Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
НИКОЛАЕВ СЕРГЕЙ БОРИСОВИЧ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ
ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ
В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ
(экспериментально-клиническое исследование)
14.03.06 Ц фармакология, клиническая фармакология
14.01.17 Ц хирургия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Курск Ц 2011
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию.
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАЕН
Быстрова Наталья Анатольевна
доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, Заслуженный врач РФ
азаренко Виктор Анатольевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Провоторов Владимир Яковлевич
доктор медицинских наук, профессор Парфенов Игорь Павлович
доктор медицинских наук ФилипповааОльгааВсеволодовна
Ведущее учреждение:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Защита диссертации состоится л____ ___________ 2011 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3).
Автореферат разослан л____ ___________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент Пашин Е.Н.
Актуальность проблемы. Гипоксия является ведущей патогенетической составляющей различных нозологических форм патологии и осложняет течение многих заболеваний. Гипоксией сопровождаются все виды дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности, кровопотеря, ишемия миокарда, нарушение мозгового или периферического кровообращения, термические и механические травмы. В хирургической практике нередко приходится на время прекращать кровоснабжение оперируемого органа, создавая искусственную ишемию. Это определяет исключительную важность и социальную значимость проблемы защиты организма от кислородной недостаточности и энергодефицита (Мороз В.В. и др., 2002; АшмаринаИ.П., 2005; Шулутко Б.И., Макаренко С.В., 2005; Игнатьев В.И., Кокосов А.Н., 2006; Бизенкова М.Н., 2008).
По современным представлениям, главной мишенью для гипоксии является энергетический обмен. Энергодефицит и активация на его фоне перекисного окисления липидов приводят к комплексной модификации всех функций биологических мембран (Лукьянова Л.Д., 2004; Чеснокова Н.П., 2006; Васильев К.Ю., Хазанов В.А., 2007), в том числе мембран иммуноцитов и эритроцитов (Стародубцева М.Н. и др., 2007; Кармен Н.Б., 2008; Конопля А.И. и др., 2008; Новицкий В.В. и др., 2008; Софронов В.В. и др., 2010). При этом при гипоксии замыкается порочный круг: недостаток кислорода нарушает энергетический обмен и стимулирует свободнорадикальное окисление, а активация свободнорадикальных процессов, повреждая мембраны митохондрий и лизосом, усугубляет энергодефицит (Зенков Н.К. и др., 2001; King J.G., Tsen K.T., 2006). Все это создает условия для проникновения в сосудистое русло метаболитов, способных непосредственно изменять функциональную активность иммунокомпетентных клеток, а также индуцировать появление иммуносупрессорных свойств у эритроцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 2003; Лебедев В.В., 2004; Земсков А.М. и др., 2007).
Иммунные нарушения, возникающие при гипоксии различного генеза, и механизмы их развития остаются все еще мало изученными (Демина Д.В., 2004; Игнатьева С.Н., 2007; Ben-Shoshan J. et al., 2008; Tsoi E.M., 2008; Lee C.T., 2010). Функции иммунной системы осуществляются на фоне метаболических процессов и их сдвигов, вызываемых действием на организм различных агентов, а также клеток микроокружения - эритроцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 2006; Kiang J.G., 2006; Земсков А.М. и др., 2007; Конопля А.А. и др., 2010). Типовые метаболические сдвиги, возникающие при гипоксии различного генеза, сочетаются и с определенными особенностями нарушений метаболизма в тех или иных органах и тканях, обусловленными спецификой их структурно-функциональной организации, природой индуцирующего агента и первичным звеном его воздействия на клетки и организм в целом (Чеснокова Н.П., 2006; Бизенкова М.Н. и др., 2007; Прокопенко Л.Г. и др., 2008). Взаимосвязь многочисленных метаболических сдвигов, нарушений физико-химических свойств эритроцитов, возникающих при гипоксии, с функцией иммунной системы до настоящего времени изучена недостаточно.
Неоднозначность механизмов нарушений, лежащих в основе разных типов гипоксии, обусловливает тот факт, что корригирующие свойства фармакологических препаратов, проявляемые на одной какой-либо модели, не обязательно должны воспроизводиться на другой (Зарубина И.В. и др., 2002; Новиков В.Е., Катунина Н.П., 2002; Оковитый С.В. и др., 2005). Для эффективной иммунореабилитации, в том числе и при гипоксии, необходимо использовать комбинации препаратов, которые способны помимо воздействия на энергопродуцирующую систему клетки, иметь дополнительные точки приложения: иммуноциты, интенсивность ПОЛ, структурно-функциональное состояние мембран клеток-мишеней и эритроцитов (Караулов А.В. и др., 2008; Конопля А.А. и др., 2010).
В существующих стандартах лечения состояний включающих гипоксическую компоненту мало патогенетически обоснованных и эффективных способов фармакологической коррекции сопровождающих их иммунных и оксидантных расстройств (Земсков А.М., Самодай В.Г., 2006; Рыбников В.Н., 2009; Мансимова О.В. и др., 2010). При выборе лекарственного препарата его точка приложения должна определяться степенью выраженности нарушений того или иного звена иммунной и антиоксидантной системы для обеспечения максимальной эффективности проводимой терапии (Земсков А.М. и др., 2008; Караулов А.В. и др. 2008; Конопля А.А. и др., 2010).
Критическая ишемия нижних конечностей является хирургической патологией, в патогенезе которой значительную роль играют нарушения, обусловленные локальной гипоксией большого массива мягких тканей. Разработка способов консервативной терапии КИНК у больных с нереконструируемым сосудистым руслом, позволяющих улучшить результаты лечения и исходы заболевания, является одной из актуальных хирургических проблем (Лазаренко В.А. и др., 2004; Беликов Л.Н. и др., 2006; Горпинич А.Б. и др., 2008). Кроме того, КИНК сопровождается развитием вторичного иммунодефицита гуморального и клеточного звена, усиливающегося при нарастании тяжести ишемии (Дибиров А.А., 2009; Малхас Т.С., 2009; Косаев Д.В. и др., 2010). Некупирующийся иммунодефицит после выполнения реваскуляризирующих операций и недостаточная эффективность прямых иммуномодуляторов возможно объясняется сохраняющейся несостоятельностью периферического сосудистого русла, что не позволяет полностью оборвать цепочку патологических реакций индуцированных гипоксией (Морозов М.Ю. и др., 2006; Kominsky D.J. et al., 2010). При этом вторичное иммунодефицитное состояние у больных с облитерирующим атеросклерозом при ишемии высокой степени способствует возникновению гнойно-воспалительных осложнений в послеоперационном периоде (Земсков А.М., Самодай В.Г., 2006; Малхас Т.С., 2009).
В связи с выше изложенным, актуален поиск фармакологических средств и их сочетаний, обладающих высокой антиишемической активностью у пациентов с нереконструируемым артериальных руслом, способных также оказывать влияние на состояние иммунной реактивности, оксидантного статуса и отдалять развитие неблагоприятных исходов в виде гангрены с последующей ампутацией конечности.
Раскрытию механизмов нарушений иммунного и метаболического гомеостаза при различных видах экспериментальной гипоксии, установлению роли эритроцитов, тромбоцитов и гепатоцитов в патогенезе этих расстройств и разработке патогенететически обоснованных методов фармакологической коррекции, с подтверждением их клинической эффективности на примере КИНК атеросклеротического генеза, посвящена данная диссертационная работа.
Цель исследования - установить характер и степень иммунометаболических нарушений при основных видах гипоксических состояний, разработать способы фармакологической коррекции.
Задачи:
- Установить закономерности изменений иммунометаболического гомеостаза при различных видах системной гипоксии (гипоксической, гемической, гистотоксической).
- Изучить особенности иммунометаболического гомеостаза при экспериментальной локальной ишемии жизненно важных органов (печень, сердце).
- Выявить характер и степень выраженности физико-химических изменений эритроцитов при системной гипоксии в эксперименте.
- Изучить механизмы иммуносупрессии при системной и локальной гипоксии, выяснив роль гепатоцитов, сывороточных и спленоцитарных факторов, форменных элементов крови в ее реализации.
- Оценить эффективность фармакологической коррекции иммунных и метаболических нарушений с использованием антиоксидантов, мембраностабилизаторов и антигипоксантов в условиях экспериментальной локальной гипоксии.
- Исследовать возможность фармакологической коррекции иммунометаболических нарушений при системной гипоксии различного генеза антиоксидантами, мембраностабилизаторами, регуляторами энергетического обмена и антигипоксантами.
- Изучить роль эритроцитарно-лимфоцитарных и эритроцитарно-тромбоцитарных взаимодействий в реализации эффектов изученных фармакологических препаратов.
- Исследовать влияние изученных фармакологических препаратов на содержание стабильных метаболитов NO в плазме крови при основных видах системной гипоксии.
- Изучить типовые изменения иммунных, антиоксидантных показателей и структурно-функциональные свойства эритроцитов при критической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза.
- Исследовать эффективность фармакологической коррекции иммунометаболических нарушений и структурно-функциональных свойств эритроцитов при критической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза серотонина адипинатом и мексикором в сравнении с традиционной терапией.
Научная новизна. Установлены характер и степень иммунометаболических нарушений при различных видах системной и локальной гипоксии, впервые проведен их сравнительный анализ.
Впервые выявлены изменения сорбционных свойств, энергетического и антиоксидантного статуса эритроцитов в зависимости от патогенеза гипоксического воздействия. Установлена взаимосвязь между метаболическими, структурно-функциональными изменениями в эритроцитах и нарушением иммунной реактивности.
На основании выявленных патогенетических особенностей развития иммунодефицита при недостатке кислорода разработаны дифференцированные способы фармакологической коррекции при различных видах гипоксии системного или локального характера.
Определена роль эритроцитов в реализации иммуномодулирующего действия полиненасыщенных фосфолипидов (фосфоглив), регуляторов энергетического обмена (эспа-липон), антигипоксантов (гипоксен) и антиоксидантов (мексикор) в условиях гипоксии.
Впервые выявлена роль эритроцитарно-лимфоцитарных взаимодействий в реализации эффектов антиоксидантов при интервальной гипоксической гипоксии. Установлено, что иммуномодулирующее действие эритроцитов животных, получавших исследованные фармакологические препараты опосредуется цитокинами спленоцитов, повышающими взаимодействие Т- и В-лимфоцитов и угнетающими развитие антигенспецифической и антигеннеспецифической форм иммуносупрессии.
Установлен механизм развития эритроцитарно-тромбоцитарной иммуносупрессии при острой гемической гипоксии и возможности ее эффективной коррекции сочетанным применением фосфоглива и эспа-липона.
Выявлены системные иммунные и оксидантные нарушения, а также изменения физико-химических свойств эритроцитов у больных с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза. Разработан метод комплексного консервативного лечения больных с критической ишемией нижних конечностей в виде сочетанного использования серотонина адипината и мексикора. Установлена клинико-лабораторная эффективность предложенной фармакологической схемы.
Практическая значимость. Экспериментально обоснована целесообразность дальнейшего изучения и использования препаратов с антиоксидантным, антигипоксантным, мембраностабилизирующим действием, регуляторов энергетического обмена, а также их комбинаций, при иммунодефицитных состояниях с патогенетическим гипоксическим компонентом.
Установлена недостаточная эффективность раздельного использования полиненасыщенных фосфолипидов, активаторов энергетического обмена, антиоксидантов и антигипоксантов для коррекции иммунометаболических нарушений при некоторых видах системной и локальной гипоксии.
Доказана возможность коррекции эритроцитарно-тромбоцитарной иммуносупрессии при гипоксии с использованием фосфоглива и эспа-липона.
Выявлено индуцирующее влияние сочетанного использования фосфоглива и эспа-липона, а также изолированного - мексикора, на повышение иммуногенных свойств тяжелых эритроцитов в условиях гипоксии.
Показана взаимосвязь между изменением физико-химических свойств, метаболического статуса эритроцитов и эффективностью фармакологической коррекции иммунометаболических нарушений при отдельных видах гипоксических состояний фармакологическими препаратами различных групп.
Обоснована целесообразность проведения дальнейших исследований по поиску оптимальных сочетаний фармакологических препаратов в качестве средств коррекции иммунометаболических нарушений при различных формах гипоксических состояний.
Клинически обоснованы методы иммунореабилитации в комплексном лечении больных с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза серотонина адипинатом и мексикором.
Разработанные рекомендации внедрены в работу ГМУ Курская областная клиническая больница, МУЗ Городская клиническая больница скорой медицинской помощи г. Курска.
Материалы диссертации включены в рабочие программы ряда кафедр Курского, Российского, Саратовского, Самарского, Волгоградской, Ивановской, Воронежской государственных медицинских университетов и академий и медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Основные виды экспериментальной системной и локальной гипоксии отличаются степенью активации ПОЛ, соотношением угнетения клеточного, гуморального иммунитета и факторов неспецифической защиты, иммуносупрессорным профилем сыворотки крови, дифференцированным изменением продукции стабильных метаболитов NO.
- В условиях изученных видов системной гипоксии установлены нарушения структурно-функциональных свойств эритроцитов, уменьшение энергетического и антиоксидантного потенциала, определяющие различную степень выраженности их иммуносупрессирующей активности.
- Различные механизмы реализации иммуносупрессии при экспериментальной системной гипоксии диктуют необходимость дифференцированного подхода к их фармакологической коррекции.
- Эффективная фармакологическая коррекция иммунометаболических нарушений в условиях экспериментальной гипоксии с использованием мексикора, фосфоглива и гипоксена реализуется при участии сывороточных и спленоцитарных факторов, легких и тяжелых эритроцитов.
- Фармакологическая эффективность антиоксидантов (мексикор), регуляторов энергетического обмена (эспа-липон) и мембраностабилизаторов (фосфоглив) при экспериментальной системной гипоксии обусловлена эритроцитарно-тромбоцитарными и эритроцитарно-лимфоцитарными взаимодействиями.
- При критической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза развиваются выраженные изменения иммунного статуса, антиоксидантного потенциала и структурно-функциональных свойств эритроцитов.
- Включение серотонина адипината и мексикора в состав терапии критической ишемии нижних конечностей корригирует иммунометаболические нарушения и повышает эффективность проводимого лечения.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II заочной электронной межвузовской научной конференции Вопросы иммунопатологии и иммунореабилитации (Курск, 2005), Российской научной конференции с международным участием Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии (Курск, 2006), Всероссийском симпозиуме Магнитные поля и здоровье человека (Курск, 2007), Международной научной конференции Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины (Паттайя, Тайланд, 2007), IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008), XIII и XV Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Дубай, ОАЭ, 2008, 2010), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), 74-й научной конференции КГМУ, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН: Университетская наука: Теория, практика, инновации (Курск, 2009), X Международном Конгрессе Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, посвященному 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2009), региональной научно-практической конференции Актуальные вопросы научно-практической медицины (Брянск, 2009), Российской научно-практической конференции Инновации в анестезиологии и медицине критических состояний (Курск, 2009), Межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ (Курск, 2009), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), III общероссийской научной конференции Фундаментальные и прикладные исследования в медицине (Сочи, 2010), совместном заседании кафедр фармакологии; клинической фармакологии; хирургических болезней ФПО; хирургических болезней №1; хирургических болезней №2; биологической химии; микробиологии, вирусологии и иммунологии; фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета (2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа, из них 18 н - в рекомендуемых изданиях ВАК РФ и 1 монография, в которых содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 327 страницах машинописного текста, иллюстрирована 68 таблицами и 21 рисунком, состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (9 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 399 отечественных и 193 иностранных источника.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы.
Экспериментальная часть. Объект исследования. Эксперименты выполнены на крысах Вистар массой 180Ц210 г, прошедших карантинный режим вивария ГОУ ВПО КГМУ Росздрава и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Исследования проводились в соответствии с Приказом МЗ РФ от 19.06.2003 г. №267 Правила лабораторной практики в Российской Федерации и принципами, изложенными в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).
Экспериментальные модели гипоксических состояний.
Острое ишемическое поражение печени вызывали оперативным методом под внутрибрюшинным гексеналовым наркозом (30 мг/кг веса) путем пережатия гепатодуоденальной связки после ее инфильтрации 0,5 мл 0,5% раствора новокаина с помощью турникета в течение 20 и 30 минут (Антопольская Е.А., 1988). Рану брюшной полости ушивали послойно и обрабатывали йодопироном. Верификация наступления структурных изменений в ткани печени производилась гистологическими методами. При патоморфологическом исследовании обращали внимание на изменение комплексной микроскопической структуры печени и состояние гепатоцитов в центральных и периферических дольках.
Инфаркт миокарда моделировали у животных под эфирным наркозом. После наступления наркоза крысу фиксировали к операционному столику, снимали исходную электрокардиограмму. Вскрывали грудную клетку и лигировали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии на 1,0-1,5 мм ниже ушка предсердия. После перевязки производили послойное ушивание раны. Послеоперационную рану обрабатывали йодопироном. Развитие экспериментального острого инфаркта миокарда верифицировали электрокардиографически в последующие сутки наблюдения (Коган А.Х., 1979).
В качестве контроля в эксперимент были введены ложнооперированные животные, у которых объем операции ограничивался вскрытием брюшной полости или грудной клетки и послойным ушиванием раны.
Интервальную гипоксическую гипоксию с гиперкапнией вызывали путем помещения крыс в гермокамеры (эксикатор) одинакового объема до появления признаков терминальной стадии гипоксии 1 раз в сутки в течение 5 дней с интервалом в 24 часа (Зеленская К.Л. и др., 2005; Лукьянова Л.Д., 1990).
Острую гемическую гипоксию моделировали следующим способом: после предварительного обильного питья под общим обезболиванием выполняли венесекцию участка бедренной вены одной из задних лапок крысы, затем канюлировали мобилизованную вену и вводили 1 мг гепарина, после чего из кровотока удаляли кровь из расчета 10 мл/кг веса, что приблизительно соответствует 1,8-2,1 мл. Объем циркулирующей жидкости восполняли аналогичным кровопотере объемом 0,9% раствора хлорида натрия (Sapirstein L.A. et al., 1960; Лукьянова Л.Д., 1990).
Гистотоксическую (тканевую) гипоксию моделировали путем пятикратного через 24 часа внутрибрюшинного введения нитропруссида натрия (Na2[Fe(CN)5NO]) в дозе 1 мг/кг веса (Зеленская К.Л. и др., 2005; Лукьянова Л.Д., 1990).
Использование фармакологических препаратов. В работе использовались следующие препараты: мексикор (ООО "ЭкоФармИнвест", Россия); фосфоглив (НИИ Биомедхимии РАМН, Россия), гипоксен (ЗАО Корпорация Олифен, Россия); эспа-липон (Esparma GmbH, Германия) и серотонина адипинат (ЗАО ЛОРР, Россия).
Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского Лекарственные средства и аннотациях по использованию препаратов. Перерасчет доз с человека (средний вес 70 кг) на животных - белых крыс производился в сторону увеличения в 5,9 раз (Фисенко В.П., 2000). Первое введение препаратов в экспериментальных моделях с однократным острым воздействием (ишемия печени, ЭИМ и ОГГ) выполнялось за 1 час до манипуляции. Исключение составлял фосфоглив в модели острой ишемии печени. Препарат начинали вводить за пять суток до операции, что было обусловлено тяжестью оперативного вмешательства и особенностями фармакокинетики препарата, чтобы обеспечить его стабильный уровень в плазме крови к моменту моделирования ишемии печени. При многократных гипоксических воздействиях (ГипГ и ГТГ) первое и последующие введения препаратов осуществляли за 1 час до помещения крыс в гермокамеры или введения нитропруссида натрия соответственно (табл. 1).
Таблица 1
Схемы применения препаратов
№ п/п | Модель гипоксии / ишемии | Препарат | Способ введения | Однократная доза, мг/кг | Интервал между введением, часов | Количество дней |
Ишемия печени | Мексикор | Внутрибрюшинно | 10 | 24 | 5 | |
Фосфоглив | Внутрибрюшинно | 200 | 24 | 10 (5 до и 5 после ишемии) | ||
Ишемия миокарда | Мексикор | Внутрибрюшинно | 20 | 24 | 10 | |
Гипоксен | Внутрижелудочно | 80 | 8 | 10 | ||
ГипГ | Мексикор | Внутрибрюшинно | 10 | 24 | 5 | |
ОГГ | Эспа-липон | Внутрибрюшинно | 50 | 24 | 5 | |
Фосфоглив | Внутрибрюшинно | 200 | 24 | 5 | ||
ГТГ | Мексикор | Внутрибрюшинно | 10 | 24 | 5 | |
Гипоксен | Внутрижелудочно | 80 | 8 | 5 |
Схемы иммунизации. Оценка интенсивности развития иммунного ответа и функционально-метаболической активности лейкоцитов периферической крови. Крыс иммунизировали однократным внутрибрюшинным введением эритроцитов барана в дозе 2х109 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность гуморального иммунного ответа оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (Мальберг К., Зигль Э., 1987). Гиперчувствительность замедленного типа у крыс индуцировали внутрибрюшинным введением 1х108 ЭБ в 0,5 мл 0,15 М раствора натрия хлорида. О выраженности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена (Федосеева В.Н. и др., 1993).
Активность и интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, выделенных из периферической крови, оценивали по фагоцитарному индексу, фагоцитарному числу и индексу активности фагоцитов (Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991; Фримель Г., 1987). Активность кислородзависимых бактерицидных систем нейтрофилов определяли в реакции восстановления нитросинего тетразолия, спонтанной и стимулированной зимозаном, с расчетом функционального резерва (ВиксманаМ.Е., МаянскийаА.Н., 1979; ЩербаковаВ.И., 1989). В части экспериментов для выяснения механизмов нарушения метаболической активности нейтрофилов периферической крови их кислородзависимую активность оценивали фотометрически по показателям оптической плотности в спонтанной, стимулированной неопсонизированным зимозаном, стимулированной опсонизированным зимозаном реакции восстановления нитросинего тетразолиям и вычисляли коэффициенты функционального резерва - КАо (отношение НСТ инд. оз к НСТ-сп.), КАн (НСТ-инд. нз к НСТ-сп.) и КО (отношение НСТ-инд. оз к НСТ-инд. нз) (Зинкин В.Ю. и др., 2004).
Выделение, фракционирование и определение иммуномодулирующей активности эритроцитов. Донорами крови служили животные опытных и контрольных групп. Кровь получали из яремной вены под эфирным наркозом у животных не получавших препараты: при ГипГ, ОГГ, ГТГ на 5-е сутки, при ЭИМ - на 10-е сутки; у крыс получавших лекарственную терапию - через 24 часа после последнего введения препарата(ов). Собирали пул крови от 5-6 однородных по опыту животных.
Кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН=7,4), содержащем 0,9% хлорида натрия и 3% декстрана Т-500, с последующей очисткой с помощью НВS-целлюлозы в Na-фосфатном буфере (Beutler E., 1985). Далее эритроциты фракционировали в градиенте концентрации агарозы (Иванов В.П. и др., 2004). Получали фракции легких эритроцитов (плотность ниже 1,079 г/см3) и тяжелых эритроцитов с плотностью, превышающей 1,117. В некоторых экспериментах эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Кобозев Т.В. и др., 1978).
Иммуномодулирующие свойства легкой и тяжелой фракций эритроцитов, определяли путем трехкратного (с интервалом в 24 часа) внутривенного введения (по 108 клеток/кг массы) интактным реципиентам, которых иммунизировали ЭБ в последний день введения аллогенных эритроцитов (Конопля А.А., 2004).
Выделение тромбоцитов и определение их иммуномодулирующей активности. Гепаринизированную кровь центрифугировали 5 мин при 180g. После расслоения крови на плазму, лейкоцитарный слой и эритроциты, отбирали первые два слоя и центрифугировали в течение 10 мин при 600 g. Супернатант представлял собой плазму, обогащенную тромбоцитами. Для получения плазмы, дефицитной по тромбоцитам, обогащенную тромбоцитами плазму центрифугировали в течение 20 мин при 1000g (Коган А.Х. и др., 1992). После выделения плазмы, дефицитной по тромбоцитам, и тромбоцитов, взвесь последних пропускали через колонку с сефарозой 2В, получая концентрированную и очищенную взвесь тромбоцитов (Ермолаева Т.А. и др., 1991).
Плазму, обогащенную и дефицитную по тромбоцитам, использовали для обработки ЛЭ (1х107 клеток инкубиронвали в 1 мл плазмы в течение 1 часа при 37 С). Тромбоциты и ЛЭ инкубировали в плазме крови (1х108 тромбоцитов плюс 1х107 эритроцитов в 1 мл плазмы, 30 минут при 37 С). Иммуномодулирующая активность инкубата определялась путем трехкратного (с шестичасовым интервалом) внутривенного введения здоровым аллогенным реципиентам, которых иммунизировали ЭБ при последнем поступлении инкубата. Иммуномодулирующую активность тромбоцитов определяли путем их однократного внутривенного введения (по 108 клеток/кг массы) интактным аллогенным реципиентам с одновременной иммунизацией ЭБ (Быстрова Н.А., 2003).
Получение супернатантов спленоцитов, прилипающих и не прилипающих к стеклу. Фракционирование белков супернатантов и определение их иммуномодулирующей активности. Клетки селезенки фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (Дерфлинг П., Вихнер З., 1987). Прилипающие к стеклу клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (Родионов С.В. и др., 1985). Клетки культивировали в среде 199 (107 клеток на 1 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики в течение 4-6 часов и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу спленоцитов, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных (Конопля А.И., Прокопенко Л.Г., 1982). Белки СПКС и СНКС после диализа и концентрирования фракционировали на сефадексе G-100 (Детерман Г., 1970). Получали три фракции белков: фракция I содержала белки с ММ более 100 кД, фракция II - белки с ММ 50-60 кД и фракция III - белки с ММ менее 15 кД. Концентрацию белков во фракциях устанавливали по Бредфорду, используя краситель Кумаси G-250 (Шишкин C.С., 1989).
Иммуномодулирущую активность СПКС и СНКС оценивали путём однокрантного внутрибрюшинного введения интактным аллогенным реципиентам из расчета 5 мг белка супернатанта на 1 кг массы тела одновременно с иммунизацией ЭБ. Для определения иммуномодулирующей активности, выделенные хроматографические фракции вводили однократно внутрибрюшинно аллогенным реципиентам из расчета 2 мг белка на 1 кг массы тела, одновременно с иммунизацией ЭБ (Быстрова Н.А., 2003).
Выделение мононуклеаров и выявление их роли во взаимодействии модифицированных эритроцитов с клетками селезенки. имфоциты периферической крови выделяли по В.Н. Федосеевой с соавт. (1993) и вводили крысам-реципиентам внутривенно однократно в дозе 108 клеток/кг одновременно с иммунизацией ЭБ. Клетки культивировали с ауто- или аллогенными эритроцитами в соотношении клеток 1:2 (5х107 лимфоцитов и 1х108 эритроцитов в 3 мл среды 199). Активность надосадочной жидкости определяли путем добавления ее к взвеси нейтрофилов (1х107 клеток на 100 мкг белка супернатанта) и последующего определения показателей ФМА нейтрофилов (Быстрова Н.А., 2003).
Фракционирование сывороточных белков и исследование их иммуномодулирующих свойств. Разделение белков сыворотки крови первоначально осуществлялось солевым методом на осадочные и надосадочные с дальнейшим фракционированием на сефадексе G-150 и G-75 соответственно. Для исследования влияния сыворотки крови, ОБ и НБ на формирование ГИО и ГЗТ на ЭБ последние вводили внутрибрюшинно, одновременно с антигеном из расчета 200 мг белка на кг, а их гель-хроматографические фракции в дозе 50 мг белка на кг массы тела лабораторного животного (Базарная Т.В., 1996).
Определение иммуносупрессорных соединений крови. Иммуносупрессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке липопротеидов низкой плотности (Меньшиков В.В., 1987) и гликозаминогликанов (Мурашов Б.Ф. и др., 1986), -1-антипротеаз и -2-макроглобулинов (Русаков С.В., Кубышкин А.В., 1995).
Исследование противоишемической активности. Размеры зон некроза и ишемии у крыс определяли через 4 часа после окклюзии коронарной артерии при помощи дифференциального индикаторного метода (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 1989).
Исследование сорбционных свойств эритроцитов. Для определения сорбционной способности эритроцитов по отношению к витальным красителям 1амл суспензии эритроцитов смешивали в пробирке с 3 мл 0,025% раствора метиленового синего, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. При длине волны 630 нм определяли оптическую плотность исходного раствора и надосадочной жидкости в единицах экстинкции по отношению к изотоническому раствору натрия хлорида (Тогайбаев А.А. и др., 1988). Количество поглощенного красителя выражали в процентах по формуле (1):
ССЭ = 100 Ц 100 С2 / С1 , где (1)
ССЭ - сорбционная способность эритроцитов в % поглощенного красителя;
С1 - оптическая плотность раствора до инкубации с эритроцитами в единицах экстинкции;
С2 - оптическая плотность раствора после инкубации с эритроцитами в единицах экстинкции.
Исследовали также сорбционную емкость гликокаликса эритроцитов для альцианового синего, который является катионным красителем фталоцианиновой группы и обладает способностью связываться с гликолипидами, гликопротеидами и кислыми мукополисахаридами. Количество поглощенного альцианового синего рассчитывали в граммах на 1 эритроцит (Семко Г.А., 1998).
Исследование биохимических параметров сыворотки крови, эритроцитов, лимфоцитов, гепатоцитов. В сыворотке крови экспериментальных животных определяли концентрацию билирубина, активность аспартат- и аланинаминотрансфераз, щелочной фосфатазы, гаммаглутамилтранспептидазы, холестерина по Ильку, бета-липопротеидов по Бурштейну, общего белка, протромбинового индекса, фибриногена, мочевины (Меньшиков В.В., 1987). Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами с использованием наборов реагентов Био-ЛА-Тест Плива-Лахема, Чехия.
Интенсивность ПОЛ в сыворотке крови оценивали по содержанию малонового диальдегида (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) и диеновых конъюгатов жирных кислот (Стальная И.Д., 1977). Антиоксидантный статус оценивали по активности в сыворотке крови каталазы (Королюк М.А. и др., 1988). В сыворотке крови также определяли концентрацию стабильных метаболитов оксида азота (Голиков П.П., 2004).
Интенсивность ПОЛ в эритроцитах оценивали по содержанию в них ацилгидроперекисей и МДА (Бенисевич В.И., Идельсон Л.И., 1973). Энергообеспечение эритроцитов оценивали по содержанию в них аденозинтрифосфата и 2,3-бисфосфоглицерата (Виноградова И.Л. и др., 1980), а их антиоксидантный статус по активности СОД и глутатионредуктазы (Макаренко Е.В., 1988).
Содержание фруктозо-2,6-дифосфата в лимфоцитах определяли по способности этого соединения активировать пирофосфатзависимую фосфофруктокиназу (Коровкин Б.Ф. и др., 1999).
В супернатанте из печени крыс традиционными методами определяли концентрацию МДА и ДК с дальнейшим перерасчетом на 1 грамм ткани печени.
Клиническая часть исследования основана на анализе результатов обследования и лечения 38 пациентов с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей в стадии критической ишемии без трофических расстройств и гангрены (согласно критериям Европейского консенсуса, 1992 г., соответствуя III стадии хронической артериальной недостаточности по классификации А.В. Покровского) с наличием нереконструируемого поражения артериального русла нижних конечностей - критерии включения. Пациенты находились на лечении в отделении сосудистой хирургии ГМУ Курская областная клиническая больница с 2008 по 2010 год (главный врач - к.м.н. М.А. Кожухов, зав. отделением - В.П. Еськов). Перед включением в клиническое обследование у всех пациентов получено информированное согласие. Протокол клинического исследования был утвержден этическим комитетом ГОУ ВПО Курский государственный медицинский университет Росздрава.
Клиническое изучение было открытым, стандартизированным. Все поступающие в отделение пациенты с критической ишемией нижних конечностей были распределены на 2 группы. 1-я группа (группа сравнения) - 20 пациентов - получала стандартную фармакотерапию (пентоксифиллин, ксантинола никотинат, ацетилсалициловая кислота). Во 2-й группе (основной) у 18 пациентов стандартную терапию в течение 10 дней дополняли серотонина адипинатом (10 мг на 200 мл физиологического раствора внутривенно капельно в течение 1-2 часов) и мексикором (800 мг в сутки, разделенные на три внутривенных введения: 200-300-300 мг с интервалом в 8 часов на 100 мл 0,9% раствора NaCl).
Данные клинические группы были стандартизированы по полу (мужчины), стадии хронической артериальной недостаточности (III), уровню атеросклеротической окклюзии. Средний возраст в группе сравнения составил 57,42,3 года, а в основной группе - 60,22,8 года.
Сопутствующая соматическая патология диагностирована у 84,2% больных с преобладанием ишемической болезни сердца - 68,4%. В анамнезе острое нарушение мозгового кровообращения было у 7,6% пациентов. Значительный вес среди сопутствующей соматической патологии занимала артериальная гипертензия - 28,9%. В анамнезе оперативное лечение по поводу облитерирующего атеросклероза было выполнено у 44,7% пациентов, реконстуктивные вмешательства выполнялись у 26,3%, поясничная симпатэктомия 10,5%, ампутация конечности и пальцев стопы - 7,9%. У остальных 55,3% пациентов имело место многоуровневое атеросклеротическое поражение, верифицированное при ультразвуковом триплексном сканировании и ангиографии и препятствовавшее выполнению реконструктивных операций.
Декомпенсация артериального кровотока у пациентов основной группы характеризовалась наличием болей в покое (100%), усиливающихся в ночное время с необходимостью опускания ишемизированной конечности с кровати для уменьшения их интенсивности (89%) и развитием отека стопы и голени (67%). У всех пациентов группы сравнения также отмечено наличие ишемической боли покоя, необходимость опускать нижнюю конечность с кровати вниз была у 85% человек, а отечность стопы - у 75%.
Учитывая важную роль в развитии атеросклероза хронического иммунного воспаления, для оценки вклада начальных патогенетических изменений, необусловленных непосредственно ишемическим компонентом, в иммунный дисбаланс, при последующем прогрессировании процесса вплоть до стадии критической ишемии, на базе отделения сосудистой хирургии ГМУ Курская областная клиническая больница изучен иммунный статус у 17 пациентов с облитерирующим атеросклерозом, хронической артериальной недостаточностью I-IIА стадии (3 группа).
Для сравнительной оценки клинической эффективности сочетанного использования серотонина адипината и мексикора ретроспективно по историям болезни отобрана группа больных в количестве 19 человек, находившихся ранее на лечении в отделении сосудистой хирургии ГМУ Курская областная клиническая больница с 2003 по 2007 год, получавших монотерапию серотонина адипинатом и удовлетворяющих критериям включения (4 группа).
Критериями исключения из исследования были: наличие гангрены нижней конечности, отсутствие регистрируемого кровотока при ультразвуковой доплерографии одновременно в дистальных отделах передней и задней большеберцовых артерий, сахарный диабет, аутоиммунные заболевания, ревматологические болезни за исключением деформирующего остеоартроза, тяжелая сердечная недостаточность, острое нарушение мозгового кровообращения или острый инфаркт миокарда в клинике, выраженные нарушения функции печени и почек, острые тромбозы артерий и вен, бронхиальная астма, индивидуальная непереносимость препаратов, недавно перенесенные инфекционные заболевания, прием иммуностимулирующих препаратов.
Контрольные значения иммунологических, биохимических, флоуметрических показателей были получены на группе из 25 практически здоровых добровольцев (5 группа) (табл. 2).
Методы обследования больных включали осмотр пациентов с проведением регистрации клинической симптоматики, проб Оппеля, Коллинза-Виленского, Гольдфлама, изменение интенсивности чувства боли при сдавлении стопы, определение поверхностной температуры стопы.
Инструментальные исследования были представлены реовазографией (Рео-Спектр НС 005, Нейрософт, Россия), ультразвуковой доплерографией (ALOKA-4000, Япония), лазерной доплеровской флоуметрией (ЛАКК-02, НПП УЛАЗМАФ, г. Москва), транскутанной оксиметрией (лTСM 2, RADIOMETER, Дания).
Оценивали среднее систолическое давление на уровне лодыжки или в первом межпальцевом промежутке и его отношение к систолическому давлению на плече - лодыжечно-плечевой индекс. Доплерометрически на ПББА и ЗББА определяли полуколичественные и количественные показатели регионарной внутрисосудистой гемодинамики: индекс периферического сопротивления; пульсационный индекс; пиковая систолическая скорость; средняя диастолическая скорость; усредненная во времени максимальная скорость кровотока; объемная скорость кровотока. Показатели локальной микроциркуляции исследовались с помощью реовазографии (до и после нитроглицериновой пробы) и лазерной доплеровской флоуметрии при проведении окклюзионной пробы (Куропаткин А.И., Сидоров В.В., 2005).
Клиническую эффективность лечения оценивали по разработанному ранее на базе Курского государственного медицинского университета способу (Лазаренко В.А. и др., 2005).
Таблица 2
Распределение больных по способу проводимого лечения
№ | Характеристика | Количество человек в группе |
1. | Больные с КИНК атеросклеротического генеза без трофических расстройств и гангрены, получавшие традиционную терапию (пентоксифиллин, ксантинола никотинат, ацетилсалициловая кислота) | 20 |
2. | Больные с КИНК атеросклеротического генеза без трофических расстройств и гангрены, получавшие с традиционной терапией серотонина адипинат (10 мг/сутки) и мексикор (800 мг/сутки) внутривенно капельно. | 18 |
3. | Больные облитерирующим атеросклерозом, хронической артериальной недостаточностью I-IIА стадии, поступавшие для оперативного лечения. | 17 |
4. | Больные с КИНК атеросклеротического генеза без трофических расстройств и гангрены, получавшие с традиционной терапией СЕРОТОНИНА АДИПИНАТ (10 мг/сутки). | 19 |
ИТОГО | 74 | |
5 | Контрольная группа практически здоровых доноров добровольцев | 25 |
Иммунологические и биохимические методы исследования. В работе фенотип лимфоцитов определялся методом иммунофлюоресцентного анализа с помощью моноклональных антител (ООО Сорбент, г. Москва) к структурам CD3 (общие Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (цитотоксические клетки), CD16 (NK-клетки), CD95 (индукторный фактор апоптоза), CD22 (В-лимфоциты).
Содержание IgG, IgM, IgA в плазме крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, используя диагностический набор ООО НП - Медицинская иммунология (г. Москва). Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов в плазме крови определяли спектрофотометрическим методом по V. Haskova (1977).
Количественная оценка уровней ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-4, ИЛ-10, интерферона-, интерферона-, С3, С4-компонентов системы комплемента, С1-ингибитора и фактора Н проводилась с помощью тест-систем (ООО Цитокин, г. Санкт-Петербург) методом твердофазного иммуноферментного анализа.
ФМА нейтрофилов, интенсивность ПОЛ, активность ферментов антиоксидантной защиты плазмы крови, сорбционные свойства эритроцитов оценивали по методикам, использованным в экспериментальной части работы.
Статистическая обработка материала. Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической и ошибки средней (Mm). Гипотеза о нормальности распределения признаков внутри группы проверялась с использованием критериев Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Однородность групповых дисперсий проверялась с помощью критерия Ливиня. Достоверность статистических различий средних арифметических величин оценивалась при множественных сравнениях - с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA): критериев Ньюмена-Кейлса, Стьюдента с поправкой Бонферрони; Крускала-Уоллиса; при парных сравнениях - с использованием критериев Стьюдента, Манна-Уитни и Уилкоксона. Корреляционные взаимосвязи устанавливали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Сопряженность номинальных, порядковых переменных выявляли, применяя критерии 2 Пирсона, Фишера. Статистически значимыми считали различия с p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Гепатопротекторные, антиоксидантные и иммуномодулирующие эффекты мексикора и фосфоглива в условиях острого ишемического поражения печени. Двадцатиминутное пережатие ГДС приводило к развитию цитолитического синдрома, проявлявшегося резким увеличением активности трансаминаз (АСТ, АЛТ), ГГТП, билирубина. Максимальный подъем исследуемых показателей происходил на 5-е сутки после ишемического воздействия. Биохимические проявления цитолитического синдрома наблюдались в течение 15 суток после пережатия ГДС и коррелировали с сохранявшейся в эти же сроки стойкой иммуносупрессией и активацией ПОЛ в гепатоцитах.
Выраженность и продолжительность синдрома гепатодепрессии была незначительной: к 5-м суткам отмечалось достоверное снижение концентрации фибриногена в 1,3 раза, ПТИ и общего белка 1,3 и 1,2 раза соответственно. Однако уже к 10-м суткам показатели не отличались от контрольных, за исключением уровня фибриногена.
Острая тридцатиминутная ишемия печени приводила к развитию синдромов цитолиза, холестаза и гепатодепрессии, активации ПОЛ, возникновению вторичной иммуносупрессии, росту уровня мочевины, сохранявшимся на протяжении 15-20 суток после пережатия ГДС. К тридцатым суткам после операции происходила полная нормализация метаболических нарушений, возникающих вследствие острой ишемии печени (табл. 3). Максимальные изменения
Примечание: определение иммунологических и биохимических показателей проведено в лаборатории иммуноферментного анализа НИИ Экологической медицины Курского государственного медицинского университета и клинической лаборатории МУЗ ГКБ №4 г. Курска, за что выражаем сотрудникам соответствующих подразделений глубокую признательность.
Таблица 3
Динамика показателей иммунной реактивности, цитолитического, холестатического, гепатодепрессивного синдромов и ПОЛ в гепатоцитах при тридцатиминутной ишемии печени (Мm)
№ п/п | Показатели | Интактные животные | Ложная операция | Время после пережатия ГДС | |||
5-е сутки | 10-е сутки | 15-е сутки | 20-е сутки | ||||
Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | Группа 4 | Группа 5 | Группа 6 | ||
АОК | 25,72,1 | 21,82,0 | 6,50,5*1,2 | 11,00,9*1-3 | 16,21,2*1-4 | 18,51,4*1-4 | |
РМЛ | 5,30,4 | 4,90,4 | 2,00,15*1,2 | 3,20,2*1-3 | 4,00,3*1,3 | 5,20,4*3-5 | |
ФРН | 21,11,8 | 18,71,6 | 8,80,9*1,2 | 11,71,0*1-3 | 14,11,1*1-3 | 16,11,3*1,3,4 | |
ИАФ | 0,720,07 | 0,610,05 | 0,120,01*1,2 | 0,220,02*1-3 | 0,350,03*1-4 | 0,510,04*1,3-5 | |
ДК гепатоцитов | 0,930,08 | 1,070,09 | 2,820,21*1,2 | 2,060,17*1-3 | 1,390,11*1-4 | 1,010,08*3-5 | |
МДА гепатоцитов | 7,90,7 | 9,40,8 | 26,12,0*1,2 | 21,91,7*1-3 | 17,01,3*1-4 | 12,50,9*1-5 | |
АСТ | 0,760,05 | 0,870,07 | 6,380,51*1,2 | 4,840,39*1-3 | 2,870,22*1-4 | 1,780,14*1-5 | |
АЛТ | 0,580,04 | 0,650,05 | 3,070,25*1,2 | 2,740,21*1,2 | 1,980,15*1-4 | 1,370,10*1-5 | |
ГГТП | 0,910,06 | 1,020,07 | 4,430,32*1,2 | 4,310,34*1,2 | 2,490,18*1-4 | 1,450,11*1-5 | |
Билирубин | 6,10,3 | 6,40,3 | 17,20,9*1,2 | 12,30,6*1-3 | 8,40,4*1-4 | 6,80,35*3-5 | |
ЩФ | 5,800,35 | 5,920,36 | 9,500,6*1,2 | 8,610,55*1,2 | 6,520,42*3,4 | 6,270,40*3,4 | |
Холестерин | 3,910,25 | 3,820,23 | 2,430,17*1,2 | 2,850,19*1,2 | 3,670,23*3,4 | 3,850,25*3,4 | |
Бета-ЛП | 3,10,2 | 3,00,2 | 5,60,3*1,2 | 4,20,27*1-3 | 2,90,18*3,4 | 3,00,21*3,4 | |
Фибриноген | 3,430,21 | 3,320,19 | 1,900,12*1,2 | 2,110,13*1,2 | 3,130,18*3,4 | 3,360,20*3,4 | |
ПТИ | 79,53,1 | 77,93,0 | 53,52,0*1,2 | 44,21,7*1-3 | 64,12,6*1-4 | 77,33,0*3-5 | |
Общий белок | 87,63,3 | 86,13,2 | 70,22,9*1,2 | 85,13,2*3 | 88,13,3*3 | 87,13,2*3 | |
Мочевина | 3,750,21 | 3,830,21 | 7,10,41*1,2 | 6,80,39*1,2 | 4,90,26*1-4 | 3,800,23*3-5 | |
Примечание. Здесь и в последующих таблицах: * - достоверность различий средних арифметических величин, р<0,05; цифры рядом со звездочкой обозначают по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.
всех изучаемых показателей наблюдались в первые пять суток, при этом их абсолютные значения превышали аналогичные при двадцатиминутной ишемии печени.
Таким образом, увеличение в 1,5 раза длительности ишемического воздействия на гепатоциты сопровождалось более выраженными иммунометаболическими нарушениями, что коррелировало с морфологическими перестройками, наблюдавшимися при гистологическом исследовании: в первые пять суток отмечалось расширение площади печеночной паренхимы с дистрофическими и некробиотическими изменениями и прогрессирующее углубление расстройств кровотока, усиление интерстициального отека. При нарастающей дискомплексации долек в зоне триад, в центральных зонах печеночных долек происходили разрывы стенок портальных и центральных вен. Цитоплазма гепатоцитов набухала, выявлялось сочетание гидропической, зернистой дистрофии и липоидоза. К пятым суткам в гепатоцитах практически отсутствовали ШИК-позитивные гранулы, появлялись отдельные клетки с явлениями коагуляционного некроза, а между печеночными балками и дольками появлялось большое количество лейкоцитов. На десятые сутки в препаратах встречались участки мостовидных некрозов, очаговая лейкоцитарная инфильтрация. К пятнадцатым суткам происходило появление ШИК-позитивных гранул в гепатоцитах, отмечалась организация некротических очагов. На двадцатые сутки увеличивалось количество ШИК-положительных веществ, формировались большие участки гидропической и зернистой дистрофии.
В условиях двадцатиминутного ишемического поражения печени мексикор и фосфоглив независимо друг от друга предотвращали развитие нарушений иммунометаболического гомеостаза, при этом, снижая летальность к пятым суткам с 17 до 9% (p<0,05). Однако при тридцатиминутном пережатии ГДС изолированное применение изучаемых препаратов было не столь эффективным.
Введение мексикора к пятым суткам после тридцатиминутной ишемии печени стимулировало развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, уменьшало выраженность нарушений функционально-метаболической активности нейтрофилов и интенсивность ПОЛ в гепатоцитах: количество АОК в селезенке, РМЛ, ФРН и ИАФ увеличивались в 2,9; 2,2; 1,8 и 4,1 раза, а содержание ДК и МДА в ткани печени снижалось в 1,8 и 1,9 раза соответственно по сравнению с группой животных, которые не получали препарат, однако полной нормализации изучаемых показателей не отмечалось. Иммуномодулирующие и антиоксидантные эффекты фосфоглива были достоверно менее выраженными, по сравнению с мексикором (табл. 4).
Мексикор у животных с ишемией печени уменьшал выраженность биохимических синдромов цитолиза, холестаза и гепатодепрессии: отмечалась нормализация содержания общего белка, холестерина, бета-ЛП, мочевины, активности ЩФ; достоверно снижался уровень билирубина в 1,9 раза и активность АСТ, АЛТ, ГГТП в 3,1; 2,2 и 2,8 раза соответственно, повышался протромбиновый индекс в 1,3 раза и содержание фибриногена в 1,5 раза по сравнению с группой животных, которые не получали препарат. Фосфоглив корригировал, но не нормализовал ни один из биохимических показателей, уступая в
Таблица 4
Влияние мексикора и фосфоглива на состояние иммунометаболического гомеостаза в условиях тридцатиминутной ишемии печени (пятые сутки) (Мm)
№ п/п | Показатели | Интактные животные | Ишемия печени | Ишемия печени | ||
+ мексикор | + фосфоглив | + мексикор и фосфоглив | ||||
Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | Группа 4 | Группа 5 | ||
АОК | 25,72,1 | 6,50,5*1 | 19,11,4*1,2 | 12,80,9*1-3 | 25,41,9*2-4 | |
РМЛ | 5,30,4 | 2,00,15*1 | 4,40,3*2 | 3,20,2*1-3 | 5,20,3*2,4 | |
ФРН | 21,11,8 | 8,80,9*1 | 15,91,3*1,2 | 12,51,05*1-3 | 20,91,8*2-4 | |
ИАФ | 0,720,07 | 0,120,01*1 | 0,500,04*1,2 | 0,310,02*1-3 | 0,690,06*2-4 | |
ДК гепатоцитов | 0,930,08 | 2,820,21*1 | 1,550,11*1,2 | 2,170,16*1-3 | 0,960,08*2-4 | |
МДА гепатоцитов | 7,90,7 | 26,12,0*1 | 13,81,2*1,2 | 19,81,5*1-3 | 8,30,7*2-4 | |
АСТ | 0,760,05 | 6,380,51*1 | 2,090,14*1,2 | 1,540,11*1-3 | 0,920,07*2-4 | |
АЛТ | 0,580,04 | 3,070,25*1 | 1,380,1*1,2 | 1,020,08*1-3 | 0,680,05*2-4 | |
ГГТП | 0,910,06 | 4,430,32*1 | 1,610,11*1,2 | 1,430,10*1,2 | 1,080,07*2-4 | |
Билирубин | 6,10,3 | 17,20,9*1 | 9,20,6*1,2 | 8,40,5*1,2 | 6,20,3*2-4 | |
ЩФ | 5,800,35 | 9,50,6*1 | 6,00,37*2 | 7,650,45*1,2 | 5,840,34*2,4 | |
Холестерин | 3,910,25 | 2,430,17*1 | 3,780,24*2 | 3,070,18*1,2 | 3,960,26*2,4 | |
Бета-ЛП | 3,10,2 | 5,60,3*1 | 3,10,18*2 | 4,20,26*1-3 | 2,90,2*2,4 | |
Фибриноген | 3,430,21 | 1,900,12*1 | 2,760,17*1,2 | 2,610,17*1,2 | 3,400,20*2-4 | |
ПТИ | 79,53,1 | 53,52,0*1 | 67,32,7*1,2 | 64,12,5*1,2 | 80,23,2*2-4 | |
Общий белок | 87,63,3 | 70,22,9*1 | 86,53,3*2 | 75,62,9*1,3 | 88,13,5*2,4 | |
Мочевина | 3,750,21 | 7,10,41*1 | 4,120,23*2 | 5,470,31*1-3 | 3,730,20*2,4 | |
совокупной гепатопротекторной активности при ишемии печени мексикору. При тридцатиминутной ишемии мексикор уменьшал летальность с 33% до 17%, фосфоглив - до 24%, а их сочетание - до 9% (р<0,05).
Сочетанное применение мексикора и фосфоглива оказалось наиболее оптимальным и позволило полностью нивелировать иммунометаболические нарушения, возникающие к пятым суткам при тридцатиминутной ишемии печени (табл. 4).
Результаты исследований свидетельствуют о высокой иммунометаболической эффективности сочетанного применения регулятора энергетического обмена и антиоксиданта (мексикора) с полиненасыщенными фосфолипидами (фосфоглив) в условиях острого ишемического поражения печени. Введение фосфоглива с мексикором оказывает более выраженный гепато- и иммунопротекторный эффект, чем применение каждого из препаратов в отдельности.
Роль гуморальных факторов сыворотки крови и селезенки в реализации иммунометаболических эффектов мексикора и фосфоглива при ишемии печени. Сыворотка животных, перенесших тридцатиминутную ишемию печени, проявляла выраженные иммуносупрессирующие свойства при введении аллогенным интактным крысам. При разделении сывороточных белков на фракции иммуносупрессирующей активностью при аллогенном переносе здоровым животным обладали: I фракция (ММ более 75 кД) НБ КПИП, а также I (ММ более 150 кД) и II (ММ 65-85 кД) фракции ОБ КПИП.
Иммуносупрессорную активность I фракции НБ отменяло только сочетанное введение КПИП мексикора и фосфоглива. I фракция НБ крыс, получавших только один из препаратов, сохраняла способность супрессировать иммунную реактивность, индуцированную ЭБ, и ФМА нейтрофилов. Сочетанное введение мексикора и фосфоглива КПИП также предотвращало появление иммуносупрессорных свойств у обеих фракций ОБ. Изолированное применение данных препаратов уменьшало супрессорную активность I фракции ОБ в отношении показателей ГИО, ГЗТ и ФМА нейтрофилов и практически не влияло на свойства II фракции (табл. 5).
Реализация иммунного ответа в норме и в условиях патологии во многом зависит от наличия и активности гуморальных факторов, выделяемых спленоцитами (Беляева С.С., 2004). В связи с этим нами изучены спленоцитарные гуморальные факторы КПИП.
Введение СКС КПИП аллогенным здоровым реципиентам угнетало развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ. При фракционировании клеток селезенки КПИП по способности прилипать к стеклу, установлено, что СПКС обладал выраженным иммуносупрессорным эффектом, а СНКС не проявлял иммуномодулирующей активности. При этом введение аллогенным животным СПКС КПИП при температуре +4-100С, оказывало выраженный иммуносупрессорный эффект, а СПКС при +20-280С и +32-370С были иммунологически не активными.
Таблица 5
Иммуномодулирующая активность фракций ОБ и НБ КПИП в условиях применения мексикора и фосфоглива (Мm)
№ п/п | Условия опыта | АОК | РМЛ | ФИ | ФЧ | НСТ-сп. | НСТ-инд. |
Контроль | 25,72,1 | 5,30,4 | 43,43,8 | 1,70,2 | 12,10,8 | 33,22,5 | |
Введение I фракции НБ КПИП | 12,51,0*1 | 3,70,25*1 | 31,52,4*1 | 1,10,1*1 | 9,30,7*1 | 23,21,5*1 | |
+ мексикор + фосфоглив | 25,32,0*2 | 5,20,4*2 | 42,83,7*2 | 1,60,2*2 | 11,70,8*2 | 34,12,6*2 | |
+ мексикор | 14,41,2*1,3 | 4,10,3*1,3 | 33,82,5*1,3 | 1,20,1*1 | 10,00,7*1 | 25,91,6*1,3 | |
+ фосфоглив | 13,81,1*1,3 | 3,90,3*1,3 | 32,12,6*1,3 | 1,10,1*1,3 | 9,60,6*1 | 24,41,5*1,3 | |
Введение I фракции ОБ КПИП | 9,40,7*1 | 2,90,2*1 | 23,11,7*1 | 0,70,1*1 | 8,50,6*1 | 20,31,5*1 | |
+ мексикор + фосфоглив | 22,62,0*6 | 5,20,35*6 | 43,13,7*6 | 1,650,2*6 | 11,90,8*6 | 34,02,5*6 | |
+ мексикор | 17,51,5*1,6,7 | 3,70,3*1,6,7 | 31,32,6*1,6,7 | 1,150,1*1,6,7 | 10,80,7*6 | 26,91,7*1,6,7 | |
+ фосфоглив | 13,11,1*1,6-8 | 3,60,25*1,6,7 | 29,82,3*1,6,7 | 1,00,1*1,6,7 | 9,80,6*1,7 | 26,11,6*1,6,7 | |
Введение II фракции ОБ КПИП | 14,61,1*1,6 | 3,80,3*1,6 | 31,42,5*1,6 | 0,80,1*1 | 9,30,7*1 | 24,61,6*1,6 | |
+ мексикор + фосфоглив | 26,12,1*10 | 5,40,4*10 | 44,83,9*10 | 1,850,2*10 | 12,60,9*10 | 34,82,6*10 | |
+ мексикор | 19,21,6*1,10,11 | 4,40,3*11 | 34,02,6*11 | 1,20,1*1,10,11 | 10,40,7*11 | 27,11,6*1,11 | |
+ фосфоглив | 18,51,5*1,10,11 | 4,00,35*1,11 | 32,62,4*1,11 | 1,10,1*1,10,11 | 9,50,6*1,11 | 25,81,8*1,11 | |
Сочетанное введение фосфоглива и мексикора КПИП отменяло иммуносупрессирующие свойства СПКС при +4-100С, в отношении аллогенных интактных реципиентов, а их раздельное применение достоверно уменьшало способность этого супернатанта вызывать угнетение гуморального и клеточного иммунного ответа на ЭБ (табл. 6).
Таблица 6
Влияние фракций СПКС КПИП, получавших мексикор и фосфоглив, на формирование ГИО и ГЗТ на ЭБ (Мm)
№ п/п | Условия опыта | АОК | РМЛ |
1. | Контроль | 25,72,1 | 5,30,4 |
2. | Введение СПКС интактных крыс | 26,82,2 | 5,40,4 |
3. | Введение СПКС при +4-100С КПИП | 10,20,9*1,2 | 2,90,2*1,2 |
4. | Введение СПКС при +20-280С КПИП | 23,52,1*3 | 5,00,35*3 |
5. | Введение СПКС при +32-370С КПИП | 22,82,0*3 | 5,10,4*3 |
6. | СПКС при +4-100С КПИП + мексикор | 16,11,2*1-5 | 4,00,3*1-5 |
7. | СПКС при +4-100С КПИП + фосфоглив | 14,31,1*1-5 | 3,80,25*1-5 |
8. | СПКС при +4-100С КПИП + мексикор + фосфоглив | 24,12,0*3,6,7 | 5,20,35*3,6,7 |
С учетом того, что в цельном СПКС могут быть как иммуносупрессирующие, так и иммуностимулирующие соединения, были исследованы иммунотропные эффекты гель-хроматографических фракций СПКС КПИП при +4-100С. При этом выраженным иммуносупрессорным эффектом обладала только II фракция СПКС КПИП. Раздельное введение фосфоглива или мексикора КПИП только лишь уменьшало иммуносупрессирующую активность белков II фракции прилипающих спленоцитов в отношении аллогенных интактных реципиентов, полная отмена иммуносупрессирующих свойств отмечалась при сочетанном применении этих двух препаратов (табл. 7).
Изолированное применение фосфоглива и мексикора не приводило к выделению спленоцитами факторов, способных влиять на иммунную реактивность и метаболический статус КПИП. При сочетанном введении изучаемых препаратов КПИП I фракция СПКС при +32-370С, содержащая белки с ММ более 100 кД, приобретала гепатопротекторные свойства и способность уменьшать выраженность ПОЛ в гепатоцитах аллогенных КПИП, полностью не нормализуя изучаемые показатели. III фракции СПКС при +32-370С и СНКС КПИП, содержащие низкомолекулярные белки (ММ 10-15 кД), под влиянием сочетанного применения фосфоглива и мексикора проявляли иммуностимулирующую активность у аллогенных КПИП, также не доводя значений изучаемых показателей до уровня интактных крыс (рис. 1).
Полученные нами результаты в некоторой степени объясняют причины изменения иммунологической реактивности в условиях ишемии печени и показывают возможные точки приложения использованных для коррекции фармакологических препаратов.
Таблица 7
Иммуномодулирующая активность гель-хроматографических фракций белков СПКС КПИП в условиях применения мексикора и фосфоглива (Мm)
№ п/п | Условия опыта | АОК | РМЛ | ФИ | ФЧ | НСТ-сп. | НСТ-инд. |
1. | Контроль | 25,72,1 | 5,30,4 | 43,43,8 | 1,70,2 | 12,10,8 | 33,22,5 |
2. | Введение СПКС интактных крыс | 26,82,2 | 5,40,4 | 41,83,7 | 1,80,25 | 11,40,8 | 33,92,4 |
3. | Введение I фракции СПКС КПИП | 24,32,1 | 5,20,35 | 43,63,9 | 1,650,2 | 12,60,9 | 34,82,6 |
4. | Введение II фракции СПКС КПИП | 8,60,7*1-3 | 2,70,2*1-3 | 22,51,6*1-3 | 0,70,1*1-3 | 8,00,5*1-3 | 19,31,4*1-3 |
5. | Введение III фракции СПКС КПИП | 21,01,9*4 | 4,90,3*4 | 41,03,7*4 | 1,70,2*4 | 13,30,8*4 | 34,42,5*4 |
6. | Введение II фракции СПКС КПИП + мексикор | 16,11,3*1-5 | 3,90,3*1-5 | 32,12,7*1-5 | 1,20,1*1-5 | 9,70,6*1,3-5 | 26,41,8*1-5 |
7. | Введение II фракции СПКС КПИП + фосфоглив | 12,61,2*1-6 | 3,50,2*1-5 | 27,31,8*1-3,5 | 1,00,1*1-5 | 9,40,5*1-3,5 | 24,31,7*1-5 |
8. | Введение II фракции СПКС КПИП + мексикор + фосфоглив | 26,12,2*4,6,7 | 5,50,4*4,6,7 | 44,33,8*4,6,7 | 1,80,2*4,6,7 | 12,90,8*4,6,7 | 34,12,6*4,6,7 |
Примечание. СПКС при +4-100С.
Рис. 1. Роль спленоцитарных факторов в реализации иммунометаболических эффектов мексикора и фосфоглива в условиях ишемии печени.
Иммунометаболические эффекты мексикора и гипоксена в условиях ишемии миокарда и механизмы реализации их иммунотропных эффектов. Течение ЭИМ сопровождалось выраженной и длительной активацией ПОЛ в сыворотке крови, угнетением активности ферментов антиоксидантной системы,
протекающих параллельно с супрессией гуморального, клеточного иммунитета, факторов неспецифической защиты организма на протяжении 10 суток эксперимента. Особенностью этой экспериментальной модели была избыточная активация нейтрофилов в НСТ-тесте, приводившая к неспособности ответить респираторным взрывом на дополнительную стимуляцию антигеном, что проявлялось
уменьшением их ФРН (рис. 2).
Рис. 2. ФМА нейтрофилов крови у животных в различные сроки после ЭИМ
По оси абсцисс: 1 - интактные животные; 2 - 5-е сутки после ЭИМ; 3 - 10-е сутки после ЭИМ; 4 - 20-е сутки после ЭИМ. По оси ординат: % по отношению к группе интактных крыс.
Здесь и в последующих рисунках: * - p<0,05; цифры рядом со звездочкой обозначают по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.
Доказанная клиническая эффективность цитопротекторов мексикора и гипоксена в комплексной терапии острого коронарного синдрома явилась основой для изучения их иммунометаболических эффектов в эксперименте.
Использование в течение десяти суток мексикора при ЭИМ позволяет предотвратить развитие супрессии гуморального и клеточного иммунного ответа, угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов и гиперактивацию кислородзависимых бактерицидных систем в них. При этом отмечается стойкое снижение концентрации продуктов ПОЛ в сыворотке крови, коррелирующее с повышением активности ферментов антиоксидантной защиты. Гипоксен в аналогичных условиях нормализовал ФРН и ФЧ, стимулировал развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ, повышал ФИ, ИАФ, снижал показатели НСТ-сп. и НСТ-инд., не доводя, однако, их до уровня интактных животных. Антиоксидантная активность гипоксена при ЭИМ также была ниже, чем у мексикора (рис. 3). Летальность при использовании мексикора и гипоксена достоверно снижалась с 29% до 9% и 17% соответственно. Для объяснения различной иммунометаболической эффективности мексикора и гипоксена в условиях ЭИМ, нами изучены их противоишемические эффекты с использованием дифференциального индикаторного метода.
Рис. 3. Коррекция иммунометаболических нарушений в условиях ЭИМ мексикором и гипоксеном (10-е сутки).
Мексикор не изменял площадь зоны ишемии у подопытных крыс, однако весьма эффективно ограничивал зону некроза. Противоишемический эффект гипоксена был менее выражен, чем у мексикора. Гипоксен также не оказывал статистически достоверного влияния на размер зоны ишемии, которая в основном определяется местом перевязки коронарной артерии. Напротив, отношения зоны некроза к общей массе миокарда и к зоне ишемии под влиянием гипоксена достоверно снижались, но оставались выше, чем аналогичные показатели при применении мексикора (рис. 4).
Рис. 4. Влияние мексикора и гипоксена на размеры ЭИМ у крыс после 4-х часовой окклюзии коронарной артерии.
Обозначения: 1 - % зоны ишемии к общей массе миокарда; 2 - % зоны некроза к общей массе миокарда; 3 - % отношения зоны некроза к зоне ишемии; * - p<0,05 по отношению к контрольной группе; - p<0,05 по отношению к группе животных, получавших мексикор.
При изучении механизма реализации иммуномодулирующих эффектов мексикора и гипоксена в условиях ЭИМ установлено, что сыворотка крови и СКС крыс с ЭИМ угнетали развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ. Применение мексикора у крыс с ЭИМ предотвращало появление иммуносупрессорной активности у сыворотки и супернатанта, а гипоксена - лишь достоверно уменьшало степень супрессии иммунной реактивности.
Реперфузионные нарушения с образованием активных форм кислорода и усилением свободнорадикального ПОЛ, сопровождающие ЭИМ, приводят к дезорганизации структуры и функций биологических мембран клеток, в том числе и эритроцитов. Последние способны модулировать функции иммунной системы. В связи с этим нами изучены иммуномодулирующие свойства фракций эритроцитов крыс с ЭИМ при применении мексикора и гипоксена.
Установлено, что ишемия миокарда индуцирует появление иммуносупрессирующих свойств у ЛЭ и не влияет на активность тяжелых клеток. Мексикор отменяет иммуносупрессирующие свойства ЛЭ и индуцирует появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток крыс с ЭИМ. Гипоксен ослабляет супрессирующее влияние ЛЭ в отношении ГИО, ГЗТ и ФМА нейтрофилов и не влияет на свойства ТЭ (табл. 8).
Для выяснения роли соединений сыворотки крови в развитии эритроцитарной иммуносупрессии ЛЭ интактных крыс инкубировали с сывороткой крови животных с ЭИМ и вводили здоровым аллогенным реципиентам. При этом сыворотка крыс с ишемией миокарда индуцировала появление иммуносупрессирующих свойств у ЛЭ интактных крыс в отношении здоровых аллогенных реципиентов. Мексикор отменял, а гипоксен достоверно уменьшал индукцию иммуносупрессирующих свойств у ЛЭ сывороткой крови крыс с ЭИМ.
Таким образом, в основе дифференцированной иммунометаболической эффективности мексикора и гипоксена лежит различное влияние этих препаратов на объем зоны некроза в миокарде, систему антиоксидантной защиты, клеточные и гуморальные механизмы реализации иммуносупрессии.
Таблица 8
Влияние мексикора и гипоксена на иммуномодулирующие свойства эритроцитов крыс при ЭИМ (Мm)
№ п/п | Условия опыта | Показатели | |||
АОК | РМЛ | ФРН | ИАФ | ||
1. | Контроль | 25,72,1 | 5,30,4 | 21,11,8 | 0,720,07 |
Эритроциты крыс с ЭИМ | |||||
2. | Э | 13,11,1*1 | 3,30,25*1 | 12,31,1*1 | 0,230,02*1 |
3. | ТЭ | 25,92,0 | 5,40,45 | 21,01,8 | 0,640,05 |
Эритроциты крыс с ЭИМ, получавших мексикор | |||||
4. | Э | 26,22,2*2 | 5,20,35*2 | 21,51,9*2 | 0,730,06*2 |
5. | ТЭ | 34,52,8*1,3 | 6,70,45*1,3 | 27,42,1*1,3 | 1,271,0*1,3 |
Эритроциты крыс с ЭИМ, получавших гипоксен | |||||
6. | Э | 18,21,5*1,2,4 | 4,20,35*1,2,4 | 15,61,25*1,2,4 | 0,360,03*1,2,4 |
7. | ТЭ | 24,12,2*5 | 5,00,4*5 | 22,41,9*5 | 0,720,06*5 |
Механизмы реализации иммуносупрессии при различных видах системной гипоксии, как точки приложения для фармакологической коррекции. Все три вида изученных нами гипоксических состояний характеризовались развитием разной степени выраженности супрессии гуморального и клеточного иммунного ответа. ОГГ и ГТГ сопровождались значительным снижением уровня ФДФ в лимфоцитах (маркер метаболической активности). При ГТГ эти изменения были наиболее выраженными. Интервальная ГипГ характеризовалась недостоверным уменьшением уровня ФДФ в лимфоцитах. Поэтому, вероятно, в условиях ГипГ супрессия ГИО и ГЗТ на ЭБ обусловлена в большей степени не нарушением метаболизма иммуноцита, а воздействием на него иммуносупрессирующих субстанций (табл. 9).
Снижение показателей НСТ-теста с неопсонизированным зимозаном (более энергоемкий процесс) при параллельном увеличении с опсонизированным в ряду ГипГ-ОГГ-ГТГ, свидетельствовало о том, что при ГипГ роль в угнетении метаболической активности нейтрофилов принадлежит ингибирующему влиянию на их рецепторной аппарат иммуносупрессирующих субстанций, при ГТГ - энергетической составляющей, при ОГГ - сбалансированному влиянию этих компонентов. Угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов было наиболее выраженным при ГТГ и менее выраженным при ОГГ и ГипГ (табл. 9).
При всех видах гипоксий наблюдалось уменьшение активности антиоксидантных ферментов. Статистически достоверное повышение концентрации продуктов ПОЛ и стабильных метаболитов NO отмечалось только при ГипГ и ОГГ. При ГТГ уровень последних наоборот снижался. Доказанной иммуносупрессорной активностью обладают ЛНП, ГАГ и антипротеазы. Каждая форма системной гипоксии характеризовалась своим иммуносупрессорным профилем (табл. 9).
Таблица 9
Иммунометаболические нарушения при основных видах системной гипоксии (5-е сутки) (Мm)
№ п/п | Показатели | Контроль | ГипГ | ОГГ | ГТГ |
Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | Группа 4 | ||
АОК | 25,72,1 | 13,11,2*1 | 9,60,8*1,2 | 15,81,3*1,3 | |
РМЛ | 5,30,4 | 3,40,2*1 | 2,70,2*1,2 | 2,80,25*1,2 | |
ФДФ лимфоцитов | 0,970,09 | 0,890,09 | 0,650,06*1,2 | 0,430,03*1-3 | |
НСТ сп. | 0,840,03 | 0,740,03*1 | 0,710,02*1 | 0,680,02*1 | |
НСТ инд. нз | 1,350,05 | 1,190,04*1 | 1,010,03*1,2 | 0,870,02*1-3 | |
НСТ инд. оз | 1,660,06 | 1,260,04*1 | 1,190,04*1 | 1,310,05*1,3 | |
КАн | 1,630,06 | 1,620,07 | 1,420,05*1,2 | 1,290,04*1-3 | |
КАо | 1,990,08 | 1,710,06*1 | 1,680,06*1 | 1,920,06*2,3 | |
КО | 1,230,05 | 1,070,035*1 | 1,190,045 | 1,510,075*1-3 | |
ФИ | 43,43,8 | 28,72,4*1 | 20,91,7*1,2 | 18,21,5*1,2 | |
ФЧ | 1,70,2 | 1,00,1*1 | 0,80,1*1 | 0,70,07*1,2 | |
ИАФ | 0,720,07 | 0,280,02*1 | 0,160,01*1,2 | 0,120,01*1-3 | |
МДА | 2,40,14 | 5,30,31*1 | 3,60,23*1,2 | 2,20,12*2,3 | |
ДК | 3,90,24 | 8,50,55*1 | 5,80,39*1,2 | 3,60,22*2,3 | |
СОД эритроцитов | 52,13,2 | 30,12,2*1 | 33,22,4*1 | 41,72,9*1-3 | |
Каталаза | 24,81,7 | 13,10,9*1 | 16,41,2*1,2 | 15,81,1*1 | |
НП | 23,91,8 | 37,42,7*1 | 53,13,8*1,2 | 28,12,0*2-3 | |
ГАГ | 0,250,02 | 0,390,03*1 | 0,550,04*1,2 | 0,280,02*2-3 | |
ААП | 25,31,8 | 27,32,1 | 39,12,6*1,2 | 32,82,3*1-3 | |
АМГ | 1,70,13 | 1,90,14 | 3,50,25*1,2 | 2,60,18*1-3 | |
смNO | 4,90,25 | 7,80,44*1 | 6,30,35*1,2 | 4,00,23*1-3 | |
АТФ | 1,80,2 | 1,70,2 | 0,60,1*1,2 | 1,60,15*3 | |
БФГ | 5,60,3 | 5,40,3 | 3,30,2*1,2 | 5,20,25*3 | |
ССЭ | 15,61,1 | 21,21,5*1 | 39,42,9*1,2 | 10,10,7*1-3 | |
СЕГ | 0,950,07 | 1,240,08*1 | 1,560,11*1,2 | 0,750,05*1-3 |
Учитывая существенную роль эритроцитов в развитии иммуносупрессии и реализации иммунотропных эффектов фармакологических препаратов были исследованы их физико-химические, метаболические и иммуномодулирующие свойства при изучаемых видах гипоксии. При ОГГ отмечалось уменьшение в эритроцитах содержания макроэргических соединений. ГипГ и ОГГ характеризовались увеличением сорбционной способности эритроцитов, а ГТГ наоборот снижением (табл. 9). ЛЭ крыс с ГипГ и ОГГ обладали иммуносупрессирующей активностью в отношении интактных аллогенных реципиентов. При этом сыворотка крови крыс при всех видах системной гипоксии приобретала иммуносупрессирующие свойства. Однако индуцировала появление аналогичной активности у ЛЭ интактных крыс только сыворотка при ГипГ и ОГГ.
При исследовании уровня корреляционной взаимосвязи между сорбционными свойствами и энергообеспечением эритроцитов при различных видах гипоксии установлены достоверно высокие уровни корреляции между ССЭ, СЕГ и иммуносупрессорной активностью ЛЭ при ГипГ и ОГГ, между уровнем АТФ, БФГ и иммуносупрессией, вызываемой ЛЭ при ОГГ. При ГТГ достоверно значимых корреляционных взаимосвязей не выявлено (табл. 10).
Установленная нами многокомпонентность иммунных нарушений, возникающих при различных видах гипоксии, диктует поиск препаратов для коррекции возникающих расстройств с различными механизмами действия и точками приложения на системном и клеточном уровнях.
Таблица 10
Уровень корреляции (r) между сорбционными свойствами эритроцитов, их энергообеспечением и выраженностью иммуносупрессирующих
эффектов легких эритроцитов при различных видах гипоксии
№ п/п | Показатели | ГипГ | ОГГ | ГТГ | |||
АОК | РМЛ | АОК | РМЛ | АОК | РМЛ | ||
1. | ССЭ | -0,94* | -0,9* | -0,92* | -0,85* | -0,06 | -0,16 |
2. | СЕГ | -0,89* | -0,78* | -0,89* | -0,82* | -0,13 | -0,06 |
3. | АТФ | 0,12 | 0,05 | 0,89* | 0,85* | 0,14 | 0,09 |
4. | БФГ | 0,06 | 0,08 | 0,86* | 0,92* | 0,17 | 0,09 |
Примечание. * - p<0,05.
Фармакологическая коррекция иммунометаболических нарушений при основных видах системной гипоксии. Участие типовых патологических процессов - гипоксии и стресса - в патогенезе различных заболеваний ставит перед современной медициной проблему повышения резистентности организма к этим повреждающим факторам.
С учетом установленных нами метаболических нарушений и механизмов реализации иммуносупрессии при различных видах системной гипоксии для коррекции при ГипГ был использован мексикор, при ОГГ - эспа-липон, фосфоглив и их комбинация, при ГТГ - гипоксен, мексикор, а так же их сочетание.
При ГипГ использование мексикора приводило к нормализации практически всех исследуемых показателей за исключением активности СОД. При ОГГ фосфоглив корригировал показатели иммунного ответа, уменьшал продукцию стабильных метаболитов NO, ЛНП, ГАГ, снижал сорбционные свойства эритроцитов. Эспа-липон нормализовал метаболическую активность лимфоцитов, эритроцитов и уровень стабильных метаболитов NO, уменьшал сорбционные свойства эритроцитов и концентрацию большей части иммуносупрессирующих метаболитов. При сочетанном использовании фосфоглив оказывал протективное влияние на эспа-липон в отношении функции иммуноцитов, гепатоцитов и эритроцитов, что позволяло предотвратить развитие иммунометаболических нарушении при ОГГ. В условиях ГТГ мексикор, и в большей степени гипоксен, корригировали измененные показатели, но их нормализация достигалась только при сочетанном использовании этих препаратов (табл. 11).
Роль эритроцитарно-лимфоцитарных и эритроцитарно-тромбоцитар-ных взаимодействий в реализации иммунотропных эффектов фармаколо-
Таблица 11
Фармакологическая коррекция иммунометаболических нарушений при основных видах системной гипоксии
Показатели Условия | Система иммунитета | ФМА нейтрофилов | Маркеры метаболической иммуносупрессии | Эритроциты | ||||||||
Гуморальный | Клеточный | Метаболическая активность лимфоцитов | МДА и ДК | СОД / Каталаза | смNO | НП и ГАГ | ААП / АМГ | ССЭ | АТФ, БФГ | |||
ГипГ | N | N | N | |||||||||
+ мексикор | Нормализация | Ц | Нормализация | К | Нормализация | Ц | Н | Ц | ||||
ОГГ | ||||||||||||
+ фосфоглив | Коррекция | Ц | Коррекция | Ц | К | Ц | ||||||
+ эспа-липон | Ц | Н | Ц | Н | Коррекция | К | Н | |||||
+ фосфоглив и эспа-липон | Нормализация | |||||||||||
ГТГ | N | N | N | |||||||||
+ гипоксен | Коррекция + | Ц | Ц / К | Н | Ц | Н / Ц | К | Ц | ||||
+ мексикор | Коррекция | Ц | Н / Ц | Н | Ц | Н / К | К | Ц | ||||
+ гипоксен и мексикор | Нормализация | Ц | Нормализация | Ц | Нормализация | Ц | ||||||
Обозначения:
Векторы исходных изменений показателей | Влияние фармакологической коррекции на изучаемые показатели |
- статистически достоверное повышение показателей | Ц - статистически достоверно не влияет |
Ц статистически достоверное снижение показателей | К - достоверная коррекция по отношению к исходным значениям |
N - показатели статистически достоверно не изменялись | Н - нормализация |
гических препаратов при коррекции иммунометаболических нарушений в условиях системной гипоксии. Инкубация эритроцитов крыс, подвергнутых ГипГ с мононуклеарами интактных животных сопровождалась выделением последними субстанций, способных угнетать ФМА нейтрофилов in vitro (рис. 5). Мексикор блокировал этот механизм реализации иммуносупрессии (табл. 12).
Рис. 5. Влияние КСИ эритроцитов интактных крыс или КПГГ с аутологичными или аллогенными мононуклеарами на показатели ФМА нейтрофилов крови интактных животных in vitro.
По оси абсцисс: 1 - показатели интактных животных, принятые за 100%. 2 - КСИ эритроцитов интактных крыс и ауто-мононуклеаров. 3 - КСИ эритроцитов интактных крыс и мононуклеаров КПГГ. 4 - КСИ эритроцитов КПГГ и ауто-мононуклеаров. 5 - КСИ эритроцитов КПГГ и мононуклеаров интактных крыс. По оси ординат: % по отношению к группе интактных животных.
Таблица 12
Влияние мексикора на свойства эритроцитов КПГГ индуцировать
выделение лимфоцитами интактных крыс цитокинов,
угнетающих ФМА нейтрофилов крови (Мm)
Условия опыта | ФИ | ФЧ | НСТ-сп. | НСТ-инд. |
1. Контроль | 43,43,8 | 1,70,2 | 12,10,8 | 33,22,5 |
2. КСИ эритроцитов КПГГ и алло-мононуклеаров | 21,72,0*1 | 0,70,1*1 | 7,90,6*1 | 14,51,3*1 |
3. КСИ эритроцитов КПГГ, получавших мексикор, и алло-мононуклеаров | 38,53,4*2 | 1,50,2*2 | 10,80,7*2 | 29,42,2*2 |
Также под влиянием мексикора ТЭ в условиях ГипГ при аллогенном переносе индуцировали появление у мононуклеаров иммуностимулирующих свойств и этот механизм реализовался при участии спленоцитарных цитокинов (рис. 6).
При ОГГ иммунотропные эффекты эспа-липона и фосфоглива реализовались при участии ЛЭ и ТЭ, а также тромбоцитов. Фосфоглив не влиял на иммуномодулирующие свойства ЛЭ и индуцировал появление иммуностимулирующих у ТЭ в отношении ФМА нейтрофилов крови. Эспа-липон уменьшал имму-
Рис. 6. Эритроцитарно-лимфоцитарные взаимодействия в реализации иммуномодулирующих эффектов мексикора в условиях ГипГ.
носупрессирующие свойства ЛЭ и не влиял на ТЭ. При совместном введении фосфоглива и эспа-липона ЛЭ теряли иммуносупрессирующие свойства, а тяжелые приобретали способность стимулировать развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ, ФМА нейтрофилов при аллогенном переносе (рис. 7).
Рис. 7. Влияние эритроцитов КПОГГ, получавших эспа-липон и фосфоглив, на ФМА нейтрофилов, развитие ГИО и ГЗТ у интактных крыс.
По оси абсцисс: 1 - контроль; 2 - эритроциты КПОГГ; 3 - эритроциты КПОГГ, получавших фосфоглив; 4 - эритроциты КПОГГ, получавших эспа-липон; 5 - эритроциты КПОГГ, получавших фосфоглив и эспа-липон. По оси ординат: % по отношению к группе интактных животных.
В условиях ОГГ активированные тромбоциты приобретали свойства угнетать развитие ГИО и ГЗТ. Иммуносупрессирующие свойства возникали у эритроцитов интактных крыс при взаимодействии их с тромбоцитами КПОГГ или плазмой КПОГГ обогащенной тромбоцитами. Эспа-липон и фосфоглив уменьшали выраженность иммуносупрессирующих свойств тромбоцитов при ОГГ. Для выяснения точки приложения эспа-липона и фосфоглива в механизме отмены эритроцитарно-тромбоцитарной иммуносупрессии изучили их влияние на супрессорную активность инкубатов тромбоцитов и эритроцитов интактных крыс в сыворотке животных с ОГГ. При этом фосфоглив отменял способность тромбоцитов интактных крыс, а эспа-липон их ЛЭ реагировать появлением иммуносупрессирующей активности в выше обозначенном инкубате (табл. 13).
Таблица 13
Влияние эспа-липона и фосфоглива на активность клеточных компонентов системы реализации иммуносупрессирующего эффекта ОГГ (Мm)
№ п/п | Условия опыта | АОК | РМЛ |
Контроль | 25,72,1 | 5,30,4 | |
Введение инкубата тромбоцитов и эритроцитов интактных крыс с сывороткой КПОГГ | 11,2±0,9*1 | 2,7±0,2*1 | |
Введение инкубата эритроцитов интактных крыс, сыворотки КПОГГ и тромбоцитов интактных крыс, получавших: | |||
Фосфоглив | 24,3±1,9*2 | 5,0±0,35*2 | |
Эспа-липон | 12,8±1,0*1,3 | 2,8±0,2*1,3 | |
Введение инкубата тромбоцитов интактных крыс, сыворотки КПОГГ и эритроцитов интактных крыс, получавших: | |||
Фосфоглив | 10,4±0,9*1,3 | 2,7±0,2*1,3 | |
Эспа-липон | 25,1±2,2*2,4,5 | 5,2±0,4*2,4,5 | |
Таким образом, под влиянием фосфоглива, вероятно, предотвращается активация тромбоцитов сывороточными соединениями (возможно, продуктами ПОЛ и окислительно-измененными ЛНП). Механизм действия эспа-липона, вероятно, связан с нормализацией энергообеспечения эритроцитов, модификацией эпитопных структур мембраны эритроцитов и уменьшением сорбционных свойств, следствием чего является снижение способности этих клеток к кооперативным взаимодействиям с сывороточными субстанциями и тромбоцитами.
Иммунометаболические эффекты и антиишемическая активность сочетанного применения серотонина адипината и мексикора в комплексной терапии больных с критической ишемией нижних конечностей. Изучены показатели иммунного и метаболического гомеостаза у пациентов с начальными стадиями облитерирующего атеросклероза и КИНК при поступлении в стационар. Если в начальных стадиях заболевания отмечалась тенденция к формированию дисбаланса в иммунной системе, отражавшая его аутоиммунный патогенез: незначительное повышение уровней ЦИК, IgG, ФНО-, ИНФ-, ИЛ-8, при снижении СD3, С3-компонента комплемента и умеренной активации нейтрофилов в НСТ-тесте, то в стадии КИНК наблюдалось развитие выраженного вторичного иммунодефицита Т- и В-клеточного звена, угнетение ФМА нейтрофилов, в плазме крови определялся избыток IgG и A, ЦИК, высокие концентрации провоспалительных цитокинов и их антагонистов, наблюдалась активация системы комплемента и ее ингибиторов, возрастала интенсивность ПОЛ, при одновременном снижении активности ферментов антиоксидантной защиты, повышались сорбционные свойства эритроцитов (табл. 14).
Таблица 14
Показатели иммунного и оксидантного статуса у больных начальными стадиями облитерирующего атеросклероза и КИНК (Мm)
№ п/п | Показатель | Здоровые добровольцы | Начальные стадии облитерирующего атеросклероза | КИНК |
1 | 2 | 3 | ||
CD3 | 58,24,3 | 46,83,4*1 | 31,52,4*1,2 | |
CD4 | 42,83,1 | 52,73,9 | 23,11,7*1,2 | |
CD8 | 25,12,1 | 21,41,6 | 9,50,7*1,2 | |
CD22 | 15,01,2 | 16,21,3 | 9,30,6*1,2 | |
CD16 | 12,81,0 | 11,90,9 | 9,70,7*1,2 | |
CD95 | 9,10,8 | 9,60,7 | 15,21,1*1,2 | |
ИАФ | 3,220,21 | 2,960,20 | 1,610,13*1,2 | |
ФРН | 26,72,2 | 33,92,4*1 | 17,61,3*1,2 | |
IgM | 1,200,11 | 1,270,10 | 1,160,09 | |
IgG | 9,720,6 | 13,50,97*1 | 16,51,3*1 | |
IgA | 1,890,14 | 2,130,16 | 2,970,22*1,2 | |
ЦИК | 69,2 3,8 | 100,77,5*1 | 134,99,6*1,2 | |
С3 | 90,86,3 | 72,35,1*1 | 265,421,5*1,2 | |
С4 | 8,30,6 | 7,50,5 | 21,31,7*1,2 | |
С1-инг. | 405,330,3 | 362,626,1 | 485,336,6*2 | |
Фактор Н | 31,11,4 | 34,52,1 | 110,58,0*1,2 | |
ФНО- | 21,81,7 | 34,92,3*1 | 74,85,4*1,2 | |
ИЛ-1 | 119,88,3 | 141,811,7 | 361,325,8*1,2 | |
ИЛ-1 | 5,80,4 | 6,50,45 | 20,41,8*1,2 | |
ИЛ-6 | 69,54,8 | 82,05,6 | 146,911,1*1,2 | |
ИЛ-8 | 50,13,7 | 70,64,8*1 | 131,88,7*1,2 | |
ИЛ-4 | 17,61,5 | 20,91,6 | 29,32,1*1,2 | |
ИЛ-10 | 29,72,3 | 31,52,2 | 22,41,5*1,2 | |
ИНФ- | 32,62,2 | 30,52,1 | 43,63,2*1,2 | |
ИНФ- | 101,57,5 | 127,98,4*1 | 246,818,3*1,2 | |
МДА | 3,50,2 | 4,20,4 | 7,20,5*1,2 | |
Каталаза | 12,40,7 | 14,80,9*1 | 7,90,4*1,2 | |
ССЭ | 29,71,6 | 34,11,8 | 47,22,0*1,2 |
Изучение влияния традиционной терапии на иммунометаболические нарушения при критической ишемии позволило установить, что она корригирует 7 из 25 исследованных показателей иммунного статуса и не влияет на состояние про- и антиоксидантного баланса, сорбционные свойства эритроцитов. Включение в состав комплексной консервативной терапии серотонина адипината и мексикора через 10 суток позволило нормализовать 14 показателей и корригировать 11: CD8, CD95, ИАФ, Фактор Н, С4, ИНФ- и -, ИЛ-1,1, IgA и M. Исследуемая комбинация препаратов восстанавливала активность каталазы и нормализовала концентрацию МДА в плазме крови, а так же ограничивала повышение сорбционных свойств эритроцитов (рис. 8).
Рис. 8. Иммунометаболические эффекты серотонина адипината и мексикора у больных КИНК на фоне традиционной терапии.
В основе иммунометаболических эффектов изученной комбинации при критической ишемии, могут лежать прямые иммунотропные влияния и антиоксидантные свойства. Однако эффективность иммунореабилитации при критической ишемии должна определяться степенью улучшения параметров локальной внутрисосудистой гемодинамики и микроциркуляции. При этом традиционная терапия не влияла на первые и лишь незначительно улучшала отдельные показатели второй. Поэтому транскутанное напряжение кислорода на стопе и голени хоть и повышалось, но было статистически не значимым. Использование серотонина адипината и мексикора улучшало основные показатели, характеризующие локальную внутрисосудистую гемодинамику, по-видимому, за счет включения коллатеральной компенсации, а также микроциркуляцию, в том числе ее интегральный показатель - резерв капиллярного кровотока. Отражением вышеописанных процессов являлось достоверное увеличение транскутанного напряжения кислорода на стопе и голени (рис. 9).
Рис. 9. Изменения показателей отражающих локальную внутрисосудистую гемодинамику и микроциркуляцию у больных КИНК, получавших серотонина адипинат и мексикор, в сравнении с традиционной терапией.
Примечание: М исх. - среднее значение показателя микроциркуляции в перфузионных единицах до окклюзии; М оккл. - показатель микроциркуляции в процессе окклюзии; ПМ max - максимальное значение ПМ в процессе развития реактивной постокклюзионной гиперемии; РК - резерв кровотока, отношение ПМ max к М исх. выраженное в процентах; Т max - интервал времени от момента снятия окклюзии до достижения ПМ max.
Улучшение кровоснабжения нижних конечностей отражалось в быстроте купирования ишемических болей покоя, как одного из важнейших показателей определяющих качество жизни пациентов. Под влиянием серотонина адипината и мексикора к 10 суткам болевой синдром сохранялся у 16% больных, против 45% - при традиционной терапии (p<0,05). Исследуемая комбинация в более короткие сроки позволяла уменьшить его интенсивность вплоть до полного купирования. Проанализированы ближайшие исходы лечения больных в основной и группе сравнения: при этом положительных результатов удалось достигнуть у 55% пациентов получавших традиционную терапию и у 84% на фоне лечения серотонина адипинатом и мексикором. Ретроспективный анализ эффективности изолированного применения серотонина адипината в стандартизированной группе показал эффективность у 68% больных (p<0,05 по отношению к сочетанному использованию препаратов).
Таким образом, использование мексикора с серотонина адипинатом в комплексной терапии КИНК повышает предельную эффективность последнего, лимитированную невозможностью реконструкции сосудистого русла, истощением резервов коллатеральной компенсации и микроциркуляции у данной группы больных, за счет присоединения его метаболических эффектов, в том числе энергизирующих и антиоксидантных. Это позволяет добиться клинической ремиссии у большего количества больных при минимальном изменении значений инструментальных показателей. Об этом свидетельствует перераспределение ближайших результатов лечения от неудовлетворительных (отсутствие динамики + ухудшение) к положительным (рис. 10).
Рис. 10. Результаты различных стратегий консервативной терапии КИНК.
Примечание: *- р<0,05 по отношению к группе получавшей только традиционную терапию.
Заключение. Сопоставляя данные литературы и результаты собственных исследований, можно прийти к заключению о том, что различные виды гипоксии характеризуются возникновением состояния, которое можно условно назвать энергозависимым иммунодефицитом. Основанием для такого заключения служит возможность эффективной коррекции иммунологических функций путём применения соединений, превалирующей функцией которых является регуляция энергетического обмена. Обращает на себя внимание возможность иммунокоррекции (с различной степенью эффективности) при различных формах нарушения энергетического обмена с помощью соединений, регулирующих гликолиз, цикл трикарбоновых кислот, работу окислительной цепи митохондрий и обладающих антиоксидантными, антигипоксантными и мембраностабилизирующими свойствами. Это свидетельствует о взаимосвязанности и взаимокомпенсации энергодонорных процессов на уровне отдельных клеток и организма в целом.
Основной точкой приложения в реализации иммунотропных эффектов исследованных препаратов было предотвращение активации перекисного окисления липидов в органах мишенях гипоксии и выделения ими субстанций способных не только самостоятельно угнетать функцию иммуноцитов, но индуцировать появление таких же свойств у эритроцитов (рис. 11). Мексикор, эспа-липон, фосфоглив и сочетание эспа-липона с фосфогливом уменьшали сорбционные свойства эритроцитов. Последняя комбинация также нормализовала их энергетический статус. Эти изменения препятствовали модификации эритроцитов иммуносупрессирующими субстанциями и приобретению ими аналогичных свойств. Фосфоглив предотвращал активацию тромбоцитов, а в сочетании с эспа-липоном отменял иммуносупрессорную активность эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов. Кроме того, исследуемые препараты препятствовали гиперпродукции NO, способного оказывать прямое цитотоксическое действие на иммуноциты, а также улучшали метаболический статус лимфоцитов. Иммуностимулирующие эффекты мексикора и комбинации эспа-липона с фосфогливом реализовывались при участии ТЭ (рис. 11).
Комбинация серотонина адипината и мексикора в условиях КИНК препятвует возникновению гипоксии большого массива мышечной массы, за счет устранения вазоплегии, улучшения энергетического обмена в ишемизированных клетках, ингибирования ПОЛ со снижением сорбционных свойств эритроцитов и повреждающего действия его продуктов на сосудистый эндотелий, улучшая реологические свойства крови и, в конечном итоге, предотвращая формирование порочного круга, усугубляющего ишемию и иммунометаболические расстройства (рис. 12).
Рис. 12. Принципы и механизмы фармакологической коррекции иммунометаболических нарушений при КИНК атеросклеротического генеза.
Все изложенное свидетельствует об универсальности корригирующего действия регуляторов энергетического обмена и обосновывает перспективность изучения эффективности биоэнергетической иммуномодуляции при различных состояниях организма, характеризующихся митохондриальными дисфункциями.
ВЫВОДЫ
- Системная гипоксия и локальная ишемия сердца и печени приводят к развитию супрессии гуморального и клеточного иммунного ответа, нарушению функционально-метаболической активности нейтрофилов. В основе нарушений функции иммуноцитов при интервальной гипоксической гипоксии лежат имуносупрессорные рецепторные влияния, при гистотоксической - уменьшение энергопродукции в клетке, при острой гемической гипоксии - вклад этих факторов сбалансирован.
- Иммуносупрессорный потенциал сыворотки крови при основных видах системной гипоксии характеризуется следующими профилями: при гемической - увеличение концентрации липопротеидов низкой плотности, гликозаминогликанов, -2-макроглобулина, -1-антитрипсина, при гипоксической - липопротеидов низкой плотности, гликозаминогликанов, при гистотоксической - -2-макроглобулина, -1-антитрипсина.
- При локальной ишемии печени и миокарда, интервальной гипоксической и острой гемической гипоксии активируются процессы перекисного окисления липидов, снижается активность ферментов антиоксидантной защиты. В условиях гистотоксической гипоксии уровень продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови не изменяется, а активность ферментов снижается. Интервальная гипоксическая и острая гемическая гипоксия характеризуются повышением в плазме крови концентрации стабильных метаболитов оксида азота, а гистотоксическая - снижением.
- При интервальной гипоксической и острой гемической гипоксии повышаются сорбционные свойства эритроцитов, емкость их гликокаликса, при гистотоксической - эти показатели снижаются. Гемическая гипоксия характеризуется снижением энергообеспечения эритроцитов и антиоксидантного потенциала. Гипоксическая и гемическая гипоксии индуцируют появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов.
- Иммуномодулирующие и гепатопротекторные эффекты мексикора, фосфоглива и гипоксена, а также их комбинаций при ишемии печени и миокарда реализуются при участии сывороточных и спленоцитарных факторов, легких и тяжелых эритроцитов. При ишемии печени фармакологическая эффективность коррекции иммунных и метаболических нарушений уменьшалась в ряду: мексикор (10 мг/кг/сутки) + фосфоглив (200 мг/кг/сутки) мексикор (10 мг/кг/сутки) фосфоглив (200 мг/кг/сутки). В условиях ишемии миокарда иммунометаболические эффекты мексикора (20 мг/кг/сутки) были более выражены, чем у гипоксена (240 мг/кг/сутки).
- При гипоксической гипоксии мексикор в дозе 10 мг/кг/сутки снижал в плазме крови содержание продуктов перекисного окисления липидов, стабильных метаболитов оксида азота, липопротеидов низкой плотности, гликозаминогликанов, сорбционные свойства эритроцитов и нивелировал явления метаболической иммуносупрессии.
- Иммуномодулирующие эффекты мексикора (10 мг/кг/сутки) при интервальной гипоксической гипоксии опосредуются мононуклеарами крови. Легкие эритроциты животных, подвергнутых гипоксической гипоксии, индуцируют выделение мононуклеарами цитокинов, супрессирующих функционально-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов крови. Мексикор (10 мг/кг/сутки) отменяет супрессирующие свойства легких эритроцитов и повышает резистентность к ним полиморфноядерных лейкоцитов животных в условиях интервальной гипоксической гипоксии. Иммуностимулирующие свойства модифицированных мексикором тяжелых эритроцитов и прилипающих к стеклу спленоцитов опосредуются мононуклеарами периферической крови.
- Сочетанное применение эспа-липона (50 мг/кг/сутки) и фосфоглива (200 мг/кг/сутки) нормализует показатели гуморального и клеточного иммунитета, функционально-метаболическую активность нейтрофилов, восстанавливает энергетический и антиоксидантный потенциал эритроцитов, уменьшает их сорбционные свойства, предотвращает накопление в сыворотке крови соединений с иммуносупрессирующими свойствами, проявляет выраженные гепатопротекторные эффекты, отменяет иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов и индуцирует появление иммуностимулирующей активности у тяжелых. Фосфоглив оказывает селективное влияние на протективную активность эспа-липона в отношении функций иммуноцитов и эритроцитов при острой гемической гипоксии.
- Появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов крыс при острой гемической гипоксии обусловлено их взаимодействием с тромбоцитами и метаболитами сыворотки крови. Основой отмены эритроцитарно-тромбоцитарной иммуносупресии являются свойства фосфоглива предотвращать активацию тромбоцитов сывороточными соединениями, а эспа-липона увеличивать энергообеспечение эритроцитов с изменением эпитопных структур их мембраны и уменьшением сорбционной емкости.
- В условиях гистотоксической гипоксии мексикор (10 мг/кг/сутки), гипоксен (240 мг/кг/сутки) корригируют, а их сочетание нормализует формирование иммунного ответа, показатели функциональной активности нейтрофилов, активность супероксиддисмутазы и каталазы, сорбционные свойства эритроцитов, повышает концентрацию в плазме крови стабильных метаболитов оксида азота и уменьшает - -2-макроглобулина и -1-антитрипсина.
- Критическая ишемия нижних конечностей атеросклеротического генеза характеризуется наличием иммунодефицита по Т-звену иммунитета, дисбалансом показателей гуморальной защиты, повышением уровня CD95, про- и противовоспалительных цитокинов, компонентов системы комплемента и их ингибиторов, супрессией функционально-метаболической активности нейтрофилов, активацией перекисного окисления липидов, повышением сорбционных свойств эритроцитов.
- У пациентов с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза применение серотонина адипината в сочетании с мексикором в составе комплексной консервативной терапии улучшает клиническую эффективность лечения, уменьшает число неудовлетворительных результатов, и, в отличие от традиционной терапии, нормализует 63% из исследованных показателей иммунного и антиоксидантного статуса, при этом корригируя остальные.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Использовать сочетание серотонина адипината и мексикора в составе комплексной консервативной терапии критической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза по разработанной схеме: мексикор в дозе 800 мг/сутки, разделенной на три внутривенных введения (200-300-300 мг) с интервалом в 8 часов на 100 мл физиологического раствора и серотонина адипинат - 10 мг на 200 мл физиологического раствора внутривенно капельно ежедневно в течение 10 суток.
Исследовать эффективность предложенной комбинации препаратов (мексикор и серотонина адипинат) для лечения критической ишемии нижних конечностей при синдроме диабетической стопы.
Рекомендовать проведение клинических исследований о целесообразности сочетанного парентерального применения препаратов фосфоглив и мексикор для профилактики повреждений гепатоцитов при плановых оперативных вмешательствах сопровождающихся прекращением кровоснабжения этого органа с последующим его восстановлением, например в трансплантологии.
Исследовать в клиническом аспекте эффективность комбинации фосфоглива и эспа-липона при остром геморрагическом шоке в составе комплексной посиндромной терапии.
Изучить фармакологические эффекты различных сочетаний антиоксидантов, антигипоксантов, регуляторов энергетического обмена и мембраностабилизаторов фосфолипидной природы при гипоксических состояниях для определения их оптимальных комбинаций наиболее эффективно корригирующих иммунометаболические нарушения.
Провести клиническую проверку использования мексикора как эффективного способа иммунореабилитации при состояниях, характеризующихся развитием гипоксии любого генеза.
Исследовать фармакологическую эффективность при различных видах гипоксических состояний препаратов селективно влияющих на метаболический путь L-аргинин/NO в условиях избытка и дефицита оксида азота.
Использовать в учебном процессе медицинских вузов знания о характере и степени иммунометаболических нарушений при различных видах локальной и системной гипоксии, а также варианты их фармакологической коррекции.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Николаев, С.Б. Антиоксидантная и гепатопротекторная активность мексикора в условиях ишемии печени / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова // Материалы II заочной электронной межвузовской научной конференции Вопросы иммунопатологии и иммунореабилитации (15-30 ноября 2005 г., г. Курск) - Курск, 2005. - С.36-37.
- Николаев, С.Б. Гипоксен как модулятор гуморального иммунного ответа в условиях гипоксии гепатоцитов / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова // Материалы Российской научной конференции с международным участием Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии (25-27 января 2006 г., г. Курск) - Курск, 2006. - С. 319-321.
- Николаев, С.Б. Состояние энергетического гомеостаза гепатоцитов в условиях острой ишемии печени / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, О.Б. Николаева // Успехи современного естествознания. - 2008. - №2. - С.109.
- Николаев, С.Б. Лазерная модуляция иммунологических эффектов, вызываемых мексикором при гипоксической гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, Р.А. Нетяга // Труды Всероссийского симпозиума Магнитные поля и здоровье человека (18 декабря 2007 г., г. Курск) - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2007. - С.65-68.
- Николаев, С.Б. Взаимодействие эритроцитов, мононуклеаров крови и спленоцитов в реализации иммуномодулирующего эффекта теплового воздействия и лазерного облучения при гипоксической гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, Р.А. Нетяга // Труды Всероссийского симпозиума Магнитные поля и здоровье человека (18 декабря 2007 г., г. Курск) - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2007. - С.68-74.
- Николаев, С.Б. Коррекция иммунных нарушений при гипоксической гипоксии / С.Б. Николаев // Аллергология и иммунология. Ц 2008. Ц Т.9, №1. Ц С.164-165.
- Николаев, С.Б. Иммуномодулирующие эффекты мексикора в условиях гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова // Вестник новых медицинских технологий. Ц 2008. Ц Т.XV, №1. Ц С.207-210.
- Николаев, С.Б. Механизм реализации иммуносупрессии в условиях гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Системный анализ и управление в биомедицинских системах.н нЦ 2008. Ц Т.7, №2. Ц С.479-481.
- Николаев, С.Б. Роль гуморальных факторов сыворотки крови и селезенки в развитии иммуносупрессии при ишемии печени / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. Ц 2008. нЦ Т.7, №2. Ц С.314-317.
- Николаев, С.Б. Эритроцитарная реализация иммуномодулирующих эффектов фосфоглива и эспа-липона при острой гемической гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Аллергология и иммунология. нЦ 2008. Ц Т.9, №3. Ц С.272.
- Николаев, С.Б. Коррекция иммунометаболических нарушений при острой гемической гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Российский иммунологический журнал. Ц 2008. Ц Т. 2(11), №2-3. Ц С. 277.
- Конопля, А.И. Коррекция иммунометаболических нарушений при остром ишемическом поражении печени / А.И. Конопля, С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. Ц 2009. Ц Т.8, №1. Ц С. 21-25.
- Николаев, С.Б. Иммунометаболические эффекты фосфоглива при ишемии печени / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, Р.А. Нетяга // Университетская наука: Теория, практика, инновации. Сборник трудов 74-й научной конференции КГМУ, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2009. - Т.I. - С.128-131.
- Николаев, С.Б. Иммуномодулирующие и антиоксидантные эффекты гипоксена в условиях экспериментального инфаркта миокарда / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Аллергология и иммунология. Ц 2009. Ц Т.10, №2. Ц С. 286.
- Роль тромбоцитарно-эритроцитарного взаимодействия в развитии иммуносупрессии при острой гемической гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля, Р.А. Нетяга // Российский аллергологический журнал. Ц 2009. - №3. Ц С.254.
- Механизмы нарушения метаболической активности нейтрофилов при различных видах гипоксических состояний / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля, Р.А. Нетяга // Медицинская иммунология. Ц 2009. Ц Т.11, №4-5. Ц С.329
- Николаев, С.Б. Иммуносупрессия при различных видах гипоксии и механизмы ее развития / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Вестник новых медицинских технологий. Ц 2009. Ц Т.XVI, №3. Ц С.163-166.
- азаренко, В.А. Эритроцитарно-тромбоцитарный механизм иммуномодулирующих эффектов эспа-липона и фосфоглива при острой гемической гипоксии / В.А. Лазаренко, С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова // Курский научно-практический вестник Человек и его здоровье. Ц 2009. Ц №4. Ц С.20-29.
- Николаев, С.Б. Иммунометаболические эффекты эспа-липона и фосфоглива при острой гемической гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Дальневосточный медицинский журнал. Ц 2009. Ц №4. Ц С.107-109.
- Николаев, С.Б. Роль эритроцитов в развитии иммуносупрессии при различных видах гипоксии / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, Р.А. Нетяга // Сборник научно-практических работ. Актуальные вопросы научно-практической медицины. - Брянск, 2009. - С.237-243.
- Роль гуморальных факторов сыворотки крови и селезенки в реализации иммунометаболических эффектов гипоксена при экспериментальном инфаркте миокарда / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля, Р.А. Нетяга // Материалы межрегиональной научно-практической конференции Инновации в анестезиологии и медицине критических состояний (23 октября 2009 г., г. Курск) - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2009. - С.177-181.
- Николаев, С.Б. Состояние перекисного окисления липидов и образования NO при гипоксической гипоксии и возможности их коррекции / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: Сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2009. - С. 267-269.
- Николаев, С.Б. Коррекция иммунометаболических нарушений в условиях экспериментальной ишемии миокарда / С.Б. Николаев, С.В. Лазаренко // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (25-26 февраля 2010 г., г. Курск) - Том II. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2010. - С. 345-349.
- Николаев, С.Б. Механизмы реализации иммуномодулирующего действия мексикора и гипоксена при экспериментальном остром инфаркте миокарда / С.Б. Николаев, С.В. Лазаренко // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (25-26 февраля 2010 г., г. Курск) - Том II. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2010. - С. 341-345.
- Иммунный статус при ишемии нижних конечностей на фоне облитерирующего атеросклероза / С.Б. Николаев, В.А. Лазаренко, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // International Journal on Immunorehabilitation (Международный журнал по иммунореабилитации). Ц 2010. Ц Т.12, №2. Ц С.140.
- Иммунометаболические нарушения в условиях гипоксии и их фармакологическая коррекция / С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, В.А. Лазаренко, А.И. Конопля - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2010. - 226 с.
- Конопля, А.И. Коррекция иммунометаболических нарушений при гистотоксической гипоксии / А.И. Конопля, С.Б. Николаев, В.А. Лазаренко, Н.А. Быстрова // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. Ц 2010. Ц Т.9, №2. Ц С.285-291.
- азаренко, В.А. Коррекция иммунометаболических нарушений у больных с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза / В.А. Лазаренко, С.Б. Николаев, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Курский научно-практический вестник Человек и его здоровье. Ц 2010. Ц №2. Ц С.77-83.
- Фармакологическая коррекция нарушений локальной внутрисосудистой гемодинамики, микроциркуляции и иммунного статуса у больных критической ишемией нижних конечностей / С.Б. Николаев, В.А. Лазаренко, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Фундаментальные исследования. Ц 2010. Ц №4. Ц С. 63-69.
- Иммуномодулирующие, антиоксидантные и гепатопротекторные эффекты мексикора и фосфоглива при экспериментальном ишемическом поражении печени / С.Б. Николаев, В.А. Лазаренко, Н.А. Быстрова, А.И. Конопля // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2010. - №10. - С.56-58.
- Использование серотонина адипината и мексикора для повышения эффективности консервативной терапии критической ишемии нижних конечностей / С.Б. Никоаев, А.П. Симоненков, В.А. Лазаренко и др. // Врач-аспирант. Ц 2010. Ц Т.42, №5. Ц С.30-40.
Принятые сокращения
ААП | - альфа-1-антитрипсин, мкмоль/л |
АЛТ | - аланинаминотрансфераза, ммоль/ч×л |
АМГ | - альфа-2-макроглобулины, мкмоль/л |
АОК | - антителообразующие клетки, 103/селезенку |
АСТ | - аспартатаминотрансфераза, ммоль/ч×л |
АТФ | - аденозинтрифосфат, мкмоль/мл эритроцитов |
Бета-ЛП | - бета-липопротеиды, г/л |
БФГ | - 2,3-бисфосфоглицерат, мкмоль/мл эритроцитов |
ГАГ | - гликозаминогликаны, г/л |
ГГТП | - гаммаглутамилтранспептидаза, ммоль/ч×л |
ГДС | - гепатодуоденальная связка |
ГЗТ | - гиперчувствительность замедленного типа |
ГипГ | - интервальная гипоксическая гипоксия с гиперкапнией |
ГИО | - гуморальный иммунный ответ |
ГТГ | - гистотоксическая гипоксия |
ДК | - диеновые конъюгаты, ΔD233 на 1 мл, ΔD233/г ткани |
ЗББА | - задняя большеберцовая артерия |
ИАФ | - индекс активности фагоцитов, абс. |
ИЛ-1 | - интерлейкин-1 альфа, пг/мл |
ИЛ-1 | - интерлейкин-1 бета, пг/мл |
ИЛ-4 | - интерлейкин-4, пг/мл |
ИЛ-6 | - интерлейкин-6, пг/мл |
ИЛ-8 | - интерлейкин-8, пг/мл |
ИЛ-10 | - интерлейкин-10, пг/мл |
ИНФ- | - интерферон альфа, пг/мл |
ИНФ- | - интерферон гамма, пг/мл |
КАн | - отношение неопсонизированного НСТ-теста к спонтанной реакции |
КАо | - отношение опсонизированного НСТ-теста к спонтанной реакции |
КИНК | - критическая ишемия нижних конечностей |
КО | - соотношение опсонизированного и неопсонизированнго НСТ-теста |
КПГГ | - крысы, подвергнутые гипоксической гипоксии |
КПИП | - крысы, подвергнутые ишемии печени |
КПОГГ | - крысы, подвергнутые острой гемической гипоксии |
КСИ | - культуральная среда инкубации |
НП | - липопротеиды низкой плотности, условные единицы |
ПИ | - лодыжечно-плечевой индекс |
Э | - легкие эритроциты |
МДА | - малоновый диальдегид, мкмоль/л, нмоль/г ткани |
ММ | - молекулярная масса, кД |
НБ | - надосадочные белки |
НСТ инд. нз | - стимулированный неопсонизированным зимозаном НСТ-тест, mOD |
НСТ инд. оз | - стимулированный опсонизированным зимозаном НСТ-тест, mOD |
НСТ-инд. | - тест восстановления нитросинего тетразолия, индуцированный, % |
НСТ-сп. | - тест восстановления нитросинего тетразолия, спонтанный, % |
ОБ | - осадочные белки |
ОГГ | - острая гемическая гипоксия |
ПББА | - передняя большеберцовая артерия |
ПОЛ | - перекисное окисление липидов |
ПТИ | - протромбиновый индекс, % |
РВГ | - реовазография |
РМЛ | - разница массы лимфоузлов, мг |
СКС | - супернатант клеток селезенки |
СНСК | - супернатант не прилипающих к стеклу спленоцитов |
СОД | - супероксиддисмутаза, ЕД на мл эритроцитов |
СПКС | - супернатант прилипающих к стеклу спленоцитов |
ССЭ | - сорбционная способность эритроцитов, % |
СЕГ | - сорбционная емкость гликокаликса, 10-12 г/эритроцит |
ТЭ | - тяжелые эритроциты |
Фактор Н | - компонент системы комлемента, нг/мл |
ФДФ | - фруктозо-2,6-дифосфат, пМ/106 лимфоцитов |
ФИ | - фагоцитарный индекс, % |
ФМА | - функционально-метаболическая активность |
ФНО- | - фактор некроза опухолей альфа, пг/мл |
ФРН | - функциональный резерв нейтрофилов, % |
ФЧ | - фагоцитарное число |
ЦИК | - циркулирующие иммунные комплексы, усл. ед. |
ЩФ | - щелочная фосфатаза, ммоль/ч×л |
ЭБ | - эритроциты барана |
ЭИМ | - экспериментальный инфаркт миокарда |
С1-ингибитор | - ингибитор C1-компонента комплемента, нг/мл |
С3 | - компонент комплемента С3, мг/л |
С4 | - компонент комплемента С4, мг/л |
CD16 | - NK-клетки, % |
CD22 | - B-клетки, % |
CD3 | - общие Т-лимфоциты, % |
CD4 | - Т-хелперы, % |
CD8 | - цитотоксические клетки, % |
CD95 | - индукторный фактор апоптоза, % |
Ig | - иммуноглобулины, г/л |
MDV | - средняя диастолическая скорость кровотока, см/сек |
mOD | - единицы оптической плотности |
смNO | - стабильные метаболиты оксида азота, мкмоль/л |
PI | - пульсационный индекс |
Tc pO2 | - транскутанное напряжение кислорода, мм рт. ст. |
VF | - объемная скорость кровотока, мл/мин |
ицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г.
Сдано в набор ___.___.20__ г. Подписано в печать ___.___.20___ г.
Формат 30х421/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom.
Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0.
Тираж 100 экз. Заказ № ___А.
Издательство Курского государственного медицинского университета
305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине