Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ЦАРЁВА ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА
ФАРМАКОГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМИ ПРЕПАРАТАМИ
03.01.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им.
Н.И.Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва (зав. кафедрой д.б.н. профессор Фаворова Ольга Олеговна).
Научный консультант: Кулакова Ольга Георгиевна кандидат биологических наук, доцент, ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова" Минздрава РФ, г. Москва
Официальные оппоненты:
Носиков Валерий Вячеславович доктор биологических наук, профессор, ФГУП Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва доктор биологических наук, профессор, Сломинский Петр Андреевич ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва
Ведущая организация: ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва
Защита состоится 4 декабря 2012 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП "ГосНИИгенетика".
Реферат разослан 1 ноября 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Т. Л. Воюшина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Рассеянный склероз (РС) - хроническое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), преимущественно поражающее людей трудоспособного возраста. При этом заболевании у больного развивается комплекс иммуноопосредованных патологических реакций, направленных на разрушение миелиновой оболочки нейронов, что впоследствии приводит к необратимой потере неврологических функций и тяжелой инвалидизации (Stadelmann C. et al, 2011). В мире насчитывается более 2.5 миллионов больных РС, в России около 200 тыс. человек. В ряде регионов России заболеваемость РС довольно высока и находится в пределах 35-случаев на 100 тыс. населения. Достаточно высокая распространенность РС в мире, а также отсутствие однозначно эффективного лечения этого заболевания, выводят проблемы изучения РС в ряд важнейших медико-биологических задач.
ечение РС остается одной из наиболее серьезных проблем практической неврологии, однако, в последнее время появились действенные пути влияния на течение болезни. Это стало возможным благодаря разработке современных подходов, опирающихся на знание иммунопатогенеза этого заболевания. В настоящее время для лечения РС широко применяют препараты, изменяющие течение РС (ПИТРС); все они тем или иным образом влияют на развитие иммунопатологических процессов. К разрешенным к использованию ПИТРС в первую очередь относят иммуномодулирующие препараты глатирамера ацетат (ГА) - синтетический сополимер из остатков аланина, лизина, тирозина и глутаминовой кислоты;
интерферон-бета (ИФНб) и финголимод - лиганд для рецепторов сфингозинЦ1Цфосфата, которые являются препаратами первой линии при длительном патогенетическом лечении больных РС (Гусев Е.И. и соавт., 2000; Lalive P. et al, 2011; Pelletier D. et al, 2012).
Терапевтический эффект этих препаратов на активность РС при ремиттирующем РС был показан в нескольких мультицентровых рандомизированных клинических испытаниях с использованием двойного слепого метода. Эти препараты снижают частоту и тяжесть обострений, задерживают прогрессирование нетрудоспособности и возникновение новых очагов (по данным магнитно-резонансной томографии головного мозга).
В то же время, лечение РС характеризуется выраженной гетерогенностью ответа на лечение ПИТРС: по данным различных клинических испытаний, от 30 до 50% больных (в зависимости от выбора клинических критериев оценки эффективности лечения) остаются невосприимчивыми к проводимой терапии (Laing R. et al, 2011). При этом вывод о действенности терапии ПИТРС для каждого больного РС можно сделать только после длительного приема препарата. К сожалению, к тому времени, когда будет вынесено решение об отмене препарата, неврологическое состояние больного может ухудшиться.
Результаты проведенных ранее исследований свидетельствует о значительной генетической детерминированности индивидуального ответа на лечение многими препаратами. Поскольку вариабельность ответа больных РС на лечение ПИТРС также может быть связана со сложным влиянием генетических факторов, возникла необходимость фармакогеномных исследований эффективности иммуномодулирующей терапии.
Фармакогеномику в настоящее время определяют как науку, изучающую общие аспекты наследования и функционирования многих генов, детерминирующих реакцию на действие лекарств. Одно из основных направлений фармакогеномики, фармакогенетика, изучает такие варианты последовательностей ДНК индивидов, которые обуславливают различия в процессах метаболического превращения лекарственного средства и его доставки и различия в ответе организма на действие лекарств.
Фармакогенетические исследования эффективности лечения РС препаратами ПИТРС первой линии проводятся сейчас во многих странах, однако, в основном, они касаются ИФНб. Эффективность применения ГА при лечении РС анализировали лишь в нескольких исследованиях, в первую очередь направленных на поиск ассоциации эффективности лечения с полиморфизмом генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса II; в единичных работах анализировали также значение полиморфизма генов, кодирующих Тклеточный рецептор, некоторые цитокины и белки миелина (Fusco C. et al, 2001; Алифирова В.М. и соавт., 2006; Grossman I. et al., 2007; Gross et al., 2011).
В России ГА, зарегистрированный для применения в 1997 году, активно используется в качестве ПИТРС первой линии. Генетические варианты, влияющие на эффектность действия этого лекарственного препарата, могут быть биологическими маркерами, определяющими выбор лекарственной терапии для конкретного больного еще до начала лечения, что является основой персонализированной медицины.
В последние годы стало ясно, что анализ независимого вклада аллелей/генотипов одиночных генов-кандидатов, каждый из которых может оказывать малый и трудно выявляемый эффект на общую эффективность лечения заболевания тем или иным препаратом, может оказаться недостаточно информативным. Благодаря развитию биоинформатики в последние годы перспективным направлением развития фармакогенетических исследований стало выявление совместного вклада генов, подразумевающее анализ ассоциации совместного носительства сочетаний аллелей/генотипов нескольких генов с эффективностью проводимой терапии.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является анализ совместного вклада ряда генов иммунного ответа в эффективность лечения иммуномодулирующим препаратом глатирамера ацетатом (ГА) больных РС, русских по этнической принадлежности.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие конкретные задачи:
1. Провести геномное типирование полиморфных участков ряда генов иммунного ответа, белковые продукты которых вовлечены в механизм действия ГА, а именно генов про- и антивовоспалительных цитокинов (IFNG: rs2430561; TNF: rs1800629; IFNB1: rs1051922;
TGFB1: rs1800469), рецепторов цитокинов и хемокинов (IFNAR1: rs1012335; IL7RA:
rs6897932; СCR5: rs333), антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4: rs231775), а также гена ГКГ класса II (HLA-DRB1) для больных РС русских по этнической принадлежности.
2. Провести сравнительный анализ как индивидуального, так и совместного вклада полиморфизма генов-кандидатов у больных РС с оптимальным ответом на лечение ГА и больных без оптимального ответа на лечение ГА (всех остальных больных РС).
3. Провести сравнительный анализ как индивидуального, так и совместного вклада полиморфизма генов-кандидатов у больных РС с оптимальным ответом на лечение и больных, характеризующихся полным отсутствием ответа на лечение ГА (сравнение "крайних" групп).
4. Проанализировать возможные механизмы взаимодействия между аллелями в составе сочетаний при их выявленном совместном вкладе в эффективность лечения больных РС препаратом ГА.
Научная новизна работы. Впервые выполнен фармакогенетический анализ эффективности лечения РС одним из препаратов первой линии - глатирамера ацетатом - для русских по этнической принадлежности больных РС. Впервые проведено целостное систематическое исследование совместного вклада функционально значимых полиморфных участков ряда генов (а именно, девяти генов иммунного ответа) в формирование ответа на лечение препаратом ГА больных РС. Впервые параллельно проведено сравнение генетического статуса больных РС с оптимальным ответом на терапию ПИТРС как с больными РС без оптимального ответа, так с больными РС с полным отсутствием ответа (сравнение "крайних" групп). Такой анализ, направленный на кросс-валидацию результатов при двух типах сравнения, впервые позволил убедительно показать участие генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом. Впервые найдены композитные (составные) маркеры, носительство которых ассоциировано с различной эффективностью ответа больных РС на лечение ГА - биаллельное сочетание (DRB1*4+IL7RA*T), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и сочетание из четырех аллелей (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G), негативно ассоциированное с ним. Впервые в рамках фармакогенетического исследования проведен анализ природы кумулятивного эффекта аллелей CCR5*d, DRB1*15, TGFB1*T и IFNAR1*G в составе аллельных сочетаний и показано, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический (нелинейный) типы взаимодействия между исследуемыми аллелями.
Практическая значимость диссертации. Обнаруженные би- и четырехаллельные сочетания могут служить композитными маркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных РС. Эти результаты могут быть основой для создания прогностического теста, направленного на выбор одного из альтернативных иммуномодулирующих препаратов первой линии для лечения больных РС еще до назначения патогенетического лечения.
Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы; она изложена на 140 страницах, включает 11 рисунков и 30 таблиц. Список литературы содержит 264 источника.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на следующих международных научных конференциях: International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 21-24 July 2011 (Moscow, 2011), VII International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientis (Moscow, 2012), UEPHA*MS Final Network Conference УMultiple Sclerosis and the OMICS SpringФ (Spain, 2012) и школе-конференции Summer Training School in Bioinformatics (UK, 2012). Работа была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии и медицинской биотехнологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова" Минздрава РФ 14 сентября 2011 года и на заседании секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП "ГосНИИгенетика" 9 октября 2012 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 6 материалов конференций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объект исследования. Для проведения ретроспективного фармакогенетического исследования методом случай-контроль использовали образцы геномной ДНК 2неродственных больных РС русской этнической принадлежности, принимавших в качестве иммуномодулирующего препарата глатирамера ацетат (Копаксоно). Все больные РС проходили лечение в Московском городском центре рассеянного склероза (МГЦРС).
Диагноз РС был поставлен согласно критериям Макдональда. Соотношение по полу (мужчины:женщины) составило 1:2.4, средний возраст дебюта РС составил 27.08.8 лет, средний возраст на момент начала лечения ГА 34.29.9 года.
Экспертную оценку эффективности лечения больных РС препаратом ГА осуществляли неврологи МГЦРС. Лечение считали клинически оптимальным, если у больных РС в течение не менее двух лет приема ГА не наблюдали обострений и нарастания неврологического дефицита по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale - расширенная шкала оценки степени инвалидизации). Из 285 больных, получавших ГА, в группу с клинически оптимальным ответом вошли 130 человек (группа "Responders", R). В группу больных без оптимального ответа на лечение ГА вошли все остальные больные (группа "Non-responders", NR, 155 чел.). В составе этой группы были как больные, характеризующиеся полным отсутствием ответа на лечение ГА (группа "Definite nonresponders", DNR, 84 чел.), так и больные с промежуточным ответом на лечение ГА (человек), течение болезни которых немного улучшалось, однако, наблюдались неблагоприятные клинические события. Все индивиды давали информированное согласие на использование их ДНК для исследования. Проведение исследования было одобрено на заседании этического комитета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова.
В контрольную группу для определения частот аллелей и генотипов полиморфных участков исследуемых генов-кандидатов вошли 125 здоровых добровольцев русской этнической группы (средний возраст 50.019.3 лет).
Выделение геномной ДНК из периферической крови. Для получения ДНК необходимой чистоты и достаточной молекулярной массы применяли метод выделения ДНК из венозной крови с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ.
Полиморфные участки генов, анализ которых проводили в работе. В работе анализировали группы аллелей гена HLA-DRB1 ГКГ класса II, соответствующие серологическим специфичностям DR1 - DR18, делеционный полиморфизм wdel32 гена CCR5 (wd, rs333) и следующие биаллельные полиморфизмы: -308G>A в промоторной области гена TNF (rs1800629); -509C>T в промоторной области гена TGFB1 (rs1800469);
49A>G в экзоне 1 гена CTLA4 (rs231775); 874T>A в интроне 1 гена IFNG (rs2430561);
153T>C в кодирующей области гена IFNB1 (синонимическая замена Tyr51Tyr, rs1051922), 16725G>C в интроне 3 гена IFNAR1 (rs1012335); C>T в экзоне 6 гена IL7RA (Thr244Ile, rs6897932).
Геномное типирование. Геномное типирование полиморфного участка в гене CCRпроводили методом анализа полиморфизма длин продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полиморфные участки генов HLA-DRB1, TNF; IFNG, TGFB1, IFNB1; IFNAR1 и IL7RA анализировали методом ПЦР с аллелеспецифическими праймерами. Геномное типирование полиморфного участка в гене CTLA4 проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продукта ПЦР. Во всех случаях ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология"). Продукты ПЦР и рестрикции анализировали методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле различной плотности в присутствии бромида этидия.
Статистический анализ. Для оценки значимости различий по количественным клиническим признакам при сравнении групп R vs NR и R vs DNR применяли непараметрический критерий Манна-Уитни.
В исследуемых группах больных РС определяли частоты аллелей и частоты носительства аллелей и генотипов анализируемых генов. Отклонение наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга проверяли по критерию 2. Анализ ассоциации индивидуальных аллелей/генотипов исследуемых генов-кандидатов с эффективностью лечения больных РС препаратом ГА оценивали с помощью двухстороннего точного критерия Фишера с помощью программы GraphPad InStat. При анализе совместного вклада полиморфизма исследуемых генов для выявления ассоциаций носительства аллелей/генотипов и их сочетаний применяли алгоритм APSampler (Favorov A.V. et al., 2005).
Уровень значимости найденных сочетаний проверяли входящими в APSampler программными средствами для валидации на основании точного критерия Фишера (р) и оценки отношения шансов (OШ) и его 95%-ого доверительного интервала (ДИ). Значимыми считали различия сравниваемых частот при значении p < 0.05, при условии, что значения 95% ДИ для ОШ не пересекают 1. Для валидации результатов также проводили пермутационый анализ (pperm, 100 пермутаций), также входящий в программное обеспечение APSampler.
РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Анализ индивидуального вклада аллелей/генотипов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА Клинические и демографические данные для больных РС, стратифицированных по эффективности лечения ГА как R, NR и DNR (см. выше), представлены в таблице 1. При ретроспективном анализе выявлено, что до лечения группы больных РС не отличались по клинико-демографическим признакам. Однако на момент оценки эффективности лечения ГА у больных из групп как NR, так и DNR наблюдали значимо более тяжелое течение РС (исходя из тяжести течения по шкале EDSS) по сравнению с больными, попавшими в группу R (p<0.0001).
Таблица 1. Демографические и клинические характеристики групп больных РС, стратифицированных по эффективности лечения ГА.
Демографические и клинические данные R, n=130 NR, n=155 DNR, n=1:3.Соотношение по полу (мужчины:женщины) 1:2.0 1:3.26.98.9 27,28,8 27.28.Средний возраст дебютаSD (годы) Средний возраст на момент начала 33.110.0 35.310.1 35.510.леченияSD (годы) На момент начала 130/0 84/0 84/лечения Формы РС (РРС:ВПРС) На момент оценки 130/0 70/14 70/эффективности лечения 1.9(0.6) 2.1(0.8) 2.1(0.8) На момент начала Среднее лечения [1.0-4.0] [1.0-4.5] [1.0-4.5] значение по шкале EDSS 1.9 (0.7)*# 3.2(1.2)* 3.2(1.2)# На момент оценки (SD) [диапазон] эффективности лечения [1.0-4.5] [1.5-6.5] [1.5-6.5] РРС - ремитирующий РС; ВПРС - вторично-прогрессирующий РС; EDSS (Expanded Disability Status Scale) - расширенная шкала оценки степени инвалидизации; SD (standard deviation) - стандартное отклонение; R - группа больных РС с оптимальным ответом на терапию ГА; NR - группа больных РС без оптимального ответа на лечение ГА; DNR - группа больных РС, характеризующаяся полным отсутствием ответа на лечение ГА.
*, # - p<0.0001 при попарном сравнении по Манну-Уитни.
Анализ распределения частот аллелей и генотипов всех исследуемых полиморфных участков в общей группе больных РС, принимавших ГА, а также в группе здоровых индивидов, с помощью критерия 2 показал, что равновесие Харди-Вайнберга соблюдается во всех случаях.
В результате сравнительного анализа частот аллелей, частот носительства аллелей и генотипов полиморфных участков исследованных генов-кандидатов в группах больных РС с различной эффективностью лечения ГА значимые ассоциации наблюдались только при сравнении групп R vs NR для аллелей генов HLA-DRB1 и ССR5 (таблицы 2 и 3).
Таблица 2. Частоты аллелей и частоты носительства аллелей гена DRB1 HLA класса II у больных РС с различной эффективностью лечения препаратом ГА (R vs NR).
R NR Аллели Величина р; ОШ [95% ДИ] n=130 n=1Аллели, число (%) DRB1*1 19 (7.3) 24 (7.7) Н.з.
DRB1*4 32 (12.3) 21 (6.8) 0.029 1.9 [1.1-3.4] DRB1*7 23 (8.8) 37 (11.9) Н.з.
DRB1*8 12 (4.6) 19 (6.1) Н.з.
DRB1*11 23 (8.8) 28 (9.0) Н.з.
DRB1*13 43 (16.5) 32 (10.3) 0.034 1.7 [1.1-2.8] DRB1*15 58 (22.3) 88 (28.4) Н.з.
DRB1*16 8 (3.1) 10 (3.2) Н.з.
DRB1*17 34 (13.1) 37 (11.9) Н.з.
Аллели, число носителей (%) DRB1*1 18(13.8) 24(15.5) Н.з.
DRB1*4 30(23.1) 21(13.5) 0.044 1.9 [1.0-3.5] DRB1*7 21(16.2) 32(20.6) Н.з.
DRB1*8 12(9.2) 19(12.3) Н.з.
DRB1*11 21(16.2) 27(17.4) Н.з.
DRB1*13 37(28.5) 32(20.6) Н.з.
DRB1*15 54(41.5) 79(51.0) Н.з.
DRB1*16 8(6.2) 10(6.5) Н.з.
DRB1*17 31(23.8) 34(21.9) Н.з.
Н.з. - не значимо Из таблицы 2 видно, что частоты аллеля DRB1*4 и аллеля DRB1*13 были значимо выше в группе больных с оптимальным ответом на лечении ГА (p=0.029, ОШ=1.9 и p=0.034, OR=1.7, соответственно). При сравнении частот носительства аллелей гена DRB1 показано, что частота носительства аллеля DRB1*4 также значимо выше в группе R (p=0.044, ОШ=1.9), тогда как для DRB1*13 значимых отличий не наблюдалось. Для остальных аллелей гена HLA-DRB1 не наблюдали значимых различий между R и NR.
Частота аллеля CCR5*w значимо выше у больных с оптимальным ответом на лечение ГА (p=0.025, ОШ=1.9), а аллеля CCR5*d - в группе больных РС без оптимального ответа (p=0.025, ОШ=0.53) (таблица 3). При сравнении частот носительства аллелей и генотипов этого полиморфного участка уровень значимости не был достигнут.
Таблица 3. Частоты аллелей, частоты носительства аллелей и частоты генотипов инсерционно-делеционного полиморфизма (wd32) гена CCR5 у больных РС с различной эффективностью терапии ГА (R vs NR).
Аллели и R NR генотипы n=130 n=155 Величина р ОШ [95% ДИ] Частота аллелей, число (%) w 239 (91.9) 266 (85.8) 0.025 1.9 [1.1-3.3] d 21 (8.5) 44 (14.2) 0.025 0.53 [0.3-0.92] Частота носительства аллелей, число (%) носителей w 130 (100.0) 150 (96.8) Н.з.
d 21 (16.2) 39 (25.2) Н.з.
Частота генотипов, число (%) носителей w/w 109 (83.8) 116 (74.8) Н.з.
w/d 21 (16.2) 34 (21.9) Н.з.
d/d 0 (0) 5 (3.3) Н.з.
Н.з. - не значимо.
2. Анализ совместного вклада аллелей/генотипов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА При сравнении групп R vs NR выявлена значимая ассоциация с эффективностью лечения ГА носительства ряда сочетаний, содержащих те или иные аллели/генотипы семи из девяти исследованных генов, за исключением генов IFNB1 и CTLA4 (таблица 4). Выявлены сочетания, состоящие из двух, трех и четырех аллелей, частота носительства которых была значимо выше как в группе R, так и в группе NR.
Только для двух из двенадцати выявленных аллельных сочетаний показана значимая ассоциация с оптимальным ответом на ГА. Носительство сочетания (DRB1*4+IL7RA*T) характеризуется наибольшей значимостью среди всех биаллельных сочетаний и выдерживает пермутационный тест (pperm=0.036, ОШ=3.7), а величина р по Фишеру для него на порядок ниже, чем в случае носительства одиночного аллеля DRB1*4 (см. табл. 2). Еще одно биаллельное сочетание, ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, включало аллели IFNG*Т и TNF*А (p=0.035, ОШ=1.9).
Все остальные выявленные аллельные сочетания характеризуются значением ОШ меньше 1 и ассоциированы с отсутствием оптимального ответа на лечение ГА. Все они включают аллель CCR5*d, за исключением биаллельного сочетания (DRB1*15+TGFB1*T) (p=0.015, ОШ=0.5). В их состав также входят различные аллели гена DRB1 (*11 и 15), аллели TGFB1*T, IFNAR1*G, IL7RA*C и генотип TNF*G/G.
Наибольшим уровнем значимости (р=0.0002) характеризуется четырехаллельное сочетание (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G), ассоциированное с отсутствием оптимального ответа при лечении ГА и валидированное пермутационным тестом (pperm=0.0048, ОШ=0.038). Были также обнаружены два триаллельных и четыре биаллельных сочетания, являющиеся составными частями выявленного четырехаллельного сочетания, частота носительства которых также была значимо выше в группе NR. Из них одно, наиболее значимое триаллельное сочетание (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T), также выдерживало пермутационный тест (pperm=0.02, ОШ=0.08), хотя уровень значимости ассоциации с неблагоприятным ответом на лечение ГА для него был в 6 раз меньше по сравнению с четырехаллельным сочетанием. Выявлено еще одно, не входящее в состав четырехаллельного сочетания, триаллельное сочетание (CCR5*d+IFNAR1*G+IL7RA*C), носительство которого также значимо выше в группе NR (p=0.014, ОШ=0.5).
Таблица 4. Сочетания аллелей/генотипов генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, TNF, IFNAR1 и IL7RA, носительство которых ассоциировано с эффективностью лекарственной терапии ГА при сравнении групп больных РС с оптимальным ответом на лечение (R) и больных без оптимального ответа на лечение (NR).
Аллели/генотипы в составе сочетания Число носителей (%)/ число неносителей (%) сочетания P ОШ (95% ДИ) pperm CCR5 IFNG TGFB1 TNF IFNAR1 IL7RA DRBR NR wd 874T>A -509C>T -308G>A 16725G>C Thr244Ile* n=130 n=1Носительство сочетания из двух аллелей/генотипов - 4 - - - - T 19 (15)/110 (85) 7 (4.5)/148 (95.5) 0.0027 3.7 [1.5-9.0] 0.0d 11 - - - - - 