Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разным специальностям  

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель:	доктор биологических наук Яруллина Любовь Георгиевна,
Официальные оппоненты:	Веселов Станислав Юрьевич, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет
	Гаврилюк Инна Павловна, доктор биологических наук, профессор, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства имени Н.И. Вавилова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится л20 декабря 2012 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, д. 32, биологический факультет, ауд. 332.

Факс (347)273-67-78, e-mail: disbiobsu@mail.ru

Официальный сайт БашГУ:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет.

Автореферат разослан л_____ ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

М.Ю. Шарипова

Общая характеристика работы

Актуальность исследований. Одной из первоочередных задач современной биологии является выявление путей формирования устойчивости растений к патогенным микроорганизмам. Важную роль в регуляции взаимоотношений системы растение - патоген играют активные формы кислорода [Тарчевский, 2000; Ramputh et al., 2002]. Так резкое и многократное повышение уровня АФК (оксидативный взрыв) при инфицировании индуцирует в растениях каскад защитных реакций [Huckelhoven, Kogel, 2003; Bollwel, Daudi, 2009], а их низкая концентрация способствует росту патогенов [Narasimhan et al., 2001; AverТyanov et al., 2007].

До недавнего времени считалось, что основным регулятором уровня АФК при инфицировании являются растения, а возможный вклад гриба в данный процесс даже не рассматривался. Однако, имеются данные об участии патогенных грибов в регуляции содержания АФК, как через продукцию Н2О2 [Аверьянов и др., 2007], так и через ее утилизацию [Zhang et al., 2004; Tanabe et al., 2009].

В настоящее время интенсивно исследуется сигнальная роль салициловой и жасмоновой кислот, индуцирующих продукцию АФК, в защите растений от патогенов [Allen, Tresini, 2000; Ладыженская, Проценко, 2002; Озерецковская и др., 2008; Шакирова и др., 2011]. Предполагается, что салицилатный сигналинг влияет на устойчивость растений к грибным патогенам с биотрофным типом питания, а жасмонатный - определяет развитие устойчивости к некротрофам. Относительно путей регуляции защитного ответа растений сигнальными молекулами при инфицировании возбудителями грибных болезней со смешанным (гемибиотрофным) типом питания сведения весьма противоречивы [Озерецковская, 2009; Максимов и др., 2011].

Возбудитель септориоза  Septoria nodorum Berk поражает мягкую пшеницу Triticum aestivum L. и другие виды злаков, что приводит к значительным потерям урожая. В связи с этим исследования роли про-/ антиоксидантной системы в формировании устойчивости к S. nodorum весьма актуальны. Они имеют большое теоретическое и практическое значение для защиты сельскохозяйственных растений.

Цель работы - выявить закономерности функционирования про-/антиоксидантной системы растений пшеницы при инфицировании возбудителем септориоза Septoria nodorum Berk и обработке сигнальными молекулами.

Задачи исследований:

- проанализировать изменения в содержании АФК, активности оксидоредуктаз в растительных тканях при инфицировании S. nodorum и обработке салициловой и жасмоновой кислотами;

- изучить экспрессионную активность генов пероксидазы и оксалатоксидазы, интенсивность накопления лигнина в растениях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами гриба S. nodorum и обработке сигнальными молекулами;

- выявить роль грибной каталазы в регуляции уровня Н2О2 в растительных тканях и проявлении агрессивности патогена;

- провести сравнительную оценку транскрипционной активности генов оксалатоксидазы и пероксидазы в растениях пшеницы различной устойчивости при инфицировании возбудителем септориоза.

Научная новизна. Получены оригинальные экспериментальные данные об изменении экспрессии генов оксидоредуктаз в растениях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами S.аnodorum и воздействии сигнальных молекул. Выявлено, что салициловая и жасмоновая кислоты оказывают защитное действие на растения пшеницы при инфицировании S. nodorum, индуцируя в них генерацию супероксидного радикала и перекиси водорода. Получены новые данные о защитных свойствах сигнальных молекул против возбудителя септориоза, обусловленные активацией оксалатоксидазы, анионной пероксидазы, ингибиторов протеиназ и снижением активности каталазы. Впервые показано, что одним из факторов, обеспечивающих агрессивность и патогенность гриба S.nodorum, является высокая экспрессионная активность гена каталазы, участвующей в регуляции уровня Н2О2 в растительных тканях.

Практическая значимость работы. Выявлена связь устойчивости пшеницы к возбудителю септориоза с уровнем экспрессионной активности генов оксидоредуктаз в растениях. Результаты исследований детализируют представления о механизмах фитоиммунитета и могут быть использованы для разработки экологически безопасных средств защиты растений, новых методов ДНК-диагностики уровня устойчивости растений к грибным патогенам. Научные положения исследований рекомендуется использовать в качестве учебного материала по дисциплинам: физиология растений, биохимия, защита растений, фитопатология.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 6-й межд. науч.-практ. конф. Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 2010), межд. конф. Актуальные проблемы ботаники и экологии (Ялта, 2010), 2-й и 3-й Всерос. школе-конф. по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика - наука XXI века (Уфа, 2011, 2012), 7-м съезде общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий (Нижний Новгород, 2011), межд. науч.-практ. конф. Интегрированная защита растений: стратегия и тактика (Минск, 2011), Всерос. конф. молодых учёных Биология будущего: традиции и инновации (Екатеринбург, 2012), 8-м межд. симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2012).

Связь с научными программами. Работа поддержана грантами: АВЦП Развитие научного потенциала высшей школы №2.1.1./5676; ФЦП Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы (ГК № 16.740.11.0061, ГК № П339); РФФИ_поволжье_а № 11-04-97037; ФЦП Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы (ГК № 16.512.11.2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 317 источников. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 31 рисунком.

Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. Л.Г.аЯруллиной, сотрудникам лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УН - РАН, в которой проводились исследования: зав.лаб., д.б.н..аМаксимову И.В., д.б.н. Трошиной Н.Б., к.б.н., Суриной О.Б., к.б.н. БурхановойаГ.Ф., к.б.н. Валееву А.Ш., асп. Ахатовой А.Р., асп. Касимовой Р.И. за неоценимую помощь при выполнении и обсуждении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работы проводились на растениях мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) различных сортов (Омская 35, Омская 36, Башкирская 24, Башкирская 26, Симбирка, Казахстанская 10, Жница). Были использованы споры патогена - гемибиотрофного возбудителя септориоза (Septoria nodorum Berk.). Различные по агрессивности штаммы S. nodorum (высокоагрессивный штамм 9МН и низкоагрессивный штамм 4ВД) были получены из Института экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларусии. СК и ЖК в соответствующих концентрациях (10-5 М и 10-7 М) использовали для предпосевной обработки семян пшеницы.

Для получения растворимой фракции белков растительный материал гомогенизировали в 0.01 М Na-фосфатном буфере (ФБ) рН 6.2 (1:10, г/мл). Активность пероксидазы и каталазы определяли по методу, описанному А.И.аЕрмаковым с соавторами [1987], а оксалатоксидазы по В. Dumas с соавторами [1995]. Активность протеиназ и их ингибиторов определяли спектрофотометрически по гидролизу хромогенного синтетического субстрата БАПНА [Erlanger et al., 1961] и по гидролизу желатина, активность амилаз - по гидролизу крахмала, иммобилизованных в геле агарозы [Шпирная и др., 2009]. Концентрацию О2- определяли с использованием 0.6 мМ нитротетразолия синего [Vaidyanathan et al, 2003]. Содержание Н2О2 определяли с использованием ксиленолового оранжевого [Bindschedler et al, 2001], локализацию Н2О2 определяли путем инфильтрации в растительные ткани диаминобензидина (ДАБ) [Caliskan, Cuming, 1998]. Для определения молекулярной массы и pI белков использовали метод двумерного электрофореза [Vincent et.al., 2006]. Накопление лигнина изучали по автофлуоресценции [Schafer et al., 2004; Плотникова, Штубей, 2009].

Для выделения РНК и ДНК использовали метод P. Chomczynski [1987]. Получение кДНК на основе мРНК проводили методом обратной транскрипции (от-ПЦР). После амплификации реакционную смесь фракционировали методом электрофореза с использованием прибора miniProtean 3 Cell (лBioRad, США) согласно описанию Т. Маниатис и др. [1984]. Для определения размеров синтезированных ампликонов использовали маркерные ДНК GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder (лFermentas, Латвия).

Эксперименты проводили в трехкратной биологической и четырехкратной аналитической повторностях. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ Stat Soft (Statistica 6.0).

Результаты и их обсуждение

1. Анализ продукции АФК и активности оксидоредуктаз в растительных тканях при инфицировании S. nodorum и обработке СК и ЖК

Наблюдение за ростом возбудителя септориоза на эпидермисе листьев показало, что в контроле уже через 24 ч после инокуляции мицелий гриба густо покрывал поверхность листа (рис. 1 а, I). В вариантах опыта с применением СК, ЖК и их смеси прорастание спор было менее интенсивным (рис. 1 б, в, г, I). В листьях растений, предобработанных СК и ЖК, симптомы болезни были выражены слабее, чем в контроле (рис. 1 б, в, III).

Рис. 1. Влияние СК и ЖК и их смеси на интенсивность прорастания спор (I), генерацию Н2О2 в клетках мезофилла в зоне инфицирования (II) и развитие симптомов септориоза (III) в листьях пшеницы: а - контроль, б - обработка СК; в - обработка ЖК, г - обработка смесью СК+ЖК. I, II, III - 24, 48 и 72 ч после инокуляции, соответственно

Образование АФК является одним из наиболее ранних ответов растительных клеток на контакт с патогеном, в результате чего индуцируются защитные реакции растения. Первым звеном в патоген-индуцируемой окислительной вспышке является активация связанной с клеточной мембраной НАДФН-оксидазы и генерация супероксидного радикала, который при участии супероксиддисмутазы преобразуется в Н2О2.

В наших исследованиях в ответ на инфицирование S. nodorum в листьях пшеницы наблюдалось повышение концентрации OХ2 через 24 ч после инокуляции (табл. 1).

Таблица 1

Накопление супероксидного радикала OХ2 и Н2О2 в листьях пшеницы сорта Башкирская 24 при инфицировании грибом S. nodorum и обработке салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислотами

Вариант	Время после инфицирования, ч
	24	48	72
OХ2, нМ/мг сырой массы
Контроль	73.03.7	81.13.2	62.03.9
S.nodorum	98.14.1	92.34.6	79.12.1
СК	99.23.7	88.16.1	74.22.4
СК+ S.nodorum	165.06.8	118.29.9	98.15.5
ЖК	893.7	124.35.8	96.33.9
ЖК+ S.nodorum	126.28.7	149.07.2	94.14.3
СК+ЖК	1013.9	1126.7	80,23.4
СК+ЖК+ S.nodorum	1318.6	1235.9	107,34.2
Н2О2, мкМ/мг сырой массы
Контроль	18.3 0.7	10.1 0.6	7.2 0.3
S.nodorum	22.7 1.5	15.9 0.9	8.6 0.2
СК	21.0 1.3	14.1 0.7	9.7 0.3
СК + S.nodorum	38.8 2.5	20.7 0.8	10.8 0.5
ЖК	20.4 0.8	21.90,5	11,3 0.2
ЖК + S.nodorum	29.2 1.6	26.81.3	12.1 0.4
СК+ЖК	24.31.4	28,31.7	15,20.7
СК+ЖК+ S.nodorum	30,11.7	34,31.2	21.30.9

В предобработанных СК и ЖК листьях синтез всех форм АФК усиливался. Цитологический анализ подтвердил, что в опытных вариантах количество Н2О2 - продуцирующих клеток было больше (рис. 1б, в, г, II), чем в контроле (рис.а1аа, II). Причем, при инфицировании под воздействием СК индуцируется более раннее повышение уровня АФК по сравнению с обработкой ЖК.

Изменение уровня АФК в растительных тканях происходит в результате многих метаболических процессов, в том числе изменения в активности про-/ антиоксидантных ферментов, таких как оксалатоксидаза, каталаза, пероксидаза. Так в ответ на инокуляцию листьев S. nodorum происходило повышение активности оксалатоксидазы (рис. 2 б, I). Обработка СК приводила к усилению активности оксалатоксидазы через 24 ч после инокуляции (рис. 2 г, I). Стимулирующее действие ЖК на активность фермента проявлялось на более поздних этапах взаимоотношений растительных клеток с грибом (рис. 2 I, е).

Рис. 2. Влияние салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот на активность оксалатоксидазы (I), каталазы (II) и пероксидазы (III) в листьях пшеницы при инфицировании S. nodorum: а - контроль, б - инфицирование S. nodorum, в - обработка СК; г - обработка СК + S. nodorum; д - обработка ЖК, е - обработка ЖК + S. nodorum, ж - обработка смесью СК+ЖК, з - обработка смесью СК+ЖК + S. nodorum.

В инфицированных листьях постепенно возрастала активность каталазы (рис. 2, II) и пероксидазы (рис. 2, III), достигая максимального значения через 72 ч после инокуляции. СК оказывала ингибирующее действие на каталазную активность и модулирующее - на активность пероксидазы. Так, если в предобработанных СК здоровых растениях активность фермента была ниже, чем в контроле на всем протяжении опыта (рис. 2, III, в), то в предобработанных и инфицированных она плавно возрастала в ходе эксперимента (рис. 2, III, г).

Важной составляющей защитного ответа растений на действие патогенов, является образование соединений, подавляющих гидролитическую активность микроорганизмов [Домаш и др., 2008]. При поражении пшеницы S. nodorum происходило изменение уровня активности гидролитических ферментов и их ингибиторов. Повышение активности ингибиторов протеиназ в листьях было обусловлено усилением экспрессии гена EU 293132.1 (рис. 3). Предобработка ЖК способствовала более высокому уровню экспрессии гена ингибитора протеиназ в постинфекционный период, по сравнению с СК (рис. 3, 5, 6).

Рис.3. Экспрессия гена ингибитора протеиназ EU 293132.1 в листьях пшеницы при инфицировании S.аnodorum: 1 - контроль; 2 - обработка СК; 3 - обработка ЖК; 4 - S. nodorum; 5 - обработка СК+ S. nodorum; 6 - обработка ЖК+ S. nodorum. I - 24, II - 48, III - 72 ч после инокуляции, соответственно. Здесь и далее цифрами над фотографиями гелей представлен уровень экспрессии гена в %.

Таким образом, обе сигнальные молекулы - СК и ЖК, оказывали пролонгированное защитное действие на растения пшеницы при инфицировании S. nodorum, усиливая в них генерацию супероксидного радикала и Н2О2. Защитное действие сигнальных молекул против возбудителя септориоза обусловлено активацией оксалатоксидазы, ингибиторов протеиназ и снижением активности каталазы.

2. Экспрессия генов пероксидазы и оксалатоксидазы, интенсивность накопления лигнина в растениях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами гриба S. nodorum и обработке сигнальными молекулами

В естественных условиях популяция патогенов состоит из смеси различных штаммов, отличающихся степенью агрессивности. Одним из важных ферментов, который наряду с НАДФН-оксидазой, повышает уровень H2O2 в растениях при инфицировании, является оксалатоксидаза [Dumas et al., 1995]. Основная функция этого фермента - участие в деградации щавелевой кислоты, которая в патогенных системах является фактором вирулентности.

Рис. 4. Экспрессия гена оксалатоксидазы AJ556991.1 (А) и активность фермента (Б) в листьях пшеницы при инфицировании штаммами S.аnodorum различной агрессивности.

1- контроль; 2- обработка СК; 3- обработка ЖК; 4- штамм 4ВД; 5- обработка СК+ штамм 4ВД; 6- обработка ЖК+ штамм 4ВД; 7- штамм 9 МН; 8- обработка СК+ штамм 9МН;

9- обработка ЖК+ штамм 9 МН. I - 24, II - 48, III - 72 ч после инокуляции, соответственно.

Результаты исследований показали, что при инфицировании высокоагрессивным штаммом уровень экспрессии гена оксалатоксидазы в растениях значительно ниже, чем при инфицировании низкоагрессивным штаммом (рис. 4 А), что напрямую отражается на активности фермента (рис. 4 Б). Интересно, что в предобработанных СК растениях но, особенно ЖК, экспрессия гена оксалатоксидазы повышается при инфицировании высокоагрессивным штаммом (рис. 4 - 8, 9).

Рис.5. Экспрессия гена пероксидазы TC 151917 (А) и активность фермента (Б) в листьях пшеницы при инфицировании штаммами S.nodorum различной агрессивности.

1- контроль; 2- обработка СК; 3- обработка ЖК; 4- штамм 4ВД; 5- обработка СК+ штамм 4ВД; 6- обработка ЖК+ штамм 4ВД; 7- штамм 9 МН; 8- обработка СК+ штамм 9МН;

9- обработка ЖК+ штамм 9 МН. I - 24, II - 48 ч после инокуляции, соответственно.

Важным ферментом, участвующим в регуляции содержания Н2О2 в растительных тканях является пероксидаза. Любопытно, в отличие от оксалатоксидазы, усиление экспрессии гена анионной пероксидазы происходило как при инфицировании низкоагрессивным, так и высокоагрессивном штаммом гриба (рис. 5 А). Вероятно, тотальная активность фермента в начальные фазы развития септориоза не зависит от степени агрессивности патогена (рис. 5 Б).

Эндогенная пероксидаза растений с использованием Н2О2 способна окислять фенольные соединения, что связано с укреплением клеточных стенок в результате лигнификации. В наших экспериментах в контрольных неинфицированных листьях слабая зеленая флуоресценция, характерная для отложений лигнина, наблюдалась в клеточной стенке ксилемы и замыкающих клеток устьиц. Развитие возбудителя септориоза сопровождалось появлением в зоне роста патогена интенсивной зеленой флуоресценции в устьичных клетках и в прилежащих к ним эпидермальных и мезофилльных клетках (рис. 6, I). При этом при инфицировании растений высокоагрессивным штаммом количество флуоресцирующих клеток в листьях оказалось меньше (рис. 6, II), чем в варианте с инфицированием листьев низкоагрессивным штаммом (рис. 6, II).

  К  СК ЖК

Рис. 6. Автофлуоресценция лигнина в листьях пшеницы при инфицировании штаммами S.аnodorum различной агрессивности и обработке салициловой и жасмоновой кислотами, 48 ч после инокуляции. I - низкоагрессивный штамм; II - высокоагрессивный штамм.

В варианте опыта с предобработкой растений СК при использовании как низкоагрессивного, так и высокоагрессивного штаммов количество флуоресцирующих клеток возрастало, однако в варианте опыта с предобработкой растений ЖК этот параметр соответствовал уровню инфицированного контроля.

Таким образом, патосистема пшеница - низкоагрессивный штамм S.аnodorum характеризуется более интенсивной лигнификацией клеточной стенки в сравнении с патосистемой пшеница - высокоагрессивный штамм S.аnodorum. Вероятно, метаболиты высокоагрессивного штамма возбудителя септориоза, негативно влияя на экспрессию гена оксалатоксидазы, снижают эффективность защитного ответа, в том числе за счет процессов лигнификации в растительных тканях.

3. Роль грибной каталазы в регуляции уровня Н2О2 в растительных тканях и проявлении агрессивности патогена S. nodorum

Возможным фактором агрессивности и вирулентности возбудителя септориоза считается способность к секреции внеклеточной каталазы, поскольку это расширяет возможности патогена к росту и развитию в растениях, в том числе при повышенных концентрациях перекиси водорода.

Инфицирование пшеницы S.nodorum сопровождалось повышением каталазной активности в листьях растений (рис. 7). Причем, уровень каталазной активности в растениях, инфицированных высокоагрессивным штаммом, был значительно выше, чем при инфицировании низкоагрессивным штаммом на всем протяжении опыта (рис. 7). Подобные результаты были получены нами при культивировании изученных штаммов гриба в жидкой питательной среде.

.	Рис. 7. Активность каталазы в листьях пшеницы при инфицировании различными штаммами S. nodorum: 1 - неинфицированные листья; 2 - низкоагрессивный штамм 4ВД; 3 - высокоагрессивный штамм 9МН.

Поскольку выявленная каталазная активность могла быть обусловлена не только факторами растения, но и гриба, были проведены эксперименты, позволившие оценить экспрессию одного из генов каталазы S.nodorum SNOG_03173 в тканях пшеницы. Как видно из рис. 8, при инфицировании растений пшеницы высокоагрессивным штаммом 9МН, усиленная экспрессия гена каталазы проявлялась уже к 6-му ч после инфицирования и поддерживалась на относительно высоком уровне на протяжении всего опыта (120 ч). В то же время, при заражении пшеницы низкоагрессивным штаммом 4ВД усиление экспрессии гена каталазы SNOG_03173.1. выявлялось только через 24 ч после инокуляции, и оно было значительно ниже (рис. 8).

Рис. 8. Экспрессия гена каталазы SNOG_03173.1. гриба S.nodorum в листьях пшеницы сорта Жница: 1 - контроль (неинфицированные растения); 2 - низкоагрессивный штамм 4ВД; 3 - высокоагрессивный штамм 9МН; 4 - амплификаты ДНК гриба S.nodorum.

Полученные данные свидетельствует о том, что степень экспрессионной активности гена SNOG_03173.1. и, соответственно, уровень активности фермента каталазы, разлагающего Н2О2, являются одним из важных факторов, обеспечивающих высокую агрессивность и патогенность гриба S.nodorum.

4. Связь устойчивости пшеницы к S. nodorum с постинфекционным уровнем экспрессии генов оксалатоксидазы и пероксидазы в растениях

Исследования проводились на пяти районированных сортах пшеницы, предположительно характеризующихся различной степенью устойчивости к септориозу. Визуальные наблюдения за ростом и развитием возбудителя септориоза на эпидермисе листьев исследуемых сортов пшеницы выявило различную степень развития патогена, и соответственно, различную степень поражаемости листьев пшеницы. На листьях пшеницы сорта Казахстанская 10 уже через 24 ч после инокуляции мицелий гриба густо покрывал поверхность листа. В вариантах опыта с применением листьев пшеницы сортов Омская 36, Симбирка, Башкирская 26 и особенно Омская 35 развитие гриба было менее интенсивным.

Размеры инфекционного пятна через 120 часов после инокуляции на листьях исследуемых сортов различались более чем в два раза (табл. 2). Таким образом, наибольшую устойчивость к возбудителю септориоза проявляли растения сорт Омская 35, наименьшую - Казахстанская 10, сорта пшеницы Омская 36, Симбирка, Башкирская 24 по степени инфицируемости листьев заняли промежуточное положение.

Таблица 2

Площадь инфекционного пятна и постинфекционный уровень экспрессии генов оксидоредуктаз (% к контролю) в листьях пшеницы различных сортов пшеницы

Cорта пшеницы с различной полевой устойчивостью	Площадь инфекционного пятна, мм2	Экспрессионная активность гена оксалатоксидазы AJ556991.1	Экспрессионная активность гена пероксидазы TC151917
Омская 35	7,3 0,3	227	200
Омская 36	9,1 0,4	150	175
Симбирка	12,60,9	194	124
Башкирская 24	15,9 1,1	120	102
Казахстанская 10	19,6 1,3	120	101

Дальнейшие исследования по выявлению зависимости между размером инфекционного пятна и уровнем транскрипционной активности генов, кодирующих белки, которые принимают непосредственное участие в защитных реакциях растений (оксалатоксидаза, пероксидаза) показали, что уровень экспрессии генов защитных белков в целом снижается при увеличении размеров инфекционного пятна, т.е. более устойчивые сорта характеризуются и высокой экспрессионной активностью (табл. 2).

ВЫВОДЫ

1. Инфицирование пшеницы возбудителем септориоза S. nodorum  усиливает экспрессию генов оксидоредуктаз в растительных тканях,  и соответственно, повышает уровень активности кодируемых ферментов, что свидетельствует об их участии в формировании и реализации защитных реакций растений к патогену.

2. Сигнальные молекулы (салициловая и жасмоновая кислоты) оказывают защитное действие на растения пшеницы при инфицировании S. nodorum, индуцируя в них генерацию супероксидного радикала и перекиси водорода. Салициловая кислота вызывает более раннее индуцирующее действие на уровень АФК, чем жасмоновая кислота. Защитное действие сигнальных молекул против возбудителя септориоза обусловлено активацией оксалатоксидазы, анионной пероксидазы, ингибиторов протеиназ и снижением активности каталазы.

3. Патосистема пшеница - низкоагрессивный штамм S. nodorum характеризуется более интенсивной лигнификацией клеточной стенки по сравнению с патосистемой пшеница - высокоагрессивный штамм S. nodorum. Повышенный синтез лигнина в зоне инфицирования обеспечивается высоким уровнем экспрессии генов оксалатоксидазы и анионной пероксидазы.

4. Впервые выявлена связь между степенью агрессивности гриба S.аnodorum и уровнем активности внеклеточной каталазы патогена. Высокая экспрессионная активность гена каталазы и, соответственно, повышенный уровень активности фермента, участвующего в регуляции уровня Н2О2 в зоне инфицирования, является одним из биохимических факторов, обеспечивающих высокую агрессивность и патогенность штамма S.nodorum.

5. Выявлена связь устойчивости сортов пшеницы к возбудителю септориоза с уровнем экспрессии генов оксидоредуктаз в растениях: наименьшую поражаемость возбудителем септориоза проявляют сорта, характеризующиеся высоким уровнем экспрессии генов оксалатоксидазы и пероксидазы в инфицированных тканях.

Публикации по теме диссертации в изданиях,

рекомендованных ВАК РФ

1. Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Черепанова Е.А., Заикина Е.А., МаксимоваИ.В. Салициловая и жасмоновая кислота в регуляции про-антиоксидантного статуса листьев пшеницы при инфицировании Septoria nodorum Berk.// Прикладная биохимия и микробиология. 2011, № 5. С.а602608.
2. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г. Сигнальная регуляция экспрессии оксидоредуктаз в системе растение - грибной патоген // Вестник Уральской медицинской академической науки, тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии. № 4/1 (38). Екатеренбург, 2011. - С. 98-99.
3. Ахатова А.Р., Яруллина Л.Г., Шпирная И.А., Заикина Е.А., Сурина О.Б., Ибрагимов Р.И. Активность гидролаз, их ингибиторов в тканях растений при заражении фитопатогенами и обработке индукторами устойчивости // Вестник Башкирск. ун-та. - 2012. - Т.18, №3. - С. 1278-1281.

Публикации в сборниках и материалах всероссийских

и международных конференций

4. Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г., Кузьмина О.И., Заикина Е.А., МаксимоваИ.В. Анализ экспрессии генов защитных белков в растительных тканях при грибном патогенезе и обработке иммуностимуляторами // Первые Международные Беккеровские чтения. Волгоград, 2010, ВГУ, С.31-33.
5. Яруллина Л.Г., Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., Максимов И.В. Хитоолигосахариды и сигнальные молекулы в регуляции активности защитных белков растений // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем Краснодар, 2010, С. 634-636.
6. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г., Максимов И.В. Салициловая и жасмоновая кислоты в регуляции продукции АФК и экспрессии гена оксалатоксидазы в растениях пшеницы при инфицировании Septoria nodorum Berk // Актуальные проблемы ботаники и экологии. Симферополь: ВД Ариал, 2010, С. 353-355.
7. Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., Яруллина Л.Г., Максимов И.В. Регуляция экспрессионной активности гена анионной пероксидазы пшеницы и картофеля сигнальными молекулами при инфицировании грибными патогенами // Актуальные проблемы ботаники и экологии. Симферополь: ВД Ариал, 2010, С. 335-336.
8. Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., Касимова Р.И., Яруллина Л.Г. Индукция устойчивости растений к патогенным грибам элиситорами и сигнальными молекулами // Биология будущего: Традиции и инновации. Екатеринбург: АМБ, 2010, С. 84-86.
9. Яруллина Л.Г., Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А. Регуляция экспрессионной активности гена оксалатоксидазы в растениях пшеницы при инфицировании SEPTORIA NODORUM BERK. // VII Съезд общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий, 2011, Нижний Новгород, С. 797-798.
10. Яруллина Л.Г., Ибрагимов Р.И., Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., МарданшинаИ.С., Шпирная И.А.. Молекулярно-биохимические механизмы индуцированной устойчивости растений // Интегрированная защита растений: стратегия и тактика. Минск, 2011. - С. 821-825.
11. Заикина Е.А., Трошина Н.Б., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на экспрессионную активность гена оксалатоксидазы и развитие защитного ответа в листьях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами Septoria nodorum BERK. // Биомика - наука XXI века, Уфа, 2011, С. 38-40.
12. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г. Оценка уровня экспрессии генов оксидоредуктаз в листьях пшеницы при обработке сигнальными молекулами и инфицировании различными по агрессивности штаммами Septoria nodorum Berk. // Материалы II всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых Биология будущего: традиции и новации 15 октября 2012 г., Екатеринбург - С. 203-206.
13. Ахатова А.Р., Заикина Е.А., Яруллина Л.Г. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на уровень активности гидролаз и их ингибиторов в листьях пшеницы при инфицировании различными штаммами возбудителя септоиоза // Материалы II всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых Биология будущего: традиции и новации 15 октября 2012 г., Екатеринбург - С. 191-194.
14. Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Заикина Е.А., Сурина О.Б., Ахатова А.Р. Индуцированное накопление лигнина в системе растение - грибной патоген // Материалы докладов VIII международного симпозиума Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты Москва, 25аоктября 2012 г. - С. 501-506.
15. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Касимова Р.И., Ахатова А.Р., Яруллина Л.Г. Экспрессионная активность генов оксидоредуктаз в листьях пшеницы различной устойчивости при инфицировании Septoria nodorum // Материалы III Всероссийской школы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика - наука XXI века.- Уфа: ИБГ УН - РАН, 2012г. - С. 42.

Список сокращений
АФК - активные формы кислорода БАПНА - N, -бензоил -DL-аргинин -4- нитроанилид ДАБ - диаминобензидин ЖК - жасмоновая кислота СК - салициловая кислота НТС - нитротетразолий синий	ПЦР - полимеразно-цепная реакция ФБ - Na-фосфатный буфер pI - изоэлектрическая точка Н2О2 - пероксид водорода О2- - супероксиданион

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разным специальностям