Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству  

ОБЪЯВЛЕНИЕ

Панкова Екатерина Витальевна

Фено -, генотипическая изменчивость бруцелл и разработка экспресс -метода оценки их иммуногенности

  06.02.02

биологические науки

Д-220.012.01

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

  420075, г. Казань, Научный городок -2, тел. (843)  239.53.20

  E mail: vnivi@mail.ru

  Предполагаемая дата защиты диссертации - 13  ноября  2012г.

На правах рукописи

Панкова Екатерина Витальевна

ФЕНО -, ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БРУЦЕЛЛ И РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС - МЕТОДА ОЦЕНКИ ИХ ИММУНОГЕННОСТИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ)

Научный руководитель:	доктор ветеринарных наук, доцент Плотникова Эдие Миначетдиновна

Официальные оппоненты:	заведующая лабораторией иммунологии ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ, доктор биологических наук, профессор Хисматуллина Наиля Анваровна
	профессор кафедры эпизоотологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины, доктор ветеринарных наук Харитонов Михаил Васильевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллёза и туберкулёза животных (г. Омск)

Защита состоится л13 ноября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГБУ Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности (420075, г. Казань, Научный городок-2, ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ (г.Казань).

Автореферат разослан л10 октября 2012 г. и размещен на официальном сайте ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak2.ed.gov.ru.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                        Степанов В.И.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате экологического воздействия на возбудителя бруцеллеза антропогенных факторов (длительная персистенция в организме носителей, промежуточных хозяев, длительное хранение музейных культур, широкое применение антибиотиков и дезинфицирующих средств, массовая вакцинация животных), участились случаи появления измененных форм бруцелл, в частности R- и L-форм (Триленко П.А., 1976; Проворский С.В. с соавт., 1981; Хузин Д.А., 1990; Плотникова Э.М. с соавт., 1994).

Известно, что в процессе хранения музейных культур эпизоотических и вакцинных штаммов нередко происходят изменения как фенотипических, так и генетических характеристик, отражаясь на основных свойствах - вирулентности эпизоотических штаммов и иммуногенности вакцинных штаммов. Определение принадлежности таких атипичных культур к роду Brucella, а также их дифференциация от антиген - родственных гетерологических микроорганизмов, а также иммуногенности вакцинных штаммов по общепринятым методам весьма трудоемки, продолжительны и требуют значительных материальных затрат (Салмаков К.М. с соавт., 2008).

Успешное решение проблемы бруцеллеза возможно только при внедрении в широкую практику эффективной научно-обоснованной системы мероприятий с использованием наиболее совершенных средств и методов диагностики и специфической профилактики болезни, актуальность разработки которой возрастает в последнее время с учетом изменения форм ведения сельского хозяйства (Иванов А.В. с соавт., 2009).

Важное место в комплексе противобруцеллезных мероприятий занимает специфическая профилактика (Иванов А.В. с соавт., 2008; Иванов А.В. с соавт., 2012). В последние годы в нашей стране широко используется вакцина из слабоагглютиногенного штамма B.abortus 82. В ряде мест ее применение способствовало достижению определенных успехов в борьбе с бруцеллезом крупного рогатого скота (Салмаков К.М., 1980; Никифоров И.П. с соавт., 1981; Исхаков О.З. с соавт., 1981, 1986; Черкасов В.В., Ростов А.П., 1981; Косилов И.А. с соавт., 1986). Однако существенным недостатком этой вакцины является ее высокая реактогенность, обуславливающая большой процент абортов у стельных животных (Шумилов К.В. с соавт., 1983; Скляров О.Д., с соавт., 2004). Кроме того, при проведении противобруцеллезных мероприятий (иммунопрофилактика и антибиотикотерапия) в очагах инфекции с использованием указанной вакцины и антибиотиков резко снижается лечебно-профилактический эффект этих средств, что связано с губительным действием применяемых антибиотиков не только на возбудителя инфекции, но и на вакцинные штаммы бруцелл. Использование для этих целей пенициллинчувстви-тельного (B.abortus 82 Пч) и стрептомицинрезистентного (B.abortus 82 St) вариантов шт. 82, также малоэффективно, поскольку эти антибиотики при бруцеллезе малоэффективны и, во-вторых, они высокотоксичны (Кайтмазова Е.И., 1962).

Наиболее перспективным в этом направлении является использование антибиотиков широкого спектра действия, в частности ципролета, который является гораздо менее токсичным и обладает более широким терапевтическим действием (Плотникова Э.М. с соавт., 2009).

Учитывая, что оценка иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл на сегодняшний день несовершенна, поскольку она предполагает обязательное последующее заражение иммунизированных животных вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза, диктуется необходимость проведения исследований в этом направлении (Григорьева Г.И. с соавт., 1998).

Из вышеуказанного следует, что разработка простых и надежных методов идентификации бруцелл (в т.ч. измененных форм) и определение иммуногенности вакцинных штаммов с использованием достижений современной биотехнологии (состава мембранных белков, гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК, а также по способности синтеза медиаторов иммуногенеза-цитокинов), является актуальной задачей ветеринарной медицины.

Цель и задачи. Целью исследований явилось изучение влияния различных факторов на фено-, генотипические свойства бруцелл и разработка экспресс - метода оценки их иммуногенности.

Исходя из цели, на решение проблемы были поставлены следующие задачи:

- изучить культурально-морфологические и биохимические свойства музейных и эпизоотических штаммов бруцелл;

- изучить полипептидный состав экзобелков бруцелл;

- провести сравнительный анализ степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма животных-носителей возбудителя;

- разработать и апробировать способ оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл по их цитокининдуцирующей способности.

Научная новизна. Впервые изучены в сравнительном аспекте культурально - морфологические, биохимические, антигенные свойства, полипептидный состав и степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК 58 культур бруцелл производственных, музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма носителей возбудителя животных.

Дана сравнительная оценка эффективности методов оценки фенотипических и генотипических характеристик различных штаммов бруцелл для их достоверной идентификации и дифференциации.

Установлена корреляция между иммуногенностью вакцинных штаммов и их способностью индуцировать синтез медиаторов иммуногенеза - цитокинов. Предложен способ использования цитокинового профиля сывороток привитых испытуемыми штаммами животных в качестве оценочного критерия иммуногенности потенциальных вакцинных препаратов.

Практическая значимость. На основании изучения фенотипических, генотипических и цитокининдуцирующих свойств различных штаммов бруцелл получен антибиотикорезистентный вариант - B.abortus 82 - и предложен для дальнейшего изучения как перспективный штамм в качестве исходного для получения вакцины против бруцеллеза животных.

Предложен для практики способ экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл путем определения цитокинового профиля сывороток крови животных, иммунизированных испытуемыми вакцинными препаратами.

Результаты исследований использованы при составлении Методических рекомендаций по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени, утв. директором ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ проф. Ивановым А.В. 11 октября 2011 г.; Методических указаний по применению иммуноферментного анализа (ИФА) для серодиагностики бруцеллеза и Временной инструкции по изготовлению и контролю набора диагностических препаратов для дифференциальной диагностики бруцеллеза, утв. начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ Камаловым Б.В. 26 июля 2011 г.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научных сессиях Ученого совета ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ по итогам НИР за 2008 - 2012 гг., на Международных научно-практических симпозиумах и конференциях (г. Саратов, 2011; г. Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- фенотипические и генотипические характеристики штаммов бруцелл в зависимости от персистенции в различных условиях;

- разработка способа экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл методом иммуноферментного анализа;

- результаты апробации эффективности способа оценки иммуногенности полученного штамма B.abortus 82Ц.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 198 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов исследований, выводов, практических предложений и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 26 таблицами и 11 рисунками. Список литературы содержит 277 наименований работ, в том числе - 89 зарубежных авторов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2008-2012 гг. в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней (музей штаммов) ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ в соответствии с тематическим планом НИР  (№ госрегистрации 01200202602).

В экспериментальных исследованиях использовали 58 штаммов бруцелл, в том числе 42 вирулентных: В.abortus, В.suis, В.melitensis и B.rangiferi, 6 вакцинных: B. abortus R-1096- (R-форма), 82- (SR-форма), 82Ц- (SR-форма), 82-Пч- (SR-форма), 19- (S -форма), Rev-1- (S-форма) и 10 эпизоотических штаммов вида В.rangiferi и В.suis, выделенных из организма диких оленей, волка, собак, горностая, дикого и клеточного песца, свиньи, а также 4 гетерологичные культуры: (Yersinia enterocolitica 0-9, Salmonella Dublin, Chlamydiales, Francisella tularensis), полученные из Щелковского биокомбината, музея штаммов ВГНКИ и музея штаммов лаборатории ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ; 12 видов антигенов бруцелл, 17 видов гипериммунных, антивидовых сывороток и антисывороток, диагностикумы собственного и производственного изготовления.

В экспериментальных исследованиях, производственных и комиссионных испытаниях были использованы: 320 белых мышей живой массой 18-20 г, 180 морских свинок живой массой 400-450 г, 6 кроликов живой массой 2,0-3,5 кг.

В рутинных микробиологических и иммунологических исследованиях применяли различные стандартные растворы, питательные среды, метаболиты, биохимические реактивы, ферменты, стимуляторы иммуногенеза, красители.

Фенотипические свойства бруцелл изучали путем использования культурально-морфологических, серологических, бактериологических, имму-нологических и других методов исследований по общепринятой схеме ФАО/ВОЗ.

Биохимические, тинкториальные и биологические свойства иссле-дуемых культур определяли согласно общепринятым в микробиологии бруцеллеза методам (Студенцов К.П., 1975).

Культуры бруцелл выделяли из организма привитых, экспериментально и спонтанно зараженных животных бактериологическим методом. Выделенные культуры бруцелл идентифицировали, используя реакцию агглютинации на стекле с применением S- и R-сывороток. Учитывали индекс инфицированности (ИИ), индекс веса селезенки (ИВС) и процент иммунных животных.

Индекс веса селезенки (ИВС) определяли по формуле:

ИВС=	Вес селезенки (г) х 1000
	Вес морской свинки (г)

Интенсивность обсеменения организма морских свинок культурами бруцелл вычисляли по формуле:

Х=	а 100	, где
	в с

X - индекс инфицированности (ИИ) в %;

а - число органов и лимфатических узлов, из которых выделены культуры бруцелл;

в - число морских свинок в опыте;

с - число органов и лимфатических узлов, взятых для посева от каждого животного.

Определение вирулентных свойств культур проводили в опытах на 50 морских свинках и белых мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по определению вирулентности штаммов бруцелл на лабораторных животных (1984). О степени вирулентности культур судили по количеству павших мышей в каждой группе путем определения летальной дозы, вызывающей гибель 50% животных в группе (LD50), вычисленной по методу Рида и Менча.

Изучали антигенные и иммуногенные свойства у штаммов-изолятов, выделенных из организма животных спонтанно зараженных возбудителем бруцеллеза, а также длительно хранившихся музейных культур. Антигены бруцелл выделяли непосредственно из микробной клетки путем физико-химического воздействия на клетку УФ - лучами, термо - водно - солевого, этанолового, фенолового, кислотного экстрагирования и ультразвукового дезинтегрирования, используя методы, предложенные  Ременцовой М.М. с соавт. (1979); Фоминым А.М. (1984); Diaz R. е.а. (1968), Dubray G. (1983).

ипополисахаридный антиген из S- форм бруцелл (шт.19, 99) выделяли по методу Stiller I.M., Nielsen K.H. (1983), Nielsen K.H. e.a. (1983) водно- фенольным методом с последующей обработкой 0,5 N NaOH (конечная концентрация 0,25N NaOH) при 560С в некоторой модификации.

Качественный и количественный состав полисахаридов устанавливали с использованием антронового реактива и метода хроматографического анализа на бумаге в системе бутанол - уксусная кислота - вода.

Белок в антигенных препаратах определяли по методу Lowry (1951), а в присутствии неионного детергента-тритона Х-100 - по методу Chi-Sun Wang, Smith R.L. (1975). Получение ЛПС и его концентрацию определяли по методу Weisbach A., Hurwitz J. (1984). Антигены внешней мембраны гладких (S-) и шероховатых (SR-) форм бруцелл получали путем действия на микробные клетки неполным детергентом-тритоном Х-100 и хелати-рирующим агентом-ЭДТА (Deiterich D. e.a., 1977). Серологическую активность полученных антигенов тестировали в непрямом сэндвич - варианте ИФА с использованием иммуноферментных конъюгатов на основе соответствующих меченых пероксидазой антисывороток.

Полипептидный состав белков внешней мембраны бруцелл изучали электрофоретически по методу Laemmi U.K. (1969). Электрофорез белков проводили в 7,5% -ном полиакриламидном геле, денситометрировали на микрофотометре ИФО-451.

Для дифференциации штаммов бруцелл, выделенных от диких животных, а также длительно хранившихся в музее штаммов, проводили генодиагностические исследования с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Выделение ДНК, подготовку проб и проведение реакции ПЦР-РВ осуществляли в соответствии с разработанными сотрудниками ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ Методическими рекомендациями по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (Казань, 2011). Для постановки ПЦР праймеры сконструировали в программе Vector NTI. При проведении реакции использовали Tag-полимеразу фирмы Сиб Энзим и олигонуклеотида фирмы Синтол.

С целью изучения гуморального иммунитета в исследованиях применяли серологические реакции: роз - бенгал пробу (РБП) с роз - бенгал антигеном, агглютинации (РА), пассивной гемагглютинации (РПГА), связывания комплемента (РСК) и иммуноферментный анализ (ИФА) с единым бруцеллезным и R-антигенами.

При изучении клеточного иммунитета использовали опсонофагоци-тарную реакцию (ОФР), которую ставили по методике Штритера В.А. (1939), вычисляли фагоцитарное число.

Иммуногенные свойства испытуемых культур изучали в соответствии с общепринятыми методами путем контрольного заражения иммунизирован-ных животных вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза и определяя уровень защиты на фоне применения препарата с параллельными серологическими (титры специфических антител), бактериологическими (индикация возбудителя) и иммуноклеточными (опсонофагоцитарное число - ОФЧ) исследованиями. Для экспресс - метода оценки иммуногенности потенциальных вакцинных препаратов использовали in vitro и in vivo тест - систему-цитокининдуцирующую активность антигенов испытуемых культур. Уровень синтеза цитокинов определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов цитокинов и моноклональных антицитокиновых антител производства ТОО Протеиновый контур (Санкт-Петербург).

Цифровой материал подвергали статистической обработке на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики (Плохинский Н.А., 1978) с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m), среднеквадратического отклонения () и коэффициента корреляции (r) с использованием программы Microsoft Excel.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Фенотипические свойства различных штаммов бруцелл

Учитывая, что в опытах нами были использованы штаммы бруцелл различного происхождения (выделенные от различных видов домашних и диких животных), находившихся под воздействием различных факторов (резкие перепады температур при лиофилизации и длительное хранение в условиях музея, персистенция в организме животных с различным уровнем антимикробной защиты), необходимо было выяснить, насколько влияют указанные факторы на бруцелл в процессе взаимодействия экосистемы лмикроб + фактор воздействия.

С учетом изложенного, на 1-м этапе работы, в соответствии с 1-й задачей, проводили изучение культурально-морфологических, тинкториаль-ных, биохимических и антигенных свойств 58 штаммов различных видов бруцелл - B.abortus, В.melitensis, B.suis и B.rangiferi.

В опытах были использованы 3 группы штаммов: 1) вакцинные, длительно хранившиеся в лиофилизированном виде в условиях музея; 2) вирулентные, длительно хранившиеся в условиях музея в лиофилизирован-ном виде и 3) эпизоотические штаммы, хранившиеся в условиях музея в лиофилизированном виде, выделенные из организма домашних и диких животных.

Результаты изучения фенотипических свойств штаммов бруцелл 1-й и 2-й групп показали, что лиофилизация культур и длительное (более 5 лет) хранение их при температуре 620С не оказывало существенного влияния на культурально-морфологические, антигенные и вирулентные свойства микробов.

Однако они претерпевали некоторые изменения фенотипических свойств, которые выражались в способности продукции H2S, фагочувствительности, изменении метаболизма тионина, акрифлавина, фуксина, антибиотикочувствительности, агглютинабельности, термоагглюти-нации. Указанные изменения культурально-биохимических свойств были временными - при последующих пассажах через организм животных они приобретали типичные для этих культур исходные свойства. Исключение составил шт. B.melitensis 356, он в процессе хранения трансформировался из S- в R-форму, сохранившую стабильность и после пассажа на морских свинках - реверсии в S-форму не последовало. Степень диссоциации при этом составляла 1,8 %.

Одновременно следует отметить, что ряд культур, при применении общепринятых методов идентификации, вследствие изменения фено-типических свойств, имели отклонения от видовых признаков, а по некоторым (антигенности) - имели схожие с гетерологичными культурами (Y.enterocolitica, S.dublin) свойства, что представляло определенные трудности при их идентификации.

При параллельном изучении фенотипических свойств 3-й группы эпизоотических штаммов бруцелл, выделенных из организма домашних (свиньи, собаки) и диких (олени, песцы, зайцы, волки) животных установлено, что по ряду признаков они имели некоторые отклонения от типичных для этого вида бруцелл. В первую очередь эти изменения касались трансформации культур из S- в RS- и R-формы. Так, B.rangiferi В-307, B.rangiferi П-278 и B.rangiferi П-271, выделенные от волка, дикого песца и клеточного песца, находились в RS-форме, а B.rangiferi С-227 и B.rangiferi 226 - в R-форме, у которых этот признак при пассировании через организм морских свинок сохранялся.

RS- и R-трансформация культур сопровождалась с одновременным изменением биологических свойств, в частности, вирулентности: R-трансформанты оказались авирулентными, а RS-трансформанты - слабовирулентными. B.rangiferi шт. 0-172, выделенный от дикого оленя и B.rangiferi шт. С-227, выделенный от собаки, не лизировались фагом Тб. Указанные признаки трансформации оказались стабильными - при последующих пассажах через организм морских свинок реверсии культур к исходным признакам не наблюдалось. При этом степень диссоциации культур составляла 30%.

Таким образом, персистенция возбудителя в организме диких (волки, песцы) и домашних (собаки) животных сопровождалась значительными изменениями фенотипических свойств, что создавало определенные трудности при их идентификации.

3.2 Изучение белкового состава клеточной мембраны бруцелл

Учитывая сведения о возможности идентификации сальмонелл и микобактерий по белковому спектру (Алимов А.М., Коксин В.П., 1997), для идентификации бруцелл нами был использован метод диск-электрофореза лизатов микробов в полиакриламидном геле.

Результаты проведенных исследований показали, что основное количество полипептидов лизата клеток бруцелл распределялось в пределах молекулярных масс от 12,3 до 80 кД, где выявлялось до 24 фракций при градиенте концентрации ПААГ 12,5-20%.

При этом каждый вид бруцелл обладал определенным набором характерных фракций. Характерными для всех видов бруцелл являлось достаточно широкое расположение интенсивно окрашенных фракций по всей длине геля. По характеру расположения крупных и средних белковых фракций отмечалось сходство бруцелл видов abortus-melitensis и suis-canis. Однако имелись видовые и даже штаммовые отличия белковых фракций бруцелл. Так, например, для вида B.abortus отмечалась характерная фракция полипептидов с М.м. около 32 кД. Кроме того, у штамма B.abortus 54 имелись в спектре белков еще две мажорные фракции с М.м. 64 кД и 36 кД.

Результаты изучения белкового спектра бруцелл различного происхождения показали межвидовую и внутривидовую общность и отличия. Так полипептид с молекулярной массой 37-40 кД, выявляемый у штаммов В.abortus и B.melitensis, отсутствовал у других видов бруцелл. В отличие от вида B.abortus, у эпизоотических штаммов B.suis и B.rangiferi, независимо от объекта выделения (олень, заяц, песец, волк), были выявлены характерные для данных видов две низкомолекулярные пептидные фракции с М.м. 25-30 кД.

Таким образом, установлено, что белковый спектр экзопродуктов бруцелл имел уникальный характер. Вместе с тем можно выделить и общие для всех видов признаки по наличию крупных фракций. На наш взгляд, сравнительное изучение электрофоретических характеристик экзобелков бруцелл может быть использовано при штаммовой дифференциации этих бактерий.

Однако в условиях воздействия на бруцеллы экологических факторов (дезинфицирующих средств, антибиотиков, высоких и низких температур и т.д.) происходят значительные изменения таксономических признаков возбудителя, что создает трудности при его идентификации. Поэтому использование общепринятых методов идентификации бруцелл в таких случаях нередко приводит к ошибочным результатам.

3.3 Изучение степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК у различных видов и штаммов бруцелл

Как показали проведенные ранее исследования, наиболее достоверным методом ускоренной идентификации микроорганизмов бруцелл является определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей их ДНК.

В связи с этим проводили генетическую идентификацию тест-штаммов в реакции ДНК-ДНК гибридизации с целью подтверждения или исключения их принадлежности к роду Brucella.

При этом нами были подвергнуты анализу 30 культур, из которых 14 - вирулентных, 10 - эпизоотических (выделенных из органов диких и домашних животных в основном - вида B.suis, B.rangiferi) и 6 - вакцинных штаммов, хранившихся в лаборатории музей штаммов в течение 5 и более лет.

Для определения степени гомологии нуклеотидных последователь-ностей вышеуказанных штаммов бруцелл различного происхождения, использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени - ПЦР-РВ.

Молекулярно-генетические исследования проводили в 2 этапа: выделение ДНК и постановка ПЦР-РВ.

Для постановки полимеразной цепной реакции, сконструировали праймеры в программе Vector NTI, используя Taq-полимеразу фирмы СибЭнзим и олигонуклеотиды фирмы Синтол.

Результаты ПЦР-РВ анализа различных видов бруцелл с использованием 3 вариантов ПЦР (ПЦР-1, мультиплекс ПЦР-2 и ПЦР-3) и 6 видов праймеров (P1 (bsp31), P2 (IS711), P3 (IS711), P4 (R0952), P5 (BMEU 0635-0636) и P6 (A0504) показали, что все виды бруцелл проявляли положительную реакцию с указанными праймерами, т.е. все они принадлежали роду Brucella, однако при этом каждый вид имел свои особенности. Так, В.abortus вступал в ПЦР с праймерами Р1 и Р2; В.melitensis - Р1 и Р3; В.suis - Р1 и Р4; В.ovis - Р1 и Р6; В.canis - Р1, Р4 и Р5.

Для подтверждения достоверности реакции лгнездового варианта ПЦР, параллельно проводили идентификацию изучаемых культур по их характеру флуоресценции в зависимости от номера цикла. Установлено, что использованные штаммы бруцелл имеют существенные отличия по характеру флуоресценции в зависимости от цикла амплификации и каждому виду бруцелл свойственна своя специфика флуоресценции.

Таким образом, в результате проведенных в первой серии опытов по идентификации различных видов музейных штаммов бруцелл с использованием 6 различных праймеров установлено, что все они имели идентичные для рода Brucella ДНК, которая выявлена у всех бруцелл при использовании праймера Р1 (bsp31) в варианте ПЦР 1.

Полученные в 1-й серии опытов положительные результаты по генотипической идентификации вирулентных и вакцинных штаммов бруцелл послужили основанием для продолжения опытов по ПЦР идентификации эпизоотических штаммов - изолятов бруцелл, выделенных из организма сельскохозяйственных (свиньи) и диких (олени, песцы, волки, зайцы) животных, обитающих на Крайнем Севере, Калининградской области РФ, Польше и Казахстане.

Поскольку выделенные из организма диких животных варианты бруцелл (B.rangiferi и B.suis) по фенотипическим свойствам имели значительные отличия от референтного штамма B.suis 1330, сочли необходимым провести определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК эпизоотических штаммов, выделенных из органов и тканей диких животных-носителей бруцелл. Результаты молекулярно-генетических исследований в ПЦР-РВ показали, что степень гомологии нуклеотидных последовательностей их ДНК, независимо от показателя вирулентности или степени диссоциации, была практически однозначной в пределах 85,0-100%.

Эпизоотические штаммы B.suis 117, B.suis 1005 (биотип 3) и B.suis 164, независимо от источника выделения, различия регионов  и степени диссоциации (S-, SR-формы), имели высокую степень гомологии с ДНК референтного штамма B.suis 1330 (84,3-100,0). Эти данные свидетельствуют о тесном генетическом родстве бруцелл и, что их SR-диссоциация не приводит к значительным перестройкам в нуклеотидной последовательности их ДНК, независимо от показателя вирулентности или степени диссоциации, подтверждающим или исключающим принадлежность микроорганизмов к роду Brucella, в то же время ДНК фенотипически сходных микроорганизмов (Y.enterocolitica) и общие нуклеотидные последовательности ДНК микроорганизмов рода Brucella практически отсутствуют - степень их гомологии составляла всего 0,1-0,5%.

Аналогичную степень гомологии с ДНК референтного штамма имели штаммы бруцелл-изолятов, выделенных из организма диких северных оленей, (степень гомологии 100,0%), волка (91,3%), собак (89,7% и 93,5%), горностая (96,1%), дикого песца (90,3%), клеточного песца (88,9%).

Таким образом, полученные данные подтверждают, что характерной особенностью микроорганизмов рода Brucella является высокая гомологичность их ДНК и отсутствие гомологии с представителями других родов. При этом изменчивость бруцелл (диссоциация, трансформация и т.п.) не ведет к заметной дивергенции их генома. Следовательно, метод ДНК-ДНК гибридизации не только дополняет общепринятую систему тестов идентификации бруцелл, но и во многих случаях является единственным достоверным показателем принадлежности штаммов к роду Brucella.

3.4 Изучение влияния различных факторов на иммуногенную активность вакцинных штаммов бруцелл

Как было показано выше, под воздействием экологических факторов (резкие перепады температур, персистенция в организме с различным уровнем антимикробной защиты), возбудитель бруцеллеза претерпевал ряд фенотипических и генотипических изменений. При этом наиболее высоким бактериоизменяющим свойством обладают такие факторы как бактериофаги и антибиотики, что послужило основанием для получения из вирулентного штамма высокоиммуногенного мутанта B. abortus 82 (Салмаков К.М. 1980).

Однако, несмотря на высокую иммуногенную активность шт. 82, при проведении противобруцеллезных мероприятий в очагах с использованием указанной вакцины для специфической профилактики и антибиотикотерапии приводит к существенному снижению эффективности иммунопрофилак-тического препарата, что связано с губительным действием антибиотиков как на вирулентные, так и вакцинные штаммы бруцелл.

Известно, что для лечения бруцеллеза широко применяют пенициллин, стрептомицин, левомицетин и другие антибиотики. Однако высокая токсичность указанных антибиотиков, особенно стрептомицина, препятствуют широкому применению указанных препаратов при проведении противобруцеллезных мероприятий.

Учитывая широкий спектр антибиотического (грамположительные и грамотрицательные бактерии) и терапевтического действия, включая заболевания опорно-двигательного аппарата и мочеполовых органов нового антибиотика - ципролета, для получения антибиотикоустойчивого мутанта вакцинного штамма бруцелл в качестве индуктора использовали указанный антибиотик из класса фторхинолонов.

Путем выращивания исходного штамма 82 В. abortus на средах с возрастающими концентрациями (5, 10, 20 мг/л) ципролета, на 50-м пассаже нами был получен антибиотикорезистентный вариант B.abortus 82 Ц, который сохранял стабильность приобретенного свойства при 50-кратных пассажах на питательных средах и 10-кратном пассаже через организм морских свинок.

Установлено, что 10-кратное пассирование ципролетрезистентного мутанта через организм морских свинок не оказывало влияния на иммунобиологические свойства - культура, независимо от кратности пассажа, сохраняла исходные свойства, положительно реагируя с R-, S- сыворотками в РСК и ИФА тест-системах, равномерно распределяясь (обсеменяя) по органам и тканям (от 35 до 70% в зависимости от органа) при индексе высеваемости селезенки (ИВС) от 1,2 до 2,5 в зависимости от кратности пассажа.

Сохранение одного из основных свойств - антигенности, у полученного антибиотикорезистентного мутанта B.abortus 82 Ц, послужило основанием для оценки его иммуногенности.

Результаты опытов, проведенных на 30 морских свинках, иммунизированных используемым штаммом с последующим заражением вирулентной культурой B.abortus 54 показали, что наиболее выраженный защитный эффект отмечен в опытах с вакциной из антибиотикорезистент-ного варианта B.abortus 82 Ц. Это подтверждается не только количеством устойчивых к заражению животных, но и выраженностью иммунологических реакций.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что антибиотикорезистентный вариант вакцинного штамма B.abortus 82 - обладает более выраженной иммуногенной активностью по сравнению с исходным штаммом и может быть использован в дальнейшем  при изготовлении препаратов для экстренной профилактики бруцеллеза.

3.5 Разработка экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл

Учитывая, что оценка иммуногенности вакцинных штаммов на сегодняшний день несовершенна, поскольку она предполагает обязательное последующее заражение иммунизированных животных вирулентным штаммом возбудителя инфекции, на завершающем этапе работы проводили исследования по разработке экспресс - метода оценки иммуногенности потенциальных вакцинных штаммов.

При разработке способа в качестве рабочей гипотезы мы использовали известный в области вакцинологии принцип - инкубирование лимфоцитов в присутствии антигенов противочумных и противохолерных вакцинных штаммов и по уровню индуцированного ими синтеза цитокинов (интерферона, интерлейкина (ИЛ-1) и фактора некроза опухолей (ФНО-) в ИФА) и определение иммуногенности вакцин.

Используя названный принцип, путем культивирования лимфоцитов в присутствии используемых антигенов тест-штаммов в in vitro тест-системе, тестировали супернатанты культуральной жидкости на наличие иммунорегуляторных цитокинов (фактора некроза опухолей, интерлейкина-1 и колониестимулирующего фактора) в ИФА с моноклональными антицитокиновыми антителами, производства ООО Цитокин. По соотношению указанных цитокинов определяли иммуногенность изучаемых штаммов бруцелл.

Результаты исследований показали, что по способности индуцировать синтез иммунорегулирующих цитокинов (ФНО-, ИЛ-1, КСФ) в модельной in vitro тест-системе испытанные антигены из штаммов бруцелл образуют следующий убывающий ряд: АГ из шт. 82 Ц>АГ из шт. 82 Пч >АГ из шт. 82 >АГ из шт. 19 >АГ из шт. R-1096.

Для проверки эффективности оценки иммуногенности различных вакцинных штаммов бруцелл и установления корреляции между цитокининдуцирующей активностью штаммов и их иммуногенностью, опыты проводили на морских свинках живой массой 400-450 г. Животные были разделены на 6 групп по 10 особей в каждой и были подвергнуты иммунизации испытуемыми штаммами бруцелл. Животным 1-й группы однократно подкожно вводили вакцину из шт. 19 в дозе 0,46х109 КОЕ в объеме 1 см3 в область паха; 2-й группы - в аналогичных условиях и дозе - вакцину из штамма 82; 3-й - вакцину из штамма 82 Пч; 4-й - вакцину из шт. 82Ц; 5-й - вакцину из шт. R-1096; животных 6-й группы заражали вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза B.abortus 54М ВГНКИ (контроль заражения).

Результаты опытов показали, что при использовании вакцины из шт. 19 (1-ая группа), шт.R-1096 (5-ая группа) заразилось по 6 животных, что составляет 40% защиты. В отличие от них, в группах 2, 3, 4, иммунизированных вакцинными штаммами 82, 82Пч и 82Ц, процент защиты составил 80%, 80% и 90% соответственно. При этом установлено, что максимальный процент защиты животных после иммунизации коррелировал с уровнем цитокинов при их соотношениях 1,25 (ФНО- ): 2-2,50 (ИЛ-1): 3-3,70 (КСФ). Любые нарушения этих соотношений как в сторону увеличения или уменьшения, ведут к снижению иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов.

При повторении аналогичных опытов на других видах лабораторных животных (белые мыши, белые крысы и кролики) были получены совпадающие данные.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами разработан метод определения гомологии нуклеотидных последовательнос-тей ДНК бруцелл различного происхождения, получен антибиоти-корезистентный вариант B.abortus 82 - и разработан способ экспресс - метод оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл.

4 ВЫВОДЫ

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства 58 вирулентных, вакцинных и эпизоотических штаммов бруцелл, находящихся длительное время (более 5 лет) в лиофилизированном состоянии (в запаянных под вакуумом стеклянных ампулах) при температуре +2 - + 40С существенным изменениям не подверглись. Степень диссоциации культур (переход из S- в R-форму) составила 1,8%.
2. Подтверждено, что хранение исследованных культур микроорганизмов в лиофилизированном состоянии является оптимальным для создания и поддержания коллекции полевых, вакцинных, селекционированных и производственных штаммов.
3. Персистенция возбудителя бруцеллеза в организме различных по чувствительности к данной инфекции домашних и диких животных (свиньи, олени, волки, зайцы, песцы, горностаи) приводит к существенным изменениям фенотипических свойств культур (степень диссоциации фенотипических признаков - 30%), что затрудняет идентификацию штаммов - изолятов.
4. Установлено, что из использованных методов идентификации (фенотипические, анализ белковых спектров мембран, генотипизация) различных по происхождению бруцелл наиболее объективным критерием оценки принадлежности их к роду Brucella является степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК.
5. Показаны значительные изменения фенотипических признаков у полевых штаммов-изолятов, выделенных в различных климатогеографичес-ких зонах РФ (Крайний Север, Калининградская обл.), Казахстане и Польше, степень гомологии нуклеотидных последователь-ностей бруцелл вида B.suis и B.rangiferi находилась на высоком уровне - 84,3-100%. При этом не установлено заметной дивергенции генома бруцелл при S-SR-R-диссоциации в процессе персистенции возбудителя в макроорганизме с различным уровнем антимикробной защиты.
6. Методом культивирования исходного штамма B.abortus 82 на среде с последовательно возрастающими концентрациями (1, 2, 3, 5, 10 мг/мл) антибиотика нового поколения - ципролета, получен антибиотикорезистент-ный вариант - B.abortus 82 Ц, обладающий менее агглютиногенными, но более выраженными иммуногенными свойствами, который может быть использован в качестве вакцинного.
7. Разработан экспресс-метод оценки иммуногенности противо-бруцеллезных вакцин по цитокининдуцирующей активности антигенов в in vitro тест-системе. Установлено, что объективным критерием оценки иммуногенности испытуемых потенциальных вакцинных препаратов является антигениндуцированный синтез иммунорегуляторных цитокинов классов ФНО-, ИЛ-1 и КСФ при оптимальном соотношении их концентраций 1-1,25:2-2,25:3-3,70 соответственно.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты исследований позволяют рекомендовать применение экспресс-метода оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцин по критерию цитокининдуцирующей активности антигенов в in vitro тест-системе методом иммуноферментного определения концентрации иммунорегуляторных цитокинов ФНО-, ИЛ-1 и КСФ, оптимальное соотношение которых для иммунногенных штаммов составляет 1-1,25:2-2,25:3-3,70 соответственно.

На основании полученных данных разработаны Методические рекомендации по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени, утвержденные директором ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ 11 октября 2011 г.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Плотникова, Э.М. Разработка тест-системы на основе био- и нанотехнологий при бруцеллезе/ Э.М. Плотникова, Е.В. Панкова// Матер. Междунар. научно-практич. конф. - От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины. - Саратов. - 2011. - С.221-225.

2. Панкова, Е.В. Использование моноклональных антител для дифференциации различных штаммов бруцелл/ Е.В. Панкова, Э.М. Плотникова// Междунар. научно-практич. конф. Фармацевтические и медицинские биотехнологии (www.mosbiotechworld.ruf) - М.: ЗАО Экспо биохим-технологии РХТУ им. Менделеева. - М., - 2012. - С.322-323.

3. Панкова, Е.В. Обеспечение сохранности антигенных и генетических свойств штаммов возбудителей бруцеллеза/ Е.В. Панкова// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань. - 2012. - Т.209. - С.257-261.

4. Панкова, Е.В. Фенотипический контроль стабильности при хранении музейных и производственных штаммов возбудителей бруцеллёза/ Е.В. Панкова // Ветеринарный врач. - Казань. - 2012. - С.23-24.

5. Иванов, А.В. Степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК бруцелл/ А.В. Иванов, Е.В. Панкова, Р.М. Ахмадеев, Э.М. Плотникова// Достижения науки и техники АПК. - М. - 2012. С.83-84.

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству