Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
Союнова Жанна Атамаммедовна
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СВЕЖЕСОБРАННОГО СЫРЬЯ ОТДЕЛЬНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ARTEMISIA L. И ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ НАСТОЕК ИЗ НЕГО
14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Москва - 2012 Диссертационная работа выполнена в Институте гомеопатии и натуротерапии Федерального научного клинико-экспериментального центра традиционных методов диагностики и лечения Росздрава.
Научный консультант:
доктор фармацевтических наук, профессор Киселева Татьяна Леонидовна
Официальные оппоненты:
Прокофьева Вера Ивановна доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Лякина Марина Николаевна доктор фармацевтических наук, зам начальника Управления экспертизы лекарственных средств №3 Центра экспертизы и контроля ГЛС ФГБУ Н - ЭСМП Минздравсоцразвития РФ
Ведущая организация: ГОУ ВПО Курский Государственный медицинский университет.
Защита диссертации состоится л__ _________ 2012 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 117998 Москва, Нахимовский проспект, 49.
Автореферат разослан л___ марта 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д.208.040.доктор фармацевтических наук, профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В современной мировой гомеопатии используются препараты из свежесобранного сырья четырех видов рода полынь: Artemisia absinthium (препарат Аbsinthium), A. vulgaris (препарат Artemisia vulgaris), A. abrotanum (препарат Аbrotanum) и A. cina (препарат Сina). Гомеопатические патогенезы этих препаратов существенно различаются. Поэтому при изготовлении последних особую актуальность приобретает дифференциальная диагностика исходного сырья и гомеопатических матричных настоек (ГМН) из него. Внешние признаки и химический состав Artemisia cina существенно отличаются от других представителей этого рода; ареал вида находится за пределами РФ. Поэтому практический интерес представляет дифференциальная диагностика трех отечественных близкородственных видов: A. absinthium, A. vulgaris и A. abrotanum.
На сегодняшний день нормативная документация (НД) на свежесобранное сырье всех трех видов полыни и ГМН из него отсутствует, поэтому, начиная с 2000 года, они не входят в Государственный реестр лекарственных средств (ЛС) России. За рубежом гомеопатические препараты всех видов полыни применяются в современной медицинской практике. В связи с этим актуальной является разработка характеристик подлинности и показателей качества, а также методик их определения для свежесобранного сырья и ГМН разных видов полыни, используемых в отечественной гомеопатии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является фармакогностическое изучение свежесобранного сырья полыни горькой, полыни божье дерево и полыни обыкновенной, а также ГМН из него для расширения отечественной сырьевой базы и арсенала гомеопатических ЛС.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести информационно-аналитическое исследование для установления степени изученности морфолого-анатомического строения, химического состава и уровня стандартизации исследуемых видов сырья и ГМН из него.
2. Изучить морфологические особенности и анатомическое строение свежесобранного сырья 3 видов полыни в сравнительном аспекте и выявить диагностические признаки каждого из видов сырья.
3. Провести фитохимическое изучение, разработать методики проведения качественных реакций и ТСХ для изучаемых видов полыни и ГМН из него.
4. С помощью разработанных методик провести анализ всех исследуемых объектов в сравнительном аспекте.
5. Выявить характеристики подлинности, позволяющие провести дифференциальную диагностику близкородственных видов свежего сырья разных видов полыни и ГМН из него.
6. Разработать методики количественного определения биологически активных веществ (БАВ) в сырье изучаемых видов полыни и ГМН из него.
7. Разработать числовые показатели для оценки качества лекарственного растительного сырья (ЛРС) изучаемых видов полыни, и показатели качества ГМН из него.
8. Разработать проекты НД на свежесобранное сырье и матричные гомеопатические настойки трех изучаемых видов полыни, удовлетворяющей современным требованиям, предъявляемым к документации такого уровня.
Научная новизна. На основании макро- и микроскопического анализа свежесобранного сырья установлены его морфологоанатомические диагностические признаки, позволяющие провести дифференциальную диагностику близкородственных видов рода полынь (Artemisia L.).
Обоснован выбор групп БАВ для качественного и количественного определения свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево и п. обыкновенной и ГМН из него. С учетом принципа сквозной стандартизации разработаны соответствующие методики.
С помощью разработанных методик качественных реакций и метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) в исследуемом сырье полыни определены терпеноиды, флавоноиды, дубильные вещества и фенолкарбоновые кислоты (ФКК), кумарины и полисахариды. Выявлены различия в составе БАВ в сырье в зависимости от вида полыни.
Впервые изучен терпеноидный состав ГМН 3-х видов полыни в сравнительном аспекте.
Обоснована целесообразность выбора и разработаны методики количественно определения различных групп БАВ в свежесобранном сырье 3-х видов полыни и ГМН из него. Впервые разработаны пока затели подлинности и критерии оценки качества свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево, п. обыкновенной и ГМН из него.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и представлены на утверждение в установленном порядке:
3 проекта ФС на свежесобранное сырье: Полыни божье дерево трава свежая - Artemisia abrotanum herba recens; Полыни горькой трава свежая - Artemisia absinthium herba recens; Полыни обыкновенной корневища и корни свежие - Artemisia vulgaris rhizomata et radices recens 3 проекта ФС на ГМН: Полыни божье дерево настойка матричная гомеопатическая - Tinctura materna homoeopathica Abrotanum; Полыни горькой настойка матричная гомеопатическая - Tinctura materna homoeopathica Absinthium; Полыни обыкновенной настойка матричная гомеопатическая - Tinctura materna homoeopathica Artemisia vulgaris.
Основные положения, выдвигаемые на защиту. На защиту выносятся:
Результаты морфолого-анатомического изучения свежесобранного сырья п. горькой, п. обыкновенной и п. божье дерево и разработки характеристик подлинности сырья и ГМН из него.
Методические подходы и результаты разработки методик качественного и количественного анализа БАВ в сырье трех изучаемых видов полыни и матричных настоек из него.
Результаты разработки критериев оценки качества, норм их содержания и установления сроков годности ГМН и исходного сырья 3-х видов полыни.
Результаты разработки проектов ФС на свежесобранное ЛРС 3-х видов рода Artemisia L. и 3-х ГМН из него с учетом современных требований к качеству лекарственных средств и исходного ЛРС.
Апробация работы. Основные положения проведенных исследований доложены и обсуждены на III и IV Российских гомеопатических съездах (М., 2007 и 2009 г.), Международном форуме Интегративная медицина 2008 (М., 2008 г.), I Российском фитотерапевтическом съезде (М., 2008 г.), III Международном конгрессе Фитотерапия и народная медицина эпохи Авиценны (Таджикистан, Душанбе, 2008 г.), Научной конференции Достижения здравоохранения Туркменистана в эпоху Великого возрождения (Туркменистан, Ашгабат, 2009 г), IV Международном форуме Индустрия Здоровья (М., 2011), II Съезде натуротерапевтов России (М., 2011).
ичный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментальнотеоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 и 6 паспорта фармакогнозии.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в рамках тематики и плана ФНКЭ - ТМДЛ МЗ СР РФ Фармакогностическое изучение некоторых видов полыни и ГМН из него (Договор с МЗ СР РФ № 208/062/001 от 2006 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на 159 страницах и содержит 50 табл., 41 рисунка; состоит из введения, пяти глав, выводов, списка использованной литературы и приложения.
Библиографический указатель включает 183 источников литературы, из них 21 зарубежных.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы. В 1 главе представлены результаты информационно-аналитических исследований по степени изученности объектов: морфолого-анатомических характеристик, химического состава, фармакологической активности и медицинского применения; методов анализа основных действующих веществ и анализу уровня стандартизации.
В Экспериментальную часть включен раздел Объекты и методы исследования и главы 2Ц5, посвященные описанию экспериментальной работы и обсуждению результатов. В разделе Объекты и методы исследования приведены данные об объектах исследования, используемых методах, приборах и реактивах, другие сведения методического характера. Глава 2 посвящена морфолого-анатомическому изучению свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево и п.
обыкновенной. Впервые подробно описаны внешний вид и диагностически значимые микроскопические признаки свежесобранного сырья 3-х видов полыни. В главе 3 излагаются результаты фитохимического исследования свежесобранного сырья изучаемых представителей рода Artemisia L. и ГМН из него. Приводятся данные по разработке методик качественного определения основных групп БАВ изучаемых объектов, а также их обоснование. В главе 4 приводятся результаты разработки методик количественного определения суммы БАВ в свежесобранном сырье и ГМН из него. Глава 5 посвящена стандартизации свежесобранного сырья некоторых представителей рода Artemisia L. и ГМН из него.
Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы графиками и рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования Объектами исследования служили образцы опытных партий свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево, п. обыкновенной, заготовленного в 2006-2009 гг. в Краснодарском крае, Московской, Тульской, Калужской, Курской и Новосибирской областях и ГМН из него. ГМН готовили по ОФС 42-2700-06 Настойки гомеопатические матричные, метод 3.
Использованные методы анализа, реактивы, масса средней и аналитической проб для проведения анализа сырья, приведены в соответствующих разделах ГФ XI и XII изданий. В частности, микроскопический анализ проводили в соответствии со статьей ГФ ХI Техника микроскопического анализа (В.2., с. 277-285) на микроскопе Olympus CX41 (Япония) с окуляром 19х, с объективами 4х, 10х, 20х, 40х и 100х и фотокамерой Olympus DIGITAL CAMERA C-30ZOOM (Япония). Фитохимические исследования проводили с использованием современных физико-химических методов: УФ- и ИК- спектрофотометрия, ГЖХ-МС, ВЭЖХ, а также ТСХ. Валидацию ана литических методик проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 57253-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений.
Морфолого-анатомическое изучение свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево и п. обыкновенной Впервые изучены и описаны в сравнительном аспекте морфолого-анатомические признаки травы и подземных органов 3-х видов полыни и выявлены их отличительные диагностические признаки, позволяющие дифференцировать близкородственные виды сырья, используемые, в том числе, в гомеопатии. На основании полученных в результате выполнения настоящей работы экспериментальных данных, составлены итоговые таблицы, имеющие практическое значение при диагностике исследуемых видов сырья (табл. 1-4).
Установлено, что сырье изучаемых видов рода полынь имеет существенные различия по ряду внешних признаков, которые могут быть использованы для их дифференциальной диагностики по форме, размеру, цвета листа и характеру его опушения; характеру ветвления, опушению и цвету стебля (табл. 1-2).
К анатомо-диагностическим признакам листьев п. горькой нами отнесены: наличие устьичного аппарата и крупных овальных эфиромасличных железок, расположенных в 2 ряда и 4 яруса, по обе стороны листовой пластинки; многочисленные Т-образные волоски. К анатомо-диагностическим признакам листьев п. божье дерево отнесены:
часто встречающийся устьичный аппарат аномоцитного типа по обе стороны листовой пластинки, наличие неспецифических паренхимных клеток с эфирным маслом (табл. 3).
К анатомо-диагностическим признакам корневищ и корней п.
обыкновенной отнесены: толстый слой перидермы; многоугольная и округлая форма клеток паренхимы; сгруппированные волокна твердого луба под вторичной ксилемой; сильно развитая флоэма; клетки запасающей паренхимы, формирующие своеобразный "замыкающий слой" годичных колец (табл. 4).
Таблица Сравнительная таблица внешних признаков свежих листьев 3-х видов рода Artemisia L.
Морфологич. Результаты исследования, имеющие диагностическое значение признак A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum Черешковые - треугольно- С очень коротким череш- Черешковые - овальокруглой формы, дважды- ком или без него, эллип- ные глубоко рассетрижды перисторассечен- тические или яйцевид- ченные на узкоФорма ные на линейно- ные, перисторассеченные линейные дольки, листьев продолговатые и тупоза- на линейно-ланцетные, мелкие - дважды пеостренные дольки. Без че- крупнозубчатые или ло- ристорассеченные с решков - тройчатые, пери- пастные доли, со слегка узколинейными сегстораздельные завернутыми вниз краями ментами Дл. 4-8 см, шир. 3-Размеры Дл. 4-12 см, шир. 3-7 см Дл. 5-10 см, шир. 3-7 см см Характер Сетчатое Сетчатое Сетчатое жилкования Характер края Цельный Цельный Цельный Сверху голые или негусто Опушение Густое с обеих сторон паутинисто-волосистые; Отсутствует снизу беловойлочные Сверху зеленый, снизу серовато-белый из-за Цвет Серовато-зеленый Синевато-зеленый обильного войлочного опушения Запах Ароматный Ароматный Ароматный Вкус Пряно-горький Пряно-горький Пряно-горький Таблица Сравнительная характеристика внешних признаков свежей травы 3-х видов рода Artemisia L.
Морфологический Результаты исследования, имеющие диагностическое значение признак A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum Форма Ребристый Ребристый Ребристый Характер ветв- Коротковетвистый Многократноветвистый в Неветвящийся ления верхней части Опушение Густое Прижатоопушенный Голый Цвет Серовато-зеленый Красновато-фиолетовый Буроватый Расположение Очередное Очередные Очередные Сложность Простые Простые Простые лист. пласт.
Стеблевые: черешковые, Эллиптические, перисторас- Нижние: овальные, глубоко округло-треугольные, два- сеченные на крупнозубчатые рассеченные на узкожды или трижды перисто- или лопастные доли. Листья линейные дольки; средние:
Форма рассеченные. Верхушечные: в соцветиях трех- или пяти- дважды перисторассеченсидячие, цельные или трех- рассеченные; верхние: цель- ные с узколинейными сеграздельные ные, ланцетные ментами; верхние: тройчатые до цельных Характер жиСетчатое Сетчатое Сетчатое кования Характер края Цельный Цельный Цельный Опушение Сверху голые или негусто Густое с обеих сторон листа волосистые; с нижней сто- Голые роны беловойлочные Цвет Сверху зеленые, снизу сероСеровато-зеленые Синевато-зеленые вато-белые Стебель Листья Таблица 2 (продолжение) Соцветие A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum Шаровидные корзинки, об- Продолговатые корзинки, Шаровидные корзинки, образующие метельчатое со- образующие метельчатое разующие узкое густое мецветие соцветие тельчатое соцветие Продолговато овальные, По краю пленчатые, наруж- Наружние - травянистые, наружные почти одинаковой ные яйцевидные, заострен- продолговато-эллиптичесЛисточки длины с внутренними, по ные; внутренние длиннее, кие; внутренние - эллиптиобертки спинке вогнутые, по краю эллиптические, тупые ческие, по краю пленчато широкопленчтые окаймленные; обертка сла бо и коротко-волосистая Цветоложе выпуклое, по- Краевые пестичные с узко- Краевые пестичные, в числе крыто белыми лентообраз- трубчатым венчиком; сред- 8; венчик узкотрубчатый, ными, чешуйчатыми плен- ние - обоеполые с 5 лопа- двузубчатый. Лопасти ками. Цветки мелкие, стями. Тычинок 5 с пыльни- рыльца выставляющиеся, Строение цветнаружные трубчатые - пе- ками. Пестик с нижней од- линейные, усеченные, ка стичные, внутренние ворон- ногнездной завязью и 2 ото- обычно более или менее ковидные - обоеполые гнутыми наружу рыльцами изогнутые; цветов диска в 14-16, венчик трубчатый, точечно-железистый Корзинки диаметром Корзинки длинной 3-4 мм и Корзинки диаметром Размеры 2,5-4,0 мм шириной 1,5-3,0 мм 2,0-2,5 мм Опушение Нет Нет Нет Цвет Желтый Красноватый Желтый Запах Ароматный Ароматный Ароматный Вкус Пряно-горький Пряно-горький Пряно-горький Цветки Таблица Сравнительная характеристика анатомического строения листьев 3-х видов рода Artemisia L.
Результаты исследования, имеющие диагностическое значение Микроскопический признак A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum Верхний С извилистыми С извилистыми С извилистыми Клетки эпидермис стенками стенками стенками эпидермиса Нижний То же То же То же эпидермис Клетки окружены 3- Клетки окружены 3-Верхний 5 клетками Нет клетками эпидермис Устьичный (аномоцитный тип) (аномоцитный тип) аппарат Клетки окружены 3-Нижний То же клетками (аномоцитный То же эпидермис тип) Эфиромасличные железки Неспециализированные Верхний Редко расположенные по паренхиматозные эпидермис Овальные Эфиромасличные листовой пластинке клетки вместилища Нижний То же Овальные То же эпидермис Верхний Т-образные; головчатые; Нет Т-образные эпидермис простые Волоски Нижний Т-образные; головчатые; То же То же эпидермис простые и войлочные Таблица Сравнительная характеристика анатомического строения корней 3-х видов рода Artemisia L.
Анатомическая Латинское название вида полыни структура A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum Состоит из прямоуголь- Состоит из прямоугольных клеток, Состоит из рыхлого и Перидерма ных клеток, образующих расположенных в несколько рядов толстого слоя темнотонкий слой и образующих толстый слой коричневых клеток, Коровая па- Клетки крупные; вытя- Толстый слой клеток многоуголь- Тонкий слой клеток ренхима нуты по ширине ной или округлой формы округлой формы Располагаются в связи с Располагаются в связи с первичной Располагаются в связи с Вместилища первичной флоэмой; расфлоэмой первичной флоэмой сеяны во вторичн. флоэме Перицикл Имеется Имеется Имеется Волокна сгруппированы в Волокна сгруппированы в комплекТвердый луб Слабо развит комплексы под ВК, обрасы под ВК зуя кольца Флоэма Имеется Сильно развита Имеется Камбий Имеется Заметен толстым и темным кольцом Имеется Клетки запасающей паренхимы форВторичная Имеется мируют своеобразный "замыкающий Сильно развита ксилема (ВК) слой" годичных колец Первичная Имеется Имеется Имеется ксилема Фитохимическое изучение свежесобранного ЛРС полыни и ГМН из него В результате информационно-аналитического исследования нами установлено, что доминирующими группами БАВ в ЛРС изучаемых видов полыни являются флавоноиды, эфирные масла, сесквитерпеновые лактоны, кумарины и фенолкарбоновые кислоты. Поэтому при разработке характеристик подлинности и показателей качества ГМН и исходного сырья (с учетом принципа сквозной стандартизации) нами были разработаны методики качественного и количественного определения именно этих групп БАВ.
При разработке методики качественных реакций предложена стадия предварительного фракционирования исследуемых матричных настоек с применением растворителей различной полярности, и последующим обнаружением БАВ в органической и неорганической фазах.
Экспериментальные данные, полученные в ходе разработки показателей подлинности (качественные реакции и ТСХ), сведены нами в итоговую таблицу (табл. 5), имеющую диагностическое значение при анализе сырья 3-х исследуемых видов полыни и ГМН из него в сравнительном аспекте.
С помощью метода ГЖХ-МС определен компонентный терпеноидный состав ГМН из сырья изучаемых видов полыни, основанный на сравнении времен удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными библиотеки масс-спектрометрических данных каталогов Wiley 275 и др.
Впервые изучен терпеноидный состав подземных частей полыни обыкновенной. В отличие от литературных данных, указывающих на наличие только двух компонентов терпеноидной природы, нами обнаружено и идентифицировано 10 компонентов с 95 % вероятностью.
В ГМН изучаемых видов полыни, обнаружены компонентымаркеры, имеющие диагностическое значение при исследовании их подлинности по терпеноидному составу: -пинен, сесквифилландрен эвгенол, кариофиллен, -мирцен, туйон. Для количественного определения компонентов в эфирном масле необходимо проведение дополнительного исследования с применением стандартов.
Рис.1. Хроматограммы ГМН из сырья разных видов полыни, полученные методом ГЖХ-МС: 1 - ГМН п. горькой; 2 - ГМН п.
божье дерево; 3 - ГМН п.
обыкновенной (корневища и корни); 4 - ГМН п. обыкновенной (трава) Анализатор: Газовый хроматограф Agilent 58c масс-спектрометрическим детектором серии 5973 (лAgilent Technologic, США); Колонки Innowax 19091N- 133 E (США), 0,25 0,25 мм.
Впервые в сравнительном аспекте методом ВЭЖХ изучен компонентный состав фенолкарбоновых кислот (ФКК) в ЛРС и ГМН 3-х видов полыни. Идентифицированы: хлорогеновая, кофейная, кумароилхинная, дикофеоилхинная и др. кислоты. Впервые изучено соотношение изомеров 3-кофеоилхинной (3-QCA), 4-кофеоилхинной (4QCA) кислот по отношению 5-кофеоилхинной (5-QCA). С использованием разработанного метода показано, что основным компонентом группы фенолокислот в водно-спиртовых экстрактах из свежесобранного сырья изучаемых видов полыни и ГМН из него является 5-QCA (основной изомер хлорогеновой кислоты), обладающей, по литературным данным, антимикробным, противовирусным, антиоксидантным и противомутагенным действием.
Определение количественного содержания БАВ в свежесобранном ЛРС полыни и ГМН из него В результате проведенного информационно-аналитического исследования, а также собственных экспериментальных исследований, установлено, что в сырье п. горькой и п. божье дерево содержатся следующие группы БАВ: флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, органические кислоты, эфирные масла и др. В соответствии с действующими Методическими рекомендациями Росздравнадзора по стандартизации лекарственных средств (2008 г), алкалоиды и эфирные масла, содержащиеся в ЛРС, используемом в гомеопатии, подлежат обязательному количественному нормированию.
Таблица Результаты разработки характеристик подлинности (качественные реакции и ТСХ) свежесобранного сырья A. absinthium, A. vulgaris и A. аbrotanum и ГМН из него Характеристики Результаты исследования, имеющие диагностическое значение подлинности ЛРС ГМН 1.Кач. р-ции A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum 1.1. На флавонои- Окраска раствора Окраска эфирной фракции:
ды (цианидиновая Розовая Отриц. Насыщ. красн. Фиол.-розовая Отриц. Интенс.проба) красн.
Окраска водной фракции:
Фиол.-розовая Отриц. Интенс.красн.
1.2. На кумарины с Окраска раствора после добавления 5 % раствора NaOH:
NaOH, последующим Желтая Темн.-желтая Желтая Желтая Темн.-желтая Желтая проведением диазоОкраска раствора после добавления диазореактива реакции Корич.-красн. Темно-красн. Красн.-оранж. Корич.-красн. Темно-красн. Красн.оранж.
1.3. На сесквитерп. Красно- Отриц. Отриц. Красно- Отриц. Отриц.
актон абсинтин с оранж. окр., оранж. окр., Na2[Fe(CN)5NO] перех. в тём- перех. в тёмно-бордов. но-бордов.
1.4. А. На полисаха- - А. Хлопьевидн. - - А. Хлопьевидн. - риды с 95% спиртом. сгустки, вып. в сгустки, вып. в Б. Восстанавливающ. осадок при сто- осадок при стосахара с р-вом Фел- янии. Б. Оранж. янии. Б. Оранж.
инга красн. осадок красн. осадок Таблица 5 (продолжение) 2. Гистохим. р-ции: ЛРС ГМН А: С р-ром I2 (на от- А. Реакция от- - - - - сутств. крахмала). риц. Б. Красн- Б: С 20% р-ром - фиол. или нафто ла или тимола оранж.-красн.
(инулин). окр. В. Желтое В: С раствором ам- окраш.
миака (слизь) 3. ТСХ Rf: 0,18; 0,40; - Rf: 0,21; 0,25; Rf: 0,18; 0,40; - Rf: 0,21; 0,25;
3.1. Флавоноиды - 0,50; 0,55; 0,95 0,30; 0,40; 0,50; 0,55; 0,95 0,30; 0,40;
этилацетат : муравь0,55; 0,72; 0,55; 0,72;
иная кислота : вода - 0,90; 0,95 0,90; 0,80:10:- Rf: 0,38; 0,46; - - Rf: 0,38; 0,46; - 3.2. ФКК - ацетон :
6,5; 7,8 6,5; 7,метиленхлорид - 5:- - Rst: 0,17; 0,24; - - 3.3. Терпеноиды - Rst: 0,17; 0,24;
0,52; 0,57;
толуол : уксусная 0,52; 0,62;
0,62; 0,66;
кислота : ацетон - 0,66; 0,93;
0,78; 0,93; 1,: 10 : 1,3.4. Кумарины А. Rf: 0,15; А. Rf: 0,15; А. Rf: 0,15; А. Rf: 0,15; А. Rf: 0,15; А. Rf: 0,15;
А. Этилацетат - бен- 0,23; 0,33 0,23; 0,33 0,23; 0,52 0,23; 0,33 0,23; 0,33 0,23; 0,зол - 1:2.
Б. Н-бутанол : ледяная уксусная кислота - - Б. Rf: 0,45; - - Б. Rf: 0,45;
: вода - 68 : 16 : 16 0,55; 0,90; 0,98 0,55; 0,90; 0, Поэтому нами была предпринята попытка выделения эфирных масел из ЛРС изучаемых видов полыни с водяным паром (по фармакопейной методике) из навески 50 г в течение 4 часов. В результате экспериментального исследования были получены следовые количества эфирного масла, не достаточные для его достоверного количественного определения, что согласуется с данными литературы. Поэтому включение в НД методики количественного определения эфирного масла мы сочли нецелесообразным.
В сырье п. горькой и п. обыкновенной алкалоиды нами обнаружены не были. Неоднозначные данные приводятся в литературе об алкалоидном составе п. божье дерево. Исходя из библиографических данных, единственный алкалоид, препаративно выделенный из полыни божье дерево, - абротанин - кристаллическое двутретичное основание, структурная формула которого СH21O22N2.
Поэтому нами была предпринята попытка количественного определения алкалоидов с помощью адаптированной методики количественного определения алкалоидов неизвестного строения в высушенном сырье (Г.Н. Бузук, Т.М. Медведева, 1983 г). При анализе сырья полыни на содержание алкалоидов воспроизводимые результаты получены не были. В частности, положительные результаты дал только образец 2009 г., собранный в Курской области: слабовыраженные осадки в случае с фосфорномолибденовой и пикриновой кислотой. Поэтому дальнейшую разработку методики количественного определения алкалоидов мы сочли нецелесообразной.
Доминирующей группой БАВ в сырье п. горькой и п. божье дерево являются флавоноиды. Поэтому нами были разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов, а показатель содержания суммы флавоноидов предложен в качестве одного из критериев доброкачественности ЛРС п. горькой и п. божье дерево, а также ГМН из него.
Сырьем п. обыкновенной в гомеопатии являются подземные органы, собранные поздней осенью и в начале зимы, когда накопление флавоноидов минимально, но, по данным литературы, возрастает содержание ФКК. Поэтому в качестве одного из критериев доброкачественности сырья и ГМН п. обыкновенной нами предложено содержание суммы ФКК.
Для количественного определения суммы флавоноидов в сырье и ГМН нами предложен спектрофотометрический метод после реакции комплексообразования со спиртовым раствором AlCl3. Результаты исследований по обоснованию выбора рабочего стандартного образца представлены на рисунке 2. В качестве стандарта выбран раствор СО рутина (= 4102 нм), максимум спектра поглощения комплекса которого со спиртовым раствором AlCl3 близки с таковым извлечения из свежесобранного сырья п. горькой (=4022 нм), п. божье дерево (=4082 нм) (рис. 2).
Рис. 2. УФ-спектры продуктов реакции комплексообразования с % спиртовым р-ром АlCl3: 1 - нарингенин; 2 - лютеолин-7гликозид; 3 - кверцетин; 4 - рутин; 5 - водно-спиртовое извлечение п. божье дерево; - водно-спиртовое извлечение п. горькой.
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в ЛРС полыни горькой и полыни божье дерево представлены в таблице 6. Ошибка опытов с добавками СО рутина (в трех повторностях) - соответственно 2,0 % и 1,3 %.
Таблица Метрологические характеристики методик количественного определения суммы флавоноидов в свежесобранном сырье п. горькой и п. божье дерево Вид сырья n f S P (%) t (Р, f) х х , % 3, % П. горькая 7 6 1,09 0,0153 95 2,45 0,0374 3,43 1,II. божье 7 6 2,14 0,0168 95 2,45 0,0412 1,92 1,дерево Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в ГМН из сырья п. горькой и п. божье дерево представлены в таблице 7.
Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в ГМН полыни горькой и полыни божье дерево х Объект ис- n f S P (%) T (Р;f) х , % 3, % следования П.горькая 7 6 0,61 0,008 95 2,45 0,01 3,21 1,П. божье 7 6 0,89 0,0137 95 2,45 0,03 3,77 2,дерево Отсутствие систематической ошибки методик доказано при помощи опытов с добавками СО рутина при проведении анализа в трех повторностях и составляет не более 3,1 % и 2,9 % для ГМН п.
горькой и п. божье дерево соответственно, что находится в пределах ошибки единичного определения.
Разработана спектрофотометрическая методика количественного определение ФКК в ЛРС и ГМН из свежесобранного сырья п.
обыкновенной. При изучении водно-спиртовых извлечений и ГМН п.
обыкновенной было обнаружено, что их спектры в УФ области совпадают со спектром хлорогеновой кислоты (максимум при 3302 нм, второстепенный максимум при 3002 нм) (Рис. 3), поэтому было решено проводить определение суммы ФКК в изучаемых объектах в пересчете на хлорогеновую кислоту.
УФ-спектры: 1 - СО хлоРис. 3.
рогеновой кислоты; 2 - ГМН п. обыкновенной; 3 - водно-спиртового извлечения из свежесобранного сырья п. обыкновенной; 4 - растворитель (плацебо).
Относительная ошибка единичного определения разработанной методики количественного определения суммы ФКК в пересчете на хлорогеновую кислоту и абсолютно сухое сырье п. обыкновенной не превышает 2,4 %, а для ГМН 3,2 % (табл. 8). При проведении анализа в трех повторностях соответственно 1,4 % и 1,8 %. Для подтверждения отсутствия систематической ошибки проведены опыты с добавками хлорогеновой кислоты. При проведении анализа в трех повторностях ошибка опытов с добавками находится в пределах ошибки единичного определения и составляет соответственно 2,3 % и 2,9 %.
Таблица Метрологические характеристики методик количественного определения суммы ФКК в свежесобранном ЛРС и ГМН п.
обыкновенной Объект иссле- n f S P (%) t (Р, f) х х , % 3, % дования ЛРС п. обык- 7 6 1,24 0,0120 95 2,45 0,0295 2,37 1,новенной ГМН п. обык- 7 6 0,85 0,0111 95 2,45 0,02 3,19 1,новенной С помощью методов валидации показано, что методики количественного определения флавоноидов и ФКК в изучаемых объектах воспроизводимы.
Разработка показателей качества и установление сроков годности ЛРС и ГМН 3-х видов полыни На основании результатов анализа 9 лабораторных серий ГМН и исходного сырья различных сроков и мест заготовки, для определения доброкачественности нами предложены критерии оценки качества и нормы их содержания, представленные в таблице 9.
На основании результатов экспериментальных исследований в процессе естественного хранения срок годности ГМН из свежесобранного сырья 3-х видов полыни установлен 2 года. Условия хранения: в защищенном от света месте при температуре не выше 25С во флаконах из стекломассы оранжевого светозащитного стекла с винтовой горловиной, навинчивающими пластмассовыми крышками по ОСТ 64-2-87-91.
Таблица Результаты анализа 9 лабораторных серий ГМН и исходного сырья 3-х видов полыни Критерии оценки Нормы содержания, % качества ЛРС A. absinthium A. abrotanum A. vulgaris Сумма флавоноидов не менее 0,8 не менее 1,5 - Сумма ФКК - - не менее 0, Таблица 9 (продолжение) Влажность не менее 60 не менее 60 не менее Зола не более 13 не более 13 не более Зола, нераств. в 10 не более 3 не более 1 не более % р-ре HCL Органич. примесь не более 1 не более 0,5 не более 0,Минер. примесь не более 1 не более 0,5 не более Критерии оценки качества ГМН Сумма флавоноидов не менее 0,5 не менее 1,0 - Сумма ФКК - - не менее 0,Плотность 0,900-0,920 0,895-0,915 0,900-0,9Сод. тяжелых Ме не более 0,001 не более 0,001 не более 0,0Сухой остаток не менее 1,8 не менее 2,3 не менее 1,Микробиол. чисто- категория 4 Б категория 4 Б категория 4 Б та Примечание к таблице 9: рекомендуемые нормы содержания влажности были определены с учетом сроков годности свежесобранного сырья (24 часа).
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. В связи с отсутствием современной НД на ГМН и исходное сырье 3-х видов полыни, используемых в гомеопатии, проведено их фармакогностическое изучение. При морфологоанатомическом исследовании свежесобранной травы и подземных органов A. absinthium, A. vulgaris, A. аbrotanum выявлены их диагностические признаки и составлены сравнительные таблицы, имеющие практическое значение для достоверной идентификации исследуемых видов сырья.
2. Проведено фитохимическое изучение сырья 3-х исследуемых видов полыни и ГМН из него. С использованием качественных реакций и ТСХ подтверждено наличие в них основных групп БАВ. Экспериментально разработанные показатели подлинности (качественные реакции, ТСХ), сведены в итоговую таблицу, имеющую диагностическое значение при анализе сырья. Впервые в сравнительном аспекте методом ГЖХ-МС изучен качественный состав терпеноидной фракции ГМН из сырья A. absinthium, A. vulgaris, A. аbrotanum; методом ВЭЖХ - качественный состав фенолкарбоновых кислот ГМН и исходного сырья 3х видов полыни.
3. Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения суммы флавоноидов в свежесобранной траве п.
горькой и п. божье дерево и ГМН из него в пересчете на рутин.
Разработана методика количественного определения фенолкарбоновых кислот в свежесобранных корневищах и корнях и ГМН п. обыкновенной в пересчете на хлорогеновую кислоту.
4. Разработанные характеристики подлинности и доброкачественности свежесобранного сырья и ГМН из него, включены в проекты ФС: Полыни горькой трава свежая, Полыни божье дерево трава свежая, Полыни обыкновенной корневища и корни свежие, Полыни горькой гомеопатическая матричная настойка, Полыни божье дерево гомеопатическая матричная настойка, Полыни обыкновенной гомеопатическая матричная настойка.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Киселева Т.Л., Цветаева Е.В., Устынюк Л.А., Союнова Ж.А., Горошко О.А.
Разработка методики проведения ТСХ для обнаружения флавоноидов и кумаринов в матричных настойках из сырья различных видов полыни. // Традиционная медицина. 2007. - №3(10). - С. 34-39.
2. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Цветаева Е.В., Устынюк Л.А.
Разработка методик определения подлинности матричных настоек из сырья различных видов представителей рода Artemisia L.
Публикация 1: Качественные реакции. / Сб. науч. тр. III Российского гомеопатического съезда, г. Москва, 19-21 октября 2007 г. - М.: Изд-во ФНКЭ - ТМДЛ Росздрава, 2007. - С. 401-411.
3. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Устынюк Л.А., Горошко О.А.
Разработка методик определения подлинности матричных настоек из сырья различных видов представителей рода Artemisia L.
Публикация 2: Получение хроматографического портрета методом ТСХ. / Сб. науч. тр. III Российского гомеопатического съезда, г.
Москва, 19-21 октября 2007 г. - М.: Изд-во ФНКЭ - ТМДЛ Росздрава, 2007.
- С. 411-417.
4. Фролова Л.Н., Союнова Ж.А., Киселева Т.Л. Лечебное применение некоторых видов полыней в народной и официальной медицине разных стран. // Традиционная медицина. - 2008. - № 3 (14). - С. 49-56.
5. Фролова Л.Н., Киселева Т.Л., Цветаева Е.В. Союнова Ж.А., Люй Годун.
Морфолого-анатомическое изучение сырья Artemisia vulgaris L. - Полыни обыкновенной, применяемого в традиционной медицине России и Китая // Традиционная медицина. - 2008. - № 4 (15). - С. 44-50.
6. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л. Химический состав лекарственного растительного сырья некоторых представителей рода Artemisia L. / Сб. науч. тр.
1-го Российского фитотерапевтического съезда, Москва, 14-16 марта 2008 г., - М.: Изд-во ФНКЭ - ТМДЛ Росздрава, 2008. - С. 256 -262.
7. Союнова Ж.А. Разработка качественных реакций для обнаружения алкалоидов в гомеопатических матричных настойках из различных видов полыней / Сб. науч. тр. Международного форума Интегративная медицина 2008, г.
Москва, 6-8 июня 2008 г. - М.: Изд-во ФНКЭ - ТМДЛ Росздрава, 2008. - С.
161-164.
8. Фролова Л.Н., Союнова Ж.А., Киселева Т.Л. Лечебное применение полыни божье дерево в народной и официальной медицине разных стран. / Сб. науч.
тр. III Международного конгресса Фитотерапии и народной медицины эпохи Авиценны, г. Худжант, 31мая 2008 г. - Худжант: Изд-во Академии наук Республики Таджикистан, 2008. - С. 252-255.
9. Киселёва Т.Л., Фролова Л.Н., Союнова Ж.А., Коновалова Е.В., Мельникова Н.Н., Цветаева Е.В. Морфолого-анатомическое изучение свежесобранного сырья Artemisia absinthium L. - полыни горькой, применяемой в гомеопатии // Традиционная медицина. - 2009. - № 1 (16). - С. 20-24.
10. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Чаузова А.В. Разработка методов количественного определения биологически активных веществ в гомеопатических матричных настойках из свежесобранного сырья некоторых представителей рода Artemisia L. / Сб. науч. тр. междунар. науч. конф. достижения здравоохранения Туркменистана в эпоху великого возраждения, г. Ашхабат, Туркменистан, 21-23 июля 2009 г. - Ашх.: Изд-во Министерства Здравоохранения Туркменистана, 2009. - С. 274.
11. Союнова Ж.А., Чаузова А.В., Киселева Т.Л., Куркова М.В., Горошко О.А.
Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в гомеопатической матричной настойке из свежесобранного сырья полыни божье дерево / Сб. науч. тр. IV Российского гомеопатического съезда, г.
Москва, 24 октября 2009 г. - М.: Изд-во ФНКЭ - ТМДЛ Росздрава, 2008. - C. 87-90.
12. Чаузова А.В., Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Куркова М.В., Горошко О.А.
Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в гомеопатической матричной настойке из свежесобранного сырья полыни горькой / Сб. науч. тр. IV Российского гомеопатического съезда, г. Москва, 24 октября 2009 г. - М.: Изд-во ФНКЭ - ТМДЛ Росздрава, 2009. - С. 94-97.
13. Киселева Т.Л., Союнова Ж.А., Чаузова А.В. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в свежесобранном сырье полыни божье дерево / Сб. науч. тр. Нучно-практичекой конференции Гомеопатия в современной клинической практике г. Москва, 23 октября 2010 г. - М.: Изд-во НО Профессиональная ассоциация натуротерапевтов, 2010. - С.
190-194.
14. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Чаузова А.В. Хромато-массспектрометрическое изучение терпеноидного состава ГМН из сырья некоторых представителей рода Artemisia L. / Сб. науч. тр. Нучно-практичекой конференции Гомеопатия в современной клинической практике г. Москва, 23 октября 2010 г. - М.: Изд-во НО Профессиональная ассоциация натуротерапевтов, 2010. - С. 190-194.
15. Киселева Т.Л., Союнова Ж.А., Чаузова А.В. Сравнительное изучение компонентного состава фенолкарбоновых кислот в свежесобранном сырье отдельных представителей рода Aretemisia L. и ГМН из него // Фармация. - 2012. - № 3 (8). - С. (в печати).
16. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Медведев Ю.В. Изучение состава фенолкарбоновых кислот отдельных представителей рода Artemisia L. методом ВЭЖХ-МС// Сборник научных трудов II Съезда натуротерапевтов России Современная натуротерапия с позиций доказательной медицины и Научно-практической конференции Средства и методы традиционной китайской медицины в России, г. Москва, 19-20 апреля 2011 г. - М.: Издательство Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2011. - С. 29-30.
17. Teneshayeva A.K, Soyunova J.A., Kiseleva T.L., Determenation method of biologically active substances in matrix tinctures out of varius wormwood species // Turkmenistan lukmanylygy. - 2008. - № 6 (40). - P. 35-38.
18. Frolova L.N., Kiseleva T.L., Karpeev A.A., Soyunova J.A., Tsvetayeva E.V., Lu Guodong. Morphologo-anatomic study of Artemisia vulgaris L - wormwood raw material used in traditional medicine of Russia and China. 6th International symposium on TCM and 10th International symposium on acupuncture and moxibustion: Collection of papers. ЦUniversity of Traditional Chinense Medicine, International University of Traditional Chinense Medicine, English edition, 2008. - P.
292.
Список сокращений:
БАВ биологически активные вещества ГФ Государственная фармакопея ГМН гомеопатическая матричная настойка ЛРС лекарственное растительное сырье ЛС лекарственные средства НД нормативный документ СО стандартный образец ТСХ тонкослойная хроматография ФС Фармакопейная статья ФКК фенолкарбоновые кислоты
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине