых белков и снижало показатели агрегации этих белков. Добавление экзогенной ТПДО к муке разнокачественных сортов пшеницы приводило к повышению растяжимости теста. Активность эндогенной ТПДО положительно коррелировала с разжижением теста и отрицательно - с устойчивостью теста.

Изменение реологических параметров всегда связано с изменением структурного состояния белков. Характер влияния дисульфидредуктазы на реологические параметры клейковины показывает, что фермент катализирует восстановление межмолекулярных SS связей глютенина, следовательно, функционирование этого фермента in vivo может влиять на формирование белкового матрикса в созревающей зерновке пшеницы и конечное технологическое качество клейковины.

Косвенным подтверждением этому служит проведенное с помощью рекомбинантных инбредных линий ITMI картирующей популяции картирование уровня активности эндогенной ТПДО, которое обнаружило, что положение на хромосомах локусов количественных признаков, ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы, совпало с положением локусов, ассоциированных с физическими свойствами теста - силой муки, упругостью, водопоглотительной способностью.

Высокая активность дисульфидредуктазы в прорастающей зерновке предполагает, что этот фермент наряду с тиоредоксином h подготавливает протеолитическую деградацию запасных белков и, следовательно, так же как и тиоредоксин h , необходим для успешного развития и адаптации проростка на ранних стадиях развития. При этом редуцирующая система тиоредоксина способствует быстрой деградации глиадинов при прорастании, а физиологическая роль дисульфидредуктазы, вероятно, состоит в редукции SS связей полимерных белков.

Учитывая высокое относительное содержание глютелинов в семенах злаков, принадлежащих к филогенетически древним таксонам, можно предположить важную роль редуцирующих систем, подобных системе ТПДО, в адаптации реликтовых злаков на ранних стадиях развития.

Влияние редуцирующей системы ТПДО на запасные белки в созревающей зерновке пшеницы отличается от влияния редуцирующей системы тиоредоксина h. По данным ряда авторов (Kobrehel et al., 1992, Shewry and Tatham, 1997; Buchanan, 2002 Angioloni and Rosa, 2007) тиоредоксины специфичны только в отношении внутримолекулярных SS связей, и либо не оказывают никакого действия на реологию теста, либо укрепляют его в результате переорганизации SS связей в полимерных белках. К тому же в зерновке пшеницы уровень накопления НАДФН- зависимой тиоредоксинредуктазы, необходимой для регенерации тиоредоксина, очень низкий (Serrato et al., 2002). Cодержание же эндогенного свободного GSH в зерновке пшеницы достаточно высоко, чтобы обеспечить эффективность функционирования редуцирующей системы с участием ТПДО (Httner and Wieser, 2001; Li et al., 2004)

Основываясь на литературных источниках и результатах собственных исследований, мы предлагаем схему, демонстрирующую основные этапы процесса полимеризации глютениновых субъединиц и роль редокс окружения в этом процессе (Рис. 18).

Образование межмолекулярных SS связей и белковых агрегатов 1-ого уровня, представляющих разветвленные структуры глютенина, начинается сразу после синтеза высоко- (HMW-GS) и низкомолекулярных (LMW-GS) субъединиц глютенина в эндоплазматическом ретикулуме, продолжается в транспортных органеллах и в белковых телах. Этот процесс длится примерно три недели, с 7-10-го  по 30-32-ой день после цветения, зависит от генетически детерминированного состава HMW-GS и LMW-GS, а также от содержания низкомолекулярных редокс агентов (GSH/GSSG и аскорбат/дегидроаскорбат) и ферментов, поддерживающих пул восстановленного GSH и аскорбата (глутатион редуктаза, дегидроаскорбат редуктаза). В нашей работе показано, что на этой стадии наряду с низкомолекулярными редокс агентами в зерновке пшеницы функционирует лабильная система оксидоредуктаз, катализирующих тиол-дисульфидный метаболизм в запасных белках. Баланс активностей этих ферментов меняется в разных условиях среды, что приводит к различиям в молекулярных размерах белковых полимеров, сформировавшихся в этот период.

Последующее образование белковых агрегатов второго уровня (нерастворимых полимеров глютенина) зависит от результатов первого этапа агрегации, от состава агрегатов первого уровня и редокс окружения клеток эндосперма, и совпадает со стадией десикации зерна, поэтому влияние редокс окружения на этом этапе снижается.

Формирование клейковины при замесе теста на 60-80 % зависит от размеров белковых полимеров, сформировавшихся на втором этапе агрегации и от суммарного редокс SS/SH статуса муки.

Таким образом, по-видимому, наибольшее влияние на формирование  клейковины редокс окружение оказывает на первом этапе агрегации белков при образовании разветвленного глютенина, а также непосредственно в процессе замеса теста, когда белковые полимеры, сформировавшиеся в каждой клетке эндосперма, объединяются в единую структуру - белковую решетку клейковины.

С 7-10 дня после цветения  До 30-32 дня после цветения С 32-35 дня после цветения  Полная спелость

до полной спелости

а

Эндоплазматический  ЭПР, аппарат Гольджи,  Белковые тела,  Мука 

ретикулум (ЭПР) белковые тела глютениновые частицы

а

а

Синтез, ко- и  Образование агрегатов Образование агрегатов  60-80 %

посттрансляционный 1-ого уровня  2-ого уровня стабильности

фолдинг HMW-GS  (разветвленный глютенин)  (нерастворимые полимеры хлебопекарного 

и LMW-GS  (Hamer, van Vliet, 2000)  глютенина)  качества

(Lemelin et al., 2005)

а

Протеин дисульфид  Состав  GSH/GSSG Состав GSH/GSSG  Состав GSH/GSSG

Изомераза (ПДИ) HMW-GS аскорбат/ агрегатов аскорбат/ агрегатов аскорбат/

Пептидил-пролил-  и LMW-GS дегидроаскорбат 1-ого  дегидроаскорбат 2-ого  дегидроаскорбат

цис-транс-изомераза липоксигеназа уровня липоксигеназа уровня липоксигеназа

Шаперон BiP тиолоксидаза  тиолоксидаза  тиолоксидаза

  редуцирующая редуцирующая редуцирующая

  система ТПДО система  ТПДО система ТПДО

Рисунок 18. Роль редокс окружения в образовании нерастворимых полимеров глютенина и формировании реологических свойств клейковины (HMW-GS Цвысокомолекулярные субъединицы глютенина; LMW-GS - низкомолекулярные  субъединицы глютенина)

ВЫВОДЫ

1. В созревающей зерновке пшеницы одновременно присутствуют тиол:кислород оксидоредуктаза (ТО, КФ 1.8.3.2) и GSH-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза (ТПДО, КФ 1.8.4.2), катализирующие соответственно образование и распад дисульфидных связей в запасных белках. Синхронность изменения соотношений SS/SH и ТО/ТПДО в созревающей зерновке свидетельствует, что ферменты регулируют SS/SH статус белков зерновки.

2. Уровень активности тиолоксидазы, дисульфидредуктазы и липоксигеназы в созревающем и зрелом зерне, так же как и физические свойства клейковины, характеризуются высокой модификационной изменчивостью, что показано на сортах и межсортовых замещенных линиях мягкой пшеницы, выращенных в разных почвенно-климатических условиях.

3. Баланс ферментативных активностей, регулирующих SS/SH статус запасных белков в созревающей зерновке, влияет на формирование физических свойств клейковины. В изученных популяциях пшеницы активность тиолоксидазы положительно, активность дисульфидредуктазы и липоксигеназы отрицательно коррелировали с физическими свойствами клейковины. Генотипы с низким отношением тиолоксидаза/дисульфидредуктаза имели низкие показатели технологического качества.

4. GSH-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза зерновки пшеницы имеет молекулярную массу нативной молекулы около 167 кДа, состоит из двух субъединиц - около 73 и 77 кДа, по энзиматическим характеристикам имеет сходство с протеиндисульфид оксидоредуктазами из животных тканей и, вероятно, принадлежит к суперсемейству тиоловых оксидоредуктаз.

5. Дисульфидредуктаза зерна пшеницы является глутаредоксин подобным белком и функционирует в редуцирующей системе НАДФН/глутатион редуктаза/GSH/ТПДО.

6. Экзогенная дисульфидредуктаза из зерновки пшеницы  снижает показатель агрегации глютениновых белков на 25-30 % и увеличивает растяжимость теста на 11-50 % у разнокачественных сортов. Это указывает на специфичность ТПДО к межмолекулярным SS связям глютенина.

7. Локусы количественных признаков (QTLs), ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы в зерне мягкой пшеницы, картированы на хромосомах 4A, 5D, 6A и 7D. Положение этих локусов на хромосомах  совпало с положением локусов, ассоциированных с показателями физических свойств клейковины.

8. Высокая активность дисульфидредуктазы в прорастающей зерновке свидетельствует об участии фермента в подготовке протеолитической деградации глютениновых агрегатов при прорастании.

9. Обнаружено очень высокое содержание глютелинов в семенах дикого злака перловник Турчанинова (Poaceae) (до 80 - 90 % от белкового комплекса семян), что характерно для представителей древних таксонов. Гипотетически, редуцирующие системы, подобные ТПДО, играют важную роль в прорастании семян злаков из филогенетически древних таксонов.

10. Экспериментально подтверждена гипотеза, что модификационная изменчивость показателей качества клейковины обусловлена функционированием в созревающей зерновке пшеницы эндогенных ферментов тиол-дисульфидного метаболизма. В обобщающей схеме показано, что в созревающей зерновке ферменты вовлечены в процесс полимеризации глютенина при образовании разветвленного глютенина и нерастворимых полимеров клейковины. Эндогенные оксидоредуктазы формируют суммарный SS/SH статус муки и влияют на образование клейковины при замесе теста.

Список основных работ по теме диссертации

Публикации в изданиях из перечня ВАК

1. Труфанов В.А., Кичатинова С.В. Дисульфидредуктазная и тиолоксидазная активности созревающих семян пшеницы//Прикладная биохимия и микробиология. 1989. Т.25. С.361-367.

2. Труфанов В.А., Кичатинова С.В., Шатилов В.Р., Кретович В.Л. Ферменты тил-дисульфидного обмена белков (обзор)//Прикладная биохимия и микробиология. 1990. Т.26(1), С.3-10.

3. Кичатинова С.В., Труфанов В.А., Пермяков А.В. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности клеточных органелл зерновки пшеницы//Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т.29(3), С.412-417.

4. Пермяков А.В., Кичатинова С.В., Труфанов В.А. Дисульфидредуктазная и тиолоксидазная активности в зависимости от содержания низкомолекулярных тиолов в зерновке пшеницы//Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т.29(5) С.728-734.

5.  Труфанов В.А., Кичатинова С.В., Пермяков А.В. Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их действие на белки клейковины//Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т.35(2). С.219-222.

6. Труфанов В.А., Кичатинова С.В., Пермяков А.В., Казарцева А.Т. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности зерна пшениц Triticum aestivum L. и их технологические  свойства //Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т.36(1), С.76-79.

7. Осипова С.В., Пермяков А.В., Митрофанова Т.Н., Дударева Л.В., Труфанов В.А. Характеристика тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерна пшеницы Тriticum aestivum L.//Биохимия, 2005. Т.70,  вып. 8. C. 1130-1136.

8. Osipova S.V., Permyakov A.V., Mitrofanova T.N., Trufanov V.A., Ermakova M.F., Chistyakova A.K., and Pshenichnikova T.A. Thiol:proteindisulphide oxidoreductase of wheat grain: Activity in maturing wheat kernels, and relationship with rheological properties of dough//Cereal Research Communication. 2007. 35(3). P.1477-1486.

9. Осипова С.В., Пермяков А.В., Митрофанова Т.Н., Труфанов. В.А. Способ получения тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из растительного сырья //Пат. 2310648  Российская Федерация, МПК(51) С12N  9/00 C12N 9/02.№ 2004125010/13; заявл. 16.08.2004; опубл. 20.11.2007, Бюл. № 32.

10. Пшеничникова Т.А., Осипова С.В., Пермякова М.Д., Митрофанова Т.Н., Лохвассер У., Рёдер М., Бернер А. Картирование локусов количественных признаков (QTL) ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы и липоксигеназы в зерне мягкой пшеницы Triticum aestivum L. Генетика. 2008.Т.44(5). С.654-662..

11. Osipova S., Dudareva L., Bondarenko N., Nasarova A., Sokolova N., Obolkina L., Timoshkin O. Temporal variation in fatty acid composition of Ulotrix zonata (Chlorophyta) from ice benthic communities of Lake Baikal// Phycologia, 2009. V.48(2), P.130-135.

12. Бондаревич Е.А., Осипова С.В. Высокое содержание глютелинов в семенах реликтового злака Melica turczaninowiana (Poaceae) //Журнал СФУ. Биология. 2010. Т.3(4).

С.384-390.

13.  Осипова С.В., Пермякова М.Д., Пшеничникова Т.А., Ермакова М.Ф. Активность липоксигеназы и глутатион-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы в зерновках межсортовых замещенных линий пшеницы Triticum aestivum L. с различным качеством клейковины// Физиология и биохимия культурных растений. 2011. (принята к печати)

14. Osipova S.V., Permyakov A.V., Permyakova M.D., Davydov V.A., Pshenichnikova T.A., Brner A. Tolerance of prolonged drought among a set of bread wheat chromosome substitution lines //Cereal Research Communication. 2011.V.39(3).

15. Osipova S.,  Permyakov A.,  Permyakova M.,  Pshenichnikova T.,  Brner A. Leaf dehydroascorbate reductase and catalase activity is associated with soil drought tolerance in bread wheat// Acta Physiologiae Plantarum (принята к печати)

Материалы международных  конференций

16. Trufanov V.A., Osipova S.V., Permyakova M.D., Mitrofanova T.N., Pshenichnikova T.A., Maystrenko O.I.//SH/SS metabolism enzyme activity and gluten quality of wheat lines with intervarietal substitution of 1 and 6 homoeoloqical groups of chromosomes //EWAC Newsletter. Proc. 11-th EWAC Conference, Novosibirsk, 2001, P.176-180 (Ed.A.J.Worland and T.A.Pshenichnikova).

17. Pshenichnikova T.A., Ermakova M.F., Popova R.K.,  Osipova S.V. Trufanov V.A. Development and use of precise genetic stocks for study of technological  parameters of grain in parameters of grain in common wheat//EWAC Newsletter. Proc. 12-th EWAC Conference. Norwich (UK). 2003. P.21-24 (Ed.A.Brner, J.W.Snape and C.N.Law).

18. Osipova S.V., Permyakov A.V.,  Mitrofanova T.N., Trufanov V.A., Ermakova M.F., Chistyakova A.K., and  Pshenichnikova T.A. The role of disulfide-reductase in determination of technological properties of grain in Triticum aestivum L.//EWAC Newsletter. 2006. Proc. 13-th EWAC Conference 27 June- 1 July 2005, Prague (Czech Republic). P.106-108 (Ed. A.Brner, K.Pankova and J.W.Snape).

19. Ermakova M.F., Pshenichnikova T.A., Shchukina L.V., Osipova S.V., Mitrofanova T.N., Brner A., Lohwasser U., Rder M. The history of the development of precise genetic stocks of bread wheat in Novosibirsk and their application for investigation of grain quality//EWAC Newsletter. Proc. 14-th EWAC Conference 6-10 May 2007, Istanbul, Turkey, 2008. P. 12-17 (Ed. A.Brner and J.W. Snape).

20. Ermakova M.F., Pshenichnikova T.A., Chistyakova A.K., Shchukina L.V., Osipova S.V., Rder M., Brner A. From cytogenetic to molecular approach and backwards: investigations of grain quality in bread wheat. Proc. 11-th International Wheat Genetics Symposium, Brisbane 24- August 2008 (ed. by R.Appels, R.Eastwood, E.Lagudah, P.Langridge, M.Mackay, L.McIntyre, P.Sharp) Sydney, Sydney University Press, paper № 244.

21.  Osipova S.V., Bondarenko N.A., Obolkina L.A, Permyakov A.P, Dudareva L.V., Timoshkin O.A.  Сommunities in the ultrapure ice of Lake Baikal: distinctive characteristics and adaptive strategies of the inhabitants//Proc. 20th IAHR Intern. Symp. on Ice, 14-17 June 2010, Lahti, Finland (ISBN 978-952-10-5979-7), paper № 40.

22. Osipova S.V.,  Permyakov A.V.,  Permyakova M.D.,  Kovalenkova M.V.,  Pshenichnikova T.A., Brner A. Leaf dehydroascorbate reductase and catalase activity is associated with drought  tolerance in bread wheat//The Intern. Conf. УPlant Genetics, Genomics and BiotechnologyФ (PlantGen 2010), Novosibirsk, Russia, June 7-10, 2010. p. 72.

Сборники статей и ежегодники

23. В.А.Труфанов, С.В.Кичатинова, И.Н.Трофимова Дисульфидредуктазная и сульфгидрилоксидазная активности пшеницы//Физиология роста и развития растений в условиях Сибири. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР. 1985. С.54-57.

24. С.В.Кичатинова, В.А.Труфанов. К вопросу о субклеточной локализации ферментов тиол-дисульфидного обмена//Физиология роста и развития растений в условиях Сибири. Иркутск:СИФИБР СО АН СССР. 1987. С.54-56.

25. Osipova S.V., Trufanov V.A., Pshenichnikova T.A. Disulfide reductase activity and gluten quality in common wheat lines with intervarietal substitution for chromosomes of homoeological groups 1 and 6//Annual Wheat Newsletter. 2002.V.48 P.147-148.

26. Osipova S.V., Mitrofanova T.N., Permyakov A.V., Trufanov V.A. Thiol:protein disulfide oxidoreductase (EC 1.8.4.2) in wheat caryopses. A. Substrate specificity of a homogenous preparation//Annual Wheat Newletter. 2004. V. 50. P.141-142.

27. Osipova S.V., Permyakov A.V., Mitrofanova T.N.,  Trufanov V.A. Thiol:protein disulfide oxidoreductase (EC 1.8.4.2) in wheat caryopses. B. Enzymatic characteristics// Annual Wheat Newletter. 2004. V. 50. P.143-144.

28. Osipova S.V., A.V Permyakov., T.N. Mitrofanova., V.A. Trufanov . Thiol:protein disulfide oxidoreductase (EC 1.8.4.2) in wheat caryopses. C. Impact on aggregation of wheat storage proteins//Annual Wheat Newletter. 2004. V. 50. P.144-145.

29. Osipova S.V., Permyakov A.V., Mitrofanova T.N., Pshenichnikova T.A., Ermakova M.F.,  Chistyakova A.K. Impact of disulfidе reductase from wheat caryopsis on certain technological characteristics of wheat flour and dough//Annual Wheat Newletter. 2005. V. 51. P. 126-127.

30. Permyakov A.V., Osipova S.V., Mitrovanova T.N. Isoforms of glutathione reductase in wheat grains Triticum aestivum L//Annual Wheat Newletter. 2005. V.51. P.127-128.

Список сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДЭАЭ - диэтиламиноэтил

ДДС-Na Ц  додецил сульфат натрия

ИДК-1 - прибор, условные единицы которого характеризуют  силу пшеницы

ОГ - липоксигеназа

ТО - тиолоксидаза

ТПДО - тиол:протеиндисульфид оксидоредуктаза

РИЛ - рекомбинантные инбредные линии

ЗЛ - межсортовые замещенные линии

GSH - восстановленный глутатион

QTL(s) - локус(ы) количественных признаков

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии