Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
Водопьянова Анна Михайловна
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ТИРЕОТОКСИКОЗА КОМПЛЕКСНЫМ РАСТИТЕЛЬНЫМ СРЕДСТВОМ ТИРЕОНОРМ
14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Улан-Удэ-2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Шантанова Лариса Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биоорганической и пищевой химии ФГБОУ ВПО Восточ- но-Сибирский государственный универ- ситет технологий и управления Мини- стерства образования и науки РФ Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна доктор медицинских наук, профессор, за- ведующий кафедрой инфекционных бо- лезней ФГБОУ ВПО Бурятский госу- дарственный университет Министерства образования и науки РФ Убеева Ираида Поликарповна
Ведущая организация: ГБОУ ДПО Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития РФ
Защита состоится л23 мая 2012 г. в 1400 на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.
Автореферат разослан л20 апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук В.Б. Хобракова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из наиболее актуальных проблем современной медицины и практического здравоохранения являются заболевания щитовидной железы (Балаболкин, и соавт., 2007; Суплотова, 2008; Касаткина, 2009; Фадеев, 2009;
Hoogendoorn et al., 2006). По распространенности заболевания щитовидной железы, прежде всего, обусловленные дефицитом йода (йоддефицитные заболевания), занимают первое место среди всех других эндокринных расстройств: частота этой патологии, даже вне зон зобной эндемии, составляет не менее 20% от общей заболеваемости (Калинин, 2000; Балаболкин, и соавт., 2008; Дедов, 2009), что позволило выделить специальную дисциплину - тироидологию. При этом в эндемичных по зобу регионах, где проживает примерно 1/3 человеческой популяции, эти показатели нередко превышают 50% (Калинин, 2000). По данным ВОЗ риску развития йоддефицитных заболеваний (ЙДЗ) подвержены не менее 1 млрд. населения Земли. В РФ практически нет территорий, население которых не подвергалось бы риску развития ЙДЗ (Федак, 2007; Трошина, 2007; Мельниченко, 2009; Дедов, 2009; Петунина, 2011). По статистическим данным, диффузно-токсический зоб встречается с частотой 18 - 24 на 100 тысяч населения, причем в последние годы отмечается увеличение заболеваемости, что связывают с ухудшением экологической обстановки (Балаболкин, и соавт., 2007, Дедов, 2009; Кроненберг, 2010).
Клинически заболевание проявляется синдромом тиреотоксикоза и гипертиреоза, обусловленных избытком тиреоидных гормонов и состоянием гиперфункции щитовидной железы (Велданова, 2005; Валдина, 2006; Петунина, 2011).
Существующие в настоящее время методы лечения ЙДЗ как хирургические, так и консервативные не являются патогенетическими, а направлены на подавление выработки тиреоидных гормонов (Балаболкин, 2008; Дедов, 2009; Фадеев, 2009; Alexander, 2002; Cooper, 2005). Консервативное лечение, связанное с применением тиреостатических препаратов, способствует неуправляемому течению заболевания с периодами спонтанных ремиссий и рецидивов. Кроме того, назначение их сопровождается высокой частотой развития побочных эффектов (Шестакова, 2007; Кияев, 2008; Lasar, 2000), что обусловливает актуальность поиска и разработки новых эффективных средств, предназначенных для лечения данной патологии.
В связи с вышеизложенным было разработано многокомпонентное растительное средство в виде сухого экстракта, полученного из следующих видов растений: лапчатка белая (Potentilla alba L.), боярышник кроваво-красный (Crataegus sanguinea Pall.), валериана лекарственная (Valeriana officinalis L.), условно названное ''Тиреонорм''. Выбор экстракта лапчатки белой обусловлен тем, что данное растение является накопителем йода (Гриценко, 1977; Николайчук, 2006; Алефиров, 2006; Айвазова, 2008). Включение экстрактов боярышника кроваво-красного и валерианы лекарственной связано с тем, что они являются сердечно-сосудистым и седативным средствами и применяются при повышенной возбудимости, развитии неврозоподобных и депрессивных состояний, повышении артериального давления, нарушениях сердечного ритма, сопровождающих тиреотоксикоз (Соколов, 2000; Балаболкин, 2008; Фадеев, 2009; Петунина, 2011).
Целью настоящего исследования явилось определение спектра фармакологической активности, фармакотерапевтической эффективности и особенностей механизма действия Тиреонорма.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. определить общие и специфические фармакологические свойства Тиреонорма;
2. выявить влияние Тиреонорма на гормональный статус и морфофункциональное состояние щитовидной железы у белых крыс;
3. определить фармакотерапевтическую эффективность Тиреонорма при экспериментальном тиреотоксикозе и иммуносупрессивном состоянии;
4. определить особенности механизма действия Тиреонорма.
Научная новизна. Работа представляет собой исследование фармакологических свойств и определение фармакотерапевтической эффективности нового растительного средства Тиреонорм. Впервые установлено, что испытуемое средство обладает широким спектром фармакологических свойств: тиреотропным, анксиолитическим, ноотропным, седативным, антигипоксическим, противовоспалительным; снижает частоту сердечных сокращений, оказывает гипотензивное действие. Показано, что курсовое введение животным испытуемого средства в экспериментально-терапевтической дозе (100 мг/кг) оказывает фармакотерапевтическое влияние при экспериментальном тиреотоксикозе. В частности, на фоне его введения наблюдали нормализацию содержания тиреотропного и тиреоидных гормонов, уменьшение выраженности патоморфологических изменений щитовидной железы, снижение признаков тревожности, повышение исследовательской и ноотропной активности животных, нормализацию уровня артериального давления и биоэлектрической активности миокарда, а также показателей обмена веществ. Впервые установлено, что Тиреонорм обладает существенным иммуномодулирующим потенциалом, повышая активность гуморального, клеточного и макрофагального звеньев иммунного ответа при иммуносупрессивных состояниях. Обнаружено, что фармакотерапевтическая эффективность испытуемого средства при экспериментальном тиреотоксикозе связана с его нормализующим влиянием на центральные и периферические звенья многоступенчатого процесса биосинтеза тиреоидных гормонов в системе гипоталамус-гипофиз-щитовидная железа. Молекулярно-клеточные механизмы действия Тиреонорма обусловлены стабилизацией мембранных структур клеток, связанной с ингибированием процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул под его влиянием, а также повышением потенциала эндогенной антиокислительной системы организма.
Практическая значимость. Установленные фармакологические свойства нового средства природного происхождения аргументируют возможность и целесообразность его внедрения в практическое здравоохранение в качестве средства, предназначенного для лечения и профилактики тиреотоксикоза. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета ФГБОУ ВПО Бурятский государственный университет (акт внедрения от 1 февраля 2012 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
- растительное средство Тиреонорм обладает широким спектром фармакологических свойств: тиреотропным, анксиолитическим, ноотропным, седативным, хронотропным, гипотензивным, антигипоксическим, противовоспалительным;
- курсовое введение животным испытуемого средства в экспериментальнотерапевтических дозах (50 - 100 мг/кг) оказывает выраженное фармакотерапевтическое влияние при экспериментальном тиреотоксикозе, нормализуя уровень тиреоидных гормонов, уменьшая выраженность патоморфологических изменений щитовидной железы, а также снижая проявления сопутствующих симптомов тиреотоксикоза со стороны центральной нервной и сердечно-сосудистой систем;
- Тиреонорм обладает существенным иммуномодулирующим потенциалом, повышая активность гуморального, клеточного и макрофагального иммунного ответа при иммуносупрессивных состояниях;
- механизмы фармакотерапевтического действия испытуемого средства связаны с его влиянием на центральные и периферические механизмы многоступенчатого процесса биосинтеза тиреоидных гормонов в системе гипоталамусгипофиз-щитовидная железа, а также со стабилизацией мембранных структур клеток, обусловленной как ингибированием процессов свободнорадикального окисления, так и повышением потенциала системы эндогенной антиокислительной защиты организма.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 10-летию медицинского факультета Бурятского государственного университета (Улан-Удэ, 2009); научнопрактической конференции, посвященной юбилею Центра восточной медицины (Улан-Удэ, 2010); научно-практической конференции, посвященной Дню медицинского работника (Улан-Удэ, 2010); 5th International symposium on present situation and future development of Mongolian traditional medicine (Ulaanbaatar, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
Работа выполнена в соответствии с проектом № 146 Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация, утвержденным Президиумом СО РАН.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 295 источников: 155 отечественных и 140 зарубежных авторов. Работа изложена на 1страницах компьютерного текста и иллюстрирована 36 таблицами, 6 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследованию подвергали cухой экстракт комплексного средства, условно названный Тиреонорм, полученный из корневищ лапчатки белой (Potentilla alba L.) - 50%, плодов боярышника кроваво-красного (Crataegus sanguinea Pall.) - 35%, корневищ валерианы лекарственной (Valeriana officinalis L.) - 15%. Сухие экстракты получены путем трехкратной экстракции 40% спиртом этиловым, последующей фильтрацией и сушкой в вакуумно-сушильном шкафу при температуре 50-60 градусов. Тиреонорм представляет собой хорошо растворимый в воде порошок темно-коричневого цвета с характерным запахом. Испытуемое средство животным вводили перорально в экспериментальнотерапевтических дозах 50-100 мг/кг в объеме 10 мл/кг в соответствии с дизайном исследований. Выбор экспериментально-терапевтических доз был осуществлен в серии предварительных экспериментов. В качестве препаратов сравнения использовали Эндокринол (Эвалар, Россия) в дозе 100 мг/кг.
Исследования выполнены на 550 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180Ц200 г и 90 мышах линии F1 (CBA x C57B1/6) обоего пола массой 2022 г. Животные находились в стандартных условиях содержания в виварии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН на обычном рационе (Приказ МЗ СССР №1179 от 10.10.83 г.). Эксперименты осуществляли в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.). Протокол исследования согласован этическим комитетом Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (протокол №3 от 03.02.2008). Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом. Разделение животных на группы производили с учетом принципа рандомизации. Кроме того, в экспериментах были использованы суспензии эритроцитов и желточных липопротеидов.
Острую токсичность определяли с использованием общепринятого метода Кербера (Хабриев, 2005).
Для исследования фармакотерапевтической эффективности Тиреонорма были использованы следующие экспериментальные модели:
- экспериментальный тиреотоксикоз воспроизводили путем перорального введения Тиреотома (Берин-Хеми, Германия), содержащего 40 мг левотироксина (Т4) и 10 мг лиотиронина (Т3) (Айвазова, 2008). Препарат вводили крысам в виде водной взвеси перорально ежедневно (за 30 минут до кормления) в течение 6 недель в еженедельно возрастающей дозе: 25, 50, 100, 150, 2мкг/кг;
- иммунодепрессивное состояние у животных воспроизводили путем внутрижелудочного введения азатиоприна в дозе 50 мг/кг в течение 5 дней (Лазарева, Алехин, 1985). При исследовании иммуномодулирующей активности Тиреонорма состояние гуморального иммунитета оценивали методом локального гемолиза (Cunningham, 1965); клеточного иммунитета - в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Петров и соавт., 1987); макрофагального звена иммунного ответа - в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей в отношении частиц коллоидной туши (РуководствоЕ, 2005).
Оценку влияния указанного фитосредства на поведенческую и познавательную активность животных проводили с использованием методов лоткрытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ), лусловного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) (Методические рекомендации Е, 2005). Для оценки седативной активности определяли его потенцирующее и пролонгирующее действие на снотворный эффект тиопентала натрия (39 мг/кг, ЕD50) (Воронина, Неробкова, 2000). Противосудорожное действие оценивали по продолжительности латентного периода и количеству выживших животных после введения конвульсантов в летальных дозах. Судороги у животных вызывали однократным введением водных растворов коразола в дозе 100 мг/кг (DL100), стрихнина нитрата в дозе 2 мг/кг (DL100) (Гацура, 1974) и тиосемикарбазида в дозе 30 мг/кг (DL100 ) (Воронина, Неробкова, 2000).
Влияние Тиреонорма на функциональное состояние сердечно-сосудистой системы оценивали по характеру его влияния на величину систолического артериального давления (САД), частоты сердечных сокращений, а также биоэлектрическую активность миокарда животных с использованием метода фотоплетизмографии на кардиомониторе СМ-42115 (Польша).
Гипобарическую гипоксию воспроизводили общепринятым методом в барокамере при разряжении воздуха, соответствующему подъему животных на высоту 10000 м. Модель гемической гипоксии вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения животным водного раствора натрия нитрита в дозе 210 мг/кг (Костюченков, 1982). Для воспроизведения тканевой гипоксии животным однократно внутрибрюшинно вводили водный раствор натрия нитропруссида в дозе 42 мг/кг (Воронина, Неробкова, 2000).
Для оценки противовоспалительной активности Тиреонорма определяли его влияние на экссудацию, альтерацию и образование фиброзногрануляционной ткани. Изучение антиэкссудативной активности проводили на моделях острого асептического воспаления задней конечности, которое моделировали путем однократного субплантарного введения в заднюю конечность белых крыс 0,1 мл 3% раствора формалина (Стрельников, 1960) и 0,1 мл 6% раствора декстрана (Лещинский, 1976). Оценку влияния фитосредства на образование фиброзно-грануляционной ткани осуществляли с использованием метода ватной гранулемы (Тринус и соавт., 1975). Для определения влияния на процессы альтерации воспалительный процесс моделировали путем подкожного введения в область спины 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты с одновременным внутрибрюшинным введением декстрана в дозе 300 мг/кг (Ойвин, Шетель, 1961).
Перекисный гемолиз эритроцитов донорской крови воспроизводили с использованием реактива Фентона, осмотический гемолиз - добавлением равного объема дистиллированной воды (Ковалев и соавт., 1986).
Для оценки антиоксидантных свойств Тиреонорма определяли его влияние на интенсивность процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул и состояние эндогенной антиоксидантной системы организма. Для этого определяли концентрацию маланового диальдегида в гомогенате печени (Стальная и соавт., 1977), активность супероксиддисмутазы (Чевари и соавт., 1985) и каталазы (Королюк и соавт., 1988) в сыворотке крови.
Кроме того, с использованием методов in vitro оценивали динамику накопления ТБК-активных продуктов в суспензии липосом яичного желтка (Клебанов и соавт., 1988). Антирадикальную активность по отношению к супероксидным радикалам определяли по методу Chen A.-S. с соавт.(2003), по отношению к ДФПГ-радикалам - по методу Seyoum A. и соавт. (2006), по отношению к NO - по методу Govindarajan R. с соавт. (2003). Инактивацию пероксида водорода оценивали по методу Chen A.-S. с соавт.(2003). Хелатирующую активность испытуемого средства определяли с использованием О-фенантролинового метода (Теселкин, 1997).
Содержание тиреоидных гормонов (трийодтиронина - Т3 и тироксина - Т4), тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови экспериментальных животных определяли с использованием наборов Total T4 RIA KIT, Total T3 RIA KIT, Total ТТГ RIA KIT фирмы Immunotech, Bekman (Чехия). Содержание гормонов рассчитывали методом интерполяции автоматически по калибровочной кривой на -счетчике фирмы LKB (Швеция).
Биохимические исследования сыворотки крови животных проводили с использованием биохимического анализатора Sapphire (Япония).
Для патоморфологических исследований щитовидную железу животных отделяли от прилежащих тканей, фиксировали в 10%-ом нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной в 4-5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином (Волкова, Елецкий, 1971). Для объективной оценки морфо-функционального состояния щитовидной железы использовали количественные методы анализа тканевых компонентов, в том числе разработанные для эндокринных органов (Хмельницкий, 2002). Методом стереоскопии точечного счета (Автандилов, 1990) с помощью компьютерной программы Диаморф на гистологических срезах определяли относительный объем тканевых компонентов щитовидной железы: фолликулярного эпителия, коллоида, интерфолликулярных островков, десквамированных тироцитов, соединительной ткани, лейкоцитов и сосудистого русла.
Полученные в ходе экспериментов данные статистически обработаны по Манну-Уитни (Сергиенко, Бондарева, 2000). Различие считали достоверным при вероятности 95 % (Р 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование фармакологической активности Тиреонорма Исследование острой токсичности сухого экстракта Тиреонорм показало, что при внутрибрюшинном введении белым крысам его DL50, рассчитанная по методу Кербера, составляет 750 мг/кг. Пероральное введение животным испытуемого средства во всех исследованных дозах не сопровождалось гибелью животных в течение всего периода наблюдения. Максимальная доза Тиреонорма составила 10000 мг/кг (максимальное количество средства, растворение которого возможно в объеме воды, исходя из расчета 10 мл/кг). При пероральном введении больших доз экстракта (6000 - 10000 мг/кг) в первые часы наблюдали признаки интоксикации в виде ограничения движений, частого мочеиспускания, отказа от корма, которые исчезали через 6-7 часов. Полученные данные позволяют отнести сухой экстракт Тироенорм к группе мало токсичных веществ по классификации К.К. Сидорова (Требования Е, 1984).
При исследовании специфической фармакологической активности Тиреонорма установлено, что его 7-дневное введение перорально крысам в дозах и 100 мг/кг оказывает выраженное психотропное действие, о чем свидетельствует повышение ориентировочно-исследовательской активности животных за счет увеличения вертикальной активности и норкового рефлекса (соответственно на 55 и 61% по сравнению с аналогичными показателями в контроле), а также почти двухкратное возрастание количества выходов животных в центральную зону камеры (табл. 1). При этом более выраженное действие оказывал Тиреонорм в дозе 100 мг/кг. Наряду с этим, отмечалось достоверное уменьшение числа болюсов и количества актов груминга соответственно в 2,3 и 1,раз по сравнению с аналогичными данными у крыс контрольной группы. Показано также, что введение крысам Тиреонорма сопровождается увеличением количества заходов в открытые рукава в 3,3 и 3,4 раза по сравнению с аналогичными показателями у крыс контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют о повышении ориентировочно-исследовательской активности, снижении уровня тревожности и ускорении периода адаптации животных к новым незнакомым условиям.
Установлено также, что Тиреонорм в дозе 100 мг/кг оказывает ноотропное действие, стимулируя когнитивные функции животных. Так, на фоне его курсового введения животным наблюдали 100% выработку условного рефлекса, ускорение времени рефлекса и сохранение памятного следа в отдаленные сроки (через 1, 3 и 7 суток после обучения); латентный период захода в темный отсек увеличивался на 15, 37 и 56% соответственно по сравнению с данными у животных контрольной группы.
Таблица Влияние Тиреонорма на поведенческую активность белых крыс в тестах лоткрытое поле и приподнятый крестообразный лабиринт Группы животных Опытная 1 (Ти- Опытная 2 (ТиреоПоказатели Контрольная реонорм, 50 норм, 100 мг/кг) (n=10) мг/кг) (n=10) (n=10) Открытое поле Общая двигательная 37,603,25 41,113,10* 41,83,90* активность Горизонтальная ак28,302,64 27,802,54 27,32,тивность Вертикальная актив8,00,50 11,40,90 12,40,50* ность Норковый рефлекс 1,320,07 1,90,10 2,1,0,17* Дефекация 3,110,10 1,700,09* 1,30,01* Груминг 5,710,40 3,00,09* 2,90,02* Кол-во выходов в 1,420,12 3,700,44* 3,800,31* центральную зону Приподнятый крестообразный лабиринт Кол-во заходов в от0,410,03 1,360,41 1,410,13* крытые рукава Кол-во заходов в за1,620,21 2,360,32 2,390,крытые рукава Время нахождения в 260,624,10 243,023,60 239,022,закрытом рукаве, с Время нахождения в 13,42,42 28,02,59* 31,03,23* открытом рукаве, с Время нахождения на центральной пло- 26,02,50 29,02,78 30,02,щадке, с Примечание: * - здесь и далее значения, достоверно отличающиеся от данных контрольной группы при Р 0,05.
Установлено, что предварительное введение крысам Тиреонорма в указанных дозах оказывает потенцирующее влияние на снотворное действие тиопентала натрия, о чем свидетельствует достоверное укорочение латентного периода засыпания и увеличение продолжительности тиопенталового сна. При этом отмечается дозо-зависимый эффект: с увеличением дозы испытуемого средства отмечается повышение его потенцирующей эффективности. Установлено, что продолжительность сна животных, получавших Тиреонорм в дозе 100 мг/кг, увеличилась более чем в 1,7 раз по сравнению с данными в контроле и составила в среднем 21,7 минут.
При исследовании притивосудорожной активности указанного средства на фоне введения конвульсантов с различными механизмами действия установлено, что подкожное введение белым крысам коразола в дозе DL100 сопровождается развитием клонико-тонических судорог, приводящих к 100% гибели животных. Однократное введение крысам Тиреонорма в дозе 100 мг/кг не предотвращало развития судорог и гибели животных. Вместе с этим, на фоне введения испытуемого препарата отмечали пролонгирование латентного периода в среднем на 60% по сравнению с данными у животных контрольной группы.
При подкожном введении белым крысам стрихнина нитрата в дозе DL100 у животных контрольной и опытной групп развивались преимущественно тетанические судороги, которые завершались 100% гибелью животных. Вместе с тем, введение животным испытуемого средства удлиняло латентный период судорожного приступа в среднем на 74% по сравнению с контролем. Введение тиосемикарбазида в дозе DL100 сопровождалось развитием клонико-тонических судорог, завершавшихся 100 % гибелью животных контрольной группы Профилактическое введение Тиреонорма в дозе 100 мг/кг оказывало выраженное противосудорожное действие, о чем свидетельствует увеличение латентного периода развития судорожного приступа и средней продолжительности жизни крыс опытной группы соответственно в 1,9 и 2,2 раза по сравнению с аналогичными данными в контроле. Кроме этого, в опытной группе, получавшей испытуемое средство, выжило 30 % животных.
При исследовании влияния Тиреонорма на функциональное состояние сердечно-сосудистой системы у интактных животных установлено, что его однократное введение в дозе 100 мг/кг не оказывает статистически значимого влияния на уровень артериального давления, ЧСС и показатели биоэлектрической активности миокарда.
Установлено, что Тиреонорм в дозе 100 мг/кг обладает выраженной антигипоксической активностью при кислороддефицитных состояниях различного генеза. Так, при гипобарической гипоксии его профилактическое 7-дневное введение в дозе 100 мг/кг сопровождалось увеличением продолжительности жизни крыс на 81%; при гемической гипоксии продолжительность жизни животных опытных групп увеличивалась в среднем на 21% по сравнению с аналогичными данными у крыс контрольной группы. При гистотоксической гипоксии испытуемое средство в указанной дозе отличалось умеренным антигипоксическим эффектом: продолжительность жизни крыс увеличивалась на 27% по сравнению с контролем.
При исследовании противовоспалительной активности исследуемого средства установлено, что Тиреонорм при введении животным в дозе 100 мг/кг на фоне острого асептического воспаления, вызванного введением формалина и декстрана, сопровождается уменьшением выраженности отека соответственно на 46 и 39% по сравнению с аналогичными данными у крыс контрольной группы. Курсовое введение животным Тиреонорма в указанной дозе на фоне альтерации тканей уксусной кислотой сопровождается уменьшением степени альтерации тканей и ускорением их регенерации. При этом противовоспалительный эффект испытуемого средства как и препарата сравнения проявляется на ранних сроках эксперимента: на 7 сутки площадь альтерации у крыс опытных групп была в среднем на 40% меньше, чем в контроле. На 14 сутки исследования площадь альтерированной ткани была в 1,6 раза меньше, чем в контроле.
При исследовании влияния Тиреонорма на процессы обмена веществ и тиреоидный статус интактных крыс установлено, что его однократное введение в дозе 100 мг/кг не оказывает статистически значимого влияния на показатели белкового, углеводного и липидного обмена, а также содержание тиреотропного гормона, трийодтиронина и тироксина в сыворотке крови белых крыс.
Фармакотерапевтическая эффективность л Тиреонорма При исследовании фармакотерапевтической эффективности испытуемого средства при экспериментальном тиреотоксикозе, установлено, что 6-недельное введение Тиреотома сопровождается существенным повышением уровня тиреоидных гормонов: трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4), снижением содержания тиреотропного гормона (ТТГ), интенсификацией обмена веществ, снижением массы животных, повышением общей двигательной активности, тревожности и ЧСС, повышением уровня артериального давления. Установлено, что курсовое (в течение 4-х недель) введение крысам Тиреонорма в дозе 1мг/кг сопровождается достоверно значимым снижением уровня тиреоидных гормонов и повышением содержания тиреотропного гормона (ТТГ) (табл. 2).
Таблица Влияние Тиреонорма на тиреоидный статус белых крыс на фоне экспериментального тиреотоксикоза Группы животных Т3, пмоль/мл Т4, пмоль/мл ТТГ, мкМЕ/мл (n=10) Интактная 1,20,09 33,03,20 0,0330,00Контрольная (тиреотом) 2,80,16 57,35,10 0,0020,00Опытная 1 (тиреотом 1,70,17* 46,44,46* 0,0410,0003* +тиреонорм) Опытная 2 (тиреотом 2,20,23 47,06,10 0,0430,0090* +эндокринол) Показано также, что на фоне курсового введения крысам испытуемого средства отмечается нормализация белкового, углеводного и липидного обмена, о чем свидетельствует повышение в сыворотке крови концентрации общего белка на 39%, глюкозы - в 1,5 раза и холестерина - в 2,1 раза по сравнению с аналогичными показателями у крыс контрольной группы. У животных этой группы отмечается достоверное увеличение массы животных по сравнению с контролем.
Таблица Влияние Тиреонорма на функциональное состояние сердечно-сосудистой и центральной нервной систем при экспериментальном тиреотоксикозе Показатели Группы животных (n=10) Интактная Контрольная Опытная 1 Опытная (Тиреотом) (Тиреотом+ (Тиреотом+ тиреонорм) эндокринол) 1 2 3 4 Сердечно-сосудистая система ЧСС, в мин 446,724,10 630,531,70 459,844,90* 502,760,САД, мм.рт.ст. 114,87,80 135,96,00 108,311,00 123,713,Тест Открытое поле Общая двига- 33,62,30 39,91,85 33,71,20* 34,52,00* тельная активность Горизонтальная 15,61,64 19,31,54 15,91,00* 16,61,активность Вертикальная 9,10,35 13,81,10 9,10,90* 10,01,активность Норковый реф- 8,90,57 6,80,10 8,70,70* 7,90,лекс Дефекация 3,00,10 4,30,40 2,90,22* 3,10,20* Груминг 2,50,40 3,80,09 2,60,15* 2,40,11* Кол-во выхо- 1,40,12 0,50,10 1,30,20* 1,00,10* дов в цен- тральную зону Тест Приподнятый крестообразный лабиринт Время нахож- 249,423,10 257,425,50 252,025,00 252,828,дения в закрытом рукаве, с Время нахож- 24,62,12 19,61,17 24,02,21* 23,22,6* дения в открытом рукаве, с Время нахож- 26,02,43 23,02,22 24,02,50 24,02,дения на центральной площадке, с Кол-во заходов 1,60,15 0,60,05 1,20,11* 1,30,14* в открытые рукава Кол-во заходов 1,30,14 2,50,23 1,60,15* 1,80,21* в закрытые рукава Установлено, что введение животным Тиреонорма сопровождается нормализацией функционального состояния центральной нервной и сердечнососудистой систем животных (табл. 3). Так, у крыс опытной группы отмечается уменьшение частоты сердечных сокращений и артериального давления соответственно на 27 и 20% по сравнению с контролем; наблюдается нормализация показателей биоэлектрической активности сердца. Установлено также, что у крыс, получавших Тиреонорм, уменьшаются признаки тревожности, эмоциональности и страха, о чем свидетельствует достоверное снижение горизонтальной двигательной активности, числа актов дефекации и груминга по сравнению с аналогичными данными у животных контрольной группы, а также снижение вертикальной активности, увеличение норкового рефлекса, количество выходов в центральную зону и количества заходов в открытые рукава ПКЛ до уровня физиологической нормы.
Таблица Влияние Тиреонорма на интенсивность процессов СРО биомакромолекул и состояние антиоксидантной системы белых крыс при экспериментальном тиреотоксикозе Показатели Интактная Контрольная Опытная 1 Опытная (тиреотом) (Тиреотом+ (Тиреотом+ тиреонорм) эндокринол МДА в го- 37,42,64 66,73,42 43,42,43* 45,84,50* могенате печени, нмоль/г СОД, 17,11,40 5,80,90 11,01,00* 11,41,13* мкмоль/мл Каталаза, 23,82,22* 24,71,10 17,91,65 24,11,82* мкат/л Восст. глу- 364,226,10 244,829,10 318,229,90* 313,830,10* татион, мкмоль/мл Как следует из данных, приведенных в таблице 4, развитие тиреотоксикоза у животных сопровождается индукцией процессов свободнорадикального окисления (СРО) биомакромолекул, на что указывает существенное повышение уровня МДА в печени и сыворотке крови, а также снижение активности эндогенной антиоксидантной системы у крыс контрольной группы. Установлено, что курсовое введение крысам Тиреонорма в указанной дозе оказывает выраженное антиоксидантное действие, о чем свидетельствует уменьшение концентрации МДА в сыворотке крови и гомогенате печени соответственно на 20 и 34%, а также повышение активности каталазы и супероксиддисмутазы на 25 и 52%, повышение концентрации восстановленного глутатиона в 1,7 раза по сравнению с показателям у крыс контрольной группы.
При микроскопическом исследовании железы выявлено, что на гистологических срезах площади тканевых компонентов приближаются к таковым показателям интактной группы животных. При морфометрическом изучении щитовидной железы (табл. 5) установлено, что курсовое введение крысам Тиреонорма сопровождается восстановлением структуры и функции щитовидной железы. Установлено, что площадь коллоида в фолликулах щитовидной железы уменьшилась на 36% по сравнению с данными в контрольной группе животных, фолликулярно-коллоидный индекс увеличился в 2,3 раза, а показатель Брауна, прямо отражающий степень накопления коллоида в фолликулах, уменьшился в 1,5 раза.
Таблица Влияние Тиреонорма на морфофункциональные показатели щитовидной железы белых крыс при экспериментальном тиреотоксикозе Тканевые ком- Интактная Контрольная Опытная 1 Опытная поненты Тиреонорм Эндокринол Коллоид, % 38,73,21 58,75,13 37,62,60* 39,23,64* Строма, % 5,00,63 10,21,50 11,21,11 11,41,Фолликулярный 34,33,11 22,52,12 29,82,32* 28,62,45* эпителий, % Диаметр 60,25,70 76,46,11 67,65,40* 70,99,фолликула, мкм Высота эпите- 8,40,41 6,50,53 9,00,60* 9,50,56* лия, мкм Фолликулярно- 0,80,02 0,30,02 0,70,04* 0,70,02* коллоидный индекс Показатель 7,10,40 11,71,12 7,50,70* 7,40,59* Брауна При исследовании фармакотерапевтической эффективности Тиреонорма при экспериментальном иммуносупрессивном состоянии у мышей установлено, что испытуемое средство оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, повышая активность клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета в условиях его супрессии (табл. 6).
Как следует из данных, приведенных в указанной таблице, под влиянием курсового введения животным фитосредства в дозе 100 мг/кг отмечается почти двукратное увеличение количества антителообразующих клеток, повышение индекса реакции ГЗТ в 3 раза, а также фагоцитарного индекса в среднем в раза по сравнению с аналогичными показателями у мышей контрольной группы.
Таблица Влияние Тиреонорма на выраженность реакций гиперчувствительности замедленного типа, антителообразования и фагоцитоза на фоне азатиоприновой иммуносупрессии у мышей линии F1(CBAxC57B1/6) Группы животных Показатели реакций Интактная Контрольная Тиреонорм (n=10) (n=10) (n=10) Индекс реакции ГЗТ 32,502,58 16,220,90 47,31,90* Количество АОК на се875244114 530133691 963205433* лезенку Количество АОК на 10б 606,034,42 373,015,65 590,049,16* спленоцитов Фагоцитарный индекс 0,0290,0020 0,0130,0009 0,03210,015* (Е 620 ) нм При исследовании механизмов действия испытуемого фитосредства установлено, что под его влиянием отмечается стабилизация мембранных структур клеток. Так, с использованием суспензии эритроцитов донорской крови установлено, что добавление испытуемого средства в дозах, эквивалентных экспериментально-терапевтическим, оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие, уменьшая степень гемолиза эритроцитов при перекисном гемолизе в 2, а при осмотическом - в 1,3 раза по сравнению с контролем.
С использованием методов in vitro показано, что мембраностабилизирующая активность Тиреонорма связана с его антиоксидантными свойствами, обусловленными прямым антирадикальным и опосредованным - хелатирующим действием веществ фенольной природы, входящих в его состав. Так, наличие выраженной антирадикальной активности исследуемого средства было установлено по отношению к супероксидным анион-радикалам, радикалам NO. Индекс половинного ингибирования (IC50) в отношении супероксидных радикалов составил 0,015 мкг/мл и превосходит таковой у препарата сравнения кверцетина (IC50 = 31.82 мкг/мл); в отношении NO-радикалов IC50 Тиреонорма составил 0,155 мг/мл, при IC50 у аскорбиновой кислоты и кверцетина соответственно 1.14 мг/мл и 0.150 мг/мл; Наряду с этим показано, что Тиреонорм снижает скорость накопления ТБК-активных продуктов в модельной системе; индекс антиокислительной активности, рассчитанный по данному тесту, составил 1,256 мг/мл.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что комплексное растительное средство Тиреонорм в дозах 50-100 мг/кг обладает широким спектром фармакологических свойств: тиреотропным, анксиолитическим, ноотропным, седативным, гипотензивным, антигипоксическим, противовоспалительным, иммуномодулирующим; нормализует процессы обмена веществ. В частности, испытуемое средство ускоряет период адаптации к новым незнакомым условиям, повышает ориентировочно-исследовательскую активность, снижает уровень эмоциональности и тревожности животных. Тиреонорм оказывает также выраженное ноотропное действие, стимулируя познавательную активность и ускоряя выработку условного рефлекса и сохранение памятного следа.
У испытуемого средства выявлены также седативные свойства, на что указывает потенцирование и пролонгирование наркотического сна, индуцированного натрия тиопенталом, а также увеличение продолжительности латентного периода судорог, вызванных конвульсантами с различным механизмом действия.
Учитывая механизмы действия указанных фармакологических средств, можно полагать, что испытуемое средство обеспечивает широкую иррадиацию тормозных процессов в разных отделах центральной нервной системы, включая кору больших полушарий, благодаря усилению блокирующих эффектов наркотических препаратов на восходящую часть ретикулярной формации. Испытуемое средство обладает также выраженной антигипоксической активностью, повышая продолжительность жизни животных при кислороддефицитных состояниях (гипобарической, гемической, гистотоксической гипоксии), увеличивая продолжительность жизни животных как в условиях низкого парциального давления кислорода в воздухе, так и при нарушениях кислород-транспортной функции крови. Таким образом, Тиреонорм обеспечивает более высокий уровень кислородного обеспечения тканей организма, что во многом объясняет наличие у него выраженных психотропных свойств.
Установлено также наличие у Тиреонорма противовоспалительной активности, при этом установлено, что данное средство оказывает выраженное влияние на основные стадии процесса воспаления: уменьшает выраженность экссудации, оказывает антиальтеративное действие, стимулирует регенерацию поврежденных тканей.
Показано, что курсовое введение животным испытуемого средства перорально в экспериментально-терапевтических дозах (50-100 мг/кг) оказывает фармакотерапевтическое влияние при экспериментальном тиреотоксикозе. В частности, на фоне его введения наблюдается нормализация уровня тиреоидных гормонов в условиях тиреотоксикоза: снижение содержания Т3, Т4 и одновременное повышение уровня ТТГ. Выявленные эффекты сопровождаются уменьшением выраженности патоморфологических изменений щитовидной железы, на что указывает уменьшение размера коллоида, нормализация состояния фолликулярного эпителия и ее функциональной активности. Наряду с этим, на фоне введения Тиреонорма отмечается уменьшение выраженности патологических явлений со стороны центральной и сердечно-сосудистой систем.
Так, у крыс опытной группы наблюдалось уменьшение признаков тревожности, повышение исследовательской и ноотропной активности, нормализация уровня артериального давления, ЧСС и показателей биоэлектрической активности миокарда, а также основных показателей обмена веществ. Тиреонорм обладает также существенным иммуномодулирующим потенциалом, повышая активность гуморального, клеточного и макрофагального иммунного ответа при иммуносупрессивных состояниях.
Установлено, что механизмы фармакотерапевтического действия испытуемого средства при экспериментальном гипертиреозе связаны с нормализацией синтеза и секреции тиреотропного и тиреоидных гормонов, обусловленного его влиянием на центральные и периферические звенья системы гипоталамусгипофиз-щитовидная железа. Учитывая данные последних лет, свидетельствующие о том, что дефицит йода не является единственным пусковым механизмом развития тиреопатий (Фадеев, Мельниченко, 2004; Пашке, 2004; Peeters et al., 2001), можно полагать, что биологически активные вещества, содержащиеся в испытуемом средстве, в том числе органический йод, оказывают комплексное влияние на сложный многоступенчатый процесс биосинтеза тиреоидных гормонов. В частности, снижение уровня тиреоидных гормонов при одновременном повышении содержания тиреотропного гормона при экспериментальном тиреотоксикозе можно объяснить снижением чувствительности тироцитов под влиянием антигормональных компонентов испытуемого средства, относящихся к группе фенолкарбоновых кислот (производные кофейной кислоты, литоспермовая кислота и др.) (Алефиров, 2006; Bucar et al., 1995; Wojciechowski et al., 1995). Другой механизм нормализации уровня тиреоидных гормонов, очевидно, связан со снижением интенсивности периферического дейодирования Т4 в печени, поскольку известно, что 80% Т3, являющегося наиболее активным гормоном (Peeters et al., 2001), образуется в печени (Kuiper et al., 2006).
Установлено, что молекулярно-клеточные механизмы действия Тиреонорма обусловлены стабилизацией мембранных структур клеток, в том числе тироцитов, о чем свидетельствуют данные патоморфологического исследования, а также наличие выраженной мембраностабилизирующей активности в условиях осмотического и перекисного гемолиза эритроцитов. Можно полагать, что одним из важных молекулярно-клеточных механизмов в действии данного средства является наличие выраженной антиоксидантной активности, поскольку известно, что локсидативный стресс является ведущим патогенетическим фактором, приводящим к развитию патологических состояний (Дедов, 2009; Петунина, 2011). При этом антиоксидантная активность испытуемого средства обусловлена ингибированием процессов свободнорадикального окисления (СРО) биомакромолекул и повышением потенциала эндогенной антиокислительной системы организма, на что указывают полученные данные о снижении содержания продуктов пероксидации липидов в тканях, повышение активности ферментов антиоксидантной защиты организма. Установлено, что ингибирование процессов СРО биомакромолекул обусловлено входящими в состав данного экстракта преимущественно соединениями фенольной природы, обладающими прямым радикалперехватывающим и опосредованным - хелатирующим действием, а также другими наличествующими в экстракте природными веществами (витаминами Е, А, С) и, тем самым, обеспечивается структурная и функциональная целостность биологических мембран тироцитов и других клеток.
При этом фармакотерапевтическая эффективность Тиреонорма при экспериментальном тиреотоксикозе была сопоставимой с таковой у препарата сравнения Эндокринол.
ВЫВОДЫ:
1. Растительное средство Тиреонорм обладает тиреотропным, анксиолитическим, ноотропным, седативным, гипотензивным, антигипоксическим, противовоспалительным действием, нормализует процессы обмена веществ и оказывает иммуномодулирующее действие.
2. Курсовое введение животным испытуемого средства в экспериментальнотерапевтических дозах (50-100 мг/кг) оказывает выраженное фармакотерапевтическое влияние при экспериментальном тиреотоксикозе, нормализуя уровень тиреоидных гормонов, уменьшая выраженность патоморфологических изменений щитовидной железы, снижая проявления сопутствующих симптомов тиреотоксикоза со стороны центральной нервной и сердечно-сосудистой систем.
3. Тиреонорм оказывает фармакотерапевтическое влияние при экспериментальном иммуносупрессивном состоянии у мышей, корригируя показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа.
4. Механизмы действия Тиреонорма связаны c его нормализующим влиянием на центральные и периферические звенья многоступенчатого процесса биосинтеза тиреоидных гормонов в системе гипоталамус-гипофиз-щитовидная железа, а также со стабилизацией мембранных структур клеток, обусловленной как ингибированием процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул, так и повышением мощности системы эндогенной антиокислительной защиты организма.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Водопьянова А.М. Лапчатка белая как перспективное средство для лечения заболеваний щитовидной железы / А.М. Водопьянова, Э.В. Архипова, Л.Н. Шантанова, С.М. Николаев // Бюллетень ВСН - СО РАМН.- 2011.- № 1 (77).- С. 131-12. Водопьянова А.М. Влияние Тиреонорма на функциональное состояние центральной нервной системы / А.В. Водопьянова, Л.Н. Шантанова // Бюллетень ВСН - СО РАМН.- 2011.- №1 (77).- С. 128-13. Хобракова В.Б. Влияние сухого экстракта лапчатки белой на состояние клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа / В.Б. Хобракова, Э.В. Архипова, А.М. Водопьянова // Бюллетень ВСН - СО РАМН.- 2011.- №1 (77).- С. 195-197.
4. Водопьянова А.М. Определение острой токсичности Potentilla alba L. / А.М. Водопьянова, Э.В. Архипова, Э.А. Алексеева, Л.Н. Шантанова // Бюллетень ВСН - СО РАМН. - 2009. - № 2 (66). - С.234-235.
5. Arkhipova E.V. The potentional source for treatment of thyroid glandТs diseases is cinquefoil white (Potentilla alba L.) / E.V. Arkhipova, A.M. Vodopyanova, S.M. Nikolaev, V.K. Kolkhir // Мэс засал. Journal of surgery. - 2011.№ 13.- Р.140.
6. Архипова Э.В. Тиреотропное действие экстракта Potentilla alba L. / Э.В.
Архипова, А.М. Водопьянова, А.И. Мешков, В.К. Колхир // Сборник материалов конференции Развитие традиционной медицины в России. - Улан-Удэ, 2010.- С.324.
7. Vodopjanova A.M. The effect of plant remedy Tireonorm at experimental hyperthyroidism/ A.M. Vodopjanova // Abstract of the 5-th international symposium on present situation and future development of Mongolian traditional medicine. - Ulanbaatar, 2011.-P.32.