ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ДОЗИМЕТРИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАДИОФАРМПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА 03.01.01 - Радиобиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Обнинск

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

На правах рукописи

ПЕТРИЕВ

Василий Михайлович

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ДОЗИМЕТРИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАДИОФАРМПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ

СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА

03.01.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Обнинск - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении

Медицинский радиологический научный центр

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН ЦЫБ Анатолий Федорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор УЛЬЯНЕНКО Лилия Николаевна,

доктор биологических наук, профессор ПЕТИН Владислав Георгиевич,

доктор биологических наук

КОМАРОВА Людмила Николаевна.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт

мозга человека им. Н.П.Бехтеревой РАН.

Защита состоится 25 октября 2011 года в 11.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.132.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

по адресу: 249036, г. Обнинск Калужской области, ул. Королева, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Медицинский

радиологический научный центр Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан л___________________2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Настоящее исследование направлено на решение актуальной радиобиологической проблемы ядерной медицины - поиску новых радиофармпрепаратов (РФП) для радионуклидной диагностики и терапии социально значимых, в том числе онкологических, заболеваний, радиобиологическому и дозиметрическому сопровождению создания новых РФП.

Актуальность проблемы обусловлена неуклонным ежегодным ростом числа онкологических заболеваний, которые продолжают оставаться в списке лидеров в структуре причин смертности населения промышленно развитых стран. Своевременная и полноценная диагностика этих заболеваний и эффективность их лечения в значительной степени обусловлены применением современных ядерно-медицинских технологий, которые, к сожалению, являются Услабым местомФ отечественного здравоохранения. Решение указанных проблем во многом связано с созданием и применением в клинической практике РФП, обладающих как высокой функциональной пригодностью, так и безопасностью в широком смысле этого термина.

Как известно, разработка и создание высокоэффективных РФП носит междисциплинарный характер, но основой всего является выбор радионуклидов с оптимальными ядерно-физическими характеристиками и их носителей, среди которых важное место занимает сывороточный альбумин человека.

РФП на основе сывороточного альбумина человека характеризуются лучшей физиологичностью и технологичностью их получения, возможностью получать наночастицы и микрочастицы с заданными размерами и программируемой скоростью протеолиза их в организме, возможностью инкорпорировать практически любые радионуклиды, прочно удерживать их в составе частиц и высвобождать по мере протеолиза денатурированного белка.

В мировой литературе отсутствуют сведения о системных и комплексных сравнительных исследованиях по разработке и биологическому изучению препаратов на основе сывороточного альбумина человека, меченных радионуклидами диагностического и терапевтического назначения, имеются лишь отдельные сведения [Mayron L.G., Kaplann E., 1975; Szymendera J., et al., 1977; Hnatowich D.G., Schlegel P., 1981; OТ Donnell P.B., McGinity J.W., 1997; Wang S.J., et al., 1998; Wang Y. F. et al., 2007]. Отсутствие комплексных радиохимических, фармакокинетических и дозиметрических исследований затрудняет выбор оптимальных по составу и функциональным признакам РФП для радионуклидной диагностики и терапии онкологических и неонкологических заболеваний.

Актуальность изучения фармакокинетических свойств и дозиметрических характеристик новых РФП состоит еще и в том, что проведение этих исследований обеспечивает выбор наиболее оптимальных и безопасных препаратов, характеризующихся высокой функциональностью в радионуклидной диагностике и терапии онкологических заболеваний.

В настоящей работе изложены материалы комплексных радиохимических, фармакокинетических и дозиметрических исследований РФП на основе нативного альбумина, наноальбумина и микросфер альбумина (МСА), меченных радионуклидами 131I, 111In, 99mTc, 177Lu, 188Re, 103Pd, в зависимости от условий их получения и физико-химических характеристик.

Цель исследования.

Изучение фармакокинетических и дозиметрических характеристик РФП на основе сывороточного альбумина человека и гамма-, бета-излучающих радионуклидов в зависимости от физико-химических свойств меченых препаратов; выбор оптимальных по функциональным признакам РФП для радионуклидной диагностики и терапии онкологических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Изучить закономерности образования комплексных соединений 99mTc с нативным альбумином и наноальбумином в зависимости от условий проведения реакции.

2. Провести сравнительные исследования фармакокинетических свойств РФП л99mTc-альбумин и л99mTc-наноальбумин, оценить их функциональную пригодность для исследования гемодинамических характеристик и сцинтиграфии лимфатических узлов и печени.

3. Изучить особенности фармакокинетики меченых МСА в организме лабораторных животных в зависимости от химической природы радионуклида, дисперсного состава частиц, степени денатурации белка, пространственного распределения радионуклида в частицах и способа их введения в организм.

4. Изучить фармакокинетические свойства препарата л177Lu-МСА, полученного нейтрон-активационным способом.

5. Изучить закономерности инкорпорирования 103Pd в состав МСА и исследовать влияние теплового воздействия и гамма-облучения белка на показатели, характеризующие поведение препарата л103Pd-МСА в организме лабораторных животных.

6. Изучить особенности фармакокинетики меченых МСА в организме лабораторных животных с экспериментальными моделями легочной патологии (облучение ионизирующим излучением, эмболия легочной артерии, асептическое воспаление и рак легких) после внутривенного введения препаратов.

7. Провести сравнительный анализ фармакокинетики РФП л103Pd-МСА в организме интактных мышей и мышей-опухоленосителей после внутримышечного и внутриопухолевого введения, а также оценить уровни накопления этого препарата в опухоли и удержания его опухолевой тканью.

8. Оценить распределение поглощенных доз внутреннего облучения органов и тканей лабораторных животных разными радионуклидами, инкорпорированными в состав МСА.

Научная новизна:

В результате проведенных исследований обоснована проблема необходимости проведения комплексного исследования закономерностей инкорпорирования радионуклидов в молекулы-носители, изучения фармакокинетических свойств и дозиметрических характеристик для создания новых эффективных по функциональным признакам РФП для радионуклидной диагностики и терапии онкологических и неонкологических заболеваний.

1. Разработана технология оригинальных препаратов: 99mTc-наноальбумин, 177Lu-, 166Ho-, 103Pd-МСА.

2. Впервые показана возможность получения меченых МСА путем активации стабильных изотопов в составе белковых частиц тепловыми нейтронами. Нейтрон-активационным методом были получены и изучены физико-химические свойства МСА, меченных 152mEu, 177Lu, 186Re, 166Ho.

3. В результате исследования закономерностей введения 103Pd в белковую матрицу микросфер путем ионной сорбции впервые показана способность инкорпорировать палладий и другие ионы металлов в состав альбуминовых частиц и изучено влияние различных факторов (дисперсный состав частиц, степень денатурации белка в результате теплового воздействия и гамма-облучения МСА) на их поведение в организме лабораторных животных.

4. Впервые показано влияние предварительного гамма-облучения легких лабораторных животных на фармакокинетику меченых МСА.

5. Получены приоритетные результаты сравнительных исследований влияния степени денатурации белка, пространственного распределения метки в частицах, химической природы радионуклидов и способов введения меченых препаратов на характер поведения МСА в организме лабораторных животных.

6. В опытах на животных с индуцированными заболеваниями легких и перевивными солидными опухолями дана оценка функциональной пригодности препаратов.

7. Впервые проведена сравнительная оценка поглощенных доз внутреннего облучения органов и тканей лабораторных животных в зависимости от вида радионуклида, инкорпорированного в состав МСА.

Практическая значимость.

В ходе выполнения данного исследования созданы новые РФП, обладающие функциональной пригодностью для радионуклидной диагностики и терапии онкологических и неонкологических заболеваний. По результатам научных исследований наработаны экспериментальные и опытные образцы лиофилизатов (наборов реагентов) к генератору 99W/99mTc и на их основе РФП л99mTc-альбумин, л99mTc-наноальбумин, л99mTc-микросферы альбумина, л177Lu-микросферы альбумина и л103Pd-микросферы альбумина.

Разработаны технологические регламенты на производство двух препаратов: л99mTc-альбумин, л99mTc-микросферы альбумина.

РФП л99mTc-альбумин прошел доклинические испытания, РФП л99mTc-микросферы альбумина прошел доклинические и клинические испытания, зарегистрирован в реестре лекарственных средств для медицинского применения и получено разрешение на его ,промышленный выпуск (регистрационное удостоверение Минздрава России № 000329/01-2001 от 20.03.2001).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фармакокинетические свойства 99mTc-альбумина зависят от технологических условий его синтеза.

2. Результаты фармакокинетики 99mTc-альбумина 99mTc-наноальбумина доказали функциональную пригодность РФП для исследования гемодинамических характеристик, диагностики лимфатических узлов и печени.

3. На фармакокинетику меченых МСА оказывает влияние дисперсный состав частиц, пространственное распределения радионуклида в частицах, степень денатурации белка в результате теплового воздействия, нейтронного и гамма-облучения, химическая природа радионуклида, способ введения в организм.

4. Результаты фармакокинетики меченых МСА в организме лабораторных животных с патологическими состояниями легких: гамма-облучение легких; эмболия легочной артерии и рак легких, доказали эффективность РФП в оценке состояния капиллярного кровотока легких.

5. Поглощенные дозы внутреннего облучения органов и тканей лабораторных животных после внутривенного и внутриопухолевого введения меченых МСА определяются фармакокинетическими и ядерно-физическими характеристиками РФП.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 15 всероссийских и международных конференциях, симпозиумах, в том числе - на 9 конференциях в России и на 6 конференциях за рубежом:

Первый съезд онкологов стран СНГ (Москва,1996).
2ICI Second International Conference on Isotopes (Sydney, Australia, 1997).
Международный конгресс ЭНЕРГЕТИКА-3000 (Обнинск, 1998).
Всероссийская конференция л50 лет производства и применения изотопов в России (Обнинск, 1998).
The Second Japanese-Russian Seminar on Technetium (Shizuoka, Japan, 1999).
International Youth Nuclear Congress 2000 (Slovakia, Bratislava, 2000).
Modern problems of radiobiology, radioecology and evolution, International conference dedicated to centenary of N.W.Timofeff-Ressovsky (Dubna, 2000).
International Conference on Current Status Medicine and Radiopharmaceuticals Congress of Russian Society of Nuclear Medicine (Obninsk, 2000).
Международный Конгресс Энергетика-3000 (Обнинск, 2002).
Всероссийская научно-практическая конференция Актуальные вопросы ядерной медицины. Школа Избранные вопросы ядерной медицины (Дубна, 2004).
International Symposium on Technetium (Oarai, Japan, 2005);
15th Radiochemical Conference (Marianske Lazne, Czech Republic, 2006);
Annual Congress of the EANM (Athens, Greece, 2006);
Шестая Российская конференция по радиохимии Радиохимия-2009 (Москва, 2009);
III Евразийский Конгресс по медицинской физике и инженерии Медицинская физика - 2010 (Москва, 2010).

Апробация диссертации состоялась 20 апреля 2011 г. на научной конференции экспериментального радиологического сектора Федерального государственного бюджетного учреждения Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, протокол № 259.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 научных статей, в том числе 18 опубликовано в отечественных научных журналах, рекомендованных ВАК МОиН РФ для докторских диссертаций, и 9 - в зарубежных журналах. Получен патент Российской Федерации на изобретение RU2359702 Способ получения меченых радионуклидом микросфер, дата публикации 27.06.2009 г.

Реализация результатов работы. По результатам проведенных исследований подготовлены:

абораторные регламенты на производство двух препаратов: Микросферы альбумина, 99mTc, Альбумин, 99mTc;
опытно-промышленные регламенты на производство двух субстанций Микросферы альбумина, 5Ц10 микрон и Микросферы альбумина, 20Ц40 микрон - субстанции для получения радиофармпрепаратов л103Pd-микросферы альбумина, 5Ц10 микрон и л103Pd-микросферы альбумина, 20Ц40 микрон;
стандарты предприятия для контроля качества препаратов Микросферы альбумина (МСА), 20Ц40 мкм и Микросферы альбумина (МСА), 5Ц10 мкм - субстанции для производства РФП л103Pd-МСА, 20Ц40 мкм и л103Pd-МСА, 5Ц10 мкм;
проведены доклинические испытания препарата л99mTc-альбумин;
проведены доклинические и клинические испытания препарата л99mTc-микросферы альбумина, препарат зарегистрирован в реестре лекарственных средств, а также получено разрешение на его промышленное производство.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 266 страницах компьютерного текста, содержит 55 таблиц и 36 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов. Список цитированной литературы содержит 311 источников.

ичный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, планировании и проведении большинства экспериментов, обработке, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и состоит в непосредственном участии на всех этапах исследования: от генерации идеи, формулировании задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов исследований и подготовки научных публикаций и докладов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез меченых препаратов. Для синтеза препаратов использовали 10% раствор сывороточного альбумин человека для инфузий. Вспомогательные реактивы были приобретены у фирмы Сигма-Алдрич, Москва. Радионуклиды 99mTc и 188Re получали элюированием с колонок генераторов 99Mo/99mTc и 188W/188Re производства ФГУП ГН - РФ - Физико-энергетический институт им. А.И.Лейпунского (г. Обнинск). Радионуклид 103Pd приобретали у ЗАО Циклотрон, 131I получали из ФГУП Филиал научно-исследовательского физико-химического института им. Л.Я.Карпова (г. Обнинск).

Синтез наноальбумина проводили путем сшивки альбумина глутаровым альдегидом с последующим фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор 22 мкм.

Синтез МСА осуществляли эмульсионным методом [Zolle I., et al., 1970; Петриев В.М. и соавт., 1976; Петриев В.М. и соавт., 1977]. Методика была существенно модифицирована. Для этой цели был разработан специальный аппарат, в комплект которого входит блок управления температурой и скоростью вращения мешалки. Метод получения МСА основан на тепловой денатурации белка в оливковом масле. Раствор альбумина вводят по каплям в оливковое масло при постоянном перемешивании. При этом образуется эмульсия раствора альбумина в масле. Эту смесь, не прекращая перемешивания, нагревают. При этом происходит процесс тепловой денатурации альбумина с образованием твердых частиц сферической формы. Размер МСА зависит от скорости перемешивания смеси, концентрации раствора альбумина и температуры предварительного нагрева масла. Для получения МСА с заданными размерами их фракционируют с помощью ультразвуковых микросит. Разработанный метод получения МСА с помощью специального аппарата позволяет получать частицы с любыми заданными диапазонами размеров от 0,5 мкм до 850 мкм и программируемой тепловой денатурацией белка в интервале температуры от 110оС до 300оС. Кроме этого, методика позволяет получать МСА, содержащие любые металлы в виде их солей или оксидов, а также любые химические соединения, в том числе лекарственные препараты, существующие в твердом состоянии [Петриев В.М. и соавт., 1980; Петриев В.М. и соавт., 1981; Петриев В.М. и соавт., 2000; Петриев В.М. и соавт., 2005].

иофилизаты (наборы реагентов) на основе альбумина, наноальбумина и микросфер альбумина к генераторному радионуклиду 99mTc получали путем лиофильной сушки раствора смеси реагентов, предварительно замороженного в жидком азоте, в сублиматоре 15-SRC-X производства фирмы УVirTisФ (США) [Петрова Г.А., Петриев В.М., и соавт., 2003]. Лиофилизаты являются субстанциями для приготовления РФП л99mTc-альбумин, л99mTc-наноальбумин и л99mTc-микросферы альбумина. Меченые препараты готовят непосредственно перед проведением исследований, путем введения элюата 99mTc во флакон, содержащий ингредиенты, способствующие связыванию технеция с молекулой-носителем.

103Pd-микросферы альбумина получали методом ионной сорбции хлорида палладии-103 в состав белковых частиц с последующим восстановлением его до оксида палладия [Петриев В.М. и соавт., патент RU2359702, 2009; Петриев В.М. и соавт., 2010; Petriev V.M., et al., 2010].

177Lu- и 166Ho-микросферы альбумина получали методом активации тепловыми нейтронами стабильных изотопов 176Lu- и 165Ho в составе МСА. Облучение проводили в реакторе ВВРц в ФГУП Филиал научно-исследовательского физико-химического института им. Л.Я.Карпова [Петриев В.М. и соавт., 1981; Петриев В.М. и соавт., 2005].

Методика проведения биологических исследований.

Изучение фармакокинетики меченых препаратов альбумина было проведено на 883 лабораторных животных, в том числе на 122 кроликах-самцах породы Шиншилла массой 1,5Ц3,0 кг, 373 белых беспородных крысах-самцах массой 130Ц250 г и 388 белых беспородных мышах-самцах массой 22Ц35 г. Экспериментальные животные содержались в условиях лабораторного вивария и получали стандартный рацион и воду без ограничений.

Фармакокинетические свойства меченых препаратов изучали в организме интактных животных и животных с разными патологическими состояниями легких кроликов: асептическим воспалением легких, эмболией легочной артерии, рак легких и после гамма-облучения легкого, а также с перевитой в мышцу бедра мышей карциномой Эрлиха. Эксперименты на животных проводили при разных способах инъекции меченых препаратов: внутривенном, внутриартериальном, внутримышечном и внутриопухолевом. Экспериментальные заболевания легких моделировали по методикам, изложенным в работах [Хачиров Дж.Г., Петриев В.М, 1978; Петриев В.М. и соавт., 1979].

Радиометрию образцов органов и тканей проводили по фотопику гамма-излучения соответствующего радионуклида в колодезном детекторе NZ-138, с помощью пересчетной установки NC-308 и высоковольтного блока NK-350/A производства фирмы Гамма (Венгрия), а также с помощью автоматического гамма-счетчика Wizard версии 2480 фирмы PerkinElmer/Wallac (Финляндия). По данным радиометрии рассчитывали содержание меченого препарата в 1 г массы ткани и во всем органе в процентах от введенного количества. Результаты радиометрии обрабатывали методом оценки средне-квадратичной ошибки средней величины (M ± m). Достоверность различий результатов оценивали с использованием критерия Стьюдента. Статистически значимыми признавались отличия с р < 0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка радиофармпрепаратов л99mTc-альбумин, 9mTc-наноальбумин, изучение их радиохимических и фармакокинетических свойств

Полученные результаты в ходе выполнения работы показали, что с целью создания радиофармпрепаратов на основе сывороточного альбумина человека (нативный альбумин, наноальбумин и микросферы) с оптимальными характеристиками по функциональным признакам для радионуклидной диагностики и терапии необходимо проведение комплексных исследований закономерностей связывания радионуклида с молекулой-носителем, изучение фармакокинетических свойств и дозиметрических характеристик.

Для изучения закономерностей образования комплексного соединения 99mTc с нативным альбумином в зависимости от условий проведения реакции были получены экспериментальные образцы лиофилизатов (наборы реагентов), содержащие 10 мг альбумина и разное количество двухвалентного олова (Sn2+) в пределах 15Ц80 мкг. Метку альбумина радионуклидом проводили путем введения элюата 99mTc, получаемого с колонки генератора 99Mo/99mTc, во флакон, содержащий ингредиенты (альбумин, Sn2+ в виде SnCl2), способствующие связыванию 99mTc с альбумином.

В результате исследований показано, что проведение реакции при pH среды, равной 2,5, уровень связывания 99mTc с альбумином практически не зависит от концентрации Sn2+ в реакционной смеси в пределах 3,75Ц10 мкг/мл (рис. 1). Причем образование комплексного соединения л99mTc-альбумин при этих условиях происходит практически мгновенно. Радиохимический выход 99mTc-альбумина составляет около 96% через три минуты после начала проведения реакции и сохраняется на этом уровне в течение 24 ч, что свидетельствует

о высокой стабильности РФП в растворе. Увеличение концентрации Sn2+ в реакционной смеси до 15 мкг/мл снижает скорость реакции образования комплекса л99mTc-альбумин и эффективность связывания 99mTc с альбумином.

Максимальный радиохимический выход меченого препарата составляет около 88% через 30 мин после начала проведения реакции. Дальнейшее повышение концентрации Sn2+ в реакционной смеси до 20 мкг/мл способствует еще большему снижению скорости реакции, эффективности связывания 99mTc с

альбумином и стабильности комплекса. Снижение скорости реакции и эффективности связывания 99mTc с альбумином при высоких концентрациях Sn2+ в реакционной смеси происходит за счет протекания конкурентной реакции, в


Рис. 1. Кинетика связывания 99mТс с альбумином от зависимости концентрации Sn2+ в реакционной смеси. Концентрация альбумина 2,5 мг/мл; 99mТс - 0,85 . 10-6 мг/мл.	Рис. 2. Кинетика образования 99mТсO2 в зависимости от концентрации Sn2+ в реакционной смеси. Концентрация альбумина 2,5 мг/мл; 99mТс - 0,85 . 10-6 мг/мл, рН 2,5.

результате которой образуется гидролизованный технеций (99mTcO2), являющийся радиохимической примесью в препарате л99mTc-альбумин. Радиохимические примеси в препарате л99mTc-альбумин, полученном в реакции с концентрацией Sn2+ в реакционной смеси в пределах 3,75Ц10 мкг/мл, не превышают 4Ц5%, тогда как концентрация Sn2+ 15Ц20 мкг/мл способствует образованию 99mTcO2 на уровне 10Ц20% (рис. 2).

Аналогичные закономерности образования комплексных соединений 99mTc происходят с наноальбумином и микросферами альбумина.

Учитывая, что введение 99mTc в молекулу альбумина, а также воздействие Sn2+ на белок может приводить к изменению его физиологических свойств, необходимо проведение фармакокинетических исследований РФП с разными модификациями препарата в организме лабораторных животных.

Поскольку 99mТс-альбумина предназначен для радионуклидного исследования гемодинамических характеристик, поведение его в крови является важнейшей фармакокинетической характеристикой.

В экспериментах на кроликах показано, что 99mTc-альбумин, полученный из лиофилизата, содержащего 15 мкг Sn2+ (соответственно 3,75 мкг/мл в реакционной смеси), имеет наиболее оптимальные фармакокинетические свойства (табл. 1). Он циркулирует в крови в течение 3 ч на уровне около 50% от введенного количества. У 99mTc-альбумина, полученного из лиофилизатов, содержащих 30 и 40 мкг Sn2+ (соответственно 7,5 и 10 мкг/мл в реакционной смеси), накопление активности в крови также было высоким (выше 50%) через 5 мин после внутривенного введения. Однако в последующие сроки меченый препарат интенсивно выводился из кровяного русла и в течение 3 ч содержание его в крови резко снижалось (табл. 1). Получение 99mTc-альбумина из лиофилизата, содержащего 80 мкг (концентрация 20 мкг/мл в реакционной смеси) Sn2+ приводит к значительному снижению уровня накопления активности в крови во все сроки наблюдений.

Таблица 1 - Содержание 99мТс-альбумина в крови кроликов после внутривенного введения препарата (в % от введенного количества на всю массу крови).

Время после введения препарата	Концентрация Sn2+, при которой получали 99мТс-альбумина, мкг/мл
Время после введения препарата	3,75	7,5	10	20
5 мин	53,0 ± 12,6	62,9 ± 2,38	58,2 ±2,25	9,98 ± 1,49
1 ч	45,3 ± 11,5	38,5 ± 3,89	9,92 ± 0,48	8,81 ± 2,43
3 ч	51,1 ± 0,76	25,5 ± 1,23	4,27 ± 0,03	3,43 ± 0,27

Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышение количества олова в составе лиофилизата с 15 до 40 мкг оказывает существенное влияние на фармакокинетические свойства РФП - ускоряет выведение его из кровяного русла. При этом радиохимические свойства 99mTc-альбумина не изменяются с повышением олова в составе лиофилизата в пределах 15Ц40 мкг (радиохимический выход составляет выше 95%, радиохимические примеси не превышают 5%) и стабильность препарата in vitro сохраняется на высоком уровне в течение 24 ч с момента его приготовления. Ускоренное выведение 99mTc-альбумина, полученного при повышенных концентрациях олова, объясняется изменением физиологических свойств белка.

С учетом полученных результатов комплексных радиохимических и биологических исследований, был выбран лиофилизат с оптимальным составом: флакон емкостью 10 см3 содержал лиофильно высушенную в стерильных условиях смесь альбумина - 10 мг и двухлористого олова - 0,0238 мг (Sn2+ - 15 мкг). Разработанный состав лиофилизата позволяет получать РФП л99mTc-альбумин в течение 10 мин с радиохимическим выходом не менее 95%.

Как было показано, незначительное изменение физиологических свойств альбумина приводит к существенному изменению поведения его в организме. Это явление было подтверждено экспериментальными исследованиями на крысах при изучении фармакокинетических свойств наноальбумина, меченного 99mTc. Разработанный наноальбумин представляет собой сшитый белок со средним размером частиц 26,1 нм.

Сравнительные данные биологического распределения 99mTc-альбумина и 99mTc-наноальбумина в органнизме крыс после внутривенного введения характеризуются существенными различиями. Содержание активности в крови крыс через 5 мин после инъекции 99mTc-альбумина и 99mTc-наноальбумина отмечается на достаточно высоком уровне (соответственно 12,8 и 28,8% во всем объеме циркулирующей крови от введенного количества). Однако 99mTc-наноальбумин интенсивно выводится из крови и через 24 ч количество его снижается в 64 раза по сравнению с 5 минутным сроком. Напротив, содержание 99mTc-альбумина в крови существенно не изменяется в течение 6 ч (р > 0,05) и только через 24 ч этот показатель статистически достоверно снижается до 9,4% по сравнению с 6 часовым сроком (p < 0,05).

Интенсивное выведения 99mTc-наноальбумина из крови сопровождается высоким уровнем накопления его в печени (табл. 2). Динамика накопления 99mTc-наноальбумина в 1 г печени характеризуется постепенным ростом активности с 4,17 до 9,51% в течение 1 ч после внутривенной инъекции препарата и остается практически без изменения в интервале наблюдения 1 - 24 ч, а к 48 ч снижается до уровня 4,3%. Напротив, величины накопления 99mTc-альбумина в печени наблюдаются на уровне следовых количеств во все сроки проведения исследования.

Избирательное накопление 99mTc-наноальбумина в печени является результатом захвата наночастиц купферовскими клетками. Полученный результат является положительной характеристикой РФП в плане возможности использования его для получения сцинтиграфического изображения печени.

Таблица 2 - Фармакокинетика 99mТс-наноальбумина в организме крыс после внутривенного и подкожного введения препарата (в % от введенного количества на 1 г массы органов, тканей).

№

пп.

Наименование органа, ткани

Метод

введения

Время после введения препарата

5 мин

1 ч

3 ч

24 ч

48 ч

Кровь

в/венное

подкожное

2,940,67

0,0150,003

< 0,01

0,400,03

0,0210,004

< 0,001

0,130,02

0,0460,006

< 0,01

0,0460,004

0,0650,005

< 0,05

0,0870,014

0,170,02

< 0,02

Щитовидная железа

в/венное

подкожное

0,500,09

0,0630,017

< 0,01

0,510,04

0,0760,016

< 0,001

0,600,04

0,240,04

< 0,001

2,460,31

0,180,02

< 0,001

5,970,99

1,220,21

< 0,01

Печень

в/венное

подкожное

4,170,66

0,0320,007

< 0,001

9,510,34

0,220,04

< 0,001

8,390,53

1,770,30

< 0,001

7,680,91

1,290,17

< 0,001

4,300,30

0,830,18

< 0,001

имфатический узел паховый

в/венное

подкожное

0,660,14

5,620,89

< 0,002

1,270,40

12,32,90

< 0,01

0,640,12

37,44,66

< 0,001

0,450,07

60,713,7

< 0,01

0,330,10

38,47,58

< 0,01

В опытах на крысах было показано, что после подкожного введения 99mTc-наноальбумина РФП имеет фармакокинетические особенности в организме, отличающиеся от таковых после внутривенного введения этого же препарата (табл. 2). Результаты биологического распределения РФП показали, что в ранние сроки после подкожного введения 99mTc-наноальбумина из всех исследуемых органов и тканей наибольшее количество активности аккумулируется в паховом лимфатическом узле. Через 5 мин после инъекции 99mTc-наноальбумина накопление активности в лимфатическом узле составляет 5,62% от введенного количества (в пересчете на 1 г массы органа), далее процент накопления активности увеличивается и достигает максимального значения (60,7%) через 24 ч, затем происходит снижение этого показателя до 38,4% через 48 ч. Такая динамика накопления активности в лимфатическом узле объясняется медленной элиминацией 99mTc-наноальбумина, депонированного под кожу после инъекции.

Особенностью фармакокинетики 99mTc-наноальбумина в организме крыс при разных способах введения является накопление его в паховом лимфатическом узле, превышающем в 8,5Ц9,7 раз (в период 5 - 60 мин) и в 58,8Ц135 раз (в период 3Ц48 ч) при подкожном введении по сравнению с внутривенной инъекцией.

Ткань щитовидной железы в течение всего периода наблюдения практически не аккумулировала активность, при исследовании 99mTc-наноальбумина после подкожного введения содержание активности в целом органе составляло на уровне тысячных или сотых долей процента. Это является показателем высокой стабильности меченого препарата in vivo, так как известно, что свободный технеций обладает тропностью к ткани щитовидной железы.

Для оценки функциональной пригодности 99mTc-наноальбумина были рассчитаны коэффициенты дифференциального уровня накопления активности в печени и лимфатическом узле по отношению к другим органам и тканям после внутривенного и подкожного введения меченого препарата (табл. 3).

Таблица 3 - Отношение удельного содержания 99mТс-наноальбумина в печени и лимфатическом узле к удельному содержанию активности в других органах и тканях крыс после внутривенного и подкожного введения препарата.

№

пп.

Наименование

органа, ткани

Время после введения препарата

5 мин

1 ч

3 ч

24 ч

48 ч

Печень/кровь

имфоузел/кровь

1,740,58*

403,667,4**

< 0,001

24,00,98

577,893,4

< 0,001

65,86,77

855,3135,9

< 0,001

182,641,7

1008317

< 0,02

55,113,3

233,542,4

< 0,002

Печень/ЩЖ

имфоузел/ЩЖ

9,152,29

108,324,6

< 0,01

19,32,20

223,311,9

< 0,001

14,10,48

157,911,6

< 0,001

3,340,69

357,492,1

< 0,01

0,800,16

32,96,05

< 0,002

Печень/легкие

имфоузел/легкие

5,751,05

1045355

< 0,02

39,82,60

1125342

< 0,05

73,65,59

1266221

< 0,002

138,445,2

2029148

< 0,001

54,06,32

1508371

< 0,002

Печень/почки

имфоузел/почки

13,43,24

279,263,8

< 0,02

11,90,41

69,26,56

< 0,001

4,740,37

42,85,95

< 0,001

1,970,43

19,86,13

< 0,05

1,000,05

22,13,85

< 0,002

Печень/селезенка

имфоузел/

селезенка

2,230,03

348,381,4

< 0,02

2,130,40

198,462,0

< 0,05

1,970,16

71,813,4

< 0,002

2,430,24

177,928,0

< 0,001

2,210,30

144,032,3

< 0,01

* внутривенное введение

**подкожное введение

Коэффициенты дифференциального уровня накопления 99mTc-наноальбумина в печени по отношению к большинству органов и тканей постепенно увеличиваются и достигают максимального значения в период 3Ц24 ч после внутривенной инъекции препарата.

Сравнительные данные уровней дифференциального накопления активности в печени и лимфатическом узле по отношению к другим органам и тканям после внутривенного и подкожного введения 99mTc-наноальбумина характеризуют особенности поведения препарата в организме крыс в зависимости от способа его введения. Показано, что дифференциальный уровень накопления 99mTc-наноальбумина в лимфатическом узле в ранние сроки после инъекции препарата на 2Ц3 порядка выше, чем аналогичный показатель для печени. В последующие сроки эти величины повышаются в течение 24 ч по отношению к большинству органов и тканей. Эти данные свидетельствуют о том, что выведение активности из печени и лимфатического узла осуществляется существенно с меньшей скоростью, чем из других органов и тканей.

Коэффициенты дифференциального уровня характеризуют функциональную ценность РФП л99mTc-наноальбумин для получения диагностической информации методом сцинтиграфии лимфатических узлов при подкожном введении и печени при внутривенном введении.

Особенности фармакокинетики меченых микросфер альбумина в

организме лабораторных животных в зависимости

от их физико-химических свойств

Для изучения влияния пространственного распределения радионуклида в микросферы альбумина, дисперсного состава частиц, химической природы радионуклида, денатурации белка в результате теплового воздействия или гамма-облучения, способа инъекции меченого препарата, патологического состояния легких на фармакокинетику в организме интактных животных и животных-опухоленосителей были разработаны и получены следующие препараты МСА:

131I-МСА диаметром 0,5Ц2, 0,5Ц5, 5Ц10 и 10Ц20 мкм, с температурой денатурации белка, равной 110, 130, 150оС и выдержкой в течение 1 ч, с поверхностным и объемным распределением радионуклида в частицах;
99mTc- и 111In-МСА диаметром 0,5Ц2 и 10Ц20 мкм с температурой денатурации белка, равной 150оС и выдержкой в течение 1 ч;
177Lu-МСА диаметром 10Ц20 мкм, полученные путем облучения стабильного изотопа 176Lu в составе МСА тепловыми нейтронами с потоком 2.1013 н/см2с в течение 1 ч;
103Pd-МСА диаметром 5Ц10 и 20Ц40 мкм с объемным распределением радионуклида в частицах, с температурой денатурации белка, равной 136оС, 200оС и выдержкой в течение 2 и 8 ч, а также воздействием гамма-облучения в дозе 0,1 и 1,0 МГр.

Сравнение данных биораспределений 131I-МСА, полученных при разных температурах, в организме интактных крыс после внутривенного введения показало, что не выявлено существенного влияния температуры денатурации белка в пределах 110Ц150оС на фармакокинетические свойства препарата (рис. 3а). Максимальный уровень накопления активности в легких меченых МСА, полученных при температуре 110, 130 и 150оС, отмечается через 5 мин после внутривенного введения и статистически достоверных различий при этом не выявлено (p > 0,1Ц0,25). В последующие сроки количество меченого препарата в легких снижается приблизительно с одинаковой скоростью (p > 0,05Ц0,1). Выведение активности из легких в течение 1Ц48 ч сопровождается закономерным накоплением ее в неблокированной щитовидной железе (ЩЖ). Активность ЩЖ закономерно увеличивается, что свидетельствует о постепенном гидролизе МСА и выведении свободного радиоактивного йода с поверхности частиц (рис. 3б).


Рис. 3. Динамика накопления и выведения активности из легких (а) и щитовидной железы (б) после внутривенного введения 131I-МСА, полученных при 110 (1), 130 (2) и 150оС (3).

Анализ сравнительных данных распределения активности в организме крыс после внутривенного введения 131I-МСА с поверхностным и объемным распределением радионуклида в частицах показал, что в течение первого часа исследования заметных различий в уровне накопления активности в легких не выявляется (p < 0,25Ц0,5), тогда как содержание в легких МСА с объемным распределением радионуклида в частицах в период наблюдений 3 - 24 ч статистически достоверно выше по сравнению с поверхностным распределением активности в частицах (p < 0.02Ц0,001) (рис. 4а). Выведение активности из легких происходит с периодом биологического полувыведения, равным 1,6 ч, после инъекции 131I-МСА с поверхностным распределением радионуклида, и 21,1 ч - с объемным распределением радионуклида в частицах. Ускоренное выведение активности из легких, когда радионуклид распределяется на поверхности частиц, сопровождается более интенсивным накоплением активности в неблокированной щитовидной железе, по сравнению с объемным распределением радионуклида в частицах, что позволяет косвенно судить о времени внутрисосудистого рассасывания микросфер альбумина (рис. 4б).


Рис. 4. Динамика накопления и выведения активности из легких (а) и щитовидной железы (б) после внутривенного введения 131I-МСА, полученных при 110оС, с поверхностным (1) и объемным (2) распределением радионуклида в частицах.

Детальное изучение влияния степени сшивки белковой матрицы МСА после теплового воздействия и предварительного гамма-облучения на фармакокинетические свойства после внутримышечного введения препарата мышам было проведено с помощью 103Pd-МСА диаметром 20Ц40 мкм с объемным распределением радионуклида в частицах.

103Pd-МСА получали методом ионной сорбции 103Pd в белковую матрицу МСА. Для инкорпорирования максимального количества 103Pd в МСА к радиоактивному палладию добавляли стабильный палладий (PdCl2). Для фиксации в пористой структуре МСА палладий восстанавливали до оксида.

В результате исследований показано, что скорость выведения 103Pd из мышечной ткани после внутримышечной инъекции 103Pd-МСА, полученных при 136оС, выше, чем в случае 103Pd-МСА, полученных при 200оС (рис. 5). Длительность теплового воздействия на белок также оказывает влияние на скорость выведения активности из мышцы после внутримышечного введения 103Pd-МСА (рис. 6). Увеличение длительности теплового воздействия на МСА снижает интенсивность выведения активности из мышечной ткани. Это объясняется тем, что МСА, полученные при более низкой температуре и более короткого теплового воздействия, имеют пониженную степень сшивки белка, что увеличивает скорость его протеолиза и тем самым повышает скорость высвобождения 103Pd из состава микросфер.

Наиболее существенное влияние на степень денатурации белка и тем самым снижение скорости выведения активности из мышцы оказывает предварительное гамма-облучение МСА (рис. 7). Из анализа параметров выведения активности из мышечной ткани после инъекции 103Pd-МСА необлученных и предварительно облученных в дозе 0,1 и 1,0 МГр следует, что периоды полувыведения различаются в значительной степени и составляют 1,02 сут, 8,57 сут и 23,6 сут, соответственно. При этом количества 103Pd-МСА в мышце в течение 40 суток снижаются в 12,6, 4,1 и 1,9 раз, соответственно, для необлученных микросфер и облученных в дозе 0,1 и 1,0 МГр.

Рис. 5. Динамика выведения активности из мышцы бедра после внутримышечного

введения 103Pd-МСА, полученных при

температурах 136оС и 200оС.

Рис 6. Динамика выведения активности из мышцы бедра после внутримышечного

введения 103Pd-МСА, полученных при

температуре 200оС в течение 2 и 8 ч.

Рис. 7. Динамика выведения активности из мышцы бедра после внутримышечного

введения 103Pd-МСА, предварительно гамма-облученных в дозах 0,1 и 1,0 МГр.

Воздействие тепловых нейтронов на степень денатурации белка оказывается еще более существенным, чем гамма-облучение. Для изучения этого феномена были разработаны и получены 177Lu-МСА путем активации стабильного 176Lu в составе МСА тепловыми нейтронами с потоком 2.1013 н/см2с в течение 1 ч. На рис. 8 представлены кривые выведения активности из легких после внутривенной инъекции 131I-МСА, полученных тепловой сшивкой белка при 150оС и 177Lu-МСА, полученных нейтрон-активационным способом. Сравнение параметров выведения активности из легких после инъекции препаратов показало, что 177Lu-МСА выводятся значительно медленнее по сравнению с 131I-МСА: биологические периоды полувыведения - 121,5 и 0,84 сут, соответственно.

Рис. 8. Динамика накопления и выведения активности из легких после внутривенного

введения 131I-МСА и 177Lu-МСА с объемным распределением радионуклидов в частицах.

Дисперсный состав является важнейшей характеристикой частиц, оказывающий существенное влияние на фармакокинетические свойства меченых МСА. В связи с этим было проведено изучение фармакокинетики 131I-МСА диаметром 0,5Ц2, 0,5Ц5, 10Ц20 мкм и 99mTc-МСА диаметром 0,5Ц2 и 10Ц20 мкм в организме интактных крыс после внутривенного введения препаратов.

Результаты исследования показали, что через 5 мин после инъекции 131I-МСА диаметром 0,5Ц5 и 10Ц20 мкм величины накопления их в легких существенных различий не имеют и составляют, соответственно, 51,6 и 63,9% в 1 г легочной ткани (р > 0.1), тогда как у 131I-МСА диаметром 0,5Ц2 мкм этот показатель составляет 12,4% (p < 0,001). Это свидетельствует о том, что частицы меньше 5 мкм проходят капиллярную сеть легких. Скорость выведения активности из легких закономерно увеличивается с уменьшением размера 131I-МСА (рис. 9а). Так, например, удельная активность легких в течение 48 ч уменьшается после инъекции 131I-МСА диаметром 0,5Ц2 мкм в 103,3 раза, 05Ц5 мкм - в 95,6 раза и 10Ц20 - в 12,6 раз. С уменьшением размера частиц растет накопление активности в печени (рис. 9б). Аналогичные закономерности распределения активности в легких и печени наблюдаются и после внутривенного введения 99mТс-МСА диаметром 0,5Ц2, и 10Ц20 мкм

Результаты изучения фармакокинетики 131I-МСА диаметром 0,5Ц2 и 5Ц10 мкм после инъекции в бедренную артерию кроликов показали, что все частицы депонируются в мышечной ткани. Накопление 131I-МСА диаметром 0,5Ц2 и 5Ц10 мкм в мышце бедра, в пересчете на 1 г мышечной ткани, через 5 мин после

Рис. 9а. Динамика выведения активности из легких крыс после внутривенного введения 131I-МСА с разными размерами, полученных при 150оС.

Рис. 9б. Динамика выведения активности из печени крыс после внутривенного введения 131I-МСА с разными размерами,

полученных при 150оС.

внутриартериального введения на 2Ц3 порядка выше, чем в большинстве других органов и тканей. В последующие сроки активность в мышце бедра быстро снижается (рис. 10). Выведение активности из мышцы бедра в течение первых

60 ч происходит более быстрыми темпами после инъекции 131I-МСА диаметром 0,5Ц2 мкм по сравнению 131I-МСА диаметром 5Ц10 мкм.

Рис. 10. Динамика выведения активности из мышцы бедра кроликов после

инъекции 131I-МСА диаметром 0,5Ц2 и 5Ц10 мкм в бедренную артерию.

Для оценки влияния химической природы радионуклида на динамику накопления и выведения активности из легких была изучена фармакокинетика МСА диаметром 10Ц20 мкм, меченных 131I, 111In и 99mTc, после внутривенного введения препаратов. Результаты исследований показали, что химическая природа радионуклида оказывает влияние на поведение меченых МСА в организме. Выведение активности из легких происходит наиболее интенсивно при инъекции 111In- и 99mТс-МСА (рис. 11). Более интенсивное выведение активности из легких после инъекции 111In- и 99mТс-МСА связано, по-видимому, с тем, что связь 111In и 99mТс с белком менее прочная, по сравнению с 131I. Подтверждением более интенсивной элиминации активности из легких 111In- и 99mТс-МСА, по сравнению 131I-МСА, является сравнительно быстрое нарастание уровня активности в печени (до 3,55% от введенного количества через 24 ч после инъекции 111In-МСА) и в почках (до 9,98% в этот же срок после инъекции 99mТс-МСА), тогда как после инъекции 131I-МСА накопление активности в печени и почках через 24 ч составляло всего 0,23% и 0,27%, соответственно.

Рис. 11. Динамика выведения активности из легких интактных крыс после

внутривенного введения 131I-, 111In- и 99мТс-микросфер альбумина, полученных при 150оС.

Для изучения возможности использования меченых МСА в оценке капиллярного кровотока легких в норме и с патологией были изучены фармакокинетические свойства препарата в организме кроликов с экспериментальными моделями легочной патологии: гамма-облучение легкого, эмболия легочной артерии и рак легкого.

В опытах на кроликах с облученным правым легким гамма-квантами в общей дозе 52,5 Гр показано, что через 24 ч после внутривенного введения 131I-МСА диаметром 10Ц20 мкм минимальный уровень накопления активности в облученном легком отмечается через 5 сут после облучения и составляет 3,29% от введенного количества меченого препарата (рис. 12). Эта величина в 12,7 раз меньше по сравнению с аналогичным показателем в левом необлученном легком (p< 0,001). Через 30 и 60 сут после облучения величины накопления меченых МСА в облученном легком увеличиваются, соответственно, в 2,52 и 6,23 раз

(p < 0,02), по сравнению с 5-ю сут после облучения, однако в 4,24 (p < 0,002) и 1,88 раз (p < 0,02) ниже по сравнению с аналогичной величиной контрольного легкого. Эти данные свидетельствуют о постепенном восстановлении капиллярного кровотока в левом облученном легком в более поздние сроки после облучения. Через 120 сут и в последующие сроки вплоть до 240 сут после облучения уровень накопления активности в облученном легком изменяется незначительно, и статистически достоверные различия по сравнению с необлученным легким не выявляются (p > 0,25Ц0,5). Полученные результаты являются свидетельством того, что через 120 сут после облучения капиллярный кровоток в левом облученном легком практически полностью восстанавливается (рис. 12).

Рис. 12. Накопление 131I-МСА в легком после гамма-облучения дозой 52,5 Гр.

Изучение распределения 131I-МСА диаметром 10Ц20 мкм в организме кроликов с эмболией легочной артерии показало, что уровень накопления активности в непораженных участках легких через 1, 3 и 5 сут после получения модели патологического состояния изменяется незначительно и составляет 11,0Ц18,3% в 1 г ткани от введенного количества препарата (p > 0,05) (табл. 4). Накопление активности в пораженных участках легких регистрируется на уровне следовых количеств и не зависит от срока получения эмболии легочной артерии. Удельная активность пораженных участков легких в 524-704 раза ниже, чем непораженной ткани легкого (Р< 0,001).

Таблица 4 - Результаты распределения 131I-МСА в легких кроликов с экспериментальной эмболией легочной артерии через 3 ч после внутривенного введения препарата (в % от введенного количества на 1 г массы органов и тканей).

№ пп.	Орган, ткань	Контроль	Время после воспроизведения модели, сут.
№ пп.	Орган, ткань	Контроль	1	3	5
1	егкие: здоровый участок	4,380,64	11,012,03	11,162,03	18,322,73
2	егкие: пораженный участок	Ц	0,0210,003	0,0170,004	0,0260,005

Результаты изучения распределения 131I-МСА диаметром 10Ц20 мкм в организме кроликов с экспериментальным раком показали, что удельная активность непораженных опухолевым процессом участков легочной ткани кроликов с раком легких практически не изменяется в течение 24 ч после внутривенной инъекции препарата (p > 0,1), в то время как удельная активность легких контрольных кроликов существенно снижается в течение 24 часов с 6,58 % до 1,89 % (p < 0,05) (табл. 5). Неизменный уровень активности в непораженных участках свидетельствует о нарушении протеолитической функции легких, пораженных опухолевым процессом. Напротив, в здоровых легких контрольной группы кроликов происходит активный протеолиз МСА с элиминацией активности из этого органа.

Таблица 5 - Динамика распределения активности в легких кроликов с экспериментальным раком легкого после внутривенного введении меченых МСА диаметром 10Ц20 мкм (в % от введенного количества на 1 г массы ткани).

№ пп.	Орган и ткань	Время после введения препарата
№ пп.	Орган и ткань	1 ч	3 ч	24 ч
1	егкие, здоровый участок	4,020,71* 6,580,65** p > 0,05	5,661,49 4,380,64 p > 0,5	6,420,88 1,890,10 p < 0,01
2	егкое, участок с опухолью	1,630,40 Ц	0,920,18 Ц	1,070,26 Ц
* Величины удельной активности органов и тканей кроликов с раком легких. ** Величины удельной активности органов и тканей контрольных кроликов.

При сопоставлении величин удельной активности пораженной легочной ткани было установлено, что в опухолевом очаге этот показатель через 3 ч после инъекции 131I-МСА составляет 0,920,18% от введенного количества, тогда как при экспериментальной эмболии легочной артерии аналогичная величина составляет 0,0170,004%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что

нарушение капиллярного кровотока участков легких, пораженных опухолевым процессом, происходит в меньшей степени, чем при эмболии легочной артерии.

В результате экспериментальных исследований установлено, что меченые микросферы альбумина диаметром 10Ц20 мкм являются эффективным радиофармпрепаратом для определения с высокой точностью степени нарушения капиллярного кровотока в пораженных участках легких с различными патологическими состояниями этого органа.

Для изучения влияния патологического состояния ткани на закономерности протеолиза и снижения относительной активности в месте ее локализации были проведены сравнительные исследования фармакокинетики 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм и 20Ц40 мкм в организме интактных мышей и мышей с опухолью (карцинома Эрлиха), соответственно, при внутримышечном и внутриопухолевом введении меченых препаратов.

Сравнительный анализ данных активности в мышце показал, что уровни содержания 103Pd в течение первых 3 ч после внутримышечного введения 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 и 20Ц40 мкм статистически достоверно не различаются (p > 0,25Ц0,05) (рис 13а). В последующие сроки наблюдений отмечается статистически достоверное снижение активности в мышце бедра, причем, наиболее заметное снижение наблюдается для 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм (p < 0,02).

Рис. 13. Сравнительные данные уровней накопления 103Pd в мышце (а) и почках (б)

после внутримышечного введения 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 и 20Ц40 мкм.

Эта тенденция сохраняется до конца срока наблюдений. Через 10 сут содержание 103Pd в мышце составляет 24,9% при инъекции 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм и 61,6% при инъекции 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм (p < 0,001), через 20 сут - соответственно, 10,5% и 16,3% (p < 0,021). Полученные данные свидетельствуют о том, что элиминация 103Pd из МСА 5Ц10 мкм протекает интенсивнее, чем из МСА диаметром 20Ц40 мкм. Это связано, по-видимому, с наиболее высокой скоростью протеолиза денатурированного белка МСА меньших размеров за счет наибольшей удельной поверхности частиц.

Снижение уровня 103Pd в мышце сопровождается повышенным накоплением активности в почках. В течение первых 3 часов относительное содержание активности в почках отмечается на уровне следовых количеств, так как в этот период практически весь 103Pd локализован в мышечной ткани (рис. 13а и 13б). В более поздние сроки наблюдений активность в почках постепенно увеличивается, что связано с постепенных рассасыванием МСА в мышце и выделением не связанного 103Pd. Причем, при введении 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм накопление активности в почках происходит более быстрыми темпами, чем при введении 103Pd-МСА диаметром 20-40 мкм.

