Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по разное
На правах рукописи
Баева Вера Михайловна
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-
-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
15.00.02- фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук
Москва - 2009
Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия
имени И.М. Сеченова Росздрава и в НИИ физизико-химической биологии им. А.Н. Бело-зерского МГУ им. М.В.Ломоносова
Научные консультанты:
член-корр. РАМН, доктор фармацевтических наук
профессор Ирина Александровна Самылина
академик РАЕН, доктор биологических наук
профессор Андрей Сергеевич Антонов
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук,
профессор Сокольская Татьяна Александровна
доктор фармацевтических наук Баландина Ирина Анатольевна
доктор фармацевтических наук,
профессор Патудин Александр Васильевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО Ярославская Государственная
медицинская академия
Защита состоится л л___________2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09. при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова
(г. Москва, Никитский бульвар, 13).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49).
Автореферат разослан л 2009г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д.208.040.09.
доктор фармацевтических наук, Наталья Петровна Садчикова
профессор
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Перспективность исследований лекарственных растений народной медицины несомненна для современной отечественной фар-мации. При введении таких растений в медицинскую практику в первую оче-редь следует проводить целый комплекс исследований, устанавливающих их видовую принадлежность и очерченностъ границ вида.
Во многих родах, в том числе и лекарственных растений с богатым видовым составом,отмечено такое широко распространенное явление, как полиморфизм, который затрудняет видовую идентификацию растений при осуществлении за-готовки лекарственного растительного сырья и создает необходимость опреде-ления глубины этой изменчивости на уровне генома растения.
Многие лекарственные растения обладают аберратными формами размноже-ния (например, апомиксисом) или склонны к образованию межвидовых гибри-дов. Эти проблемы характерны для большого числа лекарственных растений семейств: розоцветные, бобовые, гречишные, кипрейные, сложноцветные и др. Некоторые виды из этих семейств применяются в научной медицине, а такие как представители рода манжетка, язвенник, ястребинка, кипрей и многие дру-гие являются перспективными для отечественной научной медицины. Разработка оптимальных методик изучения лекарственных растений будет спо-собствовать сохранению ценных сырьевых ресурсов (В.В.Алёхин, 1938).
В связи с этим вопросы совершенствования определения равноценности ви-дов при изучении лекарственных растений с использованием новейших дости-жений науки обоснованы и своевременны. Актуально введение в практику оте-чественного здравоохранения новых видов лекарственного растительного сы-рья и расширение ассортимента препаратов обладающих противовоспалитель-ным, противоопухолевым лимфотропным и др., действием.
Также актуальным является расширение арсенала методов определения под-линности. Это может быть сделано в настоящее время, в частности с привлече-нием наиболее современных и перспективных молекулярно-биологических ме-тодов.
Известно, что манжетки способны образовывать агамный комплекс (V.Grant, 1981), который находится на стадии поздней зрелости и его агамоспермная су-перструктура достигает полного развития.Такие популяции являются непрерыв ным источником возникновения агамоспермных микровидов.
В роде манжетка выделено четыре группы, одна из которых - Vulgares не яв-ляется монотипной и её границы до сих пор не ясны (S. Frhner, 1986),так как описано несколько амфимиктических видов и множество апомиктических ага-мных видов. Манжетки этой группы предложено трактовать, как агамный ком-плекс (V.Grant, 1981). Для некоторых из них в пределах Европейской части России установлен факультативный апомиксис (К.П.Глазунова, 1977,1987). У манжетки обыкновенной высокая изменчивость проявляется в наличии много-численных форм,групп особей или отдельных экземпляров,среди которых мно-гие агамные виды описаны по морфологическим признакам: опушение, разме-ры и геометрическая форма вегетативных, генеративных органов или их частей. Кроме того, отмечено наличие многочисленных переходных форм и значитель-ные колебания хромосомных чисел от 64 до 146. Только на территории Евро-пейской части нашей страны описано более 56 видов манжетки. Некоторые ис-следователи относят к манжетке обыкновенной пять-шесть агамных видов, та-ких как м. балтийская, м. изящная, м.остролопастная, м. близкая, м. горная и м. голостебельная (К.П. Глазунова, 1990). Другие исследователи к популяции ман-жетка обыкновенная относят до двенадцати видов (С.К. Черепанов,1981), также с дискретно различающимися морфологическими вариантами, при этом часто их принадлежность к группе манжетка обыкновенная не совпадает у раз-ных авторов.
Всё это затрудняет фармакогностическое изучение этих ценных лекарствен-ных растений, разработку рекомендаций по сбору сырья и его осуществление.
Недостаточность одних лишь морфологических признаков для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости в роде манжетка заста-вило прибегнуть к привлечению дополнительных молекулярно-биологических методов, в частности, для характеристики геномов.
Для многих других ценных лекарственных растений идентификация также не разработана на должном современном уровне, поэтому разработка методичес-ких подходов к изучению лекарственных растений с использованием молеку-лярно-биологических методов актуальна.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры фармакогнозии и является фрагментом разрабатываемой комплексной темы: Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учётом антропогенных факторов, № 01.200.110546.
Молекулярно-биологическая часть эксперимента выполнена в отделе эволю-ционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, по теме: Геносистематика и молекулярная фило-генетика про- и эукариот, № госрегистации: 0187.0095927
Цель и задачи исследования. Цель исследования - разработать методичес-кие подходы к изучению лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения, используя молекулярно-биологические и фармакогнос-тические методы, направленные на прогнозирование перспективных сырьевых источников получения отечественных лекарственных средств. Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Определить характер изменчивости в популяциях модельного рода манжетка - Alchemilla L., с помощью полимеразной цепной реакции со случайными прай- мерами (RAPD-метод)
2. Оценить внутривидовую и популяционную изменчивость на фоне отсутствия корреляции с внешними устойчивыми морфологическими признаками его видов.
3. Изучить возможность применения характеристик геномов в фармакогности-ческом анализе. Провести сравнительное изучение с использованием RAPD-анализа лекарственных растений различных семейств, родов и разных морфо-логических групп.
4. Показать возможность использования для изучения перспективных и лекар-ственных растений секвенирования ДНК с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petB-petD) и на примере рода Аnthylis L., Провести филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.
5. Провести изучение химического состава полифенолов и аминокислот ман-жетки, исследовать его взаимосвязь со строением геномов лекарственных рас-тений.
6. Изучить вопросы стандартизации сырья трава манжетки, разработать крите-рии идентификации (внешние и анатомические признаки, качественные харак-теристики), числовые показатели и установить их нормы.
7. Выявить природные запасы и определить урожайность травы манжетки.
8. Разработать алгоритм изучения перспективных лекарственных растений с аберратными формами размножения.
Научная новизна результатов исследования. Показана возможность при-менения молекулярно-биологических методов для фармакогностического ана-лиза. С использованием RAPD-анализа, на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.
Изучена взаимосвязь между особенностью строения геномов видов манжетки и химическим составом полифенольного и аминокислотного комплекса. Изуче-ние полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных про изводящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.
Показана перспективность применения молекулярно-биологических методов, RAPD-анализа и секвенирования для изучения лекарственных растений и для идентификации лекарственного растительного сырья на примере сырья расте-ний семейства розоцветные, бобовые, яснотковые, буковые, гречишные, кип-рейные, астровые.
Проведено изучение сырьевой базы травы манжетки, установлены границы полиморфизма Alchеmilla vulgaris L., что позволило определить урожайность, при ежегодных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий.
Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья - трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отечественной медицины.
Исследование безопасности настоя травы манжетки показало, что он может быть отнесен к группе практически нетоксических средств, так как однократ-ное введение в желудок максимально возможной дозы настоя травы манжетки не вызывало гибели животных в течение двух недель наблюдения, кроме того, выявлена его антиметастатическая активность.
Разработан алгоритм изучения лекарственных растений народной медицины, (в том числе и для - обладающих аберратными формами размножения).
Практическая значимость полученных результатов. Нами показана воз-можность применения молекулярно-биологических методов для идентифика-ции лекарственного растительного сырья.
Разработаны оптимальные методики для идентификации свежего и высу-шенного лекарственного растительного сырья с использованием RAPD-анали-за. С использованием молекулярно-биологических и традиционных фармако-пейных методов установлены характеристики подлинности и качества травы манжетки и разработаны проект Фармакопейной статьи Трава манжетки, проект Инструкции по сбору и сушке, а также проект Общей фармакопей-ной статьи RAPD-анализ лекарственного растительного сырья.
Изучены сырьевая база и вопросы стандартизации сырья трава манжетки, в том числе подобрана методика количественного определения суммы флавоно-идов, определён и выделен ценный полифенол, обладающий противоопухоле-вой активностью - агримониин.
На основании изучения геномов и полифенольного комплекса для медицин-ского применения рекомендованы 12 видов рода Alchemilla L. Данные филоге-нетического анализа и ботанико-фармакогностического изучения легли в осно-ву проекта инструкции по заготовке сырья трава манжетки.
С помощью RAPD-анализа даны геномные характеристики 17-ти видам растительного сырья.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты оценки сравнительного изучения геномов различных видов рода манжетка - Alchemilla L., с использованием RAPD-анализа и определение характера изменчивости.
2. Данные применения RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья.
3. Результаты применения секвенирования ДНК лекарственных растений для их фармакогностического изучения.
4. Результаты изучения взаимосвязи строения геномов с содержанием полифе-нолов и аминокислот для изучаемых видов рода манжетка.
5. Результаты изучения запасов травы манжетки.
6. Данные по стандартизации травы манжетки.
7. Результаты разработки алгоритма изучения перспективных видов лекарст-венных растений с использованием молекулярно-биологических и фармако-гностических методов.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции Формирование приорететов лекарст-венной политики (Москва, 28-29 июля 1995), на Первом международном сим-позиуме Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования (Пущино, 1-5 августа 1995), на научной конференции, посвя-щенной 50-летию ботанического сада ММА им.И.М. Сеченова (Москва, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва. 21-25 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции Традиционные методы лечения - основные направления и перспективы развития (Москва,14-16 мая 1998), на интернациональном симпозиуме Plant Evolution in Man-made HabitatsФ (Vena, August 10-15, 1998), на заседании Московского общества фито-терапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соедине-ниям (Москва, 28-30 апреля 2004г),на научно-практической конференции Со-временные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе Традиционная медицина 2007 (1-3марта 2007г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах - 9.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 77 ри-сунков, 38 таблиц и 3 приложения. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальных иссле-дований, общих выводов, списка литературы (250 источников, в том числе 118 на иностранных языках).
В обзоре литературы представлен анализ современного состояния проблемы изучения геномов растений, геносистематики, полиморфизма лекарственных растений показана перспективность использования молекулярно-биологичес-ких методов для решения сложных задач при изучении перспективных лекар-ственных растений, обладающих аберратными формами размножения. Охарактеризован агамно-половой комплекс Alchemilla vulgаris L.- как источ-ник ценного лекарственного сырья, его химический состав и перспективы при-менения.
Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, методик и мето-дов анализа, использованных в работе.
В третьей главе приведены результаты применения RAPD-анализа при изу-чении самых распространённых видов рода Alchemilla, что позволило очертить круг производящих лекарственных растений для сырья - трава манжетки. Показана возможность практического применения полученных результатов по-зволивших предложить новый метод изучения лекарственных растений и ис-пользовать его для идентификации лекарственного растительного сырья.
В четвёртой главе показаны перспективы использования молекулярно-биоло-гических методов для изучения лекарственных растений: секвенирование ДНК растений (на примере рода Аnthylis L.) и RAPD-анализ различных видов сырья..
В пятой главе представлены результаты химического изучения наиболее распространенных видов рода Alchemilla и фракционное изучение полифено-лов травы манжетки, а также изучения её аминокислотного и элементного состава.
Шестая глава посвящена фамакогностическому изучению травы манжетки и практическому применению полученных результатов.
В седьмой главе представлены результаты оценки антиметастатической ак-тивности, острой и хронической токсичности водных извлечений травы ман-жетки.
В приложении представлены проекты нормативных документов по примене-нию RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья, Иструкции по сбору и сушке травы манжетки-herba Alchemillaе, Фармакопей-ной статьи трава манжетки - herba Alchemillaе.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Объекты и методы исследования.
В качестве объектов исследования были собраны следующие виды Alchemilla L.: манжетка голостебельная - Alchemilla glabricaulus Lindb.fil., манжетка ост-ролопастная - Аlchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская - Alchemilla bal-tica G. Sam.ex Juz., манжетка шерстистая - Alchemilla hirsuticaulus Lindb.fil., манжетка близкая - Аlchemilla propinqua Lindb.fil.,манжетка горная - Alchemilla monticola Opiz., манжетка семиугольная - Alchemilla heptagona Juz., манжетка изящная - Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz.,манжетка полулунная-Alchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная - Alchemilla cymato-phylla Juz., манжетка шаровидно-скрученная ЦAlchemilla conglobata Lindb.fil (A.Juzepzukii Alеch.).
Определение дикорастущих видов проводили по ключам-определителям, разработанным С.В. Юзепчуком (1939г.) и В.Н.Тихомировым (1966 г.).
Выделение ДНК. ДНК выделяли с помощью модифицированной нами методи-ки Дж. Дрейпера (1989) с использованием экстракции цетилтриметиламмония бромидом. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии или электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
Выделение ДНК и сравнение геномов сначала проводили у хорошо определя-емых видов и близких родов:манжетка (Alchemilla gracilis Opiz.) и лапчатка (Po- tentilla erecta Hampe.),а также репешок (Agrimonia eupatoria L.), собранных в Истринском районе Московской области. Там же собирали цветки таволги (Fi-lipendula ulmaria Max.) и лепестки розы (Rosa rugosa Thunb., ceм. Rosaceae), траву горца почечуйного (Polygonum persicaria L., ceм. Polygonaceae), череды трёхраздельной (Bidens tripartitus L.) и поникшей (Bidens cernuus L. ceм. Astera-ceae).
Листья дуба черешчатого и красного (Quercus robur L. и Quercus rubra L. ceм. Fagaceae) и траву язвенника (Anthylis vulneraria L.,сем. Fabaceae) собирали в ботаническом саду МГУ им.М.В.Ломоносова. Образцы других видов рода Anthylis были любезно предоставлены нам из коллекций гербариев МW, MHA, LE и др.
Цветки иван-чая узколистного (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Ch. аngustifolium var. albiflorum Hausskn., ceм. Onagraceae.) обычные и белой рассы собирали в Одинцовском районе Московской области.
Листья мяты перечной (Мentha piperita L.) и монарды двойной (Monarda di-dyma L.),траву чабреца (Thymus serpillum L.) и мелиссы (Melissa officinalis L., сeм. Lamiaceae) собирали в ботаническом саду ГОУ ВПО ММА им.И.М. Сече-нова. Цветки боярышника собирали там же с боярышника кроваво-красного (Crataegus sanquinea Pall.), а цветки боярышника кавказского (Crataegus cau-casica C. Koch.,Cratz.et Mesp.) собирали на Черноморском Побережье в Гагрин-ском районе Абхазии. Для геномного анализа использовали листья перечислен-ных выше видов манжетки, собранных в разных районах Московской области.
Для построения филогении язвенника использовали молекулярные маркеры применяемые в геносистематике: внутренний транскрибируемый спейсер-inter-nal transcribed spacer(ITS1 и ITS2)участок 18S-5.8S-26S ядерного рибосомально-го цистрона-участок ДНК, отвечающий за единичную функцию (I.Alwres,2003); хлоропластный участок petB-petD относящийся к интронам II группы и состоя-щий из куска экзона petB, межгенного спейсера, экзона petD, интрона и куска экзона petD(C.Lohne, 2005);а также хлоропластный маркер экзон rps16 из груп-пы II интронов (M.Clegg,1993; B.Oxelman,1997).
Определение нуклеотидных последовательностей ДНК для язвенника прово-дили методом циклического секвенирования с использованием набора реаген-тов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов на
автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant (Applied Biosystems) в Межинститутском Центре коллективного пользования Геном (Институт мо-лекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).
Для изображения филогенетических деревьев использовали методы макси-мальной экономии, максимального правдоподобия и дистанционный.
Для исследований ценопопуляций манжетки была использована методика сбора и обработки материала, а также терминология, разработанная А.А.Урано-вым и его учениками (1973, 1975, 1980, 1987). Были рассмотрены разновозраст-ные популяции изучаемых видов манжетки. В качестве единицы счёта исполь-зовали, как элементарный источник фитогенного поля, особь.
При описании структуры и динамики ценопопуляций сбор сырья проводили в пределах одного участка ассоциации S=100 м (10х10) внутри её контура, на трансектах (метод трансект Л.Б.Заугольновой, 1976). В ресурсоведческой рабо-те использовали методики разработанные А.И.Шретером (1966), и В.Б.Кувае-вым (1987). Урожайность сырья или плотность запаса рассчитывали на едини-цу площади (ц/га).
Фармакогностическое изучение сырья - трава манжетки: описание внешних признаков, микроскопический анализ, определение числовых показателей (вла-жность, зола общая и др.) проводили по фармакопейным методикам ГФ ХI, т.1 (1987) и т.2 (1990).
Водные извлечения из сырья готовили в соответствии с ГФ ХI, т.2(1990) в со-отношении 1:10. Извлечения 30% спиртом, 70% спиртом и ацетоном готовили в соотношении 1:10.
Изучение полифенольного состава проводили с помощью хроматографичес-ких методов. В работе была использована бумажная, тонкослойная, колоноч-ная хроматография и ВЭЖХ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответст-вии с требованиями ГФ Х1 (1987г) и с использованием пакета статистических программ УStatistica forУ.Для сравнительного изучения полифенольного, в част-ности флавоноидного состава настоев травы некоторых видов манжетки, наибо-лее часто встречающихся в естественных фитоценозах Подмосковья, был при-менён метод анализа - ВЭЖХ. Исследования проводили на хроматографе Per-kin Elmer, Diode Array, Detektor 235 C при длине волны 255 нм для флавонои-дов, и 280 нм - для фенолкарбоновых кислот. Колонка 150 х4,6 мм с размером частиц 3 мкм,сорбент гиперсил С 18; элюент ацетонитрил (АСN): вода (рН 3,2).
Компьютерную обработку полученных данных проводили по стандартной программе УTurbochrom У.
Определение содержания суммы флавоноидов проводили с помощью спект-рофотометра Beckman DU-65. Количественное определение суммы флавонои-дов проводили после модификации соответствующих фармакопейных методик спектрофотометрически.
Доклинические исследования настоя манжетки проводили на лабораторных животных: DВА2; C57BI6 ; гибриды BDF1 и F1; беспородные мыши SHK. В ис-следовании использованы перевиваемые опухоли: лимфолейкоз L1210, эпидер-моидная карцинома легкого Льюис(LLC) и саркома-37 асцитная и солидная.
Методы оценки острой токсичности и антиматастатической активности.
Изучение токсического действия настоя травы манжетки 1:10 и определение диапазона терапевтических доз на интактных животных проводили при опти-мальном пути введения вещества в организм в диапазоне доз от неэффективной до максимально переносимой (МПД). Использовали диапазон однократных или курсовых доз (при любой длительности курса). Для каждой дозы определялся максимальный эффект по одному из возможных критериев.
С помощью построения графика доза-эффект определяли ЕД20, ЕД50 и ЕД90 - расчетные дозы, вызывающие торможение роста опухоли (ТРО) на 20%, 50% и 90%, соответственно. Затем рассчитывали терапевтические индексы (ТИ20, ТИ50 или ТИ90) как соотношение соответствующей летальной и эффективной доз. ТИ является единственным показателем избирательности противоопухоле-вого действия, рекомендуемое значение ТИ502. ТИ50 определяли по формуле: ТИ=ЛД50/ЕД50,где ЛД50 - доза, вызывающая гибель 50% здоровых животных.
Определяли оптимальные схемы терапии. Оценка эффективности терапии уста-навливали по увеличению продолжительности жизни, числу полных ремиссий или излечению.
Оценку эффективности лечения, противоопухолевого и антиметастатичес-кого эффекта определяли по торможению роста опухоли:
определяли 2-3 размера опухоли у каждого животного в группе, после чего вычисляли объем (V, мм3) опухоли по формуле: V=aХbХc или V=(aХb2)/2,
где a, b и с - длина, ширина и высота опухолевого узла. Затем вычисляли средний объем опухоли в группе Vср.
Степень торможения роста опухоли определяли по показателям ТРО и Т/С, вычисляемым по формулам: ТРО%=(Vконтроля-Vопыта)x100/Vконтроля,
Т/С%=Vопытаx100/Vконтроля,
где V- средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах, со-ответственно, на конкретный срок; Т - леченая группа; С - контрольная группа; Т/С - величина, обратная ТРО. Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться не менее 7 суток после окончания лечения.
Оценку антиметастатической активности проводили на карциноме легких Льюис, меланоме В-6 и Клаудмана, а также саркоме-37 характеризующихся вы-сокой интенсивностью ментастазирования и дающих макроскопические метаста-зы,доступные для каченственной и количественной оценки простыми способами. При оценке эффективности лечебных воздействий учитывали массу первичного опухолевого узла, частоту метастазирования опухоли (ЧМ),среднюю массу ме-тастазов в пересчете на 1 мышь, рассчитывали индексы ингибирования метаста -зирования (ИИМ) и торможения роста опухоли в процентах (ТРО).
Частота метастазирования опухоли - процент животных с метастазами по отно-шению к общему количеству животных в группе. В случае лимфогенного мета-стазирования подсчитывали массу метастазов и среднее значение этого показа-теля в группе. В зависимости от количества и размера метастатических узлов в легочной ткани определяли степень поражения легких.
Индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ) рассчитывали по формуле: ИИМ = [(А х Вк) - (А х В)] х 100%/ Ак х Вк,
где Ак и А - частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опыт-ной групп; Вк и В - среднее число метастазов в легких в контрольной и опыт-ной группах.
Торможение метастазирования по средней массе легких (ТРМ%):
ТРО%=(сред. m легких контроля-сред.m легких опыта) х100/Vконтроля
Изучение геномов видов рода манжетка (как модельного)RAPD-методом
Для установления молекулярно-генетического родства между апогамными видами и популяциями манжетки обыкновенной был применён получивший широкое распространение в последнее десятилетие прошлого века метод поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами со случайной произвольной по-следовательностью - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - или AP (Arbitrary Primed) - анализ (Welsh J., 1990; Williams J.G.K, 1990), который ус-пешно используется для оценки степени cходства геномов близкородственных организмов, относящихся к самым разным таксономическим группам.
На первом этапе нами была предпринята попытка сравнительного изучения геномов нескольких хорошо определяемых в природе видов: м.балтийской, м. изящной и м.городчатой. Первые две отнесены одними авторами, а последние две - другими авторами - к манжетке обыкновенной; для сравнения, в качестве устойчивого вида, не образующего агамный комплекс, использовали лапчатку прямостоячую. Для выделения сумарной ДНК использовали методику, предло-женную Дж.Дрейпером (1989) и случайные праймеры П17 и П20. Перед этим на-ми экспериментально были подобраны: реакционная смесь (объем полимеразы, количество магния хлорида, число, количество и состав праймеров: режим ПЦР и количество циклов. ДляУDNA Thermal CyclerФУPerkin Elmer CetusФ (USA) был подобран следующий режим:
денатурация 94 C - 2 мин } 94C - 1 мин }
отжиг 25C - 2 мин } 2 цикла и 55C - 1 мин } 40 циклов
элонгация 70 C - 2 мин } 72C - 1 мин }
В качестве контроля ставили пробу без ДНК и пробу без праймера. Продук-ты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере и фотографировали на пленку УМикратФ в проходящем УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.
В результате нами было установлено, что ДНК лапчатки прямостоячей отли-чается от ДНК манжеток по следующим молекулярным признакам: при одина-ковых условиях амплификации у манжетки стабильно амплифицируется набор фрагментов, отличающихся молекулярной массой. Реакция хорошо воспроизво-дится в стандартных условия в диапазоне концентраций ДНК от 10 до 20 нг. Введение в реакционную смесь второго праймера увеличивает число амплифи-цированных фрагментов ДНК для манжетки и изменяет их подвижность для фрагментов ДНК лапчатки.
Сравнение продуктов амплификации ДНК репешка европейского,азиатского, лапчаток гусиной,ползучей и манжеток показало наличие отличающихся набо-ров полос с различной подвижностью, что позволило предположить возмож-ность дальнейшего использования этого метода для идентификации видов рода манжетка.
Далее брали небольшое количество хорошо определяемых видов из опреде-лённых мест обитаний: манжетка балтийская, собранная в Истринском районе и манжетка балтийская, собранная в парке ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова. Для них выявлены значительные отличия, а именно, наличие у пер-вой - набора из восьми фрагментов амплифицированной ДНК,а у второй - то-лько из пяти, причем, нижние две полосы, имеющие длину около 500 нуклео-тидов,(определённую относительно маркёра λHind-lll) менее четкие. При этом манжетки, собранные в одном фитоценозе (Истринский район), изящная и горо-дчатая, хорошо различающиеся по внешним признакам, проявляли явное сход-ство наборов RAPDЦфрагментов по шесть одинаковых полос. Эти виды объеди-нены С.К.Черепановым (1981) в одну группу - манжетка обыкновенная.
Набор фрагментов, амплифицированных для манжетки полулунной, из этого же фитоценоза и не относящейся вообще к манжетке обыкновенной, также как для манжетки балтийской представлен пятью полосами, но они отличаются по длине. Манжетка Линдберга, также как и полулунная, не относящаяся к группе манжетка обыкновенная и собранная в Щёлковском районе, давала на электро-фореграмме четыре фрагмента, из них последний - четвёртый более короткий, соответствующий фрагменту маркёра λHind-lll длиной менее 500 пн, характерен только для этого вида.
Таким образом, проведённый RAPD-анализ ДНК манжеток дал обнадёжи-вающие результаты, показавшие возможность его использования для иденти-фикации представителей сложных агамных комплексов.
На следующем этапе для исследования объектами служили апогамные виды Alchemilla vulgaris L.s.ampliss., собранные в период цветения в Московской об-ласти - A.baltica (1 - Бот.сад ММА им И.М.Сеченова, II - Истринский район), A.gracilis, A.subcrenata, A.hirsuticaulis ( I - Щёлковский район, II - Истринский район, К - Казахстан, предгорья Ала-тау, интродуцированая в Бот.саду ММА), А. propinqua, A.lindbtrgiana и A.semilunaris. Собранные листья замораживали и хранили при -20С до выделения ДНК.
Полимеразная цепная реакция.
Для амплификации использовали 10-ти членные олигонуклеотидные прай-меры П1-П4 с произвольной последовательностью:
П1 - 5- СТСАССGTCC-3, П2 - 5- ACGGTACCAG-3,
П3 - 5- GATGACCGCC-3, П4 - 5- AGGCGGGAAC-3.
М 1 2 3 4 5
Рис. 1. Электрофореграмма в 2% агарозном геле RAPD-
фрагментов ДНК A.hisuticaulis с разными праймерами (П)
М - маркёр длины - перевар ДНК фага рестриктазой PstI.
1 - П1 ; 2 - П 2; 3 - П3 ; 4 - П 4; 5 - П4
Реакционная смесь объёмом 20 мкл содержала 1 ед. Taq полимеразы УProme-gaФ, в буферном растворе, предлагаемом фирмой, по 100 мкМ dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 1мкМ праймера, 4 mM MgCl2 и 10-20 нг ДНК. ДНК амплифици-ровали в течение 36 циклов в програмируемом термостате УЦиклотемпФ (СТМ, Москва) в режиме: денатурация - 1 мин 94С, отжиг - 1 мин 37С, элонгация - 2 мин 72С. Продукты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере и фотогра-фировали на плёнку УМикратФ в проходящем УФ-свете (305 нм) после окра-шивания бромистым этидием.
Компьютерный ввод изображений и их обработка проведены с использова-нием видеоденситометра и програмных продуктов фирмы УittiФ (USA). Построение фенограммы осуществлено невзвешенным парно-групповым мето-дом с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием пакета про-грамм УВосторгФ (ИЦИГ РАН, Новосибирск).
Результаты и обсуждение. Количество продуктов амплификации, выявляе-мых как отдельные полосы после электрофореза, в реакции при использовании конкретного праймера с определённой последовательностью нуклеотидов зави-сит от количества сайтов связывания праймера, т.е. участков последовательнос-ти ДНК, комплементарных данному праймеру в обеих цепях ДНК исследуемо-го генома и/или от их относительного сродства. Поэтому RAPD-паттерны для каждого конкретного праймера будут состоять из различного количества полос.
Кроме того, на количество и интенсивность полос оказывают влияние усло-вия проведения реакции амплификации-концентрация и степень очистки ДНК, температура отжига праймера, концентрация MgCl2, число циклов амплифика-ции. Для каждого праймера необходимо было подобрать оптимальные усло-вия, при которых амплификация происходит эффективно и даёт воспроизводи-мые результаты. Последующее строгое соблюдение этих условий проведения реакции гарантировало надежность полученных результатов.
Четыре имевшиеся в нашем распоряжении праймера П1 - П4 были пред-варительно проверены в реакции амплификации с A.hirsuticaulis (рис. 1). Установлено,что все праймеры активны в реакции амплификации и служат за-травкой для синтеза наборов специфических фрагментов ДНК. Количество и длина амплифицированных с каждого праймера фрагментов, как и следовало ожидать, неодинаковы. В последующих опытах был использован праймер П2, приводящий к RAPD-спектру с наибольшим количеством полос (рис. 1).
Для оптимизации условий реакции было исследовано влияние изменения температуры отжига праймера, концентрации MgCl2 и концентрации ДНК на набор продуктов реакции. Установлено, что результаты хорошо воспроизводят-ся в диапазоне температуры отжига от 30 до 37С и концентрации MgCl2 2,5 - 4,0 мМ, а также при разведении исходных растворов ДНК в отношениях от
М 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 10 М
Рис. 2. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma)
RAPD-фрагментов ДНК
1.- A.semilunaris, 2.- A.gracilis, 3.- A.baltica (1), 4.- A.baltica (П),
5.- A.subcrenata, 6.- A.propinqua, 7.- A.lindbergiana, 8.- A.hisuticaulis (1),
9.- A.hisuticaulis (K), 10.- A.hirsuticaulis (П) c праймером П2
М - маркёр длины - перевар ДНК фага рестриктазой PstI.
1:10 до 1:100. Для последующих опытов были использованы разведения 1:50, что соответствует содержанию 10-20 нг ДНК в реакционной смеси.
Разделение амплифицированных фрагментов ДНК апогамных видов популя-ций Alchеmilla при электрофорезе в агарозном геле (рис.2),с последующим сканированием и математической обработкой полученных результатов с помо- щью компьтерных программ позволило установить, что исследуемые апогам-ные виды и популяции характеризуются специфическими RAPD-спектрами. Различия касаются как наличия/отсутствия полос одинакового размера у раз-ных видов, так и изменения относительной интенсивности некотоых полос.
Рис.3. Распределение амплифицированных фрагментов ДНК разной
молекулярной массы у исследованных видов манжетки
(обозначения см. рис.2).
На рисунке 3 показано присутствие амплифицированных фрагментов ДНК с указанием их размеров, а в таблице 1 - матрица состояний бинарного признака наличия/отсутствия (1/0) полос с одинаковой электрофоретической подвижнос-тью в RAPD - спектрах изученных растений. Минорные полосы слабо выявля-ющиеся на электрофореграммах рассматривались как отсутствующие, и им приписывалось значение 0.
По этим данным рассчитана матрица различий между видами и популяциями манжетки,по которой построена фенограмма (рис.4).Полученные данные свиде-тельствуют,что как апогамные A.vulgaris L.Ampliss.,так и популяции одного ви-да различаются по RAPD-спектрам, при этом диапазоны уровней сходства меж-ду популяциями и видами могут перекрываться.
Обращает внимание, что две популяции A.hirsuticaulis из Московской облас-ти гораздо более сходны между собой, чем с популяцией того же вида из Казах-
стана.Какого-либо соответствия характера кластеризации на фенограмме со схемами таксономии Alchemilla В.Ротмалера (1936) и С.В. Юзепчука (1941) не прослеживается.
Таким образом, полученные данные результов RAPD - анализа свидетельст-
вуют об отсутствии различий уровней внутри- и межвидовой генотипической изменчивости в группе A.vulgaris.Определение степени изменчивости подмос-ковных видов рода манжетка показало, что из всех видов только A.gracilis и A.baltica ведут себя как монофилетические групппы, A.glaucescens и A.hirsuti- caulis вместе также образуют монофилетическую группу. Все остальные виды не проявляют себя как монофилетические.
A.glaucescens, A.hirsuticaulis, A.monticola и A.sarmatica вместе образуют мо-нофилетическую группу. Все четыре вида относятся к секции Plicatae, согласно
Рис. 4. Фенограмма сходства RAPD-спектров ДНК видов
Рода Alchemilla, построенная методом UPGMA по данным
матрицы в таблице 1; d Цпроцент различий
S. Frhner (1990), но поV. Rothmaler (1936) они принадлежат, соответственно, к двум подсекциям. Образцы A.semilinaris образуют монофилетическую линию, а все образцы A.subcrenata объединяются вместе и близки к образцам секции Plicatae. A.acutiloba и A.gracilis перемешаны друг с другом, но по-видимому, вместе образуют монофилетическую группу. Положение A.glabricaulis и A.bal-tica неопределённо. A.gracilis, по-видимому, образует отдельную ветвь. Все ос-тальные виды расположены вперемешку друг с другом и не могут считаться монофилетическими.
Расшифровка радиограмм и электрофореграмм, компьтерная математическая обработка полученных результатов анализа показала отсутствие в изучаемых популяциях манжетки предковых видов и невозможность построения из этих видов филогенетического дерева, хотя некоторые наборы RAPD-фрагментов были сходны для нескольких видов, особенно взятых из одного фитоценоза,
что может говорить о их гибридогенном происхождении. Величина внутриви-довой и внутрипопуляционной изменчивости оказалась очень высокой.
Таким образом, применение геномного анализа позволило характеризовать геномы видов манжеток, преимущественно как гибридные, что дает возмож-ность рекомендовать для сбора траву всех видов манжеток, как близкородст-венных и обладающих сходным биосинтезом БАВ, что дает возможность про-гнозировать близкий состав биологически активных веществ.
Применение RAPD Ц анализа для идентификации
лекарственного растительного сырья.
В отечественной и мировой литературе отсутствуют данные о применении молекулярно-биологических методов для изучения лекарственного раститель-
Рис. 5. Электрофореграмма амплификатов ДНК свежих и высушенных
листьев двух видов дуба-Quercus с праймером 3С-CGGCCCCTGT-5С
1-молекулярный маркер; 2-контрольный опыт;
3-фрагменты ДНК свежих листьев дуба черешчатого;
4-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба черешчатого;
5-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба красного
ную для его идентификации. Прежде всего необходимо было адаптировать ме-тодику выделения ДНК из сухого сырья и подобрать условия амплификации.
Наилучшими оказались следующие условия проведения реакции амплифика-ции для термоциклера фирмы Perkin Elmer-Cetus Instruments:
- денатурация - 94С - 1 мин; отжиг - 36С - 1мин; синтез - 72С -1 мин.
(* В последнем цикле эта стадия длится 3 мин). При сравнении результатов ампли-фикации установлено, что RAPD-набор ДНК свежего и высушенного сырья от-личается по количеству и расположению фрагментов, вследствие деградации ДНК при сушке (рис. 5). Разделение и обнаружение фрагментов ДНК, получен-ных в результате реакции амплификации, проводили методом электрофореза в 2 % геле агарозы. Выделение и амплификацию ДНК из сухого сырья: цветков
с листьями боярышника кроваво-красного и боярышника кавказского, травы череды трёхраздельной и череды поникшей,а также цветков иван-чая узколист-
Рис. 6. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma)
продуктов RAPD ДНК растительного сырья:
1- боярышника крововокрасного - Crataegus sanquinea Pall.),
2- боярышника кавказского - Crataegus caucasica C.Koch. Cratz.et Mesp.
3- череды трёхраздельной - Bidens tripartitus L.
4- череды поникшей - Bidens cernuus L.
5- иван-чая узколистного - Chamaenerium angustifolium (L.) Scop.
6- иван-чая узколистного - Ch. angustifolium var. albiflorum Hausskn.
7- горца почечуйного (красного)- Polygonum persicaria L.
8- горца почечуйного (зеленого)- Polygonum persicaria L.
М - маркер длины (перевар ДНК фага рестриктазой Psd)
ного (розовой формы и белой), травы горца почечуйного (растущих рядом зелё-ной и красной) проводили по модифицированной нами методике. Результат разделения представлен на рисунке 6. На полученных электрофореграммах,
Таблица2. Стадии методики выделения и амплификации ДНК
лекарственного растительного сырья.
Стадия | Сущность методики | Теоретическое обоснование | |
1. Пробо- подготовка | измельчение до порошка (менее 0,5мм) | ||
2.Экстрак- ция | → СТАБ буфером (70С) + меркаптоэтанол → пробирку встряхивают, инкубируют при Т= 70С и центрифугируют ⇒отбирают жидкую фазу | Меркаптоэтанол добавляют для инактивации ферментов. | |
| 3.Очистка | Жидкая фаза + смесь хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) → встряхивают → центрифугируют ⇒ осадок денатурированных белков ⇓ | Осаждение белка | |
| 4.Выделение ДНК | жидкость над осадком + изопропанол ↓ перемешивают стекл.капил -ляром ⇒ аморфный студ-необразный осадок ДНК и полисахаридов. Далее ДНК наматывают на капилляр → погружают в пробирку с 96% этанолом → погружают в пробирку с водой до растворения ДНК. | изопропанол добавляют для осаждения ДНК 96% этанол необходим для удаления полисаха-ридов, т.к. полисахари-ды осаждаюся в спирте, а ДНК растворяется в воде. | |
5. Реакция амплифика- ции | ДНК+ праймеры +буферный раствор Tris-HCl+ дезоксинуклеозидтрифосфаты + MgCl2 + Taq-полимераза →термоциклер→разделение электрофорезом ⇒ окрашенные фрагменты ДНК. | ||
Рис. 7. Электрофореграмма в 2% агарозном геле продуктов RAPD ДНК
истьев:1- монарды двойчатой - Monarda didyma L, 2- мяты перечной- Мentha
piperita L;
травы: 3- чабреца- Thymus serpillum L.), 4- мелиссы- Melissa officinalis L.;
цветков 5-манжетки обыкновенной - Alchemilla vulgaris L., 6-таволги вязолис-тной- Filipendula ulmaria Max.), 7-розы морщинистой - Rosa rugosa Thunb., mМ- маркер длины.
(рис. 6) четко видны различия наборов RAPD-фрагментов боярышников и обих видов череды, а RAPD-спектры для ДНК иван-чая розового и белого - а также
для двух рас горца почечуйного были идентичными, что говорит о их генети-ческой равноценности.
При изучении RAPD-спектров ДНК, выделенной из разных видов сухого сырья: цветков, листьев и травы растений, относящихся к разным семействам: Lamiaceae и Rosaceae: листья монарды, листья мяты перечной, трава чабреца, трава мелиссы; цветки манжетки, цветки таволги, лепестки шиповника на элек-трофореграмме наблюдались дискретные полосы, выявляющие межвидовые различия - фрагменты ДНК отличающиеся подвижностью (размерами) и их ко- личеством (рис. 7).
Проведённые нами исследования показали возможность применения данного метода для идентификации сырья лекарственных растений.
Нами разработаны оптимальные методики для RAPD-анализа 13 родов, от-носящихся к 5 семействам.
Применение секвенирования для изучения лекарственных растений
и лекарственного растительного сырья
Применение секвенирования для филогенетического анализа рода Anthylis L., также показало перспективность его использования для изучения лекарствен-ных растений народной медицины. Установлено, что род Anthylis L., проявляет себя как монофилетическая группа с высокими уровнями поддержки при ана-лизе как ядерных, так и хлоропластных маркеров. Изолированное положение на филогенетическом дереве вида Anthylis vulneraria L.,(рис. 8)
характеризуется рядом уникальных морфологических особенностей, как отде-льный подрод, что подтверждается данными об инделях: вставках из 6 п.н
(АТААСА) на участке petB-petD. Эти молекулярные маркеры (индели) также могут быть рекомендованы для идентификации лекарственного растительного сырья молекулярно-филогенетическими методами.
Изучение состава БАВ травы манжетки.
Нами было проведено изучение полифенольного комплекса: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, танинов и аминокислотный состав видов рода Alche-milla L.Предварительное сравнительное изучение химического состава манже-ток: остролопастной, балтийской, изящной, собранных в июне 1990 года и в сентябре 1991 года в Истринском и Одинцовском районах Московской области показало сходство спектров поглощения спиртовых извлечений и сходство хро-матографического разделения: одинаковое количество зон адсорбции с Одина-ковыми Rf в различных системах растворителей. Далее исследование водных извлечений проводили с помощью метода ВЭЖХ. Идентификацию проводили по сопоставлению времен удерживания пиков соединений на хроматограмме с пиками стандартных образцов и совпадению УФ-спектров соединений с УФ-
Рис. 8. Филогенетическое дерево, построенное методом NJ
по участку ITS 1-2.
спектрами стандартных образцов. В водном извлечении были идентифицирова-
ны фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, коричная; флавоноиды - рутин, кверцетин, кемпферол (рис. 9). Определено, что в водном извлечении рутин составляет 50% и более суммы всех флавоноидов (табл.3).
Таким образом, в результате сравнительного химического изучения разных ви-дов манжетки, собранных в нескольких районах Московской и на севере Туль-ской области, нами была установлена сходность химического состава полифе-
Рис. 9. Хроматограмма водного извлечения травы манжетки:
1 - галловая кислота; 2 - хлорогеновая кислота; 3 - кофейная кислота;
4 - рутин; 5 - коричная кислота; 6 - кемпферол; 7 - кверцетин
Таблица 3. Содержание полифенолов в траве некоторых видов Alchemilla
----------------------------------------------------------------------------------------------------
! Содержание полифенолов, в %
Вид манжетки !галловой к-ты ! рутина ! гиперозида ! кверцетина
---------------------------------------------------------------------------------------------------
1. A.gracilis 9,5 28,7 14,2 7,8
2. A.gracilis 8,5 28,0 11,9 7,6
3. A.baltica 11,2 39,4 10,5 7,0
4. A.hirsuticaulis* 6,5 35,8 29,0 3,5
5. A.conglobata 10,1 32,3 19,3 5,5
6. A.gracilis 10,3 32,2 15,3 7,6
---------------------------------------------------------------------------------------------------
* A.hirsuticaulis попадает в сырьё как допустимая примесь, ее % - содержание невелико.
нольных соединений этих видов это послужило основанием для дальнейших исследований. Для более полного изучения полифенольного комплекса прово-дили фракционное изучение ацетонового извлечения травы манжетки, в кото-ром одна из фракций нами была идентифицирована как танин Цагримониин.
Выделение агримониина. Нам удалось выделить из травы манжетки димер-ный эллаготанин - агримониин, который был идентифицирован прямым срав-нением спектра со спектрами известных образцов как агримониин, с помощью Н ЯМР, C ЯМР и ПМР анализа. Полученные данные подтверждили пра-вомерность химической структуры агримониина - как одного из первых ди-мерных эллаготанинов, имеющих природное происхождение. Ранее японскими исследователями похожие соединения были выделены из некоторых растений также семейства розоцветные двух видов гравилата, репешка волосистого и эндемичной лапчатки [Okuda T., 1995].
Рис. 10. Хроматограмма агримониина.
Рис.11. Спектры основных пиков.
Хроматограмма свидетеля представлена на рисунке 10.Здесь агримониин ви-ден, как главный пик с несколькими минорными компонентами. Время удержи-вания агримониина 27 минут, а его УФ-спектр (рис.11) поглощения имеет мак-симумы при 220 и 280 нм.
Определили фракции, содержащие очищенный танин (рис. 10) их упарили и высушили. Получили белое с желтоватым оттенком вещество - агримониин, идентификация которого была проведена ранее. Водный раствор агримониина, полученного путем препаративной колоночной хроматографии был использо-
Рис.12. Хроматограмма водного извлечения (1) и агримониина (2)
ван в качестве свидетеля и для выявления расположения пика агримониина на хроматограмме водного извлечения. Сначала провели хроматографирование водного раствора свидетеля. Затем хроматографировали водное извлечение. По
времени удерживания и УФ-спектру поглощения в сравнении с раствором сви-детеля на хроматограмме был идентифицирован агримониин (рис. 12). При изу-чении отдельных фракций танинов нами установлено, что олигомерные танины манжетки представляют собой соединения, близкие по строению с агримонии-ном. Они имеют разное время удерживания на хроматограмме, но у них одина- ковый УФ-спектр с максимами поглощения при 220 и 280 нм, как у агримони-ина.
Таблица4. Содержание свободных аминокислот в траве некоторых
видов Alchemilla vulgaris L.
! ! Содержание свободных аминокислот, в мг на 1мл
! -----------------------------------------------------------------------
! Аминокислота ! М.изящная м.балтийская м.городчатая
Аспаргиновая кислота+ аспаргин
| 0 .04 | 0.04 | 0.04 |
треонин | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
Серин | 0.07 | 0.07 | 0.07 |
Глутаминовая кислота+ глутамин | 0.09 | 0.09 | 0.09 |
пролин | 0.45 | 0.45 | 0.45 |
Глицин | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
Аланин | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
Цистин | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
Валин | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
метионин | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
изолейцин | 0.04 | 0.04 | 0.04 |
ейцин | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
тирозин | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
фенилаланин | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
оксилизин | 0.13 | 0.13 | 0.13 |
изин | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
гистидин | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
аргинин | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
Сумма | 1.14 | 1.14 | 1.14 |
В результате этого исследования определено, что в водное извлечение из сы-рья переходит весь комплекс полифенолов: фенолкарбоновые кислоты, флаво-ноиды и олигомерные танины.
Изучение аминокислотного состава.
Изучение аминокислотного состава трёх видов рода манжетка: показало его идентичность (табл. 4). Из 20-ти обнаруженых аминокислот в водном извлече- нии преобладают пролин и оксилизин (0,45 мг/мл и 0,13 мг/мл соответствен-но). Обладая высокой биодоступностью, они обуславливают, наряду с другими БАВ (полифенолы, макро- и микроэлементы) травы манжетки широту спектра фармакологической активности её препаратов и могут служить маркерами, на-ряду с другими, подлинности сырья и качества настоя. Этu и данные получен-
ные с помощью RAPD-анализа позволилu нам рекомендовать к медицинскому применению, для сбора траву всех изученных видов рода Alchemilla L., и рас-сматривать эти виды как производящие сырье - трава манжетки.
Фармакогностическое изучение травы манжетки.
Фармакогностическое изучение травы манжет позволило разработать крите-рии оценки подлинности и качества этого ценного сырья, а также разработать систему мероприятий по рациональному использованию природных ресурсов Alchemilla L.sp.Последняя включает описание производящих растений, позволя-ющее определять их в природе; и проводить выявление зарослей, пригодных для сбора сырья; даны рекомендации по условиям сбора, сушки и хранения сы-рья, а также режим эксплуатации зарослей.
Внешние признаки сырья приведены в таблице № 5: трава манжетки пред-ставляет собой смесь листьев и цветоносов с цветками и бутонами. Микроскопия травы манжетки позволила выявить особенности анатоми-ческого строения стебля, листа, черешка и чашелистиков (табл.6), опушение, строение клеток-идиобластов с друзами, одинаковые для всех изученных видов, которые могут служить диагностическими признаками подлинности сырья.
Качественный анализ сырья. На основании качественных фармакопейных ре-акций установлено, что водное извлечение травы манжетки (1:10) даёт поло-жительную цианидиновую пробу на флавоноиды с металлическим магнием или
Таблица № 5. Внешние признаки сырья манжетки обыкновенной
№ п/п | Диагностический признак | Характеристика признака |
С Т Е Б Е Л Ь | ||
1 | Форма | Округлый |
2 | характер поверхности | Опушенный |
3 | характер ветвления | Разветвленный |
4 | Размеры длина диаметр | до 10 см до 4 мм |
5 | Цвет | светло-зеленый |
Л И С Т Ь Я | ||
1 | исторасположение | очередное |
2 | форма листовой пластинки | округло-почковидная и веерообразная |
3 | Размеры длина ширина | до 6 см до 4 см |
4 | наличие черешка стеблевые у розеточных | - сидячие - длиной до 5 см |
5 | строение листа | простые, лопастные |
6 | Жилкование | пальчатонервное |
7 | Край | зубчатый |
8 | Опушение верхней стороны листа с нижней стороны | малоопушенная более опушенная |
9 | Цвет верхней стороны нижней стороны | зеленый светло-зеленый |
- В Е Т К И | ||
1 | тип соцветия | дихазиальное, клубочковидное |
2 | строение цветка строение околоцветника | актиноморфный простой 4-х - мерный, чашечковидный с подчашием |
3 | Цвет | желто-зеленые |
Запах сырья | Слабый | |
Вкус сырья | Горьковатый | |
Таблица 6. Сравнительная характеристика микроскопических диагнос-
тических признаков травы манжетки отдельных видов
Диагностический признак | A.gracilis A.baltica | A.semilunaris A.hisuticaulis |
устьичный комплекс
сосудисто-волокнистых пучка в черешках | + + + + + + + + + + | + + + + + + + + + + |
цинком и концентрированной. хлористоводородной кислотой (красное окраши-вание), с раствором хлорида окисного железа - чёрно-зелёное окрашивание Ц
полифенолы.
На бумажной хроматограмме ацетонового извлечения, в системах 1-БУВ 4:2:1 и П-15% уксусная кислота, детергент желтая кровяная соль проявляет большинство соединений полифенольного комплекса - самое яркое Цагримо-
ниин.
На ВЭЖХроматограмме идентифицированы пики фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, в частности- рутина (рис. 9); олиготанинаЦагримониина (рис.12).
Экспериментально подобранные нами требования к пробоподготовке для
RAPD-анализа позволяют проводить идентификацию цельного и высокой сте-пени измельчения,как свежего так и высушенного сырья, соответственно ха-рактеризующегося набором из шести-восьми фрагментов амплифицированной ДНК, причем, нижние две полосы, имеют длину менее 500 пар нуклеотидов, (определённую относительно маркёра λHind-lll).
Числовые показатели для цельного и измельченного сырья, а также для по-рошка из него: сумма флавоноидов в пересчёте на рутин, влажность, зола об-щая, зола, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, пожел-тевшие и блёклые листья; черешки листьев и цветоносы длиннее 10 см, органи-ческая примесь, минеральная примесь, характеризующие качество сырья, определены нами экспериментально и установлены их нормы.
Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин проведено по подобранным нами и адаптированным фармакопейным спектро-фотометрическим методикам. Ошибка метода составила ±5,16%.Ф При изуче-нии вопросов стандартизации нами установлены нормы содержания основной группы БАВ.
Результаты валидации методик качественного и количественного анализа
БАВ и суммы флавоноидов в пересчете на рутин.
Валидационной проверке подвергались методики качественного и количест-венного определения биологически активных веществ: полифенолов, флавоно-идов и агримониина квалификационные исследования заключались в оценке их воспроизводимости и устойчивости стандартных растворов, подверженных ли-нейной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого вещества, достигаемой чувствительности определения, расчете метрологичес-ких характеристик и выявлению систематических погрешностей анализа. Резу-льтаты валидации показали высокую чувствительность определения (до 0,005 %) и строгость линейных зависимостей аналитических сигналов от содержания флавоноидов (коэффициенты корреляции составили 0,998), что определяет вы-сокую точность анализа. Это выражается в хорошей воспроизводимости резу-льтатов, а также в статистически доказанной правильности определения.
Сделанные выводы дают возможность считать разработанную методику при-годной для достоверного количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин для травы манжетки.
При разработке системы мероприятий, способствующих сохранению качест-ва сырья до его применения, необходимо учитывать динамику содержания и фи зико-химические свойства БАВ, содержащиеся в нём.
Таблица 7. Содержание суммы флавоноидов в траве манжетки
в зависимости от сроков хранения
Год проведения сбора| Содержание суммы флавоноидов, %
1996 2,850,15*
1995 2,780,25
1994 2,070,18
1993 1,780,28
1992 1,750,33
* До 1997 года собирали всю надземную часть манжетки, не отделяя черешки и жёсткую часть цветоносов.
Так как в траве манжетки флавоноиды относятся к одной из главных групп дей-ствующих веществ, обуславливающих основные фармакологические эффекты, проводили изучение стабильности содержания суммы флавоноидов в траве манжетки, заложенной на хранение в 1992 году в сухом, защищенном от света месте. Проведенное исследование показало, что со временем (по истечении двух лет хранения) этот показатель значительно уменьшается, сырье выгорает. Результаты спектрофотометрического определения содержания суммы флаво-ноидов в пересчете на рутин представлены в таблице 7, где видно, что хранить траву манжетки дольше двух лет нерационально.Таким образом, трава манжет-ки должна храниться по общему списку в защищенном от света, хорошо проветриваемом помещении не более двух лет.
Срок годности экспериментально установлен - 2 года.
Ресурсоведческое исследование
На основании проведенного ресурсоведческого исследования природных по-пуляций манжетки установлено, что для изученных популяции характерно до-минирование A.gracilis (до70%), A.baltica(15%), A.subcrenata (10%) и все оста-льные виды составляют менее 5% * (рис.13); определено, что проективное пок-рытие в среднем охватывает 7015% учетной площадки; сбор свежего сырья должен составлять около 50% от всей биомассы, одна особь при этом дает 20-35 грамм
свежего сырья, занимая площадь от 0,25 до 0,50 м; коэффициент усушки - со-ставил 4. В результате расчетов определено, что 1% проективного покрытия даёт 0,90,1 грамм сухого сырья при ежегодной заготовке сырья с соблюде-нием ресурсосберегающих требований.
Рис.13. Диаграмма соотношения видов Alchemila в популяции
Манжетка входит в ценокомплекс в составе злаково-манжетково-разнотрав-
ной ассоциации; разнотравье представлено следующими видами: купырь лес-ной - Anthriscus silvestris (L) Hoffm, дудник леснойЦAngelica sylvestris L., хвощ лесной - Equisetum sylvaticum L., вербейник монетчатый - Lysimachia nummu-laria L., герань лесная - Geranium sylvaticum L., лапчатка прямостоячая - Poten-tilla erecta (L.) Raeusch., вероника дубравнаяЦVeronica chamaedrys L.,горошек заборный -Vicia sepium L.,зверобой пятнистый - Hypericum quadrangulum L.,и др.Эти виды могут попадать в сырье, как органическая примесь (не более 10%).
Расчеты среднего выхода сырья с одного квадратного метра проводили за пять лет. Они составили: 56,32±5,87г(2001г), 45,46±3,45г(2002г),
65,67±8,35г(2003г), 35,52±4,57г(2004г); 72,26±9,06 г(2005г).
Проанализировав полученные данные, установили, что урожайность травы манжетки находится в зависимости от погодных факторов вегетационного пе-
риода, при этом выход сухого сырья травы манжетки может составлять в сред-нем до 5,5 ц/га.
Таким образом, нами установлено, что манжетка образует сплошные невы-сокие заросли - куртины, поэтому определение урожайности можно прово-дить по проективному покрытию, лцена 1% будет равна около 0,9 г, а урожай-ность травы манжетки в среднем составляет 5,5 ц/га. Т.о. установлен объем ежегодных заготовок.
Определение острой токсичности и специфической активности травы манжетки показало, что настой из нее относится к классу нетоксичных, макси-мально переносимая доза настоя МПД≈LD10. Установлено, что настой травы манжетки обладает антиметастатическим действием (ТРМ более 25%) при ран-нем начале лечения (на модели опухоли карциномы Льюис), при этом настой обладает способностью ингибировать процесс рецидивирования опухоли у жи-вотных. При пероральном введении настоя травы манжетки мышам в дозе 7,0 мг/кг способствует снижению метастазирования саркомы 37 на 29%. По пред-варительным данным настой травы манжетки в дозе 13,7 мг/кг per os значите-льно увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей с саркомой-37 в сравнении с контролем. Также определена перспективность его применения при комбинированной терапии.
Обсуждение результатов Лекарственные растения, применяемые отечест-венной народной медициной составляют более 600 видов, а разрешенных к ме-дицинскому применению, включенных в Государственный Реестр - 260 видов, причем многие из них не образуют промышленно значимых зарослей или вклю чены в Красную Книгу. Кроме того, ухудшение экологической обстановки, ант-ропогенное воздействие на места обитания многих ценных лекарственных ви- дов сокращают их природные запасы. Все это вызывает необходимость актив-нее изучать и внедрять лекарственные растения народной медицины для расши-рения сырьевой базы получения отечественных лекарственных средств.
Для этого необходимо разработать научно обоснованные методические под-ходы к изучению лекарственных растений Флоры России, создать алгоритм, по-
Схема 1. Алгоритм изучения лекарственных растений.
зволяющий наиболее полно изучать и эффективно внедрять их в научную ме-дицину.
Научно обоснованная схема изучения лекарственных растений народной ме-дицины должна содержать следующие этапы:
-Выявление лекарственного растения наиболее часто применяемого для лечения определенного вида патологий;
-Изучение жизненного цикла растения и возможности введения его в культуру;
-Изучение природной сырьевой базы;
-Выявление биологически активных веществ, определяющих фармакологическую активность лекарственного сырья;
-Определение показателей подлинности и качества сырья;
-Разработка нормативных документов на сырье
- Изучение биологической активности
- Клинические испытания
и представлена на схеме 1.
На основании этого алгоритма были проведены исследования для разработ-ки нормативных документов. Результаты исследования перспективных лекарст-венных растений были положены в основу методических указаний по изучению растений Флоры России.
В результате изучения особенностей биологии лекарственных растений бы-ло установлено, что для идентификации видов, обладающих аберратными фор- мами размножения необходимо использовать молекулярно-биологические ме-тоды анализа. Они позволяют четко очертить круг видов, относящихся к расте-
ниям, производящим сырье, а также определить его подлинность в препаратах из него высокой степени измельчения.
Поскольку эти методы достаточно точны, доступны, воспроизводимы и рас-ширяют возможности фармакогностического анализа, считаем необходимым включить нормативные документы на них в последующее издание Государст-венной Фармакопеи.
Проведенные исследования позволили разработать методические подходы (алгоритм) для изучения лекарственных растений народной медицины, облада-ющих сложной таксономией и аберратными формами размножения, образую-щих агамные комплексы и др. Схема 1., а также разработать нормативные доку-менты на перспективное лекарственное растительное сырье трава манжетки (проект Фармакопейной статьи и Инструкции по сбору и сушке), кроме того, проект общей Фармакопейной статьи RAPD-анализ лекарственного расти-тельного сырья.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. С помощью RAPD-анализа на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер измен-чивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между ви дами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и по-пуляционной изменчивости.
2. Изучена взаимосвязь между строением геномов видов рода манжетка и стабильностью химического состава БАВ. В качестве химических маркеров определены рутин, гиперозид, галловая и кофейная кислоты, агримониин, пролин и оксилизин.
3. Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья - трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отчественной медицины, эти данные вошли в проекты Фармакопейной статьи и Инструкцию по сбору и сушке.
4. Изучение полифенольного состава травы манжетки от разных производящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.
5. Показана возможность применения RAPD для видоидентификации лекарст-венного растительного сырья и молекулярно-биологических методов для даль-нейшего изучения лекарственных растений на примере 17 видов сырья растений, относящихся к 11-ти родам и к 7-ми семействам. Разработан проект Общей Фармакопейной статьи RAPD-анализ лекарственного растительного сырья.
6. Установлена возможность использования применения секвенирования ДНК перспективных и лекарственных растений с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petB-petD) и на примере рода Аnthylis L.,и проведен филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.
7. Выявлено отсутствие токсичности и определена специфическая активность настоя травы манжетки.
8. Определена урожайность перспективного сырья - трава манжетки: при еже-годных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий, она состав-ляет до 5,5 ц/га.
9. В результате проведенного фармакогностического изучения перспективных лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических мето-дов обобщенны экспериментальные данные и дано теоретическое обоснование необходимости и возможности их применения при комплексном изучении пер-спективных лекарственных растений, применяемых в народной медицине.
10. Разработан алгоритм изучения сложных в таксономическом отношении ви-дов и родов этих растений в том числе и обладающих аберратными формами размножения.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Баева В.М. Динамика накопления дубильных веществ цветков иван-чая узко-листного по фазам онтогенеза.-Деп.во ВНИИМИ, МРЖ, № 6, 1986, раздел ХХП, публ.1051.
2. Баева В.М., Барабанов Е.И. Микроэлементный состав иван-чая узколист-ного и препарата УХанероФ // Фармация, 1994, № 6.-С.4-6.
3. Баева В.М., Павкин А.В.ФМорфолого-анатомические особенности строения представителей рода манжеткаФ.-Сб.ФАктуальные вопросы медициныФ- Материалы Всероссийской студенческой конференции, посвященной 50-летию АМН России, 4-6 октября 1994.М., 1994. - С.60.
4. Баева В.М., Сасов С.А.ФСравнительное изучение химического состава пред-ставителей рода манжеткаФ.- УСовременные аспекты изучения лекарственных растенийФ. - Научные труды, т. ХХХ1У, М.- 1995.- С.242-244.
5. Баева В.М., Боброва В.К.ФСравнительное изучение геномов представителей рода манжеткаФ.- Материалы докладов Российской национальной конференции УФормирование приорететов лекарственной политикиФ.М., 1995 28-29 июня. - С.165-166.
6. Баева В.М., Боброва В.К.ФГеномный анализ рода манжеткаФ.- Тезисы док-ладов Первого международного симпозиума УНовые и нетрадиционные рас-тения и перспективы их практического использованияФ (1-5 августа 1995 г) Пущино - 1995.- С.24-25.
7. Баева В.М. УИзучение манжеток ботанического сада ММА им. И.М.Сече-новаФ УЛекарственные растения ботанического садаФ - Материалы тезисов научной конференции, посвященной 50-летию ботанического сада ММА им. И.М.Сеченова.- М., 1996. - С.40.
8. Баева В.М., Боброва В.К. RAPD - перспективный анализ для изучения лекарственных растений. - Научные труды: Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях, т. ХХХ1У, часть П. М., 1997.-С.174-177.
9. Баева В.М., Володин Ю.Ю., Толкачёв В.Н. Спектрофотометрическое опре-деление суммы флавоноидов манжетки // Международный конгресс по анали-тической химии 15-21 июня 1997 г. Тесизы докладов, М., 1997. - Россия. Абстракт, № 2. - С.46.
10. Баева В.М., Боброва В.К., Троицкий А.В., Антонов А.С. RAPD-анализ ДНК рода манжетка // Фармация, 1998 № 2.- С.38-41.
11. Баева В.М. Перпективы применения геномного анализа для изучения лекарственных растений // У Российский национальный конгресс Человек и лекарство. Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г. - С. 345.
12. Баева В.М., Глазунова К.П. Применение пыльцевого анализа для опреде-ления качества лекарственного растительного сырья. У Российский нацио-нальный конгресс Человек и лекарство. Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г.- С.346.
13. Баева В.М., Глазунова К.П. Манжетка обыкновенная Цперспективное ле-карственное растение // У Российский национальный конгресс Человек и ле-карство. Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998. - С.358.
14. Баева В.М., Сасов С.А. Флавоноидный состав цветков иван-чая узко-листного // У Российский национальный конгресс Человек и лекарство Тезисы докладов, М., 21-25 апреля 1998.- С. 358-359.
15. Баева В.М. Микроэлементный состав травы манжетки // Материалы науч-но-практической конференции Традиционные методы лечения - основные на-правления и перспективы развития. МЗ РФ. М., 14-16 мая 1998. - С.109.
16. Баева В.М., Глазунова К.П. Применение пыльцевого анализа для опреде-ления загрязнённости лекарственного растительного сырья. Сб. Фармацевти-ческая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения. Научные тру-ды, том ХХХУП, ч. П, М., 1998.- С.145-149.
17. Baeva V.M., Sepp S., Antonov A.S. et and. Genetic and morfological variabiliti in same microspecies of agamous Alchemilla L. Ineternacional Symposium УPlant Evolution in Man-made Habitats. - August 10-15.1998. - S. 93.
18. Баева В.М., Глазунова К.П. Изучение морфо-генетической изменчивости у видов рода манжетка // Сб. Современные проблемы фармацевтической науки и практики. Научные труды, том ХХХУШ, ч. П. М., 1999.- С.155-158.
19. Баева В.М., Коваленко Т.Ф. RAPD-анализ листьев дуба // Сб. Фармация на современном этапе - проблемы и достижения. Научные труды, том ХХХ1Х, часть П, М., 1999. - С.196-198.
20. Баева В.М.,Можайский А.М. Изучение полифенольного состава водных из-влечений травы некоторых видов манжетки // Фармация, 2001, № 5. - С. 25-26.
21. Баева В.М., Козин С.В. Изучение токсичности настоя травы манжетки // УШ Российский национальный конгресс Человек и лекарство. Тезисы докладов М., апрель 2001. - С.442.
22. Баева В.М., Сасов С.А., Ярцева И.В. Изучение полифенольного состава травы манжетки // У1 Симпозиум по фенольным соединениям 28-30 апреля 2004 Москва. Тезисы докладов М., 2004.- С.96.
23. Баева В.М. Лечение растениями. Основы фитотерапии. М., 2004.- С.202.
24. Баева В.М., Потанина О.Г., Самылина И.А., и др. Пыльца, как анатомо-диагностический признак при определении подлинности лекарственного рас-тительного сырья // Материалы съезда и конференции. 9-й международный съезд Фитофарм 2005. Конференция молодых учёных Европейского фито-химического общества (Растения и здоровье).С.-Петербург 22-25 июня 2005 г.- С.283-289.
25. Баева В.М.Полиморфизм лекарственных растений // Фармация, 2005, № 6.- С. 40-42.
26. Баева В.М. Изучение запасов перспективного лекарственного сырья - трава манжетки //Традиционная медицина - 2007. Сб.научн.трудов конгресса, посвя-щенного 30-летию со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии.Москва, 1-3 марта 2007.-С.30-32.
27. Баева В.М., Сасов С.А.Полифенолы травы манжетки // Фармация, 2007, № 8.- С. 9-10. .
28. Баева В.М., Мурин И.И.Изучение аминокислотного состава настоя и порош-ка травы манжетки //Традиционная медицина № 1 [8] 2007.- С.53-56.
29. Баева В.М. Использование методов молекулярной биологии для идентифи-кации лекарственного растительного сырья // Традиционная медицина 2007. Сб. научн. трудов конгресса, посвященного 30-летию со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии. Москва, 1-3 марта 2007.-С.32-33.
30. Баева В.М., Ермакова В.А, Сорокина А.А., Самылина И.А.и др. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. М., 2007.- С.672.
31. Баева В.М. Современный подход к изучению лекарственных растений // Сб. научных трудов. Г.Москва 14-16 марта 2008 года. М .2008. - С. 268-271
32. Баева В.М. Фармакогностическое изучение и стандартизация сырья трава манжетки.//Сб. научных трудов. Г.Москва 14-16 марта 2008 года. М .2008.- С.231-232.
33. Баева В.М., Сасов С.А. Полифенолы травы манжетки // Фармация. - 2007. - № 8.- С.9-10.
34. Монастырева Н.А., Баева В.М.Изучение состава полифенольного комплекса травы монарды методом ВЭЖХ.Тезисы итоговой научной студенческой конфе-ренции с международным участием Татьянин день, посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Москва.2007.-С.-22.
35. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние настоя травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата - циклофосфаминда // Тезисы У Конференции молодых ученых России с международным участием Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины- Российская Федерация, г. Москва.- 2008.-с.307, 545 С.
36. Баева В.М., Вальехо-Роман К.М., Смигуллин Т.Х. Перспективы изучения лекарственных растений с использованием секвенирования ДНК на примере рода Anthyllis L.// Фармация.2009, № 3.- С.23-26.
37. Баева В.М., Монастырева Н.А. Применение RAPD-анализа для изучения лекарственного растительного сырья // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009, №2. - С. 29-31.
38. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние агримониина и суммы поли-фенолов, выделенных из травы манжетки, на общую токсичность противоопу-холевого препарата циклофосфамид // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 2 // Материалы УШ Всероссийской научно-практической конферен-ции Отечественные противоопухолевые препараты Москва, 21-22 апреля 2009 г.- С.55.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по разное