ФАРМАКОТЕРАПИЯ НАРУШЕНИЙ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРИ ДИСБАЛАНСЕ ЭСТРОГЕНОВ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологичесикх наук Волгоград

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

На правах рукописи

ФЕДОТОВА

Юлия Олеговна

ФАРМАКОТЕРАПИЯ НАРУШЕНИЙ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРИ ДИСБАЛАНСЕ ЭСТРОГЕНОВ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологичесикх наук

Волгоград - 2008 г.

Работа выполнена в Отделе нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург)

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ,

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Сапронов Николай Сергеевич

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Игнатов Юрий Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор

Хоронько Владимир Владиленович

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор

Воронина Татьяна Александровна

Ведущая организация: Военно-медицинская академия им.

С.М. Кирова (Санкт-Петербург)

Защита состоится л___ _____________ 2008 г. в _____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава

Автореферат разослан л___ _____________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор А.Р. Бабаева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время накоплен большой объем экспериментальных данных, свидетельствующих о роли половых стероидов не только в репродуктивном поведении, но и в модулирующем влиянии на другие, не связанные с половым, формы поведения (McEwen, Alves, 1999; Toran-Allerand et al., 1999). Действительно, исследования последних лет убедительно показали, что мозг гораздо более чувствителен к действию половых стероидов, чем предполагалось ранее (Falkenstein et al., 2000; McEwen, 2001). Установлено, что эстрогены проявляют контролирующее влияние на пренатальный и ранний постнатальный периоды развития головного мозга, а также в течение всей жизни при различных нарушениях в гипофизарно-овариальной системе (Vries, 2004). Органами-мишенями для эстрогенов являются передний мозг, гипоталамус, гиппокамп и ядра шва мозга (McEwen, 2001).

При этом, гормональные сдвиги, обусловленные аномальным функционированием гипоталамо-гипофизарно-овариальной системы, глубоко изменяют высшую нервную деятельность (McEwen, Alves, 1999; McEwen, 2001). Кроме того, исследования последних лет показывают, что эстрогены оказывают многогранное влияние на взаимодействие различных нейромедиаторных систем между собой (McEwen, Alves, 1999; McEwen, 2001, 2002; Бабичев, 2005). Это взаимодействие осуществляется посредством геномного и негеномного механизмов действия эстрогенов (McEwen, 2001). Доказано влияние эстрогенов за счет обоих механизмов действия на следующие нейромедиаторные системы: норадренергическую, ацетилхолинергическую, серотонинергическую, дофаминергическую, ГАМКергическую и опиоидергическую (McEwen, Alves, 1999; Toran-Allerand et al., 1999). Такое множественное влияние эстрогенов на медиаторную нейропередачу в головном мозге позволяет предполагать их участие в патофизиологических механизмах целого ряда когнитивных и психических расстройств (Lindamer et al., 1999; Sherwin, 2000, 2005; Amin, Epperson, 2005). Не случайно, что когнитивные и нервно-психические расстройства чаще встречаются у женщин по сравнению с мужчинами (Amin, Epperson, 2005).

Для коррекции обмена веществ при возникающих гормональных сдвигах в гипофизарно-овариальной системе у женщин, как правило, назначают стандартную заместительную гормонотерапию. При этом, положительный результат нередко сопровождается рядом побочных явлений, весьма губительных для отдельных пациенток. Так, длительное применение эстрогенсодержащих препаратов в качестве заместительной терапии в большинстве случаев приводит к резким нарушениям в сердечно-сосудистой и гепатобилиарной системах, а также к появлению новообразований (Cметник, 2003; Wang-Cheng, Rosenfeld, 2003). Следует отметить, что в эти схемы лечения не входит оптимальная нормализация мнестических процессов пациента, а сведения о какой-либо фармакологической коррекции нарушений высших функций мозга при патологическом функционировании гипофизарно-овариальной системы, кроме заместительной гормональной терапии, отсутствуют.

Принимая во внимание многомерность влияния эстрогенов на ЦНС, а также широкий спектр воздействия эстрогенов на функциональную активность нейромедиаторных систем, особенно важным представляется вопрос об изучении роли эстрогенов в реализации эффектов различных фармакологических нейротропных веществ, действующих на нейромедиаторные рецепторы. Анализ данных литературы показывает, что эстрогены могут оказывать существенное влияние на развитие эффектов лекарственных веществ как при остром, так и при хроническом применении препаратов (Арушанян, 2005). Следовательно, детализация эффектов нейротропных препаратов при дисбалансе эстрогенов является необходимым условием как для поиска оптимальных подходов к терапии, так и для разработки новых лекарственных препаратов. Кроме того, установлено, что введение 17b-эстрадиола в очень низких дозах, обеспечивающих уровень эстрадиола в крови, близкий к физиологическому, выраженно улучшает когнитивные процессы у овариоэктомированных крыс при исследовании в различных поведенчеcких тестах по сравнению с введением других препаратов эстрогенов в высоких дозах (Wise et al., 2005).

В связи с этим, разработка новых подходов фармакокоррекции, при которых используемые различные нейротропные препараты или их комбинация с эстрогенами в минимальных дозах прямо или опосредованно модулируют функциональную активность нейромедиаторных или гормональных систем, приводя к улучшению или полной нормализации процессов высшей нервной деятельности мозга, является актуальной.

Целью настоящей работы являлось изучение возможности фармакологической коррекции нарушений высшей нервной деятельности мозга в условиях аномального функционирования гипофизарно-овариальной системы, а также в ключевые периоды полового цикла у самок крыс, с помощью сочетанного введения нейротропных веществ и гормонального агента в низких дозах.

Задачи исследования:

1. Оценить эффекты низкого или высокого уровня эндогенных эстрогенов, тотального дефицита эндогенных эстрогенов и экзогенного введения 17β-эстрадиола на мнестические процессы, уровень половых гормонов в крови, обмен моноаминов и экспрессию генов рецепторов в структурах головного мозга у самок крыс.

2. Провести сравнительный анализ влияния серотонинотропных, дофаминотропных и холинотропных веществ в низких дозах на условнорефлекторную деятельность и эмоциональные формы поведения, гормональный и нейромедиаторный статус, а также экспрессию генов рецепторов в головном мозге в условиях физиологических колебаний уровня эндогенных эстрогенов у нормально циклирующих самок.

3. При экспериментальном дефиците эстрогенов провести сравнительное изучение действия серотонинотропных, дофаминотропных и холинотропных веществ, введенных изолированно или в комбинации с 17β-эстрадиолом в минимальных дозах, на поведенческий, гормональный и нейромедиаторный статус, а также на экспрессию генов рецепторов в головном мозге.

Научная новизна. Проведенное исследование позволило уточнить характер взаимодействия моноаминергических и холинергической систем с гипоталамо-гипофизарно-овариальной системой, нарушения которых определяют развитие когнитивных расстройств при аномальном функционировании указанной гормональной системы. Впервые проведено комплексное сравнительное изучение роли нейромедиаторных систем в патогенезе развития нарушений высшей нервной деятельности в условиях естественного колебания уровня эстрогенов в крови в течение полового цикла и при экспериментально созданном дефиците эстрогенов у самок крыс. Обоснован новый подход к фармакотерапии когнитивных нарушений при дисбалансе эстрогенов, который заключается в минимизации доз нейротропных препаратов и 17β-эстрадиола при их комбинированном использовании.

В процессе исследования было впервые установлено, что:

1/ стимуляция 5-ГТ1А-подтипа или блокада 5-ГТ2А/2С-подтипа серотониновых рецепторов корректирует мнестические процессы у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-эстрадиол;

2/ стимуляция Д1-типа или Д2-типа дофаминовых рецепторов нормализует высшую нервную деятельность и уменьшает выраженность тревожного поведения у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-эстрадиол;

3/ блокада Д2-типа дофаминовых рецепторов восстанавливает мнестический статус и оказывает антидепрессивный эффект у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-эстрадиол;

4/ повышение уровня ацетилхолина, стимуляция М- или блокада Н-холинорецепторов корректирует условнорефлекторную память у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-эстрадиол;

5/ блокада 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов или Д1-типа дофаминовых рецепторов нарушает мнестические функции мозга у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-эстрадиол.

Приоритетный характер носят полученные в работе данные об эффектах серотонинотропных, дофаминотропных и холинотропных веществ в низких дозах на гормональный статус, обмен моноаминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и рецептора 17β-эстрадиола в структурах головного мозга, вовлеченных в механизмы реализации высших функций мозга.

Научно-практическое значение работы. Представленная работа, посвященная анализу важнейшего аспекта проблемы взаимодействия нейромедиаторных и гормональной овариальной систем при дисбалансе эстрогенов в патогенезе мнестических расстройств, носит фундаментальный характер. Основное теоретическое значение работы состоит в раскрытии нейро-эндокринных взаимодействий, включающих модуляцию гормонального статуса, обмена биогенных аминов и экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-эстрадиола. Полученные в работе данные позволяют говорить о существовании конкурентных или синергичных взаимоотношений в ряде случаев между эстрогенами и нейромедиаторами в контроле высшей нервной деятельности при дефиците эстрогенов в эксперименте.

Вместе с тем, проведенное исследование создает экспериментальный базис для разработки и внедрения новых подходов к фармакотерапии когнитивных расстройств при дефиците эстрогенов в клинической практике. Предложен способ лечения нарушений мнестических функций при гипоэстрогенном синдроме (патент № 2268726). Полученные в работе результаты могут быть использованы и в разработке новых подходов для коррекции гормонального статуса при различных эндокринных патологиях, сопровождающихся дисфункцией гипофизарно-овариальной системы.

Результаты исследования способствуют выбору оптимальной терапии конитивных расстройств при дефиците эстрогенов с учетом всех негативных и позитивных эффектов монотерапии нейротропными веществами в низких дозах или комбинированной терапии нейротропными препаратами совместно с 17β-эстрадиолом в низкой дозе и создают необходимые условия для разработки специальных гендерных схем назначения веществ с целью повышения их эффективности и ограничения побочных реакций.

Проведенный в работе анализ эффектов комбинированной терапии нейротропными веществами с 17β-эстрадиолом открывает перспективы для создания новых фармакологических препаратов, сочетающих в себе одновременно гормональной и нейромедиаторный агенты. На основе экспериментальных данных могут быть предложены новые подходы к применению нейротропных средств и/или их комбинациий с гормональными препаратами для эффективной фармакокоррекции расстройств высших функций мозга при дисбалансе эстрогенов в организме.

Основные положения, выносимые на защиту:

Направленность фармакологических эффектов нейротропных веществ, введенных изолированно или в комбинации с 17β-эстрадиолом в низкой дозе, зависит от типа расстройств высших функций мозга и функционального состояния гипофизарно-овариальной системы.
При выборе оптимальной схемы фармакокоррекции мнестических нарушений при дисфункции гипофизарно-овариальной системы в эксперименте следует учитывать гормональный фон и тип патологии высшей нервной деятельности.
Фармакологические воздействия на холинергическую, дофаминергическую или серотонинергическую системы могут потенцировать или ингибировать поведенческие эффекты экзогенно введенного 17β-эстрадиола в зависимости от стимуляции или блокирования типа нейромедиаторных рецепторов.
Использование холинотропных веществ, активирующих М-холинореактивные структуры или блокирующих Н-холинореактивные структуры головного мозга, оказывает универсальное корректирующее влияние при нарушениях высшей нервной деятельности независимо от гормонального статуса самок крыс.
Нормализация эмоциональных форм поведения при применении нейротропных средств, стимулирующих 5-ГТ1А-подтип серотониновых рецепторов или блокирующих 5-ГТ2А/2C-подтип серотониновых рецепторов, не детерминируется состоянием гипофизарно-овариальной системы.
Позитивные эффекты дофаминотропных веществ на мнестические процессы и тревожно-депрессивное поведение зависят от гормонального статуса и характера нарушений высших функций головного мозга.

ичный вклад автора. Автором лично проведены все опыты с использованием различных поведенческих методик, выполнены биохимические исследования по определению уровня тропных и периферических половых гормонов в крови in vitro и оценке обмена биогенных аминов в структурах головного мозга. Часть исследований, посвященных изучению экспрессии генов рецепторов в разных образованиях головного мозга, проделана совместно с Н.А. Платоновой, Н.В. Цымбаленко и Л.В. Пучковой (Отдел молекулярной генетики ГУ НИИЭМ РАМН).

Апробация работы. Результаты работы докладывались на различных международных и всероссийских конгрессах и конференциях. Из числа важнейших форумов, на которых были представлены материалы диссертации, следует отметить: Пленум правления Российского научного общества фармакологов Фармакология и современная медицина (Санкт-Петербург, 1999); 1-ый, 2-ой и

3-ий Региональные конгрессы Международного общества психонейроэндокринологов (Санкт-Петербург, 2001; Бухарест, Румыния, 2002; Капподокия, Турция, 2004); 33-ий и 35-ый Ежегодные конгрессы Международного общества психонейроэндокринологов (Пиза, Италия, 2003; Глазго, Шотландия, 2004); 2-ой Съезд Российского общества фармакологов (Москва, 2003); Всероссийская конференция с международным участием Нейроэндокринология - 2003 (Санкт-Петербург, 2003); 1-ый Международный экологический форум (Санкт-Петербург, 2003); 24-ый конгресс Международной коллегии нейропсихофармакологии (Париж, Франция, 2004); Региональный конгресс Международной коллегии нейропсихофармакологии (Брно, Чехия, 2004); 17-ый, 18-ый и 20-ый конгрессы Европейской коллегии нейропсихофармакологии (Стокгольм, Швеция, 2004; Амстердам, Нидерланды, 2005; Вена, Австрия, 2007); 8-ой Региональный конгресс Европейской коллегии нейропсихофармакологии (Москва, 2005); 8-ой Всемирный конгресс биологической психиатрии, (Вена, Австрия, 2005); 3-ий Съезд фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), а также на научных заседаниях отдела нейрофармакологии НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург (2004 - 2007 гг).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 53 работы, из них 22 статьи в центральных отечественных и зарубежных реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 342 страницах машинописного текста, включая 36 таблиц и 83 рисунка. Диссертация содержит разделы Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты, Обсуждение результатов и Выводы. Список литературы насчитывает 344 источника, из них 28 работ на русском языке, 316 - на иностранном.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 3800 половозрелых cамках крыс линии Вистар массой 180-200 г, получаемых из питомника Рапполово. Все исследования проводились в утренние часы (10.00 - 13.00). Для выполнения каждой методики крыс разделяли на группы по 8-10 особей в каждой.

Операция удаления яичников. Операционное вмешательство осуществляли с соблюдением правил асептики. В качестве наркоза использовали диэтиловый эфир. Методические особенности и детали операции подробно описаны у Я. Д. Киршенблата (1969). Отсутствие эстрального цикла у самок подтверждали анализом влагалищных мазков в течение 4-х дней до начала эксперимента.

Цитологический метод определения стадии полового цикла у самок. Для анализа влияния разного уровня эндогенных эстрогенов нами были выбраны три наиболее характерные фазы полового цикла: диэструс, проэструс и эструс (Розен, 1994). Определение фаз полового цикла (диэструс, проэструс, эструс) у интактных крыс проводили с использованием характерных морфологических признаков по мазкам согласно описанию у Я. Д. Киршенблата (1969).

Вещества

Серотонинотропные вещества. 8-OH-DPAT ([±]-8-гидрокси-2-дипропиламинотетралина гидробромид) - селективный агонист 5-ГТ1А-рецепторов растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили подкожно в дозе 0,05 мг/кг. NAN-190 (1-(2-метоксифенил)-4-(4-фталимидобутил) пиперазина гидробромид) - селективный антагонист 5-ГТ1А-рецепторов растворяли в смеси, состоящей из 5 частей дистиллированной воды, 4 частей пропиленгликоля и 1 части 96% этилового спирта, и вводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг. m-CPP (1-(3-хлорфенил)пиперазина гидрохлорид) - селективный агонист 5-ГТ2В/2C-рецепторов растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг. Кетансерин (R 41468/3-[2-[4-(4-флюоробензоил)-1-пиперидинил]этил]-2,4[1Н,3Н]-квиназолинэдиона тартрат) - селективный антагонист 5-ГТ2А/2C-рецепторов растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг.

Дофаминотропные вещества. SKF-38393 ([±]-1-фенил-2,3,4,5-тетрагидро-(1Н)-3-бензазепин-7,8-диол гидробромид) - агонист Д1-типа рецепторов растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно в дозе 1,0 мг/кг. SCH-23390 ([R]-(+)-7-хлор-8-гидрокси-3-метил-1-фенил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-3-бензазепин гидрохлорид) - антагонист Д1-типа рецепторов растворяли в смеси, состоящей из 5 частей дистиллированной воды, 4 частей диметилсульфоксида и 1 части 96% этилового спирта, и вводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг. Квинпирол ([4а-транс]-4,4а,5,6,7,8,8а,9-октагидро-5-пропил-1Н-пиразол[3,4-g]квинолина гидрохлорид) - агонист Д2-типа рецепторов растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг. Сульпирид ([RS]-(±)-5-аминосульфонил-N-[(1-этил-2-пирролидинил]-2-метоксибензамид) - антагонист Д2-типа рецепторов растворяли в смеси, состоящей из 5 частей дистиллированной воды, 4 частей диметилсульфоксида и 1 части 96% этилового спирта и вводили внутрибрюшинно в дозе 10,0 мг/кг.

Холинотропные вещества. Галантамина гидробромид растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно в дозе 1,0 мг/кг. Метамизил растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг. Ганглерон растворяли в 0,9% растворе NaCl и вводили внутримышечно в дозе 5,0 мг/кг. При сочетанном введении метамизила и галантамина, последний вводили через 20 минут после введения метамизила.

Гормональный препарат. 17β-Эстрадиол (17β-Е2) растворяли в стерильном персиковом масле и вводили внутримышечно в дозе 0,5 мкг на каждое животное. Необходимо отметить, что в данном исследовании была использована низкая доза 17β-эстрадиола (Wise, 2000).

Необходимо подчеркнуть, что все нейротропные вещества были использованы в низких поведенческих дозах, полностью соответствующих данным литературы (Diaz-Veliz et al., 1995, 1997, 1999; Лосев,. 2001; Bethea et al., 2002). Фармакологические вещества вводили в объеме 0,1 мл на животное ежедневно в течение 14 дней, через 2 недели после овариоэктомии. Поведенческие тесты проводили через 1 час после последнего введения фармакологических веществ.

Поведенческие тесты

Условную реакцию пассивного избегания (УРПИ) вырабатывали на основе однократного электрокожного подкрепления в установке, состоящей из двух камер - большой (освещенной) и малой (темной) с электрифицированным полом, сообщающихся между собой круглым отверстием (Любимов, 1965). Методическая особенность эксперимента заключалась в использовании высоких значений электрического тока (6 мA) для выработки прочно сформированного навыка пассивного избегания (Sandi, Rose, 1997). Регистрировали латентный период захождения животного в темную камеру. Воспроизведение УРПИ определяли через 24 часа. Незахождение в темную камеру расценивали как воспроизведение навыка пассивного избегания, а укорочение времени нахождения в освещенной камере - как амнезию навыка.

Водный лабиринт Морриса. Для выявления способности животных к пространственной ориентации в работе использовали бассейн диаметром 130 см и высотой 50 см, заполненный водой на глубину 35 см (Пономарев, Виноградова, 2000). В течение 7 дней животных обучали поиску этой платформы, которая располагалась на периферии бассейна в 15 см от борта. В день тестирования (8-ой день эксперимента) животному предоставлялись две попытки - тренировочная и опытная, интервал между которыми составлял 60 с. В течение 3 мин регистрировали время обнаружения платформы в течение тренировочной и опытной попыток.

Уровень тревожности у животных определяли с использованием общепринятого теста приподнятого крестообразного лабиринта (Воронина, Середенин, 2000). Поведение животных регистрировали в течение 5 мин и оценивали следующие параметры: время нахождения в открытых и закрытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава.

Тест Порсолта. Суть метода состоит в том, что крыс помещают в сосуд 30-40 см в диаметре и глубиной 60 см, заполненный водой с температурой 25 ± 20С. Животные, попадая в воду, стараются выбраться из сосуда. Убедившись в тщетности своих попыток, крысы оставляют их и зависают в воде в характерной позе (Porsolt et al., 1978). Показателем выраженности депрессивноподобного состояния по данному тесту является длительность неподвижности, которую оценивали визуально. Через 24 часа проводили тестирование выраженности депрессивноподобного состояния. Животное снова помещали в сосуд с водой и в течение 5 мин регистрировали время неподвижности.

Биохимические методы

Определение метаболизма моноаминов в структурах головного мозга. Выделенные структуры мозга (гипоталамус, гиппокамп и миндалина) размельчали в гомогенизаторе стекло-тефлон при 40С и скорости вращения пестика 3000 об/мин с использованием в качестве среды выделения 0,1 н HСlO4. После этого пробы центрифугировали при 14000 g в течение 7 мин при 40C, после чего супернатант был профильтрован через 0.2 мм Millipore фильтр. Концентрацию дофамина (ДА), норадреналина (НА), серотонина (СА) и их метаболитов - МГФГ, ДОФУК и 5-ГИУК в гипоталамусе, гиппокампе и миндалине определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на Beckman System Gold с электрохимическим детектором LC-4C. Разделение пиков проходило в хроматографической колонке SperoClone 5μ ODS 2 (250 mm x 4,60 mm) с предколонкой SecurityGuard (ODS 4,0 mm L x 3,0 mm ID) производства Phenomenex. В состав подвижной фазы входил 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0,3 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрила (рН = 3,2) (Андреев и соавт., 2002). Идентификацию и чистоту хроматографических пиков, а также их количественную оценку осуществляли по отношению к пикам, полученным от внешних стандартов с использованием пакета компьютерных программ.

Определение уровня половых тропных и периферических гормонов в сыворотке крови. Уровень половых гормонов (лютеинизирующий гормон - ЛГ, фолликулостимулирующий гормон - ФСГ, эстрадиол - Э, прогестерон - П) определяли в сыворотке крови с помощью гормональных тест-наборов для твердофазного иммуноферментного анализа in vitro у человека (DRG - Германия, Adultis - Италия, Biochimmak - Германия, Хема-Медика - Италия-Россия) согласно прилагаемой инструкции, но с предварительной раститровкой всех наборов и подбором оптимального разведения сывороток крови крыс, выполнением теста на удвоение и теста внутреннего стандарта для каждого набора. Подсчет результатов производился автоматически с помощью многоканального плашечного спектрофотометра Униплан (Россия) при длине волны 450 нм.

Определение уровня экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2-рецептора в структурах головного мозга. Характер экспрессии 5-ГТ1А-рецептора, 5-ГТ2C-рецептора, Д1-рецептора, Д2-рецептора, M-холинорецептора, Н-холинорецептора и 17β-Е2-рецептора в гипоталамусе, гиппокампе и миндалине определяли методом полуколичественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Последовательности прямого и обратного праймеров, кодирующих 5-ГТ1А-рецептор, были подобраны по последовательности Genbank Ac.N NM_012585, Rattus norvegicus 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1A(Htr1a), mRNA, 1269 bp. Длина ПЦР-продукта для 5-ГТ1А-рецептора составляла 362 п.н. Последовательности прямого и обратного праймеров, кодирующих 5-ГТ2С-рецептор, были подобраны по последовательности Genbank Ac.N NM_012765, Rattus norvegicus 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 2С(Htr2с, mRNA, 1383 bp). Длина ПЦР-продукта для 5-ГТ2C-рецептора составляла 170 п.н. Последовательности прямого и обратного праймеров, кодирующих Д1-рецептор, были подобраны по последовательности Genbank Ac.N NM_012546, Rattus norvegicus dopamine receptor 1A (Drd1a), mRNA, 3715 bp. Длина ПЦР-продукта для Д1-рецептора составляла 202 п.н. Последовательности прямого и обратного праймеров, кодирующих Д2-рецептор, были подобраны по последовательности Genbank Ac.N NM_012547, Rattus norvegicus dopamine receptor 2 (Drd2), mRNA, 2750 bp. Длина ПЦР-продукта для Д2-рецептора составляла 399 п.н. Последовательности прямого и обратного праймеров, кодирующих М-холинорецептор, были подобраны по последовательности Genbank Ac.N NM_031016, Rattus norvegicus cholinergic receptor, muscarinic 2 (Chrm2), mRNA, 2483 bp. Длина ПЦР-продукта для М-холинорецептора составляла 200 п.н. Последовательности прямого и обратного праймеров, кодирующих Н-холинорецептор, были подобраны по последовательности Genbank Ac.N NM_031016, Rattus norvegicus cholinergic receptor, nicotinic, alpha, polypeptide 2 (neuronal) (Chrna2), mRNA, 1931 bp). Длина ПЦР-продукта для Н-холинорецептора составляла 201 п.н. Последовательности прямого и обратного праймеров, кодирующих 17β-Е2-рецептор, были подобраны по последовательности Genbank Ac.N RNU57439, Rattus norvegicus estrogen receptor beta mRNA, 2555 bp. Длина ПЦР-продукта для 17β-Е2-рецептора составляла 332 п.н. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с использованием программы BLAST ( Тотальную РНК выделяли из ~25-30 мг ткани с помощью QiuckPrep Total RNA Extraction kitTM (AmershamPharmaciaBiotech, UK Limited) в полном соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1,0 мкг полирибосомной РНК, 200,0 ед. РНК-зависимой ДНК-полимеразы (M-Mlv обратная транскриптаза, 200,0 Eд/мкл, АмплиСенс, Россия), 1,0 мкМ random-праймера (АмплиСенс, Россия), эквимолярную смесь четырех dNTP по 500,0 мкM каждого (Promega, США), 5XОТ-буфер. Полимеразную цепную реакцию проводили в 30,0 мкл смеси, содержащей 1 мкл синтезированной кДНК, 1,5 ед. рекомбинантной Диа Taq-полимеразы (5,0 Eд/мкл, АмплиСенс, Россия), 1,5 мМ MgCl2, эквимолярную смесь четырех dNTP по 200,0 мкмолей каждого, 6,0 мкл 5-кратного ПЦР-буфера (АмплиСенс, Россия) и по 0,5 мкМ специфических праймеров (Синтол, Россия). Начальную денатурацию проводили при 940С в течение 5 мин, синтез состоял из 30 циклов, включавших этапы денатурации (940С, 1 мин), отжига (600С для 5-ГТ1А-рецептора, 550С для 5-ГТ2С-рецептора, 570С для Д1-рецептора, 590С для Д2-рецептора, 550С для M-холинорецептора, 590С для Н-холинорецептора, 1 мин) и элонгации (720С, 1 мин). Заключительный цикл элонгации длился 7 мин. Протокол амплификации для 17β-Е2-рецептора: начальная денатурация при 940С в течение 5 мин, 35 циклов: 94 0C 1 мин, 530C 1 мин, 680C 1 мин, и последний цикл элонгации 7 мин 680C. В качестве контроля синтезированных кДНК проводили ПЦР с праймерами к β-актину. Были использованы следующие праймеры: прямой 5Т-GAAGATCCTGACCGAGCGTG-3Т и обратный 5Т-AGCACTGTGTTGGCATAGAG-3Т. Длина ПЦР-продукта составляла 327 п.н. Электрофоретический анализ ПЦР продуктов проводили в 1% агарозном геле. В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры фирмы Сибэнзим (от 1000 п.н. до 100 п.н., отличающиеся друг от друга на 100 п.н.). Определение относительного содержания ЦП-мРНК проводили следующим образом. ПЦР-продукты подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, гели окрашивали бромистым этидием, цифровые фотографии геля денситометрировали посредством программы Scion Image и результаты выражали как отношение количества образовавшегося ПЦР-продукта данной мРНК к количеству β-актина.

Статистическая обработка результатов

Результаты экспериментов обрабатывали с применением интегрированного пакета статистических программ SPSS 9.0 (StatSoft, Inc). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (General Linear Model) при Р<0.05. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения и не прошедшие тест на равенство дисперсий, обрабатывали с применением теста Краскалла-Уоллиса. В таблицах и графиках результаты экспериментов представлены в виде M ± m, где: М - среднее арифметическое, m - среднеквадратичная ошибка среднего арифметического, число животных в группах (N) было 8-10 особей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние серотонинотропных веществ на высшую нервную деятельность у интактных самок крыс

Было выявлено, что при стимуляции 5-ГТ1А-подтипа или при блокаде 5-ГТ2А/2С-подтипа серотониновых рецепторов независимо от уровня эндогенных эстрогенов в организме нарушалась способность к воспроизведению условной реакции пассивного избегания (УРПИ) и существенно угнеталась способность самок к пространственному обучению (рис. 1 и 2).

В то же время, блокада 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов как при низком уровне эндогенных эстрогенов, так и при их высоком уровне приводила к восстановлению процесса воспроизведения УРПИ у крыс (рис. 1). С другой стороны, стимуляция 5-ГТ2В/2С-подтипа серотониновых рецепторов выраженно улучшала пространственное обучение у крыс независимо от уровня эндогенных эстрогенов в организме (рис. 2).

В тесте приподнятый крестообразный лабиринт у самок крыс при среднем или низком уровне эндогенных эстрогенов на фоне блокады 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов регистрировался анксиогенный эффект, тогда как при высоком уровне эстрогенов, напротив, проявлялся анксиолитический эффект (табл. 1). При стимуляции 5-ГТ2В/2C-подтипа серотониновых рецепторов при низком или среднем уровне эндогенных эстрогенов уровень тревожности снижался, а при их

Таблица 1

Влияние NAN-190, m-CPP и кетансерина на тревожное поведение

интактных самок крыс

Фаза цикла	Время в лоткрытых рукавах, сек	Время в закрытых рукавах, сек	Количество заходов в лоткрытые рукава, раз	Количество заходов в закрытые рукава, раз
ИНТАКТНЫЕ САМКИ
ДИЭСТРУС	86,4 ± 6,2	213,6 ± 2,4	1,8 ± 0,2	2,1 ± 0,4
ПРОЭСТРУС	36,4 ± 3,4*	263,6 ± 8,6*	0,4 ±0,1*	4,5 ± 0,2*
ЭСТРУС	42,6 ± 4,2*	257,4 ± 2,2*	0,3 ± 0,1*	4,0 ± 0,6*
ИНТАКТНЫЕ САМКИ + NAN-190
ДИЭСТРУС	41,2 ± 3,4#	258,8 ± 8,6#	1,2 ± 0,2	2,2 ± 0,2
ПРОЭСТРУС	90,3 ± 3,4#	209,7 ± 6,2#	0,4 ± 0,2	4,0 ± 0,4
ЭСТРУС	23,7 ± 2,2#	276,3 ± 3,8#	0,3 ± 0,1	4,1 ± 0,6
ИНТАКТНЫЕ САМКИ + m-CPP
ДИЭСТРУС	153,4 ± 3,2#	146,6 ± 4,2#	4,2 ± 0,4#	0,8 ± 0,2#
ПРОЭСТРУС	13,8 ± 0,8#	286,2 ± 5,6	0,1 ± 0,02#	3,9 ± 0,8
ЭСТРУС	86,8 ± 5,2#	213,2 ± 7,2#	3,6 ± 0,2#	1,6 ± 0,4#
ИНТАКТНЫЕ САМКИ + КЕТАНСЕРИН
ДИЭСТРУС	83,5 ± 4,2	216,5 ± 2,4	1,6 ± 0,2	2,0 ± 0,6
ПРОЭСТРУС	84,0 ± 4,8#	216,0 ± 5,6#	2,8 ± 0,2#	0,6 ± 0,2#
ЭСТРУС	92,0 ± 6,2#	208,3 ± 4,6#	2,6 ± 0,2#	0,5 ± 0,2#

Примечание: * - р<0,05 (тест Тьюки), достоверное отличие от самок в фазе диэструса; # - р<0,05 (тест Тьюки), достоверное отличие от контрольных самок в соответствующих фазах полового цикла.

высоком уровне - степень тревожности у самок крыс увеличивалась. Однако блокада 5-ГТ2А/2С-подтипа серотониновых рецепторов однонаправлено вызывала анксиолитический эффект в условиях как низкого, так и высокого содержания эндогенных эстрогенов.

В тесте Порсолта стимуляция 5-ГТ1А- или 5-ГТ2В/2С-подтипов серотониновых рецепторов в условиях низкого или высокого уровня эндогенных эстрогенов оказывала антидепрессивный эффект у самок (рис. 3).

Таким образом, можно говорить о наличии избирательного влияния серотонинотропных веществ на условнорефлекторную деятельность и депрессивноподобное поведение в течение полового цикла. Действие серотонинотропных веществ на тревожное поведение во многом определяется фазой полового цикла.

Согласно данным литературы, 8-OH-DPAT в низких дозах (0,1 - 0,3 мг/кг, подкожно) улучшает кратковременную рабочую память у самцов крыс, тогда как введение 8-OH-DPAT в высокой дозе (1,0 мг/кг, подкожно), напротив, нарушает кратковременную рабочую память и удлиняет латентный период появления рефлекса (Cole et al., 1994; Menenses, Hong, 1995). Это связано с тем, что в низких дозах 8-OH-DPAT действует на пресинаптические рецепторы, а в высоких дозах - на постсинаптические 5-ГТ1А-рецепторы (Bethea et al., 2002). Выявлено, что NAN-190 (1,0 мг/кг, внутрибрюшинно) улучшал различные виды памяти у самцов крыс (Ohno, Watanabe, 1996; Souza et al., 2001). Работы Diaz-Veliz и соавторов (1997) показали, что однократное введение кетансерина (3,0 мг/кг, подкожно) за 30 минут до тестирования проявляло анксиолитический эффект в фазу диэструса, но анксиогенный эффект - в фазы эструса и проэструса, при этом кетансерин в данной дозе не оказывал какого-либо влияния на тревожное поведение у самцов крыс. У самок, получавших кетансерин, не было выявлено воспроизведения УРПИ в фазы диэструса и метэструса, но в фазу эструса при введении этого препарата отмечалось воспроизведение УРПИ. На УРАИ кетансерин оказывал позитивное влияние в фазу эструса, однако нарушал способность у животных к этой форме обучения в фазу диэструса (Diaz-Veliz et al., 1997).

Влияние серотонинотропных веществ на уровень тропных и периферических половых гормонов в крови, обмен биогенных аминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-эстрадиола в головном мозге у интактных самок крыс

При изучении нейрохимических механизмов действия серотонинотропных препаратов на мнестические функции мозга было выявлено, что данные гормонального и нейромедиаторного статуса, а также результаты экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2 у самок в фазу эструса или проэструса, получавших исследуемые вещества, не коррелируют отчетливо с результатами, обнаруженными в поведенческих тестах. Можно говорить только о существовании модуляции протекания биохимических процессов в зависимости от фазы полового цикла под действием серотонинотропных веществ, что в конечном итоге выражается и в модуляции условнорефлекторной деятельности. Вместе с тем, нельзя недооценивать те биохимические и поведенческие эффекты, которые оказывают серотонинотропные вещества при их применении в течение полового цикла в эксперименте, поскольку эти нейротропные вещества глубоко изменяют функциональное состояние всей гипоталамо-гипофизарно-овариальной системы.

Влияние серотонинотропных веществ на высшую нервную деятельность у овариоэктомированных самок и овариоэктомированных самок, получавших 17β-эстрадиол

Изолированное или комбинированное с низкой дозой 17β-E2 хроническое введение агониста 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов - 8-OH-DPAT или антагониста 5-ГТ2А/2C-подтипа серотониновых рецепторов - кетансерина ОЭ самкам оказывало позитивное влияние на процессы обучения и памяти как на модели непространственного обучения - модель УРПИ, так и на модели пространственного обучения - водный тест Морриса (рис. 4, 5, 6 и 7). При этом, введение 8-OH-DPAT или кетансерина ОЭ самкам, получавшим 17β-E2 и без него, сопровождалось снижением уровня тревожности в тесте приподнятый крестообразный лабиринт ([F(7,36) = 3,40, p<0,05] и [F(5,72) = 21,95, p<0,01], соответственно) и степени депрессивности в тесте Порсолта ([F(7,36) = 2,88, p<0,01] и [F(5,72) = 5,97, p<0,01], соответственно).

В то же время, изолированное или сочетанное с 17β-E2 хроническое введение антагониста 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов - NAN-190 вызывало антиамнестический эффект у ОЭ самок на разных моделях обучения и не оказывало какого-либо влияния на эмоциональные формы поведения. Необходимо также отметить, что позитивные поведенческие эффекты самого 17β-E2 у ОЭ самок на фоне введения NAN-190 полностью блокировались. Вместе с тем, введение агониста 5-ГТ2B/2C-подтипа серотониновых рецепторов ОЭ самкам - m-CPP только частично проявляло позитивное действие на условнорефлекторную деятельность. Такие эффекты препарата могут быть обусловлены его способностью действовать не только на 5-ГТ2B- или 5-ГТ2C-подтипы серотониновых рецепторов, но и на 5-ГТ1B- и 5-ГТ1Д-подтипы серотониновых рецепторов, хотя и в меньшей степени (Bethea et al., 2002).

Влияние серотонинотропных веществ на уровень половых гормонов в крови, обмен биогенных аминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-эстрадиола в головном мозге у овариоэктомированных самок и овариоэктомированных самок, получавших 17β-эстрадиол

Анализ гормонального фона у ОЭ самок, получавших 8-OH-DPAT или кетансерин изолированно или в сочетании с 17β-E2, показал, что данные препараты понижали уровни тропных гормонов - ФСГ и ЛГ - и повышали содержание Э в крови, тем самым корректируя нарушенный гормональный статус у ОЭ самок (рис. 8). Оценка обмена нейромедиаторов в структурах головного мозга, имеющих непосредственное отношение к мнестическим функциям, выявила, что 8-OH-DPAT и кетансерин восстанавливают нарушенный обмен НА ([F(7,36) = 14,56, p<0,05] и [F(5,72) = 15,22, p<0,05] соответственно) и ДА ([F(7,36) = 7,40, p<0,01] и [F(5,72) = 20,05, p<0,01] соответственно) в гипоталамусе и миндалине, а также обмен СА ([F(7,36) = 15,22, p<0,05] и [F(5,72) = 3,22, p<0,01] соответственно) в гиппокампе у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-E2. Кроме того, изолированное или комбинированное с 17β-E2 введение 8-OH-DPAT или кетансерина ОЭ самкам приводит к нормализации экспрессии генов 5-ГТ1А-рецептора ([F(7,36) = 15,44, p<0,05] и [F(5,72) = 22,11, p<0,01] соответственно), 5-ГТ2С-рецептора ([F(7,36) = 9,40, p<0,05] и [F(5,72) = 15,40, p<0,01] соответственно) и 17β-E2-рецептора ([F(7,36) = 2,88, p<0,01] и [F(1,72) = 6,92, p<0,01] соответственно) в гипоталамусе, гиппокампе и миндалине.

Как свидетельствуют эти данные, при введении ОЭ самкам агониста 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов или антагониста 5-ГТ2А/2C-подтипа серотониновых рецепторов изолированно или совместно с 17β-E2 происходит нормализация как условнорефлекторной деятельности, так и эмоциональной сферы поведения. Можно предполагать, что такие поведенческие эффекты данных препаратов у ОЭ самок могут быть обусловлены позитивным и комплексным влиянием этих веществ на гормональный и нейромедиаторный статус, а также на паттерн экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2. Следует также отметить, что в условиях комбинированного с 17β-E2 введения 8-OH-DPAT и кетансерина отмечается потенцирование всех поведенческих и биохимических эффектов нейротропных веществ и гормонального агента. В то же время, негативное действие NAN-190 при его введении с 17β-E2 на высшие функции мозга у ОЭ самок распространяется как на гормональный, так и на нейромедиаторный статус, а также на экспрессию генов рецепторов в структурах головного мозга. Это говорит о том, что негативное действие NAN-190 на поведенческие процессы при дефиците эстрогенов сопровождается еще большим увеличением уровня ЛГ и понижением концентрации Э в крови, отсутствием изменений в обмене моноаминов во всех структурах головного мозга и патологически усиленной экспрессией генов 5-ГТ1А-рецептора и 17β-E2 в структурах головного мозга, имеющих непосредственное отношение к мнестическим процессам. Введение m-CPP ОЭ самкам только частично проявляет позитивное действие на мнестические расстройства, при этом параллельно также частично восстанавливая нарушенный гормональный фон, повышая уровень НА, ДА и СА в гипоталамусе и экспрессию генов 5-ГТ2С-рецептора и 17β-E2-рецептора в гипоталамусе и экстрагипоталамических образованиях головного мозга.

Как свидетельствуют результаты настоящего исследования, эффекты агониста и антагониста 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов на высшую нервную деятельность у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-E2, противоположны, что свидетельствует об избирательном действии этих веществ именно на 5-ГТ1А-подтип серотониновых рецепторов. Полагают, что 5-ГТ1А-подтип серотониновых рецепторов опосредует многие эффекты эстрогенов на ЦНС (Wissnik et al., 2001). С другой стороны, известно, что ЭР может быть активирован многими стероидными и нестероидными лигандами, а не только его собственным лигандом - эстрадиолом (Tzukerman et al., 1994; Wissnik et al., 2001). Можно предположить, что разнонаправленные эффекты 8-OH-DPAT и NAN-190 связаны с их воздействием на ЭР. По-видимому, агонист 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов выступает в качестве синергичного с 17β-E2 активатора эстрогеновых рецепторов (ЭР), тогда как антагонист данного подтипа серотонинового рецептора препятствует связыванию 17β-E2 с ЭР и последующие эффекты обусловлены только аллостерической активацией ЭР посредством NAN-190. Данное предположение подтверждается результатами наших исследований на ОЭ самках, получавших 17β-E2: так 8-OH-DPAT потенцировал эффекты 17β-эстрадиола на поведенческий, гормональный и нейромедиаторный статус, а также на экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2, тогда как NAN-190, напротив, полностью блокировал эффекты 17β-E2 на эти же показатели. При анализе поведенческих эффектов кетансерина и m-CPP также прослеживается разнонаправленность в их действии, хотя присутствует и некоторая схожесть их эффектов на поведенческие процессы. Оба вещества воздействуют на 5-ГТ2С-подтип серотониновых рецепторов, хотя один препарат активирует, а другой блокирует этот подтип рецепторов, но при этом эффекты на процессы обучения и памяти в некоторой степени однотипны. Выявленное обстоятельство отнюдь не артефакт. Во-первых, в литературе имеются сведения о том, что агонисты и антагонисты одного подтипа нейромедиаторных рецепторов могут приводить к одинаковым поведенческим эффектам именно у самок крыс с дисбалансом эстрогенов, при этом молекулярные механизмы таких эффектов до сих пор не выяснены (Diaz-Veliz, 1997). Во-вторых, m-CPP и кетансерин проявляют разнонаправленные эффекты на эмоциональные формы поведения ОЭ самок, позитивный эффект m-CPP на обучение, в отличие от такого же эффекта кетансерина, лишь частичен. Поэтому можно говорить о том, что частичный позитивный эффект m-CPP вызван его действием на 5-ГТ2С-подтип серотониновых рецепторов, но полностью не реализуется вследствие его агонистического действия на 5-ГТ2В-подтип серотониновых рецепторов и другие подтипы серотониновых рецепторов. Это позволяет предполагать, что 5-ГТ2А-подтип серотониновых рецепторов играет более значимую роль в высшей нервной деятельности при дефиците эстрогенов у самок, чем 5-ГТ2В-подтип серотониновых рецепторов.

Влияние дофаминотропных веществ на высшую нервную деятельность у интактных самок крыс

Как показали результаты экспериментов, введение агониста Д1-типа дофаминовых рецепторов - SKF-38393 или агониста Д2-типа дофаминовых рецепторов - квинпирола циклирующим самкам нормализует условнорефлекторную деятельность в фазах проэструса и эструса на моделях непространственного и пространственного обучения (за исключением действия SKF-38393 в водном лабиринте Морриса) (рис. 9 и 10).

Вместе с тем, хроническое введение антагониста Д1-типа дофаминовых рецепторов - SCH-23390 или антагониста Д2-типа дофаминовых рецепторов - сульпирида приводило к ухудшению мнестических процессов у самок в фазах проэструса и эструса на разных моделях обучения (рис. 9 и 10). При этом, введение квинпирола сопровождалось снижением уровня тревожности в тесте приподнятый крестообразный лабиринт в фазах проэструса и эструса, тогда как введение SKF-38393 у этих же групп животных приводило к усилению проявления тревожного

поведения (табл. 2). Кроме того, эти вещества негативно влияли на тревожность в тесте приподнятый крестообразный лабиринт, проявляя анксиогенный эффект у

Таблица 2

Влияние дофаминотропных веществ на тревожное поведение интактных самок крыс

Фаза цикла	Время в лоткрытых рукавах, сек	Время в закрытых рукавах, сек	Количество заходов в лоткрытые рукава, раз	Количество заходов в закрытые рукава, раз
ИНТАКТНЫЕ САМКИ
ДИЭСТРУС	86,4 ± 6,2	213,6 ± 2,4	1,8 ± 0,2	2,1 ± 0,4
ПРОЭСТРУС	36,4 ± 3,4*	263,6 ± 8,6*	0,4 ±0,1*	4,5 ± 0,2*
ЭСТРУС	42,6 ± 4,2*	257,4 ± 2,2*	0,3 ± 0,1*	4,0 ± 0,6*
ИНТАКТНЫЕ САМКИ + SKF-38393
ДИЭСТРУС	36,0 ± 2,4#	264,0 ± 3,2#	0,6 ± 0,2#	2,2 ± 0,2
ПРОЭСТРУС	12,4 ± 2,2#	287,6 ± 2,4#	0,1 ± 0,05#	4,0 ± 0,2
ЭСТРУС	20,8 ± 3,2#	279,2 ± 2,8#	0,06 ± 0,02#	4,1 ± 0,2
ИНТАКТНЫЕ САМКИ + SCH-23390
ДИЭСТРУС	30,0 ± 2,6#	270,0 ± 4,6#	0,5 ± 0,2#	2,4 ± 0,2
ПРОЭСТРУС	14,0 ± 1,2#	286,0 ± 2,2#	0,09 ± 0,02#	3,9 ± 0,6
ЭСТРУС	23,0 ± 2,2#	277,0 ± 3,8#	0,05 ± 0,02#	4,3 ± 0,6
ИНТАКТНЫЕ САМКИ + КВИНПИРОЛ
ДИЭСТРУС	156,4 ± 3,2#	143,6 ± 4,2#	4,9 ± 0,4#	0,7 ± 0,2#
ПРОЭСТРУС	81,6 ±2,4#	218,4 ± 5,2#	2,7 ± 0,2#	0,8 ± 0,2#
ЭСТРУС	92,0 ±3,4#	208,0 ± 7,2#	3,8 ± 0,2#	1,2 ± 0,4#
ИНТАКТНЫЕ САМКИ + СУЛЬПИРИД
ДИЭСТРУС	53,4 ± 3,2#	246,6 ± 2,2#	0,8 ± 0,2#	2,0 ± 0,2
ПРОЭСТРУС	11,8 ± 1,2#	288,2 ± 5,6#	0,1 ± 0,02#	4,0 ± 0,2
ЭСТРУС	22,0 ± 1,2#	278,0 ± 3,6#	0,06 ± 0,02#	4,0 ± 0,2

самок во все фазы полового цикла (табл. 2). Однако блокада Д1-типа дофаминовых рецепторов независимо от уровня эндогенных эстрогенов в организме оказывала антидепрессивный эффект у интактных самок [F(5,72) = 20,05, p<0,01].

Исследованиями Диаз-Велиз и соавторов (1999) продемонстрировано, что при введении как агонистов/антагонистов Д1-типа рецепторов, так и агонистов/антагонистов Д2-типа рецепторов в различных тестах обнаруживается однонаправленный эффект указанных выше дофаминотропных веществ на поведенческие реакции животных обоего пола.

Таким образом, влияние агонистов и антагонистов Д1-/Д2-типов дофаминовых рецепторов на поведенческие процессы у интактных самок противоположны, что свидетельствует об избирательном действии этих веществ на дофаминовые рецепторы. При этом, агонисты как Д1-типа, так и Д2-типа дофаминовых рецепторов однотипно проявляют позитивные эффекты на условнорефлекторную память, тогда как антагонисты Д1-/Д2-типов дофаминовых рецепторов сходным образом оказывают негативные эффекты на мнестические процессы у интактных самок в фазы проэструса и эструса.

Влияние дофаминотропных веществ на уровень тропных и периферических половых гормонов в крови, обмен биогенных аминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-эстрадиола в головном мозге у интактных самок крыс

Наши исследования по определению биохимических механизмов поведенческих эффектов дофаминотропных веществ, указывают на то, что поведенческие эффекты этих веществ также не коррелируют с данными гормонального и нейромедиаторного анализа. Кроме того, действие квинпирола и сульпирида на мнестические процессы также не коррелирует с результатами определения экспрессии генов рецепторов в структурах головного мозга, имеющих непосредственное отношению к когнитивным процессам. Однако, для SKF-38393 и SCH-23390 обнаружена четкая корреляция между их поведенческими эффектами и экспрессией генов соответствующих рецепторов в структурах мозга. Так, позитивные эффекты SKF-38393 сопровождались увеличением экспрессии генов Д1-рецептора и 17β-Е2-рецептора в гиппокампе и миндалине, тогда как негативные эффекты SCH-23390 ассоциировались с выраженным снижением экспрессии генов этих рецепторов в структурах головного мозга (рис. 11). Можно полагать, что приведенные выше поведенческие эффекты SKF-38393 и SCH-23390 у циклирующих самок реализуются за счет их действия на экспрессию генов Д1-рецептора и 17β-Е2-рецептора, тогда как поведенческие эффекты квинпирола и сульпирида не связаны с действием этих веществ на гормональный и нейромедиаторный статус, а также на экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2, а могут реализовываться посредством других биохимических механизмов.

Влияние дофаминотропных веществ на высшую нервную деятельность у овариоэктомированных самок и овариоэктомированных самок, получавших 17β-эстрадиол

Хроническое введение SKF-38393, квинпирола и сульпирида изолированно или в комбинации с 17β-E2 ОЭ самкам восстанавливало условнорефлекторную деятельность как на модели УРПИ, так и в водном тесте Морриса (за исключением действия SKF-38393 у ОЭ самок) (рис.12, 13, 14 и 15).

Наряду с этим, введение SKF-38393 и квинпирола ОЭ самкам на фоне введения 17β-E2 или без него сопровождалось снижением уровня тревожности в тесте приподнятый крестообразный лабиринт ([F(7,36) = 2,88, p<0,05] и F(5,72) = 20,40, p<0,01] соответственно), тогда как введение сульпирида тем же группам

животных оказывало антидепрессивный эффект в тесте Порсолта (рис. 16 и 17). С другой стороны, изолированное или сочетанное с 17β-E2 хроническое введение SCH-23390 проявляло антиамнестический и анксиогенный эффекты у ОЭ животных. Необходимо также отметить, что эффекты 17β-E2 на поведенческий статус у ОЭ самок полностью блокировались при сочетанном введении с SCH-23390.

Согласно данным литературы, однократное введение SCH-23390 ОЭ самкам изолированно или в сочетании с 17β-E2 еще более ухудшает условнорефлекторную память (Daniel et al., 2006), что полностью совпадает с результатами настоящего исследования, в котором SCH-23390 вводился хронически. Вместе с тем, однократное введение SKF-38393 в дозе 2,5 мг/кг внутрибрюшинно, PPHT - агонист Д2-рецепторов (в нашем исследовании это квинпирол) в дозе 31,3 мкг/кг подкожно или сульпирида в дозе 10,0 мг/кг нарушало процессы активного и пассивного обучения у ОЭ самок, что противоречит результатам нашего исследования. Эти противоречия можно объяснить за счет разного времени введения фармакологических веществ, видом гормонального агента, используемых доз и линий животных. Однако данные работы Diaz-Veliz и соавторов (1999) о позитивных эффектах однократного введения сульпирида и PPHT в сочетании с эстрадиолом бензоатом на поведенческий статус у ОЭ самок полностью соответствуют результатам нашего исследования, в котором сульпирид и квинпирол вводились хронически в сочетании с 17β-E2.

Таким образом, эффекты агониста и антагониста Д1-подтипа дофаминовых рецепторов на высшую нервную деятельность у ОЭ крыс и ОЭ самок, получавших 17β-Е2, противоположны, что свидетельствует об избирательном действии этих веществ на Д1-тип дофаминовых рецепторов.

Установлено, что многие агонисты Д1-подтипа дофаминовых рецепторов могут выступать в качестве нестероидных лигандов, которые непосредственно связываются с ЭР (Dagger et al., 2002). В связи с этим, можно предполагать, что противоположные эффекты SKF-38393 и SCH-23390 связаны с их разнонаправленным воздействием на ЭР. Так, у ОЭ самок агонист Д1-типа дофаминовых рецепторов, по-видимому, активирует ЭР, в результате чего реализуется частичный антиамнестический эффект. Однако полной нормализации мнестических функций в этих условиях не происходит, возможно, из-за низкой дозы данного препарата.

Влияние дофаминотропных веществ на уровень половых гормонов в крови, обмен биогенных аминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-эстрадиола в головном мозге у овариоэктомированных самок и овариоэктомированных самок, получавших 17β-эстрадиол

Сопоставление данных гормонального статуса у ОЭ самок, получавших SKF-38393, квинпирол или сульпирид изолированно или в сочетании с 17β-Е2, позволяет говорить о том, что эти препараты понижали уровни ФСГ и ЛГ гормонов до значений интактных самок в фазе диэструса, однако при этом повышались в несколько раз концентрации П и Э в крови, что свидетельствует о несбалансированной коррекции нарушенного гормонального статуса у ОЭ самок (рис. 18). Кроме того, в условиях сочетанного введения данных препаратов с 17β-Е2 отмечалось потенцирование эффектов нейротропных препаратов и гормонального агента на содержание П и Э в крови у ОЭ самок. Повышение уровней периферических половых гормонов само по себе является положительным фактором по сравнению с минимальными значениями этих гормонов в крови ОЭ самок. Однако этот прирост концентраций гормонов происходит в несколько раз, и отсроченные во времени эффекты таких высоких уровней гормонов в настоящее время предсказать не представляется возможным. В связи с этим, следует принимать во внимание то обстоятельство, что хотя SKF-38393, квинпирол и сульпирид позитивно влияют на мнестические процессы, эти препараты выраженно повышают уровни периферических половых гормонов в крови.

Нейрохимический анализ обмена моноаминов в гипоталамусе и экстрагипоталамических структурах головного мозга выявил, что SKF-38393, квинпирол и сульпирид нормализуют нарушенный кругооборот НА ([F(5,72) = 14,52, p<0,01] и ([F(7,36) = 14,56, p<0,05] соответственно) и ДА ([F(5,72) = 2,88, p<0,05] и [F(7,36) = 2,88, p<0,05] соответственно) в гипоталамусе у ОЭ самок и ОЭ самок, получавших 17β-Е2.

Наряду с этим, изолированное или комбинированное с 17β-Е2 введение квинпирола или сульпирида ОЭ самкам приводило к нормализации экспрессии генов Д2-рецептора и 17β-Е2-рецептора в головном мозге (рис. 19). Следует также отметить, что при совместном введении данных препаратов с 17β-Е2 у ОЭ самок происходит потенцирование действия нейротропных веществ и гормонального препарата на экспрессию генов рецепторов в головном мозге. Вместе с тем, у ОЭ самок SKF-38393 только при его сочетанном введении с 17β-Е2 восстанавливал экспрессию генов Д1-рецептора и 17β-Е2-рецептора в гипоталамусе, гиппокампе и миндалине ([F(7,36) = 11,22, p<0,01] и [F(7,36) = 9,40, p<0,01] соответственно).

Как было продемонстрировано выше, при введении ОЭ самкам агонистов Д1- или Д2-типов дофаминовых рецепторов или антагониста Д2-типа дофаминовых рецепторов изолированно или совместно с 17β-Е2 происходит нормализация как

мнестических процессов, так и депрессивно-тревожного поведения. Можно предполагать, что такие поведенческие эффекты данных препаратов у ОЭ самок реализуются за счет восстанавливающего действия этих веществ на гормональный и нейромедиаторный статус, а также на паттерн экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2. С другой стороны, негативное действие SCH-23390 на условнорефлекторную память и эмоциональные формы поведения при дефиците эстрогенов коррелирует с еще большим нарушением экспрессии генов рецепторов в структурах головного мозга, имеющих непосредственное отношение к мнестическим процессам.

Вместе с тем, при введении ОЭ самкам SKF-38393 совместно с 17β-Е2 отмечается полное восстановление условнорефлекторной деятельности одновременно с нормализацией нейромедиаторного статуса и экспрессии генов рецепторов в мозге. По-видимому, эти эффекты у ОЭ самок обусловлены совместной активацией ЭР как SKF-38393, так и 17β-Е2, в результате чего происходит потенцирование действия обоих препаратов и таким образом восстанавливаются нарушенные процессы, вызванные дефицитом эстрогенов. В то же время, SCH-23390, вероятно, блокирует связывание 17β-Е2 с ЭР и последующие эффекты обусловлены только аллостерической активацией ЭР посредством SCH-23390. Данное предположение подтверждается результатами наших исследований на ОЭ самках, получавших 17β-Е2: SCH-23390 полностью блокировал эффекты 17β-Е2 на поведенческий статус и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2.

При анализе эффектов квинпирола и сульпирида прежде всего обращает на себя внимание их однотипность в действии на мнестические процессы, несмотря на то, что один препарат является агонистом Д2-типа дофаминовых рецепторов, а другой - антагонистом этого типа рецептора. Данное противоречие объяснить с точки зрения биохимических процессов в настоящее время не представляется возможным. Тем не менее, существуют сведения о том, что агонисты и антагонисты одного подтипа нейромедиаторных рецепторов могут приводить к одинаковым поведенческим эффектам именно у самок крыс с дисбалансом эстрогенов; при этом, молекулярные механизмы таких эффектов до сих пор не выяснены (Diaz-Veliz et al., 1997, 1999).

Влияние холинотропных веществ на высшую нервную деятельность у интактных самок крыс

В результате проведенных исследований было обнаружено, что независимо от уровня эндогенных эстрогенов в организме самок введение ингибитора ацетилхолинэстеразы - галантамина и комбинаций веществ, стимулирующих М- или Н-холинорецепторы, оказывает позитивное влияние на расстройства процессов обучения и памяти, происходящие в течение полового цикла у самок крыс (рис. 20 и 21). Вместе с тем, введение блокаторов М- или Н-холинорецепторов для коррекции нарушений условнорефлекторной памяти при низком или высоком уровне эндогенных эстрогенов в организме циклирующих крыс являлось неэффективным.

Влияние холинотропных веществ на уровень тропных и периферических половых гормонов в крови, обмен биогенных аминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-эстрадиола в головном мозге у интактных самок крыс

При изучении нейрохимических механизмов действия холинотропных препаратов на высшие функции мозга было установлено, что параллельно с улучшением процессов обучения и памяти в течение полового цикла у самок, получавших указанные выше препараты, происходило лишь однотипное повышение уровня Э в крови (рис. 22). В то же время, корреляцию между концентрацией других гормонов и характером мнестических процессов выявить не удалось. Данные нейромедиаторного статуса позволяют говорить о том, что галантамин, метамизил или ганглерон, введенные совместно с галантамином, однонаправленно понижали обмен НА в гипоталамусе и гиппокампе (табл. 3).

Однако, анализ экспрессии генов М- и Н-холинорецепторов в гипоталамусе и экстрагипоталамических структурах головного мозга самок крыс в фазы проэструса и эструса свидетельствует о существовании корреляции между восстановлением нарушенных мнестических функций у циклирующих самок крыс и увеличением степени экспрессии генов М- и Н-холинорецепторов в структурах головного мозга (рис. 23).

Таблица 3

Влияние холинотропных препаратов на обмен норадреналина в головном мозге в течение полового цикла у интактных самок

Фаза цикла	Структуры головного мозга
	Гипоталамус	Гиппокамп		Миндалина
	ИНТАКТНЫЕ САМКИ
	НА, пг/мг
Диэструс	2203,0 ± 20,2	700,5 ± 12,4		901,7 ± 10,2
Проэструс	1100,0 ± 10,8*	360,8 ± 12,2*		203,2 ± 10,2*
Эструс	1311,0 ± 10,8*	310,2 ± 11,2*		200,1 ± 12,2*
3,4-МГФГ, пг/мг
Диэструс	102,3 ± 1,2	50,2 ± 1,2		50,9 ± 4,6
Проэструс	40,5 ± 1,2*	100,0 ± 8,6*		4,1 ± 0,8*
Эструс	51,2 ± 1,2*	211,7 ± 10,2*		2,0 ± 0,2*
3,4-МГФГ/НА
Диэструс	0,05 ± 0,01	0,07 ± 0,01		0,06 ± 0,01
Проэструс	0,04 ± 0,02	0,3 ± 0,1*		0,02 ± 0,001*
Эструс	0,04 ± 0,01	0,7 ± 0,1*		0,01 ± 0,001*
Диэструс	ИНТАКТНЫЕ САМКИ + ГАЛАНТАМИН
	НА, пг/мг
	2223,0 ± 10,6	708,5 ± 8,2	910,0 ± 10,2
Проэструс	1110,5 ± 10,2*	330,0 ± 10,2*	199,6 ± 10,2*
Эструс	1341,0 ± 10,2*	320,0 ± 8,6*	208,5 ± 12,2*
3,4-МГФГ, пг/мг
Диэструс	100,0 ± 8,2	706,0 ± 10,2		52,3 ± 6,2
Проэструс	23,5 ± 2,2#	5,2 ± 0,2#		4,3 ± 0,8*
Эструс	19,0 ± 1,2#	2,3 ± 0,2#		2,4 ± 0,2*
3,4-МГФГ/НА
Диэструс	0,04 ± 0,01	0,02 ± 0,002#	0,06 ± 0,01
Проэструс	0,02 ± 0,002#	0,04 ± 0,02#	0,02 ± 0,001*
Эструс	0,01 ± 0,002#	0,01 ± 0,001#	0,01 ± 0,001*
Диэструс	ИНТАКТНЫЕ САМКИ + МЕТАМИЗИЛ
	НА, пг/мг
	2220,0 ± 10,6	690,0 ± 10,2	890,0 ± 10,2
Проэструс	416,3 ± 10,2#	122,0 ± 10,2#	202,0 ± 10,2*

Продолжение таблицы 3

Эструс	305,9 ± 10,2#	162,0 ± 8,6#	223,5 ± 10,2*
3,4-МГФГ, пг/мг
Диэструс	103,5 ± 10,2	56,5 ± 5,2	50,3 ± 4,2
Проэструс	3,5 ± 0,2#	4,9 ± 0,2#	4,8 ± 0,2*
Эструс	2,4 ± 0,2#	2,0 ± 0,2#	2,2 ± 0,2*
3,4-МГФГ/НА
Диэструс	0,05 ± 0,02	0,07 ± 0,02	0,06 ± 0,02
Проэструс	0,008 ± 0,002#	0,04 ± 0,02#	0,008 ± 0,002*
Эструс	0,007 ± 0,002#	0,01 ± 0,001#	0,009 ± 0,002*
Диэструс	ИНТАКТНЫЕ САМКИ + ГАНГЛЕРОН
	НА, пг/мг
	2223,0 ± 10,6	708,5 ± 10,2	911,0 ± 10,2
Проэструс	1115,3 ± 10,2*	372,0 ± 10,2*	192,6 ± 10,2*
Эструс	1302,2 ± 10,2*	316,5 ± 8,6*	206,5 ± 12,2*
3,4-МГФГ, пг/мг
Диэструс	100,0 ± 8,2	56,7 ± 5,2	52,3 ± 6,2
Проэструс	43,6 ± 0,2*	544,8 ± 10,2#	324,3 ± 10,8#
Эструс	52,4 ± 0,2*	480,9 ± 10,2#	367,3 ± 10,2#
3,4-МГФГ/НА
Диэструс	0,04 ± 0,01	0,07 ± 0,02	0,06 ± 0,01
Проэструс	0,04 ± 0,002	1,5 ± 0,2#	1,7 ± 0,2#
Эструс	0,04 ± 0,002	1,5 ± 0,2#	1,8 ± 0,2#
Диэструс	ИНТАКТНЫЕ САМКИ + МЕТАМИЗИЛ + ГАЛАНТАМИН
	НА, пг/мг
	2209,3 ± 10,6	704,0 ± 10,2	910,0 ± 10,2
Проэструс	1121,6 ± 10,2*	346,4 ± 10,2*	198,6 ± 10,2*
Эструс	1317,5 ± 10,2*	307,5 ± 8,6*	200,5 ± 12,2*
3,4-МГФГ, пг/мг
Диэструс	2,3 ± 0,2#	2,0 ± 0,2#	53,2 ± 6,2
Проэструс	3,5 ± 0,2#	4,2 ± 0,2#	4,0 ± 0,8*
Эструс	2,2 ± 0,2#	1,8 ± 0,2#	2,4 ± 0,2*
3,4-МГФГ/НА
Диэструс	0,001 ± 0,0001#	0,003 ± 0,001#	0,06 ± 0,01
Проэструс	0,003 ± 0,001#	0,01 ± 0,002#	0,02 ± 0,001*
Эструс	0,002 ± 0,0001#	0,006 ± 0,001#	0,01 ± 0,001*
Диэструс	ИНТАКТНЫЕ САМКИ + ГАНГЛЕРОН + ГАЛАНТАМИН
	НА, пг/мг
	670,3 ± 10,6#	375,4 ± 12,2#	911,0 ± 10,2
Проэструс	423,6 ± 10,2#	118,4 ± 10,2#	199,0 ± 10,2*
Эструс	610,5 ± 10,2#	158,5 ± 8,6#	201,5 ± 12,2*
3,4-МГФГ, пг/мг
Диэструс	2,9 ± 0,2#	2,4 ± 0,2#	54,0 ± 6,2
Проэструс	3,7 ± 0,2#	4,6 ± 0,2#	4,1 ± 0,8*
Эструс	2,0 ± 0,2#	1,9 ± 0,2#	2,5 ± 0,2*
3,4-МГФГ/НА
Диэструс	0,004 ± 0,002#	0,006 ± 0,002#	0,06 ± 0,01
Проэструс	0,008 ± 0,002#	0,04 ± 0,02#	0,02 ± 0,001*
Эструс	0,003 ± 0,001#	0,01 ± 0,001#	0,01 ± 0,001*

Вместе с тем, следует отметить, что действие данных препаратов неизбирательно, поскольку обе комбинации веществ, стимулирующих разные типы холинотропных рецепторов, одинаково позитивно влияют на условнорефлекторную деятельность у самок крыс. Кроме того, это действие веществ не детерминировано уровнем эндогенных эстрогенов в организме самок крыс. В то же время, неэффективность действия метамизила и ганглерона в фазах проэструса и эструса у самок на процессы обучения и памяти не коррелирует с уровнем половых гормонов в крови и обменом моноаминов в структурах головного мозга. Тем не менее, отсутствие изменений в характере экспрессии генов М- и Н-холинорецепторов на фоне применения М- или Н-холиноблокаторов коррелирует с отсутствием позитивного эффекта данных веществ на мнестические процессы у самок крыс независимо от уровня эндогенных эстрогенов в течение полового цикла.

Влияние холинотропных веществ на высшую нервную деятельность у овариоэктомированных самок и овариоэктомированных самок, получавших 17β-эстрадиол

При изолированном или комбинированном с 17β-Е2 введении ингибитора ацетилхолинэстеразы - галантамина, блокатора Н-холинорецепторов - ганглерона или комбинации веществ, стимулирующих М- холинорецепторы, - ганглерона в комбинации с галантамином у ОЭ самок регистрировалось выраженное стимулирующее влияние этих веществ на процессы обучения и памяти на моделях пространственного и непространственного обучения (рис. 24 и 25).

С другой стороны, только комбинированное с 17β-Е2 введение блокатора М-холинорецепторов - метамизила или комбинации веществ, стимулирующих Н-холинорецепторы, - метамизил в комбинации с галантамином оказывало позитивное действие на мнестические процессы у ОЭ самок. При этом, введение указанных выше холинотропных веществ без 17β-Е2 является неэффективным. Согласно данным литературы, однократное введение оксотреморина - потенциального агониста М-холинорецепторов улучшает поведенческий статус у ОЭ самок, получавших эстрадиола бензоат, что также соответствует результатам нашего исследования (Diaz-Veliz et al., 1995). В совместных с клиницистами исследованиях, посвященных изучению эффективности использования низкой дозы 17β-эстрадиола в сочетании с галантамином для фармакокоррекции расстройств высшей нервной деятельности у пациенток, перенесших экстирпацию матки с придатками, было установлено, что использование данной комбинации

нашего исследования (Diaz-Veliz et al., 1995). В совместных с клиницистами исследованиях, посвященных изучению эффективности использования низкой дозы 17β-эстрадиола в сочетании с галантамином для фармакокоррекции расстройств высшей нервной деятельности у пациенток, перенесших экстирпацию матки с придатками, было установлено, что использование данной комбинации веществ корректирует когнитивный статус и уровень половых гормонов в крови у пациенток (Патент № 2268726). Кроме того, этот метод терапии оказался более эффективным по сравнению с применяемой стандартной заместительной гормональной терапией.

Влияние холинотропных веществ на уровень половых гормонов в крови, обмен биогенных аминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-эстрадиола в головном мозге у овариоэктомированных самок и овариоэктомированных самок, получавших 17β-эстрадиол

Анализ гормонального фона у ОЭ самок, получавших галантамин, ганглерон или ганглерон в комбинации с галантамином, выявил, что эти препараты понижали уровни тропных гормонов и повышали содержание Э в крови, тем самым корректируя нарушенный гормональный статус у ОЭ самок (рис. 26). Однако, при комбинированном введении этих веществ с 17β-Е2 уровень Э в крови у ОЭ самок резко возрастает (эффект потенцирования), что следует учитывать при составлении схем терапии для пациентов. Оценка обмена нейромедиаторов и экспрессии генов рецепторов в структурах головного мозга, имеющих непосредственное

отношение к высшим функциям мозга, показала, что галантамин, ганглерон или ганглерон в комбинации с галантамином восстанавливают нарушенный в головном мозге обмен моноаминов ([F(7,36) = 14,56, p<0,05], [F(7,36) = 9,40, p<0,05], [F(7,36) = 15,22, p<0,05]) и экспрессию генов М- и Н-холинорецепторов, а также гена 17β-Е2-рецептора у ОЭ крыс и ОЭ самок, получавших 17β-эстрадиол (рис. 27).

Можно предполагать, что поведенческие эффекты данных препаратов у ОЭ самок могут быть обусловлены позитивным и комплексным влиянием этих веществ на гормональный и нейромедиаторный статус, а также на характер

экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2. Следует также отметить, что в условиях комбинированного с 17β-Е2 введения галантамина, ганглерона и комбинации веществ, стимулирующих М-холинорецепторы, отмечается потенцирование биохимических эффектов нейротропных веществ и гормонального агента. Наряду с этим, позитивные эффекты сочетанного введения метамизила или метамизила в комбинации с галантамином совместно с 17β-Е2 на процессы обучения и памяти у ОЭ крыс коррелируют с улучшением гормонального и нейромедиаторного статуса, и экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17β-Е2 в мозге.

Таким образом, можно говорить о том, что в нарушении высших функций мозга при овариоэктомии более значимую роль играют М-холинорецепторы, чем Н-холинорецепторы. Это предположение основывается на том, что прямая активация М-холинорецепторов при блокаде Н-холинорецепторов или опосредованная (но более выраженная) при действии ингибитора ацетилхолинэстеразы на фоне блокады Н-холинорецепторов обуславливает позитивные поведенческие эффекты у ОЭ самок, не получавших гормонального агента. В то же время, блокада М-холинорецепторов или стимуляция Н-холинорецепторов в отношении их действия на мнестические процессы является эффективной только у ОЭ самок, получавших 17β-Е2. В отношении способности холинотропных лигандов модулировать функциональную активность ЭР четких данных в литературе не встречается, однако исключать такую возможность нельзя (McEwen, Alves, 1999). В таком случае можно предполагать, что блокатор Н-холинорецепторов и стимуляторы М-холинорецепторов могут активировать ЭР подобно катехоламинергическим лигандам (Dagger et al., 2002), в результате чего происходит реализация позитивных эффектов этих веществ у ОЭ самок. Вместе с тем, могут существовать и другие механизмы действия холинотропных препаратов при дефиците эстрогенов, для выяснения которых необходимо проведение дальнейших исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При использовании стандартной заместительной гормонотерапии воздействие осуществляется в большей степени через ЭР и незначительно через рецепторы нейромедиаторов, в результате чего полной и адекватной нормализации высшей нервной деятельности не происходит. В предлагаемом нами новом подходе к терапии мнестических расстройств при дисбалансе эстрогенов сочетанное применение низких доз гормонального и нейротропного агентов обеспечивает сбалансированное и комплексное воздействие как на ЭР, так и на соответствующие рецепторы нейромедиаторов. При этом, низкая доза эстрогенов может играть триггерную роль в подготовке ЭР и рецепторов нейромедиаторов к функциональной активации, после их угнетения вследствие дефицита эстрогенов. Комбинированное применение гормонального и нейротропного агентов в низких дозах приводит к потенцированию позитивных эффектов друг друга, в результате чего происходит полное восстановление адекватной деятельности головного мозга за счет нормализации уровня гормонов, обмена моноаминов и экспрессии генов соответствующих рецепторов в структурах головного мозга, имеющих отношение к высшей нервной деятельности.

В заключение следует отметить, что полученные в настоящей работе результаты создают фундаментальную основу для внедрения в медицинскую практику новых подходов к фармакотерапии расстройств высшей нервной деятельности при дисбалансе эстрогенов в организме: изолированное или комбинированное с низкой дозой 17β-Е2 введение нейротропных веществ также в низких дозах в зависимости от характера нарушений когнитивных процессов при разном уровне эндогенных эстрогенов в организме.

ВЫВОДЫ:

Поведенческий статус самок крыс детерминируется степенью активности гипоталамо-гипофизарно-овариальной системы. При этом, направленность и выраженность поведенческих расстройств зависит от причины (естественная или искусственная), обусловливающей функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-овариальной системы.
Эффективность действия нейротропных веществ в низких дозах, введенных изолированно или в комбинации с 17β-эстрадиолом в низкой дозе, зависит от вида когнитивной патологии и функционального состояния гипофизарно-овариальной системы. Хроническое введение 17β-эстрадиола в низкой дозе может играть триггерную роль в подготовке эстрогеновых рецепторов и рецепторов нейромедиаторов к функциональной активации, после их угнетения вследствие дефицита эстрогенов.
Фармакологические воздействия на холинергическую, дофаминергическую или серотонинергическую системы могут потенцировать или ингибировать биологические эффекты экзогенно введенного 17β-эстрадиола в зависимости от стимуляции или блокирования типа нейромедиаторных рецепторов.
В механизмах когнитивных расстройств, возникающих в ключевые фазы полового цикла, М- и Н-холинорецепторы принимают участие в равной степени. С целью устранения этих расстройств возможно использовать галантамин, метамизил или ганглерон в комбинации с галантамином.
5-ГТ1А-подтип и 5-ГТ2В-подтип серотониновых рецепторов вовлекаются в механизмы аффективных расстройств в течение полового цикла у самок крыс. При этом, стимуляция данных подтипов рецепторов приводит к снижению выраженности депрессивноподобного поведения у самок в ключевые фазы полового цикла.
5-ГТ2А/2C-подтипы серотониновых рецепторов играют выраженную роль в тревожных расстройствах в течение полового цикла и при дефиците эстрогенов у самок крыс. При этом, блокада данных подтипов рецепторов приводит к уменьшению проявления тревожности у самок в ключевые фазы полового цикла и на фоне овариоэктомии.
В механизмах мнестических расстройств, сопровождающихся тревожным поведением у циклирующих самок, принимает участие Д2-тип дофаминовых рецепторов. При этом, стимуляция данного типа рецептора востанавливает оптимальный поведенческий статус у самок в течение полового цикла.
5-ГТ1А-подтип серотониновых рецепторов и Д1-тип дофаминовых рецепторов играют существенную роль в расстройствах высшей нервной деятельности, обусловленных дефицитом эстрогенов: стимуляция этих типов рецепторов приводит к нормализации мнестических процессов и корректирует эмоциональные формы поведения, тогда как блокада этих типов рецепторов, напротив, полностью нарушает мнестические функции у овариоэктомированных самок.
Д2-тип дофаминовых рецепторов вовлекается в механизмы эмоциональных форм поведения при дефиците эстрогенов. При этом, стимуляция данного типа рецептора уменьшает выраженность тревожного поведения, тогда как блокада Д2-типа дофаминовых рецепторов оказывает антидепрессивный эффект у овариоэктомированных самок.
В нарушении высших функций мозга при овариоэктомии более значимую роль играют М-холинорецепторы, чем Н-холинорецепторы. Введение галантамина, ганглерона или комбинации ганглерона с галантамином корректирует поведенческий статус при дефиците эстрогенов.
Фармакотерапия расстройств поведения при дисбалансе эстрогенов в организме заключается в изолированном или комбинированном с низкой дозой 17β-эстрадиола применении нейротропных веществ в низких дозах в зависимости от типа нарушений высшей нервной деятельности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Патент:

1. Н.С. Сапронов, Н.А. Лосев, Ю.О. Федотова, М.Е. Комова Способ лечения нарушений мнестических функций. - Патент № 2268726 - Бюллетень изобретений. - 2006. - С. 1-6.

Статьи:

1. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, Н.П. Гончаров Половые гормоны и поведенческие реакции. - Вестник РАМН. - 2001. - № 12. - С. 29-34.

2. Н.П. Гончаров, Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Влияние дегидроэпиандростерона на условное пассивное избегание у овариоэктомированных крыс-самок разного возраста. - Журн. высш. нервн. деятельности им. И. П. Павлова. - 2002. - Т. 52. - № 3. - С. 371-373.

3. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, А.А. Байрамов Влияние ДГЭА на условнорефлекторную деятельность и моноаминергический статус у овариэктомированных крыс. - Мед. акад. журнал. - 2003. - Т. 3. - № 1. - С. 41-47.

4. Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Способность ципрамила корректировать условное пассивное избегание у овариоэктомированных крыс-самок. - Экспер. и клин. фармакол. - 2003. - № 1. - С. 8-11.

5. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, Е.И. Малыгина Модулирующие эффекты 8-OH-DPAT на поведенческий статус овариоэктомированных крыс-самок. - Бюлл. эксперим. биолог. мед. - 2004. - Т. 137. № 1. - С. 51-55.

6. Ю.О. Федотова Влияние агонистов серотониновых рецепторов I подтипа на поведение и уровень половых гормонов в крови интактных и овариоэктомированных крыс-самок. - Новости медико-биологических наук (News of Biomedical Sciences). - 2004. - № 1. - C. 90-98.

7. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, Е.И. Малыгина Роль 5-HT1A рецепторов серотонина в условнорефлекторных реакциях при дефиците эстрогенов. - Мед. акад. журн. - 2004. - Т.4. - № 2. - С. 53-61.

8. J.O. Fedotova, G. Hartmann, L. Lenard, N.S. Sapronov Effects of 5-НТ1А receptor agonist and antagonist on anxiety in intact and ovariectomized female rats. - Acta Physiologica Hung. 2004. - V. 91. - № (3-4). - P. 175-184.

9. J.O. Fedotova, G. Hartmann, L. Lenard, N.S. Sapronov Involvement of 5-HT1A receptors in passive avoidance learning in intact and ovariectomized female rats. - Acta Physiologica Hung. - 2004. - V. 91. - № (3-4). - P. 185-196.

10. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова Экспериментальные и клинические аспекты психонейроэндокринологии. - В мон.: Основы Нейроэндокринологии. - ЭЛБИ-СПб. - 2005. - С. 32-83.

11. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, Е.И. Малыгина Участие Д1- и Д2-подтипа дофаминовых рецепторов в модуляции поведенческих процессов при дисбалансе эстрогенов. - Мед. акад. журн. - 2005. - Т. 5. - № 3. - С. 52-58.

12. D. Consoli, J. Fedotova, V. Micale, N. Sapronov, F. Drago Stressors affect the response of male and female rats to clomipramine in a model of behavioral despair (forced swim test). - Eur. J. Pharmacol. - 2005. - V. 250. - N. 1-3. - P. 100-107.

13. Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Нейрохимические механизмы антидепрессивного эффекта антагониста Д2-подтипа дофаминовых рецепторов у овариоэктомированных крыс. - Нейрохим. - 2005. - Т. 22. - № 4. - С. 302-308.

14. Ю.О. Федотова Влияние введения агониста и антагониста Д2-дофаминовых рецепторов на поведение интактных и овариоэктомированных крыс. - Журн. высш. нервн. деят. им. И. П. Павлова. - 2006. - Т. 56. - № 1. - С. 111-117.

15. Ю.О. Федотова Влияние 8-OH-DPAT на депрессивное поведение и обмен моноаминов в гиппокампе овариоэктомированных крыс. - Эксперим. и клинич. фармаколог. - 2006. - Т. 69. - № 1. - С. 12-17.

16. Н.А. Лосев, Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Антиамнестический эффект галантамина в комбинации с эстрадиолом у овариоэктомированных крыс-самок среднего возраста. - Бюлл. эксперим. биолог. мед. -2006. - Т. 141. - № 4. - С. 411-413.

17. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, Н.А. Лосев Комбинированное введение NAN-190 с 17β-эстрадиолом устраняет амнестический эффект скополамина у овариоэктомированных крыс среднего возраста. - Бюлл. эксперим. биолог. мед. - 2006. - Т. 142. - № 7. - С. 90-93.

18. Ю.О. Федотова, Н.А. Платонова, Н.С. Сапронов 8-OH-DPAT модулирует экспрессию генов 1А/2А подтипов и рецептора 17β-эстрадиола у овариоэктомированных крыс в тесте Порсолта. - Эксперим. и клинич. фармаколог. - 2006. - Т. 69. - № 3. - С. 53-57.

19. J. Fedotova Effects of mild, moderate and severe stress on depression in female rats: modifications by estrous cycle, ovariectomy and estradiol treatment. - Biol. Psychiat. Psychopharmacol. - 2006. - V. 8. - № 1. - P 45-47.

20. Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Эффекты эстрогенов в центральной нервной системе. - Усп. физиолог. наук. - 2007. - Т. 38. - С. 46-62.

21. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова Эстрогены и психоневрологический статус женщин. - Мед. акад. журн. - 2007. - Т.7. - № 2. - С. 24-34.

22. С.В. Барабанова, Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Эффекты антагонистов 1А и 2А/2С подтипов серотониновых рецепторов на депрессивное поведение и экспрессию C-FOS белка в гипоталамусе у овариоэктомированных крыс. - Эксперим. и клинич. фармаколог. - 2007. - Т. 70. - № 2. - С. 3-7.

Тезисы:

1. Б.А. Рейхардт, Ю.О. Федотова Влияние ципрамила на поведенческие процессы у овариоэктомированных крыс-самок. - Тезисы докладов VIII Росс. Нац. Конгр. Человек и лекарство М. - 2000. - С. 669.

2. A.A. Bairamov, J.O. Fedotova, N.P. Goncharov, N.S. Sapronov Influence of DHEA on brain biogenic monoamines in ovariectomized rats. - Regional ISPNE Congress, June 2 - 5, 2001. St.Petersburg (Russia). - Neuropsychopharmacol. & Biol. Narcol. - 2001. - № 2. - P. 133-134.

3. J.O. Fedotova The role of thyroid hormones and estrogenes in cognitive functions of the brain. - Regional ISPNE Congress, June 2 - 5, 2001. St.Petersburg (Russia). - Neuropsychopharmacol. & Biol. Narcol. - 2001. - № 2. - P. 99-100.

4. J.O. Fedotova, N.S. Sapronov DHEA and biogenic amines in female rats. - In: Abstract Book of Int. Soc. of Psychoneuroendocrinol. Ann. Meeting, August 5 - 8, 2001. Quebec, Canada. - P. 69.

5. B.I. Tkachenko, J.O. Fedotova, N.S. Sapronov The influence of estradiol and testosterone on learning and behavior in male and female rats following castration. - In: Abstract Book of Int. Soc. of Psychoneuroendocrinol. Ann. Meeting, August 5 - 8, 2001. Quebec, Canada. - P. 77.

6. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, О.М. Родионова, Е.Н. Селина, И.И. Степанов, Н.А. Лосев Антиамнестический эффект хронического введения галантамина у овариэктомированных крыс-самок. - Тезисы докладов IX Росс. Нац. Конгр. УЧеловек и лекарствоФ М. - 2002. - С. 692.

8. Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Влияние гемиовариоэктомии на гормональный и нейромедиаторный статус у взрослых крыс-самок в разные фазы овариального цикла. - Психофармакол. и биол. наркол. - 2002. - Т. 2. - № 3-4. - С. 461-462.

9. N.S. Sapronov, J.O. Fedotova, N.P. Goncharov Effects of dehydroepiandrosterone on passive avoidance in the ovariectomized female rats of different age. - XXXIII Аnnual ISPNE Congress, March 20 - 23, 2003. Pisa (Italy). Abstr. Book. УThe brain as a source and target of hormones and antihormones: from basic science to clinical applicationФ. Pisa. - 2003. - P 20.

10. J.O. Fedotova, N.S. Sapronov Capability of cypramil to correct passive avoidance performance in the ovariectomized female rats. - XXXIII Аnnual ISPNE Congress, March 20 - 23, 2003. Pisa (Italy). Abstr. Book. УThe brain as a source and target of hormones and antihormones: from basic science to clinical applicationФ. Pisa. - 2003. - P 20.

11. Ю.О. Федотова, Н.С. Сапронов Сравнительная оценка эффективности серотонинергических препаратов при когнитивных нарушениях у овариоэктомированных крыс. - В сб.: УФундамент. проблемы фармакологииФ Сб. тезисов 2-го Съезда Российского научного общества фармакологов. М. - 2003. - Ч. II. - С. 252.

12. Ю.О. Федотова Поведенческие эффекты хронического введения 8-OH-DPAT или его комбинации с эстрадиолом. - Тезисы докладов. Всерос. конф. с междунар. участием УНейроэндокринология - 2003Ф, Санкт-Петербург, 23 - 25 сентября 2003. - 2003. - С. 74-75.

13. Н.С. Сапронов, Ю.О. Федотова, Б.А. Рейхардт Психонейроэндокринология: прошлое, настоящее, будущее. - Тезисы докладов. Всерос. конф. с междунар. участием УНейроэндокринология - 2003Ф, Санкт-Петербург, 23 - 25 сентября 2003. - 2003. - С. 59-61.

14. J.O. Fedotova, N.S. Sapronov Influence cypramil on the behavioral and hormonal status in the old ovariectomized female rats. - Environment and human Health: the Complete Works of International Ecologic Forum, June 29 - July 2, 2003. St. Petersburg, Russia (Sofronov G., Ed.), 2003. - P. 505-506.

15. Ю.О. Федотова Комбинированное введение 8-OH-DPAT или NAN-190 с эстрадиолом модулирует поведенческий и гормональный статус у овариоэктомированных крыс. - Юбилейная конференция, посвященная 50-летию со дня основания Института Физиологии НАН Беларуси (Минск, 7-8 окт. 2003), Тезисы докладов. - 2003. - С. 162-163.

16. J.O. Fedotova, N.S. Sapronov 8-OH-DPAT in combination with estradiol modulates passive avoidance performance in ovariectomized female rats. - Int. J. Neuropsychopharmacol. - 2004. - V. 7. - Suppl. 1. - P. 476.

17. J.O. Fedotova 5-HT1A receptors play a role in behavioral and hormonal responses in intact and ovariectomized rats. - Turkish Journal Endocrinol. Metab. - 2004. - Suppl. 1. - V. 8. - P. 56-57.

18. Ю.О. Федотова Участие Д1-подтипа дофаминовых рецепторов в поведенческих процессах интактных и овариоэктомированных крыс. - Мед. акад. журн. - Прилож. 5. - 2004. Т. 4. - № 3. - С. 70-71.

19. J.O. Fedotova, N.S. Sapronov Antidepressant effect of 5-HT1 and 5-HT2 receptors agonists in rats with estrogen fluctuations. - Psychiatrie. - 2004. - V. 8. - Suppl. 4. - P. 20.

20. J.O. Fedotova, N.S. Sapronov D1-receptors involve in behavioral and hormonal responses in ovariectomized female rats. - Eur. J. Neuropsychopharmacol. - 2004. - V. 14. - Suppl. 3. - P. 357.

21. J. Fedotova, N.S. Sapronov 5-HT1A receptors modulate behavior and c-fos expression in ovariectomized rats in forced swim test. - Eur. Neuropsychopharmacol. - 2005. - V. 15. - Suppl. 2. - P. 110.

22. J. Fedotova Estrogen-serotonin interactions: implications for cognitive and affective disorders. - World J. Biol. Psychiat. - 2005. - V. 6. - Suppl. 1. - P. 110

23. J. Fedotova, N. Platonova, N. Sapronov 8-OH-DPAT modulates expression of 5-HT1A-, 5-HT2A- and 17β-estradiol receptors mRNAs in ovariectomized rats in forced swim test. - Eur. Neuropsychopharmacol. - 2005. - V. 15. - Suppl. 3. - P. 395.

24. J. Fedotova 8-OH-DPAT modulates anticholinergic effects on avoidance behavior in ovariectomized rats. - Abstr. of the 36th ISPNE Congress, Montreal, September 24-27, 2005. - P. 97.

25. S. Barabanova, J. Fedotova, N. Platonova, N. Sapronov 5-HT2A/2C receptors modulate behaviour and c-fos expression in ovariectomized rats in forced swim test. - Eur. Neuropsychopharmacol. - 2006. - V. 16 - Suppl. 4 - P.234.

26. Ю.О. Федотова, Н.А. Платонова Кетанзерин модулирует депрессивное поведение и экспрессию генов рецепторов 1А/2А подтипов и рецептора 17β-эстрадиола у овариоэктомированных крыс. - Материалы 4-ой международной конференции УБиологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствамФ. - 13 - 16 марта 2006, Москва. - C. 76.

27. J. Fedotova, N. Sapronov, N. Losev NAN-190 facilites learning impairment induced by scopolamine in estradiol-treated ovariectomized rats. - Eur. Neuropsychopharmacol. - 2006. - V. 16 - Suppl. 4 - P. 253.

28. J. Fedotova, N. Platonova Behavioral response to clomipramine after application of different stressors in ovariectomized female rats. - Eur. Neuropsychopharmacol. - 2007. - V. 17 - Suppl. 4 - P. 368.

29. Ю.О. Федотова Роль 5-ГТ1А-рецепторов в когнитивных функциях при дефиците эстрогенов. - Психофармаколог. и биолог. нарколог. - 2007. - Т. 7. - Спец. Вып. Ч. 2. - С. 1989.

30. Ю.О. Федотова, О. О. Масалова, Н.А. Лосев, Н.С. Сапронов Альтернативные методы фармакокоррекции когнитивных расстройств у женщин с гипоэстрогенным синдромом. - Психофармаколог. и биолог. нарколог. - 2007. - Т. 7. - Спец. Вып. Ч. 2. - С. 1990.

Финансирование исследований, составивших предмет настоящей диссертации осуществлялось частично из средств Российского Фонда фундаментальных исследований (РФФИ) (проекты № 01-04-48816 и № 04-04-49025) и из средств Российского гуманитарного научного фонда (РГНФ) (проект № 06-06-00551а).

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

Blog