В результате исследований показано, что в течение первых 24 ч 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм и 20Ц40 мкм удерживаются в мышце и опухоли практически на одном уровне и составляют около 90% от введенного количества (p>0,25) (рис. 14а и 14б). В последующие сроки уровень активности продолжает снижаться в мышце и опухоли как в случае с 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм, так и 20Ц40 мкм, при этом наиболее заметное снижение относительной активности отмечается из мышечной ткани для микросфер меньших размеров. Выведение 103Pd-МСА из мышечной ткани происходит более быстрыми темпами, чем из опухолевой ткани. 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм выводятся интенсивнее из мышечной ткани, чем 103Pd-МСА диаметром 20Ц40 мкм. Это приводит к достоверным различиям в величинах содержания в мышце меченых МСА диаметром 5Ц10 мкм через 3 сут (p < 0,001), тогда как для 103Pd-МСА диаметром 20Ц40 мкм статистически достоверные различия в этих величинах выявляются только через 10 сут после инъекции препарата. Такая же тенденция сохраняется до 20 сут. Более интенсивная элиминация активности из мышечной ткани в случае 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 мкм по сравнению с 103Pd-МСА 20Ц40 мкм объясняется тем, что более мелкие МСА имеют большую удельную поверхность, а значит и биодеградация их происходит интенсивнее, чем более крупных частиц. Выведение 103Pd из мышечной и опухолевой ткани находится в полном соответствии с закономерностями накопления активности в почках. Чем интенсивнее выводится 103Pd из мышцы и опухоли, тем выше накопление его в почках, что свидетельствует о наличии четкой корреляции между выведением 103Pd из мышечной и опухолевой ткани и накоплением его в почках.

Рис. 14. Накопление активности в опухоли после внутриопухолевого введения 103Pd-МСА

диаметром 5Ц10 мкм (а) и 20Ц40 мкм (б).

Установлено, что размер 103Pd-МСА не оказывает существенного влияния на скорость выведения активности из опухолевой ткани (рис. 15), тогда как в мышечной ткани размеры частиц влияют на этот процесс. Это явление, очевидно, объясняется более слабым кровотоком и, соответственно, низкой интенсивностью метаболических процессов в центре опухоли по сравнению с мышечной тканью.

Результаты сравнительных исследований фармакокинетики в организме мышей-опухоленосителей 103Pd-МСА, с инкорпорированным радионуклидом по всему объему частиц, и 188Re-МСА с распределением радионуклида на поверхности частиц показали, что 188Re выводится из опухоли интенсивнее, по сравнению с 103Pd (рис. 16). Эти данные свидетельствуют о том, что радиоактивная

метка, связанная с поверхностью частиц, элиминируется из опухоли сравнительно быстро в результате гидролиза связи радионуклида с белком, а также в результате протеолиза поверхностного слоя МСА.

Рис. 15. Сравнительные данные уровня накопления 103Pd в опухоли после внутриопухолевого введения 103Pd-МСА диаметром 5Ц10 и 20Ц40 мкм (в % от введенного количества).

Рис.16. Сравнительные данные уровня накопления 103Pd-МСА и 188Re-МСА

в опухоли после внутриопухолевого введения.

Дозиметрические характеристики меченых микросфер альбумина

В процессе разработки и биологических испытаний новых диагностических и терапевтических радиофармпрепаратов в первую очередь необходимы сведения о создаваемых ими поглощенных дозах в опухоли, в органах, тканях и во всем организме. Это важно с точки зрения безопасности РФП.

Средние поглощенные дозы внутреннего облучения всего тела и некоторых органов, создаваемые препаратами, меченными диагностическими радионуклидами, такими, как 99mTc (T1/2 = 6 ч), 113mIn (T1/2 = 1,73 ч) и 123I (T1/2 = 13 ч), 131I (T1/2 = 8,04 сут), представлены в табл. 6.

Из данных таблицы видно, что поглощенные дозы во всем организме и органах, создаваемые 131I, на порядок выше по сравнению с 99mTc, 113mIn и 123I. Из перечисленных в табл. 6 органов, в легких формируется наиболее высокая поглощенная доза, в остальных органах дозы сравнительно невелики. Это связано, с тем, что в легких накапливается до 70Ц90% меченых МСА. Из радионуклидов 99mTc, 113mIn и 123I, наименьшая поглощенная доза в легких создается 99mTc.

Таблица 6 - Средние поглощенные дозы в организме и некоторых органов крыс после однократного внутривенного ведения меченых МСА.

№ пп.	Наименование препарата	Средние поглощенные дозы внутреннего облучения, мГр/МБк
№ пп.	Наименование препарата	Все тело	егкие	Щитовидная железа	Печень	Селезенка	Тонкая кишка
1	99mTc-МСА	0,54	20,0	2,00	4,05	2,97	3,51
2	113mIn-МСА	1,11	83,7	1,35	0,49	0,38	0,81
3	123I-МСА	2,78	162,0	9,45	2,78	2,24	2,75
4	131I-МСА	55,8	2214,0	220,3	25,4	22,1	27,0
Погрешность в величинах средних поглощенных доз не превышала 25%

Патологическое состояние легких не оказывает существенного влияния на формирование поглощенной дозы внутреннего облучения. Так, например, при однократном введении 123I-МСА крысам с асептическим воспалением легких средняя поглощенная доза в этом органе составляет 2,83 мГр/МБк, против 2,78 мГр/МБк в легких здоровых животных.

Формирование поглощенной дозы в опухоли практически заканчивается через 15 - 20 суток после внутриопухолевого введения 103Pd-МСА и составляет

120 Гр/ГБк (рис. 17). В прилегающей к опухоли мышце бедра экспериментальных животных через 15 дней после введения 103Pd-МСА накопленная поглощенная доза оказалась в 15 раз меньше, чем доза облучения опухоли, а в критическом органе (почки) накопленная доза облучения в 20 раз меньше поглощенной дозы в опухоли.

При однократном введении 103Pd-МСА в центр опухоли распределения доз внутреннего облучения имеют большую степень неравномерности по объему опухоли. Для получения более равномерного распределения дозы внутри опухоли необходимо вводить препарат в несколько точек опухоли. Расчеты показали, что введение 103Pd-МСА в 10 точек создает однородное распределение поглощенной дозы по всему объему опухоли.

Таким образом, в результате выполненных исследований показано, что при разработке эффективных радиофармпрепаратов, предназначенных для радионуклидной диагностики и терапии онкологических и неонкологических заболеваний, необходимо использовать комплексный подход, включающий изучение фармакокинетических свойств и дозиметрических характеристик. Следуя этому принципу, решена проблема создания ряда эффективных радиофармпрепаратов на основе сывороточного альбумина человека.

Рис. 17. Поглощенные дозы в организме мышей с карциномой Эрлиха после

внутриопухолевого введения 103Pd-МСА диаметром 20Ц40 мкм.

В результате экспериментальных исследований разработаны лиофилизаты с оптимальными составами для получения радиофармпрепаратов на основе генераторного радионуклида 99mTc в условиях клиники непосредственно перед инъекцией пациенту. 99mTc-альбумина прошел доклинические испытания, 99mTc-микросферы альбумина прошел доклинические и клинические испытания, и зарегистрирован в реестре лекарственных средств.

В Ы В О Д Ы

1. Разработана и оптимизирована технология получения РФП л99mTc-альбумин и л99mTc-наноальбумин. Показано, что синтезированные РФП обладают высоким радиохимическим выходом (не менее 95%) и стабильностью in vivo, что подтверждено результатами изучения фармакокинетики РФП в организме лабораторных животных.

2. Экспериментально доказана функциональная пригодность РФП. Показано, что до 50% 99mTc-альбумина от введенного количества в течение трех часов после внутривенной инъекции циркулирует в крови, что позволяет использовать РФП для изучения гемодинамических характеристик; 99mTc-наноальбумин при подкожном введении избирательно накапливается в лимфатичеких узлах, при внутривенном введении - в печени, что позволяет использовать его для сцинтиграфии этих органов.

3. В экспериментальных исследованиях показано, что такие факторы: как дисперсный состав частиц, степень денатурации белка, пространственное распределения радионуклида в частицах, способ введения РФП, химическая природа радионуклида оказывают заметное влияние на фармакокинетику меченых МСА в организме лабораторных животных.

4. 177Lu-МСА, полученные нейтрон-активационным способом, удерживаются в легких крыс на уровне 50% от введенного количества в течение 20 суток после внутривенного введения.

5. Изучение закономерностей инкорпорирования 103Pd в белковую матрицу МСА, исследования влияния температуры денатурации белка и воздействия гамма-облучения на характер поведения 103Pd-МСА в организме лабораторных животных, явилось результатом создания оптимизированной технологии получения нового РФП л103Pd-МСА с оптимальными характеристиками для лечения опухолей.

6. Фармакокинетика меченых МСА в организме кроликов после гамма-облучения легких, индуцированной эмболией легочной артерии и раком легких, показала функциональную пригодность препарата в оценке состояния капиллярного кровотока легких с различными патологическими состояниями.

7. После внутриопухолевого введения мышам-опухоленосителям 103Pd-МСА установлен факт длительного удержания меченого препарата опухолевой тканью.

8. В результате оценки поглощенных доз внутреннего облучения показано, что при внутриопухолевом введении нового терапевтического радиофармпрепарата 103Pd-МСА позволяет осуществлять избирательное облучение опухоли (в 15 раз больше) по сравнению с прилегающими тканями и критическими органами. После внутривенного введения диагностических РФП (113mIn-, 123I- и 99mTc-МСА) наиболее низкие поглощенные дозы внутреннего облучения легких формируются от 99mTc-МСА.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

	Хачиров Дж.Г., Петриев В.М. Радиоизотопная диагностика пневмонии с помощью меченых микросфер альбумина сыворотки человеческой крови (экспериментальное исследование) // Медицинская радиология. Ц 1978. - Т. 23. - № 8. С. 28Ц34.
	Петриев В.М., Степченков В.И., Хачиров Дж.Г. Физические и некоторые радиохимические свойства микросфер альбумина, используемых в радиоизотопной диагностике // Isotopenpraxis. - 1979. - V. 15. - No. 5. - P. 22Ц25.
	Петриев В.М., Хачиров Дж.Г. Диагностика экспериментального рака легких с помощью меченых микросфер альбумина // Медицинская радиология. - 1979. - Т. 24. - № 4. - С. 29Ц34.
	Петриев В.М., Хачиров Дж.Г., Кирьяков М.А. Радиоизотопная диагностика эмболии легочной артерии с помощью меченых микросфер альбумина в эксперименте // Медицинская радиология. - 1979. - Т. 24. - № 8. - С. 31Ц35.
	Dz.G.Chacirov, V.M.Petriev Die vergleichende Beurteilung der markierten Humanserumalbumin-Praparate binsichtlich ihrer Dekorporirung (Experimentaluntersuchung) // Radiobiol. Radiother. - 1980. - V.21. - № 4. - C. 537Ц543.
	Петриев В.М., Степченков В.И. Нейтрон-активационный способ получения меченых микросфер альбумина // Isotopenpraxis. - 1980. - V. 16. - № 6. - P. 202Ц203.
	Петриев В.М., Степченков В.И., Хачиров Дж.Г. Физико-химические свойства меченых микросфер альбумина, получаемых активацией нейтронами // Isotopenpraxis. - 1981. - V. 17. - № 8/9. - P. 315Ц317.
	Петриев В.М., Степаненко В.Ф. Поглощенные дозы в организме и некоторых органах животных при введении меченых микросфер альбумина // Медицинская радиология. - 1981. - Т. 26. - № 9. - С. 60Ц61.
	Цыб А.Ф., Хачиров Дж.Г., Стригунов В.И., Испенкова Л.И., Петриев В.М. Кинетика 131I-микросфер альбумина сыворотки крови человека при их введении в лимфатические сосуды // Медицинская радиология. Ц 1983. - Т. 28. - № 2. - С. 18Ц24.
	Chacirov Dz.G., Ispenkova L.I., Petriev V.M. Tierexperimentelle Radiopharmakokinetik endolymphatisch applizierter markieter Albumin-Mikrospharen zur Diagnostik regionarer Lymphknotentumoren. 3. Mitteilung // Radiology Diagnostic. - 1984. - V. 25. - No. 5. - P. 623Ц628.
	Хачиров Дж.Г., Файзиев И., Испенкова Л.И., Петриев В.М. Изучение распределения ударного объема сердца в организме собак со спонтанным пародонтозом с помощью 125I-микросфер альбумина // Стоматология. - 1986. - Т. 65. Ц № 4. - С. 11Ц13.
	Таиров У.Т., Деденков А.Н., Петриев В.М. Исследование местного капиллярного кровотока с помощью меченых микросфер альбумина при остеотомии верхней челюсти (экспериментальное исследование) // Медицинская радиология. - 1989. - Т. 34. - № 3. - С. 65Ц69.
	Дроздовский Б.Я., Разиев Р.А., Гончарова А.Я., Деденков А.Н., Бродский Р.А., Петриев В.М. Поведение 125I-микросфер сывороточного альбумина в организме кроликов при селективном введении препаратов в печеночную артерию // Медицинская радиология. - 1990. - Т. 35. - № 11. - С. 26Ц29.
	Дроздовский Б.Я., Петриев В.М, Разиев Р.А., Гончарова А.Я. Внутриартериальная селективная терапия цитостатиками и радиофармпрепаратами при злокачественных новообразованиях (обзор) // Вопросы онкологии. - 1992. Ц Т. 38. - № 7 - С. 771Ц777.
	Петрова Г.П., Петриев В.М., Скворцов В.Г. Короткоживущие радионуклиды в экспериментальной ядерной медицине и биологических исследованиях // Ядерная энергетика. - 2000. - № 4. - С. 70Ц75.
	Петриев В.М., Ганжа Е.Г., Рыжикова Т.П. Получение микросфер альбумина, содержащих стабильный рений, для моделирования радиоактивных и нерадиоактивных аэрозолей // Ядерная энергетика. - 2000. Ц № 4. - С. 76Ц79.
Е	Петрова Г.А., Петриев В.М., Скворцов В.Г. Изучение фармакокинетики 99мТс-альбумина крови человека в организме лабораторных животных // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2003. - № 3. - С. 30Ц34.
	Петриев В.М., Скворцов В.Г., Смахтин Л.А., Рыжикова Т.П. Нейтрон-активационный способ получения 166Нo-микросфер альбумина Ц потенциального радиофармпрепарата для лечения онкологических заболеваний // Радиохимия. - 2005. - Т. 47. - № 3, - С. 274Ц277
	Петриев В.М., Скворцов В.Г., Смахтин Л.А., Шутова И.Н. Контроль радионуклидных примесей в 166Нo-микросферах альбумина, получаемых активацией тепловыми нейтронами // Радиохимия. - 2005. - Т. 47, № 3. - С. 278Ц280
	Petriev V.M., Skvortsov V.G., Smakhtin L.A., Ryzhikova T.P.аNeutron Activation Preparation of 166Ho-Albumin Microspheres as a Promising Radiopharmaceutical for Tumor Therapy // Radiochemistry. - 2005. - V. 47. - No. 3. - P.а301Ц304.
	Petriev V.M., Skvortsov V.G., Smakhtin L.A., Shutova I.аN.аMonitoring of Radionuclide Impurities in 166Ho-Albumin Microspheres Prepared by Neutron Activation with Thermal Neutrons // Radiochemistry. - 2005. - V. 47. - No. 3. - P.а305Ц307.
	Петриев В.М., Орлов М.Ю. Радионуклидные примеси в 166Но-микросферах альбумина, образующиеся при облучении тепловыми нейтронами // Ядерная энергетика. - 2006. - № 3. - C. 97Ц104.
	Петриев В.М., Подгородниченко В.К., Рыжикова Т.П., Демидова Н.А., Тарасова Т.А., Сморызанова О.А. Комплексообразующая способность 188-рения с микросферами альбумина крови человека // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук, КН - АКО, РФФИ, Калуга. - 2007. - Вып. 12. - С. 195Ц204.
	Петриев В.М., Закономерности образования комплексного соединения 188Re с микросферами альбумина крови человека // Радиохимия. - 2009. - Т. 51. - № 5. - С. 446Ц451.
	Petriev V. M., Regular trends in complexation of 188Re with human blood albumin microspheres // Radiochemistry. - 2009. - V. 51. - No. 5 - P. 510Ц516.
	Петриев В.М., Ширяев В.К., Смахтин Л.А., Скворцов В.Г. Разработка метода получения 103Pd-микросфер альбумина крови человека - потенциального радиофармпрепарата для лечения злокачественных опухолей. Радиохимия. - 2010. - Т. 52. - № 2. - С. 177Ц180.

	Petriev V.M., Shiryaev V.K., Smakhtin L.A., Skvortsov V.G. Development of a Procedure for Preparing 103Pd-Microspheres of Human Blood Albumin, a Potential Radiopharmaceutical for Treatment of Malignant Tumors // Radiochemistry. - 2010. - V. 52. - No. 2. - P. 207Ц211.
	Скворцов В.Г., Степаненко В.Ф., Петриев В.М., Орлов М.Ю, Крюкова И.Г., Соколов В.А., Борышева Н.Б., Ширяева В.К., Орленко C.П., Хайлов А.М., Цыб А.Ф. Фармакокинетические и дозиметрические характеристики нового радиофармпрепарата 103Pd-микросферы альбумина // Радиационная биология Радиоэкология. - 2010. - Т. 50. - № 6. - С. 703Ц711.
	Степаненко В.Ф., Петриев В.М., Орлов М.Ю., Крюкова И.Г., Соколов В.А., Цыб А.Ф., Скворцов В.Г., Дозы внутреннего облучения организма в экспериментальных исследованиях нового препарата на основе 103Pd и микросфер альбумина для радионуклидной терапии // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук, КН - АКО, РФФИ, Калуга. - 2010. - Вып. 15. - С. 171Ц180.

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog