Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Яковлев Андрей Георгиевич
ФЕМТОСЕКУНДНЫЕ ПРОЦЕССЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА
Специальность 03.01.02 - Биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук
Москва - 2011
Работа выполнена в отделе фотобиофизики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.
Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова
Научный консультант:
академик РАН, доктор биологических наук, профессор Шувалов Владимир Анатольевич
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор Крюков Петр Георгиевич;
доктор физико-математических наук, профессор Пащенко Владимир Захарович;
доктор физико-математических наук Чекалин Сергей Васильевич
Ведущая организация:
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
Защита состоится л 24 марта 2011 г. в 14 ч. 00 м. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория Новая.
Автореферат разослан л_____________________ 2011 г.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.
Ученый секретарь Диссертационного совета к.б.н. М.Г. Страховская - 2 -
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Фотосинтез - это глобальный биологический процесс преобразования солнечной энергии в энергию химически устойчивых соединений.
Фотосинтез растений и водорослей является основным источником кислорода и органических соединений на Земле, которые служат для питания человека и животных в настоящее время, а также запасены в виде ископаемых углеводородов. Солнечная энергия - это практически неисчерпаемый и экологически чистый вид энергии. Важность исследований процессов фотосинтеза является очевидной как с научной стороны, так и с прикладной.
Фотосинтез представляет собой совокупность сложнейших физических и химических превращений, которые начинаются с поглощения квантов света в светособирающих комплексах хлорофилла. Затем энергия возбуждения передается на реакционные центры (РЦ) фотосинтеза, представляющие собой особые пигмент-белковые комплексы в составе клеточной мембраны. Создание лазерных спектрометров сверхвысокого временного разрешения в сочетании с методами направленного мутагенеза и получением рентгеноструктурных данных о трехмерном строении ряда Р - обусловило быстрый рост объема данных о первичных этапах фотосинтеза. Эти данные имеют фундаментальный характер и формируют современные представления о мире. В результате серии быстрых реакций переноса электрона в Р - происходит первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с феноменальной квантовой (~100%) и высокой энергетической эффективностью. Универсальность структуры и функции Р - всех известных фотосинтезирующих организмов заключается в том, что первичное разделение зарядов в этих Р - происходит между синглетновозбужденным первичным донором электрона Р и производными хлорофилла. В Р - пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides, которая является классическим объектом изучения, разделение зарядов происходит вдоль фотоактивной А-цепи пигментов и заключается в переносе электрона от возбужденного димера бактериохлорофилла P* на бактериофеофитин НA за ~3 пс и далее с HA - на хинон QA за ~200 пс [Holten et al., 1980; Paschenko et al., 1985; Kaufmann et al., 1975; Rockey et al., 1975].
Проблема участия молекулы мономерного бактериохлорофилла ВА в качестве промежуточного акцептора в первичном разделении зарядов имеет многолетнюю историю и логично следует из положения ВА между Р и НА согласно рентгеноструктурным данным [Deisenhofer et al., 1984; Ermler et al., 1994]. В течение долгого времени в большом количестве лидирующих лабораторий не удавалось получить убедительные - 3 - доказательства прямого участия ВА в разделении зарядов. Во многом благодаря этому возникло представление о виртуальном участии вакантного электронного уровня ВА, находящегося выше уровня Р*, в переносе электрона от Р на НА по механизму суперобмена. Результаты пико- и фемтосекундной спектроскопии постепенно привели к пониманию основной сложности обнаружения состояния Р+ВАЦ, которая связана с тем, что время образования Р+ВА - в несколько раз превышает время его распада из-за переноса электрона с ВА - на НА [Holzapfel et al., 1989, Arlt et al., 1993]. Это приводит к малой заселенности состояния Р+ВА - в течение всего времени его существования, которое не превышает нескольких пс. Другая сложность связана с тем, что в видимом диапазоне, где проводилось подавляющее большинство измерений, спектр состояния Р+ВА - сильно замаскирован спектрами других состояний. Получить убедительное доказательство существования состояния Р+ВА - удавалось только в химически модифицированных РЦ, в которых блокирование переноса электрона на НА приводило к накоплению состояния Р+ВА - в пикосекундном диапазоне [Kennis et al., 1997]. Тем не менее, вопрос об участии молекулы ВА в переносе электрона в нативных Р - оставался во многом открытым.
Ближайшее окружение молекулы ВА может влиять на первичное разделение зарядов, динамически воздействуя на уровень свободной энергии состояния Р+ВА - или являясь составной частью пути переноса электрона. Интересной и практически неизученной стороной этой проблемы является влияние молекулы воды, обнаруженной недавно в непосредственной близости от ВА [Ermler et al., 1994]. Другим важным аспектом является выявление механизма существенного влияния молекулы тирозина М210, расположенной вблизи ВА, на первичное разделение зарядов [Hamm et al, 1993]. Кроме того, движение ядерной подсистемы, на фоне которого происходит перенос электрона, также влияет на параметры первичной реакции разделения зарядов [Vos et al., 1991, 1993].
Для решения вопроса об участии определенных мод этого движения в разделении зарядов в Р - необходима прямая регистрация первичного состояния фотопродукта методами фемтосекундной спектроскопии.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование вовлеченности молекулы бактериохлорофилла ВА и ее ближайшего окружения в первичную (физическую) фазу разделения зарядов в Р - бактериального фотосинтеза. В работе были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать участие молекулы бактериохлорофилла в А-цепи ВА в первичном разделении зарядов в Р - пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides R-26 и зеленой бактерии Chloroflexus (Cfx). aurantiacus, для чего:
- 4 - а) Определить взаимное расположение уровней свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами P+BA - и возбужденного состояния димера бактериохлорофилла Р* в Р - Rba. sphaeroides R-26;
б) Исследовать динамику формирования и распада ИК полосы поглощения аниона бактериохлорофилла BA - в процессе первичного разделения зпрядов в РЦ.
2. Исследовать влияние молекулы кристаллографической воды НОН55, входящей в состав Р - Rba. sphaeroides R-26, на процессы первичного разделения и переноса зарядов.
3. Исследовать роль тирозина М210 в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в Р - Rba. sphaeroides R-26 и в Р - мутантов по этому сайту.
4. Экспериментально и теоретически исследовать влияние коллективных движений ядерной подсистемы на процессы первичного разделения зарядов в Р - фотосинтезирующих бактерий, для чего:
а) Исследовать влияние коллективных движений ядер на населенности состояний с первично разделенными зарядами при фемтосекундном световом возбуждении;
б) Провести теоретическое моделирование первичного разделения зарядов с учетом движений ядерного волнового пакета, который формируется при фемтосекундном возбуждении РЦ;
в) Исследовать возможность когерентного переноса электрона в малоактивную В-цепь пигментов РЦ.
Научная новизна работы.
1. В результате исследования фемтосекундной динамики ИК полосы поглощения аниона мономерного бактериохлорофилла в А-цепи ВА - впервые получено прямое доказательство реального участия ВА в первичном разделении зарядов в нативных Р - Rba. sphaeroides R26 и Cfx. aurantiacus. Аналогичный вывод сделан и в отношении ряда мутантных Р - Rba.
sphaeroides. Таким образом, ВА является первичным акцептором электрона, а состояние P+BA - - первичным состоянием с разделенными зарядами в этих РЦ.
2. По результатам исследования температурной зависимости замедленной флуоресценции феофитин-модифицированных Р - Rba. sphaeroides R-26 найдено, что уровень свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами P+BA - находится ниже уровня свободной энергии возбужденного состояния димера Р* на ~550 смЦ1. Положение уровня свободной энергии P+BA - ниже аналогичного уровня Р* создает условия для реального участия молекулы ВА в переносе электрона от Р*.
- 5 - 3. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства влияния коллективных движений ядер (в форме волнового пакета) в возбужденном состоянии димера Р* на первичное разделение зарядов в нативных и мутантных Р - Rba. sphaeroides и в нативных Р - Cfx. aurantiacus. Показано, что обнаруженные осцилляции населенностей первичных состояний с разделенными зарядами отражают обратимые переходы волнового пакета ядер с поверхности потенциальной энергии Р* на аналогичные поверхности фотопродуктов. Выявлены характерные моды ядерных движений, сопряженные с переносом электрона.
4. Впервые показано, что молекула кристаллографически определенной воды НОН55, расположенная вблизи бактериохлорофилла ВА в Р - Rba. sphaeroides, оказывает сильное влияние на перенос электрона от димера бактериохлорофилла Р к ВА. Присутствие воды НОН55 ускоряет первичное разделение зарядов в ~4 раза, а ее вращение, регистрируемое при фемтосекундном возбуждении Р, модулирует населенность состояния P+BA - с частотой 32 смЦ1 и кратными частотами. Анализ влияния воды НОН55 на перенос электрона с помощью мутантов по сайту М203 выявил один из возможных наиболее эффективных путей переноса электрона от Р к ВА с участием НОН55 по цепочке полярных групп атомов NЦMg(PB) ЦNЦCЦN(HisM202)ЦHOH55ЦO=(BA).
5. Выявлена ключевая роль тирозина М210, находящегося вблизи димера Р и мономерного бактериохлорофилла ВА в Р - Rba. sphaeroides, в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов. Впервые показано, что замедление первичной реакции переноса электрона в десятки раз в мутантных РЦ, не содержащих тирозин М210, сопровождается отсутствием стабилизации разделенных зарядов в состоянии P+BAЦ. Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутантных Р - не компенсируется его введением в положение М197 или значительным увеличением разницы свободной энергии состояний Р* и Р+ВАЦ. Выявлено стабилизирующее влияние полярной ОН-группы тирозина М210 на состояние P+BA - в процессе разделения зарядов в тирозин-содержащих РЦ.
6. Впервые в мутантных Р - Rba. sphaeroides и в Р - Cfx. aurantiacus обнаружен обратимый перенос электрона в малоактивную В-цепь, вызванный когерентным движением ядерного волнового пакета. Этот перенос возникает раньше на 60-80 фс, чем аналогичный когерентный перенос электрона в фотоактивной А-цепи. Возникновение когерентного переноса электрона в В-цепи не зависит от наличия или отсутствия условий для обычного, некогерентного переноса, а определяется в основном динамикой волнового пакета.
- 6 - Научная и практическая значимость. Работа имеет выраженную фундаментальную направленность. Получена новая информация о самых ранних стадиях процессов преобразования световой энергии в энергию состояний с разделенными зарядами в реакционных центрах бактериального фотосинтеза. Полученные результаты имеют приоритетный характер и во многом задают направление исследований в данной области.
Работы по выявлению участников первичного разделения зарядов в РЦ, исследования по когерентному переносу электрона в обеих цепях РЦ, изучение роли ближайшего окружения первичного донора Р и акцептора ВА в разделении зарядов между ними - все эти направления находятся в русле мировых исследований. Данные по участию мономера бактериохлорофилла ВА в первичном разделении зарядов, по когерентным осцилляциям в первичных состояниях с разделенными зарядами, по влиянию кристаллографической воды НОН55 в переносе электрона, по ключевой роли тирозина М210 в стабилизации первично разделенных зарядов, по обратимому переносу электрона в неактивную В-цепь получены впервые. Полученные результаты могут найти применение при моделировании живых систем и создании преобразователей солнечной энергии.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Мономер бактериохлорофилла ВА является первичным акцептором электрона в Р - Rba.
sphaeroides и Cfx. aurantiacus, участвуя в двухступенчатой схеме переноса электрона от возбужденного димера бактериохлорофилла Р* к ВА и далее от ВА к бактериофеофитину НА. Этому способствует положение уровня свободной энергии состояния P+BA - ниже аналогичного уровня Р* на ~550 смЦ1.
2. Коллективные движения ядер влияют на первичное разделение зарядов в Р - Rba.
sphaeroides и Cfx. aurantiacus и визуализируются в виде осцилляций, возникающих в результате фемтосекундного возбуждения Р - в населенностях первичных состояний с разделенными зарядами и в населенности возбужденного состояния димера Р*.
Временные и спектральные особенности данных осцилляций отражают движение ядерного волнового пакета по поверхностям потенциальной энергии указанных состояний. Теоретическое моделирование коллективных ядерных движений с помощью теории Редфилда в приближении двух независимых координат объясняет осциллирующий характер процессов первичного разделения зарядов и формирования соответствующих состояний с разделенными зарядами в РЦ.
3. Молекула воды НОН55, расположенная в Р - Rba. sphaeroides между димером бактериохлорофилла Р и мономером бактериохлорофилла ВА, ускоряет перенос электрона от Р* к ВА, который может происходить по цепи полярных групп атомов NЦMg(PB) ЦNЦC - N(HisM202) ЦHOH55ЦO=(BA). Вращение этой молекулы, выявляемое при - 7 - фемтосекундном световом возбуждении димера Р, происходит с фундаментальной частотой 32 смЦ1 и приводит к появлению моды 32 смЦ1 и ее обертонов в осцилляциях кинетики полосы поглощения аниона бактериохлорофилла ВА - при 1020 нм.
4. Тирозин М210, находящийся вблизи димера бактериохлорофилла Р и мономера бактериохлорофилла ВА в Р - Rba. sphaeroides, играет ключевую роль в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в этих РЦ.
Отсутствие тирозина М210 в мутантных Р - приводит к значительному замедлению первичного разделения зарядов и отсутствию стабилизации разделенных зарядов.
Взаимодействие полярной ОН-группы TyrM210 с заряженными молекулами P+ и BA - ускоряет разделение зарядов между ними и стабилизирует состояние P+BA- в нативных Р - Rba. sphaeroides.
Апробация результатов. Основные результаты диссертации отражены в 37 публикациях и доложены на рабочем совещании л Реакционные центры фотосинтетических бактерий:
структура и динамика (Фелдафинг, Германия, 1995); XI международном конгрессе по фотосинтезу (Будапешт, Венгрия, 1998); на XI международном симпозиуме Сверхбыстрые явления в спектроскопии (Тайпей, Тайвань, 1999); на 60-ом ежегодном Тимирязевском чтении (Москва, 1999); на XII международной конференции Сверхбыстрые процессы в спектроскопии (Флоренция, Италия, 2001); на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на 13-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Монреаль, Канада, 2004); на 14-ой европейской конференции по биоэнергетике (Москва, 2006); на 3ей Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, 2007); на международной конференции Преобразование световой энергии при фотосинтезе (Пущино, 2008); на 4-ой Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, 2009); на XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах" (Пущино, 2009); на 15-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Пекин, Китай, 2010); на семинарах НИИ физико-химической биологии им.
А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и кафедры биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ (25 - в журналах и сборниках, 12 - в трудах конференций и конгрессов), список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы работы изложены на 263 страницах - 8 - машинописного текста, включая 69 рисунков. Список литературы содержит 3библиографических ссылок.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении формулируется актуальность темы, цель диссертационной работы, ее научная новизна, научная и практическая значимость, перечислены поставленные задачи, приводятся основные защищаемые положения.
Первая глава содержит аналитический обзор экспериментальных и теоретических работ по первичным процессам разделения зарядов в реакционных центрах фотосинтеза.
Реакционный центр (РЦ) бактериального фотосинтеза - это пигмент-белковый комплекс в составе фотосинтетической мембраны, в котором световая энергия преобразуется в химическую энергию состояний с разделенными зарядами в результате серии быстрых реакций переноса электрона. Пространственная структура Р - пурпурных бактерий Blastochloris (Rhodopseudomonas) viridis и Rhodobacter (Rba.) sphaeroides изучена с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов Р - [Deisenhofer et al., 1984]. Р - Rbа.
sphaeroides состоит из трех белковых субъединиц с разной массой, обозначаемых как H (тяжелая), L (легкая) и M (средняя), и ряда кофакторов, вмонтированных в L и M субъединицы. Эти кофакторы образуют две пространственно симметричные ветви, обозначаемые A и B. Обе ветви начинаются с двух общих для них молекул бактериохлорофилла (BChl), PA и PB, образующих первичный донор электрона, димер P, расположенный вблизи периплазматической стороны мембраны. По мере удаления от димера в каждой ветви находится молекула мономерного BChl (BA или BB), молекула бактериофеофитина (BPheo) (HA или HB) и молекула хинона (QA или QB), которая находится в конце ветви вблизи цитоплазматической стороны мембраны. Также в состав Р - входит атом негемового железа и молекула каротиноидов. Фотохимически активной является только ветвь А [Kirmaier et al., 1985]. Установлено, что после светового возбуждения P электрон переносится с первого синглетного возбужденного уровня P* на НA за ~3,5 пс при комнатной температуре, образуя состояние P+HA - [Holten et al., 1980]. Этот перенос происходит при участии BA. Механизм и степень этого участия дискутировались в течение последних 30 лет. Пикосекундные измерения спектров изменения поглощения ряда РЦ, выполненные в 1970-е годы, указали на возможность участия ВА в переносе электрона в качестве первого акцептора [Shuvalov, Klimov, 1976; Shuvalov, 1978]. Вместе с тем, измерения кинетик переноса электрона с разрешением 100-200 фс, выполненные в ряде более поздних работ, привели к противоположному выводу о том, что возможно лишь - 9 - виртуальное участие ВА в прямом переносе электрона от возбужденного димера Р* к бактериофеофитину НА по механизму суперобмена[ Martin et al., 1986; Woodbury et al., 1985; Breton et al., 1986]. Сложность обнаружения состояния Р+ВА - в нативных Р - объясняется тем, что время его образования в несколько раз больше времени его распада, связанного с дальнейшим переносом электрона от ВА - на НА [Holzapfel et al., 1989, Arlt et al., 1993]. Дополнительная сложность связана с тем, что изменения в полосах поглощения ВА при 800 и 600 нм при разделении зарядов маскируются изменениями в полосах поглощения Р, а также сдвигами и изменением формы этих полос. В феофитин-модифицированных Р - перенос электрона от ВА - к НА блокирован в пикосекундном масштабе времени при низких температурах, что приводит к накоплению состояния Р+ВА - и значительно облегчает его регистрацию [Kennis et al., 1997]. Следующая ступень разделения зарядов заключается в переносе электрона с HA - на QA за ~200 пс при комнатной температуре с образованием состояния P+QA - [Kaufmann et. al., 1975]. При криогенных температурах все реакции ускоряются в 2-3 раза. Квантовый выход процесса первичного разделения зарядов в целом близок к 1 как при комнатной, так и при низкой температуре [Wraight, Clayton, 1974].
Каждый новый этап переноса электрона сопровождается потерей свободной энергии в обмен на увеличение времени диссипации запасенной энергии от ~300 пс в состоянии Р* до ~0,1 с в состоянии P+QAЦ. На каждом следующем этапе электрон все дальше уходит от катиона Р+: расстояние между центрами молекул Р и ВА, Р и HA, Р и QA равно соответственно 11, 16 и 25 ангстрем. Молекулы Р, В, Н и Q в Р - окружены аминокислотными остатками. Часть этих остатков имеет водородные связи с указанными хромофорами, другая часть находится в Ван-дер-ваальсовом контакте с ними.
Взаимодействие белкового окружения с участниками первичного разделения зарядов очень важно при движении ядерной подсистемы вдоль координаты реакции переноса электрона. В состав Р - также входит молекула кристаллографической воды НОН55, расположенная между PB и BA [Ermler et al., 1994]. В В-цепи Р - находится симметрично расположенная молекула воды HOH30. Вода HOH55 находится на расстоянии образования водородной связи как от кислорода 131-кетокарбонильной группы ВА, так и от атома азота остатка His M202, который обеспечивает аксиальное лигандирование центрального атома магния в BChl PB. Таким образом, имеется прямая пространственная связь между PB и BA через HOH55 и His M202.
Р - термофильных зеленых бактерий Chloroflexus (Cfx.) aurantiacus имеют в своем составе 3 молекулы BChl, 3 молекулы BPheo, 2 молекулы менахинона QA и QB и атом марганца [Blankenship et al., 1983]. Большое количество данных по структуре полипептидов, спектроскопии и расчеты экситонного взаимодействия указывают на то, что кофакторы в - 10 Р - Cfx. aurantiacus образуют две цепи пигментов, как и в Р - Rbа. sphaeroides [Vasmel et al., 1983]. Первичным донором электрона в Р - Cfx. aurantiacus является димер BChl.
Фотохимически активная А-цепь содержит молекулу BChl ВА, молекулу BPheo НА в качестве промежуточного акцептора электронов и молекулу QA. В-цепь в Р - Cfx.
aurantiacus содержит две молекулы BPheo, ФB и HB, и молекулу QB, причем ФВ находится в положении ВВ. Трехмерная структура этих Р - до сих пор неизвестна. Распад возбужденного состояния Р* Р - Cfx. aurantiacus происходит с постоянной времени 7 пс при 296 К, а при 10 К в нем выделяют две компоненты с постоянными времени 2 и 24 пс [Feick et al., 1990]. Квантовый выход первичного разделения зарядов при 280 K и комнатной температуре близок к 1[Volk et al., 1991]. Перенос электрона от HA - к первичному хинону QA происходит в Р - Cfx. aurantiacus с константой времени ~320 пс при 280 K [Kirmaier et al., 1986]. Несмотря на схожесть с бактериальными Р - в расположении хромофоров и фотохимии, Р - Cfx. aurantiacus имеют ряд существенных отличий по составу белков и кофакторов.
Оптическая спектроскопия с фемтосекундным временным разрешением позволяет исследовать ядерные движения кофакторов и белка, которые могут вызывать или сопровождать реакции переноса электрона. Идентификация когерентных сигналов колебаний или вращений молекулярных групп, связанных с редокс-хромофорами и молекулами окружения, может также дать информацию о возможных путях начального переноса электрона. Показано, что возбуждение P в Р - пурпурных бактерий сверхкороткими (<30 фс) лазерными импульсами с широким спектром приводит к осцилляциям в кинетиках спада стимулированного излучения P* с частотами в диапазоне 10-400 смЦ1 [Vos et al., 1991, 1992, 1993]. Такие же осцилляции были обнаружены в спонтанной флуоресценции РЦ. Эти данные объяснялись формированием и когерентным распространением ядерного волнового пакета на поверхности потенциальной энергии возбужденного состояния P*. Из-за того, что положение волнового пакета на поверхности потенциальной энергии зависит от времени, а также из-за относительного смещения поверхностей Р* и Р, полоса стимулированного излучения имеет коротковолновый ( около 900 нм) и длинноволновый (930-940 нм) максимумы. Осцилляции в обоих максимумах противоположны друг другу по фазе, но имеют одинаковые частоты. Когерентные компоненты были обнаружены в кинетиках выцветания сложной полосы при 800 нм, имеющей вклад поглощения BA [Streltsov et al., 1997]. Когерентные эффекты в динамике формирования состояния P+HA - в Р - Rbа. sphaeroides наблюдались в кинетиках электрохромного сдвига мономера BChl [Vos et al., 2000].
- 11 Направленная модификация структуры белка в составе Р - путем мутации гена, кодирующего его биосинтез, оказалась очень плодотворным направлением в изучении первичных процессов фотосинтеза. При сайт-специфическом мутагенезе происходит точечная замена только одного из оснований в ДНК, что приводит к направленной замене одних аминокислот в структуре белка на другие. Один из примеров работ в этом направлении - это изменение количества и локализации водородных связей в димере Р с помощью комбинации мутаций HL168F, LM160H, LL131H, FM197H [Lin et al., 1994, Allen et al., 1996]. Для изучения процессов переноса электрона в В-цепи кофакторов, которая в нативных Р - практически неактивна, используют комбинации различных мутаций, активирующих перенос электрона в В-цепи и тормозящих его в А-цепи. Сочетание методов направленного мутагенеза с фемтосекундной спектроскопией является одним из мощных инструментов в исследовании первичных реакций фотосинтеза.
Анализ работ показал необходимость дальнейшего исследования первичных процессов бактериального фотосинтеза на качественно новом экспериментальном уровне.
Прежде всего это касается окончательного выяснения роли мономера BChl ВА в первичном переносе электрона от Р*, влиянию ближайшего окружения Р и ВА на разделение зарядов между ними, выяснению роли В-цепи в первичном фотосинтезе. Для выполнения этих задач в данной диссертационной работе применено сочетание высокочувствительной спектроскопии поглощения с временным разрешением менее 30 фс и методов направленного мутагенеза.
Во второй главе дано описание методов и объектов экспериментальных исследований.
Для генетических манипуляций и выделения реакционных центров использовались стандартные методики с небольшими изменениями [Васильева и др., 2001; Paddock et al., 1989; de Boer et al., 2002; Goldsmith, Boxer, 1996]. Низкотемпературные измерения при К были выполнены на образцах, содержащих 65% глицерина. Оптическая плотность образцов составляла 0,5 при 860 нм в кювете с длиной оптического пути 1 мм. Для поддержания состояния PBAHAQA - в образцы добавляли 5 мM дитионита натрия.
Процесс дейтерирования реакционных центров заключался в замене Н2О в буфере на D2O, для чего реакционные центры концентрировались на мембране и затем переносились в D2O буфер. Данная процедура повторялась дважды.
Замена молекулы бактериального феофитина НА в реакционных центрах Rba.
sphaeroides R-26 на молекулу растительного феофитина производилась следующим образом [Shkuropatov, Shuvalov, 1993]. Р - в буфере 10 мM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% LDAO, 10% метанол, содержащем 20-кратный избыток растительного феофитина, были инкубированы в темноте при 42? С в течение 90 мин. Затем избыток свободных пигментов - 12 удалялся хроматографией на DEAE - целлюлозе. Для контроля аналогичной процедуре инкубации и очистки подвергались те же Р - в среде без растительного феофитина.
Спектры поглощения невозбужденных образцов измерялись на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC.
Фемтосекундные измерения изменений поглощения (свет - темнота) были выполнены при помощи лазерного спектрометра, созданного в отделе фотобиофизики НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Для генерации фемтосекундных световых импульсов использовался лазер с синхронизацией мод на Ti-сапфире Tsunami, который непрерывно накачивался лазером на гранате Millennia (оба Spectra Physics, США).
азерные импульсы усиливались в 8-проходном усилителе на Ti- сапфире (Авеста, Россия) и использовались для генерации континуума в смеси обычной и тяжелой воды (1:1). Малая часть континуума (~4%) использовалась для зондирования образцов. Для возбуждения образцов из основной части континуума с помощью фильтров вырезалась полоса с центром при 870 нм. Длительность импульсов накачки и зондирования могла варьироваться от 16 до 30 фс. Оптический многоканальный анализатор (лOriel, Франция), сопряженный с полихроматором, использовался для измерения спектров изменения поглощения с частотой 15 Гц. Задержка между импульсами возбуждения и зондирования устанавливалась с точностью 1 фс и варьировалась с переменным шагом 15100 фс. Временная дисперсия после дополнительной компенсации не превышала 30 фс в диапазоне 940-1060 нм, а в диапазоне 735-790 нм - 20 фс. Импульсы возбуждения и зондирования были почти полностью (> 95%) деполяризованы. Дифференциальные спектры поглощения являлись результатом усреднения 3000-10000 измерений для каждой задержки. Чувствительность спектрометра составляла (1-3)10Ц5 единиц оптической плотности. Кинетики изменений поглощения (А) для узких спектральных полос в области ~1020 и ~760 нм были построены с использованием измеренных в максимумах амплитуд полос поглощения при дополнительном вычитании широкополосного фона.
Этот подход отличается от обычных измерений кинетик изменений поглощения при фиксированной длине волны относительно нуля. Данный метод позволяет строить кинетики формирования и затухания лчистых состояний с помощью регистрации выцветания или нарастания соответствующих относительно узких полос на фоне широких спектральных полос. Для аппроксимации экспериментальных кинетик использовались полиномиальные неосциллирующие кривые, которые находились математически. При изучении ранних процессов разделения зарядов такой подход более приемлем, чем стандартная аппроксимация экспонентами, которая использовалась только для оценки характерных времен различных процессов. Осциллирующие части кинетик получались в - 13 результате вычитания аппроксимирующих кривых из исходных кинетик и анализировались при помощи преобразования Фурье для получения частотного спектра осцилляций. Неосциллирующие кривые соответствовали минимальному шуму в спектрах Фурье и минимальной амплитуде осцилляций.
Для возбуждения флуоресценции реакционных центров использовалось непрерывное излучение узкополосного титан-сапфирового лазера мощностью 100-2мВт на длине волны 840 нм, который накачивался аргоновым лазером (лSpectra Physics, США). С помощью комбинации из цилиндрической и сферической линз лазерный луч, падающий на образец под углом 45 град., имел форму полоски шириной 1 мм и высотой 12 мм. Флуоресценция собиралась под углом 90 град. к возбуждающему лучу, при этом отраженный возбуждающий свет блокировался. Образец толщиной 2 мм помещался в криостате между двумя пластинками из плексигласа диаметром 15 мм. Спектр флуоресценции регистрировался оптическим многоканальным анализатором (лOriel, Франция), сопряженным с полихроматором с вертикальной щелью. Величину флуоресценции нативных и феофитин-модифицированных реакционных центров Rba.
sphaeroides определяли по амплитуде в максимуме ее спектра при 920 нм.
Третья глава посвящена экспериментальному исследованию участия мономера бактериохлорофилла (BСhl) ВА в первичном разделении зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rba. sphaeroides R-26 и зеленой бактерии Cfx. aurantiacus.
Для определения участия ВА в прямом переносе электрона ключевым вопросом является положение уровня свободной энергии состояния Р+ВА - относительно уровня свободной энергии возбужденного состояния Р*. Если уровень Р+ВА - находится ниже уровня Р*, то возможен обычный перенос электрона от Р* на ВА. Для определения разницы указанных уровней использованы феофитин-модифицированные Р - Rba.
sphaeroides R-26, в которых НА заменен на растительный феофитин ФфА, в результате чего состояние Р+ВА - становится долгоживущим. В этих Р - измерялась флуоресценция, появляющаяся при рекомбинации Р+ВА - с образованием Р*. Найдено, что температурная зависимость флуоресценции феофитин-модифицированных Р - с предвосстановленными хинонами имеет значительный полностью обратимый подъем с ростом температуры в диапазоне 95-200 К. Меньший подъем флуоресценции с ростом температуры наблюдается в феофитин-модифицированных Р - без восстановителя. В нативных Р - температурная зависимость флуоресценции не имеет подъема с ростом температуры. В рамках теоретической модели разделения зарядов в нативных и феофитин-модифицированных Р - с учетом обратных переходов, рекомбинации и лбыстрой флуоресценции получены температурные зависимости выхода флуоресценции. Аппроксимация экспериментальных - 14 температурных зависимостей теоретическими позволяет сделать вывод о том, что в феофитин-модифицированных Р - Rba. sphaeroides R-26 уровень Р+ВА - находится ниже уровня Р* на ~550 смЦ1. Поскольку данная модификация не затрагивает молекулы ВА и Р, есть основания считать, что полученная оценка справедлива и для нативных Р - Rba.
sphaeroides R-26.
Для прямого определения участия ВА в переносе электрона в Р - Rba. sphaeroides R-26 и Cfx. aurantiacus измерены спектры А в диапазоне 900-1070 нм ( полоса вынужденного излучения Р* и полоса поглощения аниона ВАЦ) и 730-790 нм (полоса поглощения НА) в диапазоне задержек 0 - 4 пс (с шагом 30 фс) относительно момента возбуждения Р при 90 К. Аналогичные измерения проведены для феофитинмодифицированных Р - Rba. sphaeroides R-26, в которых происходит накопление состояния Р+ВА - в пикосекундном диапазоне времени, что облегчает исследование этого состояния. Впервые обнаружена слабая полоса поглощения ВА - с центром при 1020 нм в Р - Rba. sphaeroides R-26 и при 1028 нм в Р - Cfx. aurantiacus, которая по своей форме идентична полосе поглощения ВА - в феофитин-модифицированных Р - Rba. sphaeroides R26 (рис. 1). Форма и спектральное положение обнаруженной полосы остаются неизменными в диапазоне задержек 0 - 4 пс, однако амплитуда меняется во времени сложным осциллирующим образом (рис. 2). Первый, наиболее интенсивный максимум в осцилляциях амплитуды полосы ВА - наблюдается при задержке 120 фс, за ним следует ряд менее интенсивных максимумов. Полоса поглощения ВА - полностью исчезает при задержках 2,5 пс, что указывает на дальнейший переход электрона с ВА - на НА. После математического выделения осцилляций в неосциллирующей части кинетики А при 10нм можно видеть фазу роста с константой времени ~0,2 пс, за которой следует фаза спада с константой времени ~0,8 пс. В феофитин-модифицированных Р - наблюдается монотонный рост полосы поглощения ВАЦ, отражающий накопление состояния Р+ВАЦ, который сопровождается затухающими осцилляциями. Это обстоятельство облегчает исследование осцилляций при задержках > 1 пс. Спад вынужденного излучения Р* при 935 нм в нативных и феофитин-модифицированных Р - имеет основную константу времени ~1,2 пс при 90 К и также сопровождается быстро-затухающими осцилляциями (рис. 2). Эти осцилляции находятся в фазе с осцилляциями в полосе поглощения ВАЦ.
Выцветание полосы поглощения НА при 760 нм в нативных Р - Rba. sphaeroides R-отражает появление электрона на НА с константой времени ~1,2 пс при 90 К (рис. 2).
Кинетика А при 760 нм имеет небольшой временной лаг ~0,2 пс при 90 К, который указывает на задержку появления электрона на НА из-за его более раннего появления на ВА. Выцветание полосы поглощения НА при 760 нм сопровождается слабыми - 15 осцилляциями, которые примерно соответствуют интегрированию по времени осцилляций полосы ВАЦ, что указывает на эффективный перенос электрона от ВА - на НА.
а б в 1A 12215324A 342950 A 38241000 1040 1000 1040 1010 10Длина волны, нм Рис. 1. Разностные (свет - темнота) спектры поглощения при некоторых фемтосекундных задержках для нативных (а) и феофитин-модифицированных (б) Р - Rba. sphaeroides R-26, а также Р - Cfx. aurantiacus (в), возбуждаемых при 90 К 25-фемтосекундными импульсами при 870 нм. Двойные стрелки показывают амплитуду полос, которая использовалась при построении кинетик. Числа над кривыми - задержка в фс. Кривые смещены по вертикали для наглядности.
Спектры преобразования Фурье для осцилляций при 935, 1020 и 760 нм содержат несколько полос и имеют сложную форму (рис. 2). В Фурье-спектре осцилляций вынужденного излучения Р* при 935 нм доминирует широкая полоса с центром при 1смЦ1, в которой можно выделить несколько более узких полос, разделенных интервалом ~25-35 смЦ1. Этот спектр отражает, в основном, колебательные движения внутри димера Р с основным периодом ~250 фс [Vos et al., 1994, 1996, 1998]. В Фурье-спектре осцилляций полосы ВА - при 1020 нм широкая полоса при 130 смЦ1 присутствует наряду с более низкочастотными полосами, среди которых выделяется интенсивная полоса при 32 смЦ1, соответствующая периоду осцилляций ~ 1 пс (рис. 2). Мода при 32 смЦ1 особенно выделяется в осцилляциях полосы ВА - феофитин-модифицированных РЦ, где она является доминирующей. Фурье-спектр осцилляций полосы НА при 760 нм содержит, в основном, ряд узких полос в диапазоне 10-120 смЦ1, среди которых выделяется полоса при 32 смЦ1.
- 16 0,00,00.0Таким образом, мода ядерных движений 130 смЦ1 имеет сопряжение с реакцией Р* Р+ВАЦ, а мода 32 смЦ1 - с реакцией Р+ВА - Р+НАЦ.
0,935 нм 760 нм -A 0,0 2 0 2 -A 0,-0,0 2 4 0 2 Время, пс Время, пс 1193 9 1130 200 400 0 200 4Частота, см-1 Частота, см-Рис. 2. Кинетики А (верхние кривые), 1020 нм их осциллирующая часть (средние 0 кривые) и спектр Фурье-преобразования 0 2 осциллирующей части (нижние кривые) полосы поглощения ВА - при 1020 нм, вынужденного излучения Р* при 935 нм 0 2 и поглощения НА при 760 нм нативных 1Время, пс Р - Rba. sphaeroides R-26, возбуждаемых 1при 90К 25-фемтосекундными 1импульсами при 870 нм. Числа - частоты 23максимумов Фурье-спектра.
0 200 4Частота, см- - 17 A xA xОтн. ед.
Отн. ед.
A xОтн. ед.
В Р - Cfx. aurantiacus динамика полосы вынужденного излучения Р* при 940 нм, поглощения ВА - при 1028 нм и поглощения НА при 750 нм качественно схожа с аналогичной динамикой для Р - Rba. sphaeroides R-26. Фаза роста неосциллирующей части кинетики А при 1028 нм имеет константу времени ~1 пс при 90 К, а фаза спада имеет константу времени ~5 пс. Время затухания Р* и выцветания НА в Р - Cfx.
aurantiacus при 90 К составляет ~5 пс, что указывает на более медленное разделение зарядов по сравнению с Р - Rba. sphaeroides. В полосе поглощения ВА - при 1028 нм регистрируются очень слабые осцилляции, частотный спектр которых имеет широкую полосу при ~150 смЦ1 и ряд более узких полос при 35, 52 и 72 смЦ1. Осцилляции в полосе поглощения НА имеют похожий набор частот, а в осцилляциях полосы вынужденного излучения Р* преобладают частоты ~150 смЦ1.
Таким образом, полученные данные указывают на то, что первичное разделение зарядов в Р - Rba. sphaeroides и Cfx. aurantiacus происходит по двухступенчатой схеме Р* Р+ВА - Р+НА - [Schenck et al., 1982] с непосредственным участием ВА. Этот классический, необратимый перенос электрона сопровождается обратимым, осциллирующим переносом, который связан с движением ядерного волнового пакета.
Полученные данные позволяют конкретизировать движение волнового пакета по поверхностям потенциальной энергии различных состояний (рис. 3), которые для краткости обозначены далее как Р, Р*, Р+ВА - и P+НA. В нативных Р - Rba. sphaeroides R26 уровень P+BA находится ниже уровня Р* на ~550 смЦ1, а уровень P+НA находится ниже уровня Р* на 1500-2000 смЦ1. Поверхность P+BA пересекает поверхность Р* на ее правом, длинноволновом склоне недалеко от ее дна, так что энергия активации реакции Р* P+BA не превышает нескольких десятков смЦ1. Аналогично поверхность P+НA пересекает поверхность P+BA вблизи ее дна. В точках пересечения происходит расщепление поверхностей на верхнюю и нижнюю. Энергетическая щель между расщепленными поверхностями Р* и P+BA составляет величину ~ 10-30 смЦ1 [Marcus, 1985; Parson et al., 1987]. Волновой пакет, образованный несколькими колебательными подуровнями, возникает на левом, коротковолновом склоне поверхности Р*, где его излучение имеет длину волны ~900 нм. После этого пакет начинает движение по поверхности Р* в сторону длинноволнового склона и через ~120 фс достигает точки пересечения поверхностей Р* и P+BA. В этот момент волновой пакет излучает при 935 нм.
В точке пересечения часть волнового пакета переходит на поверхность P+BA с сохранением когерентного движения, что сопровождается возникновением полосы поглощения BA. При задержке ~190 фс эта часть пакета, двигаясь по поверхности P+BA, - 18 1020 нм 0, 240... фс 1020 нм 120, 360... фс 190, 430... фс P+BA_HA P*BAHA h 900 нм 935 нм P+BAHA_ потенциальная энергия РВAHA координата Рис. 3. Упрощенная однокоординатная схема движения ядерного волнового пакета по поверхностям потенциальной энергии основного состояния РВАНА, возбужденного состояния Р*ВАНА и состояний с разделенными зарядами Р+ВАЦНА и Р+ВАНАЦ. В тексте также используются сокращенные обозначения Р, Р*, Р+ВА - и P+НA.
достигает ее пересечения с поверхностью P+НA и частично переходит на нее, вызывая увеличение выцветания полосы НА. Основная часть пакета остается на поверхности Р* и, достигнув ее края, начинает движение в обратную сторону. Точка поворота пакета находится вблизи точки пересечения поверхностей Р* и P+BA. При задержке ~360 фс волновой пакет вновь оказывается вблизи этой точки пересечения, и события повторяются. Циркуляция волнового пакета сопровождается его затуханием и расплыванием из-за процессов диссипации и релаксации. Реальное движение волнового пакета на каждой из поверхностей носит сложный характер и происходит одновременно в разных направлениях на нескольких частотах, среди которых можно выделить, как минимум, две основные моды при 130 и 32 смЦ1. Относительный вклад различных мод в общую картину осцилляций в продукте определяется проекциями этих мод на направление первичной реакции Р* P+BA. Сложный характер движения пакета может быть следствием ангармоничности поверхностей или может означать формирование многомодовых гиперповерхностей. Неизменность формы полосы поглощения BA во времени означает отсутствие смещения поверхностей P+BA и P+(BA)* по координате. В этом случае движение волнового пакета по поверхности P+BA не визуализируется, однако осцилляции в полосе поглощения НA подтверждают его присутствие на поверхности - 19 P+BA. Характер осцилляций в полосе поглощения BA указывает на существенную обратимость переноса электрона, вызванного движением пакета с частотой 130 смЦ1. В принципе, коэффициент переноса волнового пакета с одной поверхности на другую зависит от времени его пребывания вблизи места переноса и от ширины его энергетического спектра. Чем меньше время пребывания и чем шире спектр пакета по сравнению с шириной энергетической щели в точке расщепления поверхностей, тем меньшая часть пакета перейдет на другую поверхность. Для моды 130 смЦ1 характерное время пребывания волнового пакета вблизи пересечения поверхностей составляет ~1фс, а для моды 32 смЦ1 это время увеличивается до ~600 фс, что обуславливает увеличение необратимости переноса электрона на этой частоте.
Согласно формуле Ландау-Зенера вероятность однократного перехода квазичастицы с поверхности донора на поверхность акцептора р обратно пропорциональна ее скорости dx/dt:
р = 1-exp(-2V2/(Ю dx/dt | dU1/dx - dU2/dx|)), (1) где V - энергия электронного сопряжения, dU1/dx и dU2/dx - кривизна поверхностей донора и акцептора в точке их пересечения [Zener, 1932]. При малых dx/dt величина р стремится к 1. В значительной степени обратимый характер переноса электрона на частоте 130 смЦозначает, что вероятность обратного перехода волнового пакета с поверхности P+BA на поверхность Р* сравнима с 1. Анализ экспериментальных данных показывают, что для прямого и обратного перехода волнового пакета при задержке 120 фс величина р достигает 0, 8Ц0,9. Из этого следует, что скорость волнового пакета на обеих поверхностях Р* и P+BA вблизи точки пересечения поверхностей достаточно мала, что означает близость точек поворота к точке пересечения. Поскольку скорость осциллирующего движения пропорциональна частоте осцилляций, из (1) следует, что высокочастотные моды движения волнового пакета имеют меньшую вероятность перехода р, чем низкочастотные. Это означает, что в осцилляциях продукта доля низких частот будет выше, чем в осцилляциях донора, что полностью подтверждается в эксперименте. Особенно ярко фильтрация низких частот осцилляций проявляется в полосе поглощения вторичного продукта НA.
Четвертая глава посвящена теоретическому моделированию динамики переноса электрона в Р - с помощью теории Редфилда [Redfield, 1965] для случая сильной связи электронных состояний Р* и P+BA с двумя колебательными модами. Теория Редфилда в адаптации В.И.
Новодережкина позволила рассчитать когерентное движение электронно-колебательного волнового пакета между потенциальными поверхностями первичного донора и - 20 фотопродукта. В модели учитывались 4 электронных состояния: основное состояние первичного донора Р, возбужденное состояние Р*, первичное состояние с разделенными зарядами P+BA и возбужденное состояние P+(BA)*. Поверхности потенциальной энергии состояний Р* и P+BA зависели от двух эффективных ядерных координат. Первая координата реакции была связана со смещением состояния Р* относительно Р, что приводило к формированию неравновесного колебательного состояния при возбуждении Р и к когерентным колебаниям волнового пакета с частотой 130 смЦ1. Смещение поверхности P+BA вдоль второй координаты реакции создает колебательное движение с частотой 32 смЦвдоль этой координаты. Это дополнительное движение создает осцилляции на частоте смЦ1 в состоянии P+BA, которые накладываются на осцилляции с частотой 130 смЦ1, проникающие в это состояние из состояния Р*. За счет связи состояний Р* и P+BA мода смЦ1 проникает на поверхность Р*, создавая осцилляции на этой частоте в кинетике стимулированного излучения Р*. В расчетах достигнуто хорошее согласие с экспериментальными кинетиками А вынужденного излучения Р* и поглощения BA (рис.
4). Расчеты показывают, что невысокий потенциальный барьер между состояниями Р* и Рис. 4. Экспериментальные (точки, соединенные тонкой линией) и рассчитанные (толстые линии) кинетики изменений поглощения в феофитин-модифицированных Р - на длинах волн 900, 935 (вынужденное излучение Р*) и 1020 (поглощение BA) нм.
- 21 P+BA вдоль координаты реакции, соответствующей моде 130 смЦ1, задает высокую скорость проникновения пакета в область продукта. Смещение пакета вдоль второй координаты, соответствующей моде 32 смЦ1, приводит к необратимому разделению зарядов. Из расчетов следует, что комбинация двух коллективных ядерных мод увеличивает скорость прямой реакции и уменьшает скорость обратной. Эффективность переноса электрона, определяемая конфигурацией потенциальных поверхностей донора и продукта, практически одинакова в случае когерентного и некогерентного возбуждения. Наличие когерентных осцилляций в эксперименте лишь модулирует динамику переноса, но общая скорость остается такой же, как и в природном фотосинтезе (где когерентность отсутствует). Однако когерентные (и долгоживущие) осцилляции помогают визуализировать вклады различных коллективных ядерных мод на разных стадиях реакции, и, в конечном счете, дают возможность определить основные координаты реакции и конфигурацию соответствующих потенциальных поверхностей. Относительно большие времена жизни осцилляций связаны с переносом когерентности в процессе вибронной релаксации, включая перенос когерентности из одной моды в другую. Так, когерентные колебания вдоль первой координаты реакции, созданные импульсным возбуждением в области первичного донора, сохраняются и при движении вдоль второй координаты. Математически это связано с несекулярными членами в релаксационном тензоре Редфилда. Эти члены ответственны также за связь когерентностей с населенностями вибронных уровней.
Пятая глава посвящена исследованию влияния молекулы кристаллографической воды НОН55, входящей в состав Р - Rba. sphaeroides, на процессы первичного разделения и переноса зарядов. Интерес к воде HOH55 вызван тем, что она находится как вблизи ВА на расстоянии образования водородной связи от кислорода 131-кетокарбонильной группы ВА, так и вблизи PB на расстоянии образования водородной связи от атома азота остатка His M202 [Ermler et al., 1994]. Для решения поставленной задачи были взяты РЦ, в которых вода НОН55 отсутствовала или была заменена тяжелой водой, и проведено детальное сравнение результатов фемтосекундной спектроскопии с таковыми для контрольных образцов РЦ, содержащих воду НОН55. В мутанте GM203L Rbа. sphaeroides основной результат замены Gly M203 на Leu состоит в стерическом удалении кристаллографической воды HOH55 за счет того, что Leu M203 занимает часть объема, принадлежащего воде HOH55 в нативных Р - [Potter et al., 2005]. Данная мутация не оказывает заметных влияний на структуру РЦ, за исключением небольшого изменения конформации His M202. Отсутствие воды НОН55 в мутанте GM203L также подтверждается измерениями резонансного рассеяния Рамана, согласно которым в Р - мутанта отсутствует взаимодействие по H-связи с 131кетокарбонильной группой в BA.
- 22 Анализ кинетик A в Р - мутанта GM203L показывает, что при 90 К спад стимулированного излучения Р* в его длинноволновом максимуме при 940 нм имеет основную константу времени ~4,3 пс (рис. 5, а), что почти в 4 раза больше таковой для нативных Р - (см. рис. 2). Таким образом, мутация GM203L приводит к существенному увеличению времени жизни Р*. Спад излучения Р* сопровождается выраженными осцилляциями. Фурье-спектр этих осцилляций в мутантных Р - отличается от такового для нативных Р - (см. рис. 2) подавлением моды при 125 смЦ1. В мутанте GM203L впервые обнаружена полоса поглощения BA - при 1020 нм, которая возникает при задержке 113 фс после возбуждения P в ответ на перенос электрона от возбужденного состояния P* на BA.
(рис. 5, б). Этот процесс переноса электрона происходит обратимо, и при задержке 206 фс поглощение BA - существенно уменьшается. Следующее увеличение полосы поглощения при 1020 нм наблюдается при 331 фс. Как и в нативных РЦ, полоса при 1020 нм в Р - мутанта GM203L существует не более 2-3 пс. В кинетике A полосы поглощения BA - при 1020 нм мутантных Р - на фоне сильных осцилляций можно выделить фазу подъема и спада, как это имеет место и в нативных РЦ. Этот факт говорит в пользу двухступенчатого 1а -A 0,0,0 1 2 3 0 100 200 31б A 0,00,00 1 2 3 4 0 100 200 3в A 0,110,0 100 20 1 2 3 Время, пс Частота, см-Рис. 5. Кинетики A (левая колонка) и спектры Фурье-преобразования осцилляций в этих кинетиках (правая колонка) в Р - мутанта GM203L Rba. sphaeroides для полосы вынужденного излучения Р* при 940 нм (а) и полосы поглощения ВА - при 1020 нм (б) и в Р - дейтерированных феофитин-модифицированных Р - Rba. sphaeroides R-26 для полосы - 23 Отн. ед.
Отн. ед.
Отн. ед.
поглощения ВА - при 1020 нм (в). Тонкая линия - аналогичный спектр Фурье для недейтерированных РЦ. Р - возбуждались 18-20 фемтосекундными импульсами на длине волны 870 нм при 90 К. Числа - частоты максимумов Фурье-спектра.
механизма переноса электрона в Р - мутанта GM203L по схеме Р* ВА НА. В мутантных Р - эти фазы замедлены по сравнению с нативными РЦ. Основное отличие спектров Фурье для осцилляций в полосе BA - мутантных Р - (рис. 5, б) от таковых для нативных Р - (рис. 2) состоит в отсутствии моды при 32 и 127 смЦ1. Эти моды являются доминирующими в спектрах Фурье нативных Р - для этой полосы. Другие частоты спектра Фурье осцилляций в полосе 1020 нм мутантных Р - при 25, 41, 64, 95 и 153 смЦ1 практически совпадают с таковыми для осцилляций стимулированного излучения Р* с точностью 2-4 смЦ. Кинетики A при 760 нм для Р - мутанта GM203L и нативных РЦ, отражающие перенос электрона от BA - на НА, качественно схожи. Характерное время накопления состояния P+НA в мутантных Р - в несколько раз больше, чем в нативных РЦ. Выцветание полосы НА в мутантных Р - сопровождается слабыми осцилляциями, как и в нативных РЦ. В спектре Фурье осцилляций при 760 нм Р - мутанта отсутствует полоса при 32 смЦ1, характерная для аналогичных спектров нативных РЦ. Похожие изменения наблюдаются и в кинетиках перечисленных выше полос для сухих пленок Р - Rba. sphaeroides R-26.
Перейдем к результатам, полученным в дейтерированных Р - Rba. sphaeroides R-при 90 К. Дейтерированию подвергались как нативные, так и феофитин-модифицированные РЦ. Замена HOH-буфера на DOD-буфер не привела к деструктивным изменениям в структуре РЦ. Об этом говорит неизменность формы и спектрального положения полосы поглощения BA - при 1020 нм и полосы поглощения НА при 760 нм, а также неизменность характерных констант времени для спада стимулированного излучения Р*, выцветания полосы НА и динамики полосы BAЦ. В дейтерированных Р - первичное разделение зарядов сопровождается осцилляциями во всех перечисленных спектральных полосах. Амплитуда и характерные времена затухания этих осцилляций схожи с таковыми для Р - в НОН-буфере.
Основной результат дейтерирования Р - заключается в изменении спектров Фурье этих осцилляций. В дейтерированных Р - наблюдается общий низкочастотный сдвиг характерных полос в спектрах Фурье осцилляций в диапазоне 50-200 смЦ1 по сравнению с Р - в HOH-буфере, что соответствует увеличению периода осцилляций (рис. 5, в для полосы поглощения BAЦ). Этот сдвиг имеет коэффициент ~1,4Ц1,6 в нативных и феофитинмодифицированных РЦ. Поскольку узкая интенсивная полоса при 32 смЦ1 доминирует в Фурье-спектрах осцилляций поглощения BA - и НА в недейтерированных РЦ, ее - 24 низкочастотный сдвиг при дейтерировании Р - особенно заметен. Сдвиг других полос в Фурье спектрах осцилляций вынужденного излучения Р* и поглощения BA - и НА может маскироваться изменением их относительных амплитуд. Сдвиг центра широкой полосы при 130 смЦ1 в Фурье-спектрах осцилляций Р* и BA - при дейтерировании Р - имеет тот же коэффициент, что и сдвиг полосы при 32 смЦ1.
Таким образом, при удалении воды из Р - или при ее замене тяжелой водой изменения касаются в первую очередь моды 32 смЦ1 осцилляций в полосе поглощения ВA при 1020 нм и ряда более высокочастотных мод в осцилляциях вынужденного излучения Р* при 940 нм и поглощения ВA при 1020 нм. В нативных Р - этот ряд мод имеет частоты, очень близкие к частотам, кратным 32 смЦ1 (рис. 2), что указывает на их принадлежность к обертонам фундаментальной моды 32 смЦ1. При удалении воды мода 32 смЦ1 и кратные ей моды исчезают в Р - мутанта GM203L, а при дейтерировании Р - все указанные моды смещаются вниз по шкале частот с примерно одинаковым коэффициентом. Так как вода HOH55 определенно отсутствует в мутанте GM203L, то исчезновение моды 32 смЦ1 и кратных ей мод в кинетиках Р - этого мутанта означает принадлежность данной моды к этой молекуле воды.
Появление высоких гармоник в осцилляциях (вплоть до седьмой) характерно скорее для вращательных мод, чем для колебательных. Хорошо известно, что молекула воды в газовой фазе имеет три типа вращения с характерными частотами 20, 32 и 52 смЦ[Герцберг, 1949]. Частота вращения 32 смЦ1 в точности соответствует наблюдаемой экспериментально моде осцилляций, а разность двух других частот также равна 32 смЦ1.
Оценить величину изотопического сдвига проще всего для узкой интенсивной моды смЦ1, которая наиболее удалена от колебательной полосы 130 смЦ1. Экспериментальная величина этого сдвига составила ~1,6, что больше расчетной величины для сдвига колебательных полос молекулярных групп, содержащих протон (1,375), но меньше расчетной величины 1,8 для сдвига вращательных полос этих молекулярных групп.
Полученное расхождение указывает на неполное дейтерирование или его отсутствие в некоторой части РЦ. Присутствие глицерина, содержащего ОН-группы, в буфере Р - при низкотемпературных измерениях увеличивает вероятность получения молекул DOH (изотопический коэффициент 1,422) вместо DOD. Совокупность полученных данных указывает на то, что мода 32 смЦ1, регистрируемая в осцилляциях продуктов P+BA и P+НA, является одной из вращательных частот молекулы воды.
Существенное замедление спада стимулированного излучения Р* в Р - мутанта GM203L является наиболее ярким следствием удаления воды НОН55 из этих РЦ.
- 25 Сравнение данных рентгеновского анализа структуры Р - мутанта GM203L и нативных Р - исключает существенное изменение их конформации в результате данной мутации. В Р - мутанта GM203L величина среднеточечного потенциала Em пары P/P+ такая же, как и в нативных Р - [Potter et al., 2005]. Можно ожидать, что отсутствие водородной связи между кетокарбонильной группой BA и водой НОН55 в мутанте GM203L изменит величину Em пары BA/BAЦ, однако никаких данных по этому вопросу в настоящее время нет. Также отсутствуют данные о том, происходит ли образование водородной связи между BA и HOH55 в течение времени жизни состояния P+BAЦ, или нет. Таким образом, нельзя исключить возможность того, что мутация GM203L вызывает изменения в энергетике первичной реакции разделения зарядов.
Время жизни Р* в Р - мутанта GM203L (4,3 пс) совпадает с минорной компонентой (15-20%) кинетики вынужденного излучения Р* в нативных РЦ. Исчезновение основной компоненты переноса электрона со временем 1,2 пс (80-85% в нативных РЦ) при исключении воды НОН55 из структуры Р - указывает на удаление наиболее вероятного пути переноса электрона. Более медленная компонента (4,3 пс) может отражать другие, менее эффективные пути электронного транспорта от P* к BA. Положение молекулы воды HOH55 таково, что она входит в состав следующей цепи полярных атомов: NЦMg(PB) ЦN - CЦN(HisM202) ЦHOH55ЦO=(BA), которая соединяет Р и ВА и может использоваться для переноса электрона. С этой точки зрения, увеличение времени жизни Р* в мутанте GM203L означает нарушение целостности этой цепи из-за исключения воды HOH55.
Согласно квантово-механическим расчетам, максимальная плотность -электронов в состоянии P* локализована на атомах азота, соединенных с центральным атомом Mg в молекуле PB [Plato et al., 1988]. Это означает, что атом азота в His M202, лигандирующий атом Mg, также очень близок (около 2 ангстрем) к максимальной спиновой плотности в PB. Указанная выше цепь полярных групп обеспечивает основной (80-85%) путь переноса электрона с высокой скоростью (1/1,2 псЦ1) в нативных РЦ. Когда эта цепь разорвана из-за отсутствия HOH55, скорость электронного транспорта сильно уменьшается (1/4,3 псЦ1) и он происходит по другим (лнеспецифическим) путям электронного туннелирования.
Доля этого более медленного транспорта не превышает 15-20% в нативных РЦ, но становится основной в Р - мутанта GM203L. Необходимо отметить, что указанный мост из полярных групп имеет большую длину, чем кратчайший путь туннелирования электрона через пространство между PA/ PB и BA (~8,5 ангстрем по сравнению с 3,5-5,ангстрем). Большую скорость переноса электрона по этому мосту можно объяснить тем, что цепь полярных групп создает более эффективную среду для туннелирования электрона, чем вакуум, компенсируя тем самым разницу в расстоянии. Так, водородная - 26 связь создает среду, которая почти в три раза эффективнее вакуума при туннелировании электрона [de Rege et al., 1995].
Анализ полученных данных приводит к выводу, что, безотносительно к причине замедления спада P* в Р - GM203L, вращение воды НОН55, следующее за фемтосекундным возбуждением РЦ, влияет на динамику переноса электрона от P* к BA.
Водородная связь между водой НОН55 и ВА силой ~4 ккал/моль отчетливо регистрируется в окисленных Р - Rba. sphaeroides методами спектроскопии комбинационного рассеяния, но не регистрируется в нейтральных Р - [Potter et al., 2005]. Это означает, что данная связь устанавливается в процессе разделения зарядов в ответ на появление положительного заряда Р+ и отрицательного заряда ВАЦ, которые разворачивают диполь воды. После 1-оборотов с частотой 32 смЦ1 вращение воды прекращается. Установление Н-связи между НОН55 и ВА способствует стабилизации состояния P+BAЦ. Вращение воды вызывает периодический перенос электрона от РВ на ВА и обратно с частотой 32 cмЦ1.
Периодическое появление дополнительной электронной плотности на BA - на ранней стадии разделения зарядов, когда населенности состояний P* и P+BA- примерно равны, может дополнительно стабилизировать состояние BAЦ. Эта стабилизация происходит быстрее, чем относительно медленная релаксация окружающих молекул к новой электронной конфигурации.
Шестая глава посвящена исследованию роли тирозина М210 в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в Р - Rba. sphaeroides. Согласно данным о пространственной структуре Р - Rba. sphaeroides, кислород тирозина M2локализован симметрично между РА и РВ и находится на расстоянии ~5 ангстрем как от углерода С-N(IV) РА, так и от азота N(II) ВА [PDB, файл 1AIJ]. Для исследования этого вопроса дифференциальная спектроскопия поглощения с разрешением 20 фс была применена к мутантам YM210W, YM210L/FM197Y и YM210L/HL168L Rba. sphaeroides при детальном сравнении результатов с контрольными образцами нативных Р - Rba.
sphaeroides. Мутация YM210W(L) заменяет тирозин М210 на триптофан (лейцин). Мутация FM197Y меняет фенилаланин М197 на тирозин, который образует дополнительную водородную связь с ацетил-карбонильной группой кольца I в PВ [Kuglstatter et al., 1999].
Мутация HL168L заменяет гистидин L168 на лейцин, что удаляет водородную связь между ацетил-карбонильной группой кольца I в РА и природным гистидином HL168 и приводит к сильному понижению редокс-потенциала Р+/Р на 123 мВ [Spiedel et al., 2002].
Кинетики A при 935-940 нм всех исследованных мутантов демонстрируют очень медленное затухание вынужденного излучения Р* в пикосекундном диапазоне, сопровождаемое отчетливыми осцилляциями сложной формы (рис. 6 для мутанта - 27 YM210W). Время жизни Р* в указанных мутантах в несколько десятков раз больше, чем в нативных РЦ, в соответствии с полученными ранее данными [Hamm et al., 1993; Jia et al., 1993]. Амплитуда осцилляций вынужденного излучения Р* в Р - мутантов близка к амплитуде аналогичных осцилляций в нативных РЦ. В отличие от нативных РЦ, осцилляции вынужденного излучения Р* в Р - мутантов сохраняются в течение ~1,5 пс (~0,пс в нативных РЦ), что позволяет увидеть до 7 пиков осцилляций. Первый, самый интенсивный пик осцилляций наблюдается при задержке ~120 фс относительно возбуждения. Фурье-спектр осцилляций вынужденного излучения Р* мутанта YM210W содержит широкую доминирующую полосу сложной формы с центром при ~150 смЦ1, что соответствует основному периоду осцилляций ~230 фс. В мутанте YM210L/FM197Y наблюдается низкочастотный сдвиг основной полосы Фурье-спектра осцилляций вынужденного излучения Р* от 150 к 100 смЦ1, что указывает на увеличение эффективной массы некоторой части согласованно осциллирующих (вследствие фемтосекундного возбуждения) молекулярных групп благодаря присоединению к ним новых групп через водородную связь. В мутанте YM210L/HL168L Фурье-спектр осцилляций вынужденного излучения Р* содержит две основные перекрывающиеся полосы при 117 и 152 смЦ1, а сами осцилляции затухают несколько быстрее, чем в других указанных мутантах.
Во всех перечисленных мутантах впервые обнаружена очень слабая полоса поглощения аниона ВА - при 1020 нм. Появление этой полосы однозначно указывает на участие ВА в первичном переносе электрона от Р* в данных мутантах. Форма и спектральное положение данной полосы идентично таковой в нативных Р - Rba. sphaeroides R-26. Кинетика A при 1020 нм исследованных мутантов показывает практически полное отсутствие стабилизации состояния Р+ВА - в Р - мутантов YM210W (рис. 6) и YM210L/FM197Y и очень слабую стабилизацию состояния Р+ВА - (в форме подставки в кинетике) в Р - мутанта YM210L/HL168L. В Р - этих мутантов обнаружены осцилляции полосы поглощения ВА - как целого без изменения ее формы и положения, подобно аналогичным осцилляциям в нативных РЦ. Эти осцилляции примерно синхронны осцилляциям в вынужденном излучении Р*. Характер осцилляций в полосе 1020 нм указывает на почти полностью обратимый перенос электрона между Р* и ВА, вызванный движением ядерного волнового пакета вблизи пересечения потенциальных поверхностей Р* и Р+ВА - (см. гл. 3 и 4). Амплитуда осцилляций полосы поглощения ВА - мутантных Р - в несколько раз меньше, чем нативных и феофитин-модифицированных РЦ. Осцилляции в полосе поглощения ВА - мутантов прекращаются через ~1,5 пс после возбуждения. Как и в осцилляциях Р*, в осцилляциях полосы ВА - насчитывается до 7 пиков. Фурье-спектр осцилляций в полосе ВА - исследованных мутантов содержит полосы, характерные для - 28 аналогичных осцилляций Р*, а также ряд узких низкочастотных полос в диапазоне 10-смЦ1, среди которых выделяется полоса при 28-33 смЦ1.
935 нм 1020 нм 0,000,-A A 0,0 0,00-A 0 2 4 0 2 0,000,A 0,0,000 2 0 2 Время, пс Время, пс 1112512215246 310 200 40 200 4Частота, см-Частота, см-Рис. 6. Кинетики А (верхний ряд), их осциллирующая часть (средний ряд) и спектр Фурье-преобразования осциллирующей части (нижний ряд) полосы вынужденного излучения Р* при 935 нм (левая колонка) и полосы поглощения ВА - при 1020 нм (правая колонка) Р - мутанта YM210W Rba. sphaeroides. Р - возбуждались при 90 К 20фемтосекундными импульсами при 870 нм. Числа - частоты максимумов Фурье-спектра.
Анализ полученных данных приводит к выводу, что присутствие тирозина М210 в Р - является необходимым фактором, обеспечивающим стабилизацию разделенных зарядов в состоянии Р+ВАЦ. В мутантах, не содержащих тирозин M210, необратимый перенос электрона от Р* к ВА практически отсутствует, а время жизни Р* увеличено в десятки раз по сравнению с нативными РЦ, содержащими тирозин М210. Наличие обратимого фемтосекундного переноса электрона между Р* и ВА в мутантах, не содержащих тирозин M210, означает, что в этих мутантах стабилизация первичного состояния с разделенными зарядами Р+ВА - отсутствует. Можно выделить два аспекта стабилизации Р+ВА - в РЦ. Во-первых, электрон может быть перенесен от Р* на высокий колебательный уровень потенциальной энергетической поверхности Р+ВА - с последующей - 29 Отн. ед.
Отн. ед.
колебательной релаксацией на более низкий уровень. Для эффективной стабилизации Р+ВА - за счет колебательной релаксации необходимо, чтобы потенциальная поверхность Р+ВА - находилась заметно ниже поверхности Р*. Характерное время колебательной релаксации является фактором, ограничивающим скорость разделения зарядов между Р* и ВА. В двойном мутанте YM210L/HL168L вторая мутация понижает редокс-потенциал пары Р+/Р на 123 мВ [Spiedel et al., 2002], что может привести к значительному понижению уровня Р+ВА - относительно Р* и увеличить роль колебательной релаксации в процессе стабилизации состояния Р+ВАЦ. Отсутствие заметной стабилизации состояния Р+ВА - в двойном мутанте YM210L/HL168L указывает на важность присутствия тирозина М210 для осуществления этой стабилизации и ее иной механизм. Присутствие тирозина М197 в двойном мутанте YM210L/FM197Y также не исправляет ситуацию, на что указывает отсутствие стабилизации состояния Р+ВА - в этом мутанте.
Во-вторых, стабилизация состояния Р+ВА - может достигаться в результате переориентации окружающих полярных групп под действием разделенных зарядов Р+ и ВАЦ. В нативных Р - ядерная конфигурация может быть изменена путем переориентации окружающих полярных групп типа О-Н+ тирозина M210. Движение Н+ в направлении ВА - уменьшает энергию Р+ВА - относительно Р* и, таким образом, стабилизирует состояние Р+ВАЦ. Н+ группы ОН тирозина M210 может занимать два характерных положения относительно РА и ВА. В первом положении диполь О-Н+ тирозина M2перпендикулярен линии, проходящей между углеродом C-N(IV) РА и азотом N(II) ВА, которые являются ближайшими соседями тирозина M210 и имеют максимальный положительный и отрицательный заряды, соответственно, в состоянии Р+ВА - [Plato et al., 1988]. Это положение реализуется в нейтральном состоянии РВА или Р*ВА. Во втором положении Н+ группы ОН тирозина М210 располагается на линии, соединяющей кислород О - группы ОН тирозина М210 и азот N(II) ВА. Это положение реализуется, когда Р+ВА - стабилизируется благодаря движению Н+ в направлении ВА, притягиваясь к ВА - и отталкиваясь от РА+. Оценка энергии электростатического взаимодействия дает энергетическую разницу между двумя положениями ~900 смЦ1. Экспериментальное значение разницы в энергии между Р* и Р+ВА - для стабильного состояния Р+ВА - в феофитин-модифицированных Р - составляет ~550 смЦ1 (гл. 3). Таким образом, энергия, затрачиваемая на переориентацию группы ОН тирозина M210, достаточна для стабилизации состояния Р+ВАЦ. Важно, что притяжение и отталкивание Н+ зарядами ВА - и РА+ соответственно происходит только при образовании Р+ВА - и отсутствует в нейтральном состоянии Р*В. Экспериментально наблюдаемое увеличение времени стабилизации с температурой согласуется с предложенным механизмом, так как - 30 взаимодействие Н+ группы ОН тирозина М210 с фононами среды способно индуцировать некоторые дополнительные движения Н+, ведущие к увеличению времени стабилизации.
В Р - Cfx. aurantiacus отсутствует тирозин М210, но присутствует другой тирозин М195, локализованный между Р и ВА [Bruce et al., 1982], который может отвечать за стабилизацию Р+ВА - в этих РЦ. Стабилизация Р+ВА - в Р - Cfx. aurantiacus занимает большее время (~5 пс) при 90 К, чем в Р - Rba. sphaeroides R-26 (~1,5 пс) (глава 3). Это согласуется с несимметричным положением тирозина М195 по отношению к РА и ВА (в противоположность тому, что наблюдается для тирозина М210).
Существенное уменьшение амплитуды осцилляций населенности состояния P+BA - в мутантных Р - по сравнению с таковой в нативных Р - означает, что значительная часть волнового пакета не достигает пересечения потенциальных поверхностей Р* и P+BA - в мутантных РЦ. Это происходит, если место пересечения поверхностей Р* и P+BA - находится достаточно высоко по шкале энергии, то есть поверхность P+BA - находится выше поверхности Р*, а энергия активации реакции Р* P+BA - сравнима с энергией волнового пакета. К аналогичному выводу приводят и расчеты констант скорости разделения зарядов в Р - исследованных мутантов в рамках теории Маркуса [Marcus, 1964]. Сравнительно медленное затухание осцилляций в мутантах, не содержащих тирозин М210, указывает на отсутствие некогерентных изменений в ядерной конфигурации при обратимом перемещении волнового пакета по поверхности Р* и его периодическом появлении вблизи пересечения поверхностей Р* и Р+ВАЦ.
Полученные данные согласуются с расчетами молекулярной динамики для Р - Rba.
sphaeroides. Эти расчеты показывают, что присутствие тирозина M210 понижает уровень энергии полностью стабилизированного состояния P+BA - более чем на 1000 смЦ1 благодаря совместному действию двух механизмов: статическому перераспределению зарядов в прилегающей области и динамическому эффекту реориентации полярной OH-группы TyrM210 [Alden et al., 1996]. Если процесс стабилизации разделенных зарядов P+ и BA - не завершен, понижение уровня P+BA - оказывается меньшим. Расчеты молекулярной динамики позволяют оценить характерное время реориентации OH-группы TyrM210, которое оказывается близким к времени жизни Р*. Анализ расчетов молекулярной динамики приводит к выводу о существенном вкладе реориентации OH-группы TyrM2в стабилизацию состояния P+BAЦ. Расчетный спектр автокорреляционной функции флуктуаций стохастических поворотов OH-группы TyrM210 состоит из нескольких пиков в диапазоне от 270 до 390 смЦ1 с двумя главными пиками при 356 и 368 смЦ1 [Parson, Warshel, 2009]. Эти пики отсутствуют в аналогичном расчетном спектре мутантных РЦ, лишенных тирозина M210, а также в спектре резонансного комбинационного рассеяния - 31 тирозина. Важным является то, что точно такие же пики присутствуют в Фурье-спектре автокорреляционной функции флуктуаций электростатической энергии Velec в состоянии РВ и P+BAЦ, но отсутствуют в аналогичном спектре флуктуаций электростатической энергии прямого взаимодействия Р+ и ВА - VQQ. Это еще раз указывает на принадлежность пиков при 356 и 368 смЦ1 к окружению Р и ВА. Спектр Фурье-преобразования для осцилляций в полосе поглощения BA - при 1020 нм и в полосе вынужденного излучения P* при 935-940 нм нативных и феофитин-модифицированных Р - Rba. sphaeroides содержит слабые полосы в диапазоне 300-400 смЦ1, близкие к расчетным (рис. 2).
Седьмая глава посвящена исследованию когерентного переноса электрона при первичном разделении зарядов в В-цепи Р - мутанта HM182L Rba. sphaeroides и Р - Cfx.
aurantiacus. Мутация HM182L заменяет молекулу бактериохлорофилла ВВ в В-цепи Р - Rba. sphaeroides на молекулу бактериофеофитина ФВ [Katilius et al., 1999]. Уровень Р+ФВ - оказывается ниже Р* на ~0,16 эВ в мутанте HM182L, что приводит к некогерентному переносу электрона на ФВ с небольшим квантовым выходом ~12% при 77 К и характерным временем ~ 8 пс [Katilius et al., 2002]. В В-цепи Р - Cfx. aurantiacus также имеется молекула ФВ в положении ВВ, что сближает эти Р - с Р - мутанта HM182L [Blankenship et al., 1983]. Оценки уровня энергии Р+ФВ - в Р - Cfx. aurantiacus дают его положение вблизи или даже ниже уровня Р*, что открывает теоретическую возможность переноса электрона в В-цепь в этих РЦ.
В Р - мутанта HM182L впервые обнаружена слабая полоса поглощения ВА - при 1020 нм, что дало возможность исследовать самый ранний этап разделения зарядов в Ацепи. Формирование состояния P+BA - в мутанте HM182L при фемтосекундном возбуждении происходит качественно также, как и в Р - Rba. sphaeroides R-26, то есть сопровождается выраженными осцилляциями как в полосе вынужденного излучения Р*, так и в полосе поглощения BAЦ. Эти осцилляции синфазны, а их первый, наиболее интенсивный максимум наблюдается при задержке ~120 фс. Также в мутанте HM182L впервые обнаружено небольшое динамическое выцветание полосы поглощения ФВ при 785 нм. Это выцветание регистрируется только в диапазоне задержек 0 - 80 фс и однозначно указывает на полностью обратимый перенос электрона в В-цепь с формированием состояния Р+ФВЦ. Кинетика А полосы поглощения ФВ при 785 нм имеет вид одиночного пика с максимумом при ~40 фс, что на ~80 фс раньше, чем первый пик осцилляций в полосе BA - и Р* (рис. 7). Отметим, что при задержке 40 фс полоса поглощения BA - еще полностью отсутствует.
- 32 A C. aurant.
HM182L 1028 нм, x1020 нм, xA 0,0748 нм 0,785 нм 940 нм, x0.1 -0,0940 нм, x0.-0,-0,0785 нм, x0 200 400 0 100 200 3A A 1028 нм, x785 нм, x(-1) 0,0785 нм, x(-1) 0,0940 нм, x(-0.1) 940 нм, x(-0.2) 0,00,000 748 нм, x(-1) 1020 нм -0,00 200 400 0 100 200 3Время, фс Время, фс Рис. 7. Кинетики А (верхний ряд) и их осциллирующая часть (нижний ряд) полос поглощения ФВ при 785 и 748 нм, полосы поглощения ВА - при 1020-1028 нм и полосы вынужденного излучения Р* при 940 нм в Р - мутанта HM182L Rba. sphaeroides (левая колонка) и в Р - Cfx. aurantiacus (правая колонка). Р - возбуждались при 90 К 20фемтосекундными импульсами при 870 нм.
В Р - Cfx. aurantiacus при фемтосекундном возбуждении впервые обнаружены затухающие осцилляции в полосах поглощения ФВ при 748 и 785 нм (рис. 7). Полоса при 785 нм начинает выцветать с очень малой задержкой ~10 фс после возбуждения и достигает первого максимума при задержке ~25 фс. Полоса при 748 нм начинает выцветать при несколько большей задержке ~30 фс, достигая первого максимума при задержке ~60 фс. Далее осцилляции в обеих полосах развиваются синхронно со средним периодом ~200-220 фс. Фурье-анализ осцилляций выявляет характерные частоты 79 и 1смЦ1 в осцилляциях полосы 785 нм и 73 и 154 смЦ1 в осцилляциях полосы 748 нм.
Синхронные осцилляции вынужденного излучения Р* при 940 нм и поглощения BA - при 1028 нм в Р - Cfx. aurantiacus развиваются заметно позже. Первый максимум этих - 33 осцилляций наблюдается при задержке ~110 фс, а при задержках менее 50 фс они отсутствуют.
Таким образом, во всех перечисленных выше Р - перенос электрона в В-цепь сопровождается осцилляциями в состоянии с разделенными зарядами. Эти осцилляции начинаются на несколько десятков фс раньше, чем осцилляции, сопровождающие перенос электрона в А-цепь. В Р - мутанта HM182L осцилляции в В- цепи имеют вид одиночного пика, а в Р - Cfx. aurantiacus - это быстро- затухающие осцилляции. Полученные данные позволяют детализировать когерентные процессы, сопровождающие первичное разделение зарядов в Р - при фемтосекундном возбуждении. Возбуждение Р 18-20 фс импульсами с широким спектром формирует ядерный волновой пакет, который начинает осциллирующее движение по поверхности Р* вдоль двух независимых координат, соответствующих реакциям Р* Р+ВА - и Р* Р+ФВЦ. Сразу после формирования волновой пакет находится на коротковолновом склоне поверхности Р* и излучает свет при ~900 нм. Тот факт, что осцилляция в полосе поглощения первичного акцептора электронов в В-цепи возникает сразу после возбуждения, указывает на близость области пересечения поверхностей Р* и Р+ФВ - к области формирования волнового пакета.
Временной ход данной осцилляции указывает на обратимость когерентного переноса электрона в В-цепи под действием волнового пакета. При задержке ~100-120 фс волновой пакет достигает области пересечения поверхностей Р* и Р+ВА - на длинноволновом склоне кривой Р*. В этой области волновой пакет излучает при 930-940 нм. Появление волнового пакета в области пересечения поверхностей Р* и Р+ВА - приводит к появлению осцилляции в полосе поглощения ВАЦ, которая синфазна осцилляции излучения Р* при 940 нм. После отражения волнового пакета в области пересечения поверхностей и его ухода в обратную сторону поглощение в полосе ВА - резко уменьшается, что указывает на обратимость когерентной реакции Р* Р+ВА - и отсутствие стабилизации разделенных зарядов при этой задержке. Таким образом, когерентные компоненты реакций переноса электрона в А- и В-цепи разделены во времени, причем в В-цепи перенос начинается раньше на 60-80 фс, чем в А-цепи. Это указывает на различие в оптимальных конфигурациях ядер для переноса электрона по двум цепям. При задержке ~200-250 фс волновой пакет снова оказывается на левом склоне поверхности Р* вблизи области пересечения поверхностей Р* и Р+ФВЦ. В Р - Cfx. aurantiacus это приводит к появлению второго пика осцилляций в полосе поглощения ФВЦ. В мутанте HM182L аналогичные пики отсутствуют, что указывает на уменьшение энергии волнового пакета к этому времени, которая становится недостаточной для преодоления потенциального барьера. При задержке ~350 фс волновой пакет вновь оказывается на правом склоне поверхности Р* вблизи области пересечения - 34 поверхностей Р* и Р+ВАЦ, что приводит к появлению второго максимума в осцилляциях продукта при 1020 нм и излучения Р* при 940 нм. В процессе движения волновой пакет быстро расплывается из-за процессов диссипации, что приводит к регистрации всего нескольких периодов осцилляций.
В заключении сформулирован общий итог работы, определяющий ее место в общемировых исследованиях по данной тематике. Первичный акт фотосинтеза заключается в преобразовании энергии света в энергию разделенных зарядов, которая используется в дальнейших реакциях фотосинтеза. Он происходит в специальных пигмент-белковых комплексах (реакционных центрах) с высокой эффективностью.
Поглощение фотона в светособирающей антенне и в самих реакционных центрах приводит в конечном итоге к возбуждению спецпары (димер бактериохлорофилла в реакционных центрах бактерий), которая выполняет функцию конечного акцептора энергии возбуждения и одновременно первичного донора электронов Р. Первичный перенос электрона в реакционных центрах происходит с высокой скоростью между кофакторами хлорофилловой природы, взаимное расположение которых обеспечивается структурой белка реакционных центров. Каждый новый этап переноса электрона сопровождается потерей энергии исходно поглощенного кванта в обмен на увеличение времени диссипации запасенной энергии при постепенном его увеличении на каждом этапе разделения зарядов. Удаление электрона от его первичного донора сопровождается уменьшением энергии взаимодействия неспаренных электронов, а скорость движения электрона назад по вакантным орбиталям также уменьшается в связи с увеличением фактора Больцмана. В результате время диссипации запасенной энергии увеличивается от ~300 пс в состоянии Р* до ~0,1 с в состоянии Р+QAЦ. Максимально высокая скорость прямых реакций переноса электрона, намного превышающая скорость процессов рекомбинации и релаксации, является ключевым фактором, обеспечивающим высокую эффективность работы реакционных центров и фотосинтеза в целом.
В реакционных центрах бактерий молекула дополнительного бактериохлорофилла ВА является первичным акцептором электрона и обеспечивает высокую скорость приема электрона от первичного донора Р* и еще большую скорость передачи электрона на следующий акцептор, бактериофеофитин НА. Это достигается за счет малости или отсутствия активационных барьеров реакций разделения зарядов и за счет хорошего перекрытия электронных орбиталей участников этих реакций. Без прямого участия ВА в переносе электрона достижение максимально высокой скорости этого переноса - 35 невозможно. Ближайшее окружение молекулы ВА служит достижению той же цели, ускоряя перенос электрона. Ярким примером этого ускорения является влияние на первичный перенос электрона молекулы кристаллической воды НОН55 и молекулы тирозина М210. Отсутствие данных молекул в окружении ВА приводит к сильному замедлению переноса электрона. Механизмы влияния молекул окружения ВА на перенос электрона могут включать прямое влияние на энергетику реакций разделения зарядов, участие в процессе динамической стабилизации разделенных зарядов в состоянии Р+ВА - или прямую включенность в состав пространственной тропы переноса электрона.
Отличительной особенностью молекул НОН55 и тирозина М210 является их полярность, которая позволяет настраивать механизмы влияния в ответ на появление разделенных зарядов, то есть обеспечивает обратную связь между этими механизмами и процессом разделения зарядов.
В переносе электрона между реагентами активную роль играют колебания ядерной подсистемы. Возбуждение реакционных центров фемтосекундными световыми импульсами создает коллективные движения ядер в форме волнового пакета. Это состояние не имеет аналогов в природе, но служит ценным источником информации о влиянии ядерных движений на перенос электрона в эксперименте. Фемтосекундная спектроскопия демонстрирует, что само возбуждение одного из электронов Р не приводит к разделению зарядов. Только движение ядерной подсистемы вначале в самом Р*, а затем в его окружении, куда входит и молекула ВА, приводит в итоге к переносу электрона с Р* на ВА с образованием первичного продукта Р+ВАЦ. Это движение, вероятно, направлено на максимально возможное сближение Р* и ВА. Импульс, приобретенный в результате такого движения, может быть использован как для преодоления энергетического барьера переноса электрона с Р* на ВА, так и для дальнейшего движения, приводящего к разведению продуктов реакции Р+ и ВА - в пространстве. Сопряжение движений ядерной и электронной подсистем, таким образом, важно для эффективного преобразования световой энергии в энергию разделенных зарядов при фотосинтезе. Это справедливо как в отношении активной А-цепи реакционных центров бактерий, так и для малоактивной Вцепи.
Автор выражает глубокую благодарность всему коллективу соавторов за неоценимую помощь в работе. Работы по теме диссертации частично финансировались грантами РФФИ, NWO, INTAS и МНТЦ.
- 36
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ I. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства того, что в реакционных центрах Rba. sphaeroides R-26, Cfx. aurantiacus и ряда мутантов Rba. sphaeroides первичным акцептором электрона является молекула мономерного бактериохлорофилла в А-цепи ВА.
1) В этих реакционных центрах с помощью высокочувствительной дифференциальной спектроскопии поглощения с временным разрешением 18-25 фс проведена прямая регистрация ИК полосы поглощения аниона ВА - (при 1020 нм в Rba. sphaeroides и при 1028 нм в Cfx. aurantiacus), появление которой однозначно указывает на разделение зарядов между возбужденным состоянием первичного донора электронов, димера бактериохлорофилла Р*, и ВА.
2) Исследование температурной зависимости замедленной флуоресценции феофитинмодифицированных реакционных центров Rba. sphaeroides R-26 показало, что уровень свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами P+BA - находится ниже уровня свободной энергии возбужденного состояния димера Р* на 550 30 смЦ1.
Этот фундаментальный факт создает предпосылку для прямого участия ВА в первичном переносе электрона от Р*.
3) Исследование фемтосекундной динамики полосы поглощения ВА - полностью подтверждает последовательную схему переноса электрона при первичном разделении зарядов в бактериальных реакционных центрах (Р* мономерный бактериохлорофилл ВА бактериофеофитин НА Е), впервые предложенную более 30 лет назад в пионерских работах В.А. Шувалова и соавт. Показано, что время жизни состояния P+BA - в реакционных центрах Rba. sphaeroides R-26 и Cfx. aurantiacus не превышает нескольких пс, что связано с быстрым переносом электрона на бактериофеофитин НА.
II. Впервые экспериментально показано, что молекула кристаллографической воды НОН55, входящая в состав реакционного центра Rba. sphaeroides, играет важную роль в переносе электрона от первичного донора электрона Р* к первичному акцептору ВА.
1) Удаление воды НОН55 из структуры Р - в мутантах по сайту М203 замедляет первичную реакцию разделения зарядов между Р* и ВА примерно в 4 раза.
2) Вращение молекулы воды НОН55, выявляемое при фемтосекундном возбуждении реакционного центра Rba. sphaeroides, приводит к модуляции населенностей первичных состояний с разделенными зарядами P+BA и P+НA на частоте вращения - 37 смЦ1 и кратных ей частотах. Принадлежность моды 32 см1 и ее гармоник к вращению воды НОН55 доказана в экспериментах с реакционными центрами, не содержащими данную молекулу. При удалении воды НОН55 из структуры реакционного центра мода осцилляций при 32 см1 и ее гармоники исчезают, а при замене этой воды на тяжелую воду происходит изотопическое понижение частот указанных мод с коэффициентом, характерным для вращательных спектров.
3) С учетом данных рентгеноструктурного анализа реакционных центров, вода НОНможет быть включена в одну из пространственных троп эффективного переноса электрона по цепи полярных групп атомов, соединяющей димер Р и мономер ВА: N - Mg(PB) ЦNЦCЦN(HisM202) ЦHOH55ЦO=(BA).
III. Впервые экспериментально раскрыто определяющее влияние тирозина М210, находящегося в реакционном центре Rba. sphaeroides вблизи димера Р и мономера бактериохлорофилла ВА, на первичное разделение зарядов и стабилизацию разделенных зарядов в реакционных центрах.
1) Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутантных реакционных центрах препятствует стабилизации разделенных зарядов в состоянии Р+ВАЦ, что сопровождается сильным замедлением процесса первичного разделения зарядов.
2) Найдено, что значительное понижение уровня свободной энергии состояния Р+ВА - относительно аналогичного уровня возбужденного состояния Р* в реакционных центрах мутантов Rba. sphaeroides не способно компенсировать отсутствие тирозина М210 и ускорить разделение зарядов.
3) Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутантных реакционных центрах не компенсируется его введением в положение М197.
4) Выявлено стабилизирующее влияние полярной ОН-группы тирозина М210 на состояние P+BA - в процессе разделения зарядов в тирозин-содержащих РЦ.
IV. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства (подтверждаемые теоретически) сопряжения ядерных движений с переносом электрона при первичном разделении зарядов в реакционных центрах пурпурных и зеленых бактерий.
1) Продемонстрирована связь коллективных ядерных движений в виде волнового пакета, созданного в состоянии Р* при фемтосекундном возбуждении реакционных центров Rba. sphaeroides R-26 и Cfx. aurantiacus, и впервые обнаруженных осцилляций населенностей состояний фотопродуктов P+BA - и P+НAЦ. С помощью Фурье-анализа - 38 этих осцилляций выявлены характерные моды ядерных движений, сопряженные с первичным переносом электрона.
2) Экспериментально показано, что периодическое появление волнового пакета с частотой ~130 смЦ1 вблизи пересечения поверхностей потенциальной энергии Р* и P+BA - в реакционных центрах приводит к обратимому переносу электрона на ВА, что выражается в синхронных осцилляциях поглощения BA - и вынужденного излучения Р*. Найдено, что часть волнового пакета, проникшая на поверхность P+BAЦ, затем эффективно переходит на поверхность P+НAЦ.
3) Обнаружено, что при фемтосекундном возбуждении реакционных центров Cfx.
aurantiacus и мутантных по сайту М182 реакционных центров Rbа. sphaeroides происходит обратимый перенос электрона от Р* в малоактивную В-цепь, который целиком определяется движениями ядерного волнового пакета и опережает начало аналогичного переноса в А-цепь на 60-80 фс. Показано, что этот процесс определяется присутствием волнового пакета на коротковолновом склоне потенциальной поверхности Р* вблизи ее пересечения с потенциальной поверхностью первичного состояния с разделенными зарядами в В-цепи.
4) Теоретическое моделирование динамики волнового пакета в рамках теории Редфилда подтвердило возможность его многократных, обратимых переходов с поверхности донора Р* на поверхность фотопродукта P+BA - с сохранением когерентности. Показано, что учет как минимум двух коллективных ядерных мод, соответствующих двум координатам реакции, необходим для объяснения экспериментальных кинетик состояний Р* и P+BAЦ.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:
1. Streltsov A.M., Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (1995) Dynamic hole burning within special pair absorption band of Rhodobacter sphaeroides (R-26) reaction center at room temperature. FEBS Lett., 357, 239-241.
2. Streltsov A.M., Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (1996) Femtosecond kinetics of electron transfer in the bacteriochlorophyll(M)-modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides (R-26). FEBS Lett., 383, 129-132.
3. Shuvalov V.A., Streltsov A.M., Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya. (1996) Femtosecond kinetics of special pair bleaching and electron transfer in Rhodobacter sphaeroides (R-26) reaction centers. In: The Reaction Center of Photosynthetic Bacteria; Structure and Dynamics, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, M.E. Michel-Beyerle (ed.) pp. 175-186.
- 39 4. Шувалов В.А., Яковлев А.Г. (1998) Положение уровня энергии Р+В - относительно Р*, найденное по измерениям рекомбинационной флуоресценции в феофитинмодифицированных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides R-26. Биол. мембр. 15, 455-460.
5. Nowak F.R., Kennis J.T.M., Franken E.M., Shkuropatov A.Ya., Yakovlev A.G., Gast P., Hoff A.J., Aartsma T.J., Shuvalov V.A. (1998) The energy level of P+B - in plant pheophytin exchanged bacterial reaction centers probed by the temperature dependence of delayed fluorescence. Proc. XI Intern. Congress on Photosynthesis, Kluwer Acad. Publs., Dordrecht, pp.
783-786.
6. Yakovlev A.G., Shuvalov V.A. (1999) Nuclear wavepacket motion producing a reversible charge separation in bacterial reaction centers. Abstr. XI Intern. Symposium Ultrafast Phenomena in Spectroscopy, Taipei, Taiwan, ROC, р. 35.
7. Yakovlev A.G., Shuvalov V.A. (2000) Formation of bacteriochlorophyll anion band at 10nm produced by nuclear wavepacket motion in bacterial reaction centers. J. Chin. Chem. Soc., 47, 709-714.
8. Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2000) Nuclear wavepacket motion producing a reversible charge separation in bacterial reaction centers. FEBS Lett., 466, 209-212.
9. Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2001) Nuclear wavepacket motions leading to electron transfer in bacterial reaction centers. Proc. XII Conference УUltrafast Processes in SpectroscopyФ, Califano S., Foggi P., Righini R. (eds.), Firenze Leo S. Olschki Editore MMIII, Florence, Italy, pp. 405-418.
10. Яковлев А.Г., Шувалов В.А. (2001) Разделение зарядов в реакционных центрах фотосинтеза при фемтосекундном возбуждении. Биохимия, 66, 261-272.
11. Яковлев А.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2002) Молекулярная цепь переноса электрона в первичном акте бактериального фотосинтеза, определенная с помощью фемтосекундной спектроскопии. Докл. АН, 385, 262-268.
12. Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2002) Nuclear wavepacket motion between P* and P+BA - potential surfaces with a subsequent electron transfer to HA in bacterial reaction centers at 90 K. Electron transfer pathway. Biochemistry, 41, 14019-14027.
13. Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2002) Nuclear wavepacket motion between P* and P+BA- potential surfaces with a subsequent electron transfer to HA in bacterial reaction centers. I. Room temperature. Biochemistry, 41, 2667-2674.
14. Яковлев А.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2002) Природа первичного акта разделения зарядов в бактериальных реакционных центрах по данным фемтосекундной - 40 спектроскопии. III съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, тез. докладов, с.
275.
15. Yakovlev A.G., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya., Bolgarina T.I., Shkuropatova V.A., V.A. Shuvalov (2003) Mechanism of charge separation and stabilization of separated charges in reaction centers of Chloroflexus aurantiacus and of YM210W(L) mutants of Rhodobacter sphaeroides excited by 20 fs pulses at 90 K. J. Phys. Chem. A, 107, 8330-8338.
16. Shuvalov V.A., Yakovlev A.G. (2003) Coupling of nuclear wavepacket motion and charge separation in bacterial reaction centers. FEBS Lett., 540, 26-34.
17. Яковлев А.Г., Шувалов В.А. (2003) Перенос электрона в дейтерированных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides при 90 К по данным фемтосекундной спектроскопии. Биохимия, 68, 741-749.
18. Яковлев А.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2003) Фемтосекундные ядерные осцилляции при разделении зарядов в реакционных центрах фотосинтеза. Биохимия, 68, 664-675.
19. Novoderezhkin V.I., Yakovlev A.G., van Grondelle R., Shuvalov V.A. (2004) Coherent nuclear and electronic dynamics in primary charge separation in photosynthetic reaction centers:
a Redfield theory approach. J. Phys. Chem. B, 108, 7445-7457.
20. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Болгарина Т.И., Шкуропатова В.А., Долгова Т.А., Шувалов В.А. (2004) Механизм разделения зарядов и их стабилизации в бактериальных реакционных центрах. Биофизика, 49, 199-211.
21. Yakovlev A.G., Vasilieva L.G., Shkuropatov A. Ya, Jones M.R., Shuvalov V.A. (2004) Mechanism of charge separation and stabilization of separated charges in native and mutant reaction centers of Rhodobacter sphaeroides excited by 20 fs pulses at 90 K. Abstr. 13th International Congress of Photosynthesis, Montreal, Canada, р. 134.
22. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Болгарина Т.И., Шкуропатова В.А., Долгова Т.А., Шувалов В.А. (2004) Фемтосекундная спектроскопия первичных процессов разделения зарядов и их стабилизации в бактериальных реакционных центрах фотосинтеза при 90 К. III съезд биофизиков России, тез. докладов, Воронеж, с. 484-485.
23. Новодережкин В.И., Яковлев А.Г., Шувалов В.А. (2005) Когерентный перенос электрона в первичном акте бактериального фотосинтеза: моделирование с помощью теории Редфилда. Докл. АН, 402, 697-701.
24. Yakovlev A. G., Jones M.R., Potter J.A., Fyfe P.K., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2005) Primary charge separation between P* and BА: electron-transfer pathways in native and mutant GM203L bacterial reaction centers. Chem. Phys., 319, 297-307.
- 41 25. Shuvalov V.A., Yakovlev A.G., Shkuropatova T.A., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Y., Gast P. (2006) Electron transfer in bacterial reaction centers with modified B-branch pigment composition. Proc. 14-th European Bioenergetic Conf., Biochim. Biophys. Acta, 1757, supplement 1, р. 38.
26. Shuvalov V.A., Yakovlev A.G., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya. (2006) Primary charge separation between P700* and primary electron acceptor complex A-Ao: comparison with bacterial reaction centers. In: Photosystem I: The Light-Driven Plastocyanin:Ferredoxin Oxidoreductase. Series: Advances in Photosynthesis and Respiration, Golbeck J.H. (ed.), Springer, The Netherlands, 24, 291-300.
27. Yakovlev A.G., Shkuropatova T.A., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya, Gast P., Shuvalov V.A. (2006) Vibrational coherence in bacterial reaction centers with genetically modified Bbranch pigment composition. Biochim. Biophys. Acta, 1757, 369-379.
28. Yakovlev A.G., Jones M.R., Potter J.A., Fyfe P.K., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2007) Electron-transfer pathways in native and mutant GM203L bacterial reaction centers. Proc.3-rd Moscow conference on computational molecular biology, Moscow State University publ., Moscow, pp. 320-322.
29. Yakovlev A.G., Shkuropatova T.A., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A.
(2008) Wave packet motions coupled to electron transfer in reaction centers of Chloroflexus aurantiacus. Abstr. Intern. Conference УLight Energy Conversion in PhotosynthesisФ, Puschino, p. 67.
30. Yakovlev A.G., Shkuropatova T.A., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya, Shuvalov V.A.
(2008) Wave packet motions coupled to electron transfer in reaction centers of Chloroflexus aurantiacus. J. Bioinform. Comput. Biol., 6, N4, 643-666.
31. Яковлев А.Г., Шкуропатова Т.А., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А.
(2009) Фемтосекундная фаза разделения зарядов в реакционных центрах Chloroflexus aurantiacus. Биохимия, 74, 1042-1051.
32. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2009) Первичные процессы разделения зарядов в реакционных центрах мутантов YM210L/FM197Y и YM210L Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 74, 1479-1487.
33. Yakovlev A.G., Shuvalov V.A. (2009) Stabilization of separated charges in reaction centers of bacterial photosynthesis. Proc. 4-th Moscow conference on computational molecular biology, Moscow State University publ., Moscow, pp. 374-375.
34. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2009) Разделение зарядов в реакционных центрах мутантов YM210L и YM210L/FM197Y Rhodobacter - 42 sphaeroides. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах", посвященные 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева, тезисы докладa, Пущино, с. 68-69.
35. Яковлев А.Г., Шкуропатова Т.А., Шкуропатова В.А., Шувалов В.А. (2010) Фемтосекундный этап переноса электрона в реакционных центрах тройного мутанта SL178K/GM203D/LM214H Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 75, 501-513.
36. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Хмельницкая Т.И., Шкуропатова В.А.. Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2010) Первичный перенос электрона в реакционных центрах мутантов YM210L и YM210L/HL168L Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 75, 944-953.
37. Yakovlev A. G., Vasilieva L. G., Khmelnitskaya T. I., Shkuropatova V. A., Shkuropatov A.
Ya., Shuvalov V. A. (2010) Coherent electron transfer in reaction centers of YM210L and YM210L/HL168L mutants of Rba. sphaeroides. Abstr. 15th International Congress of Photosynthesis, Beijing, China, p. 25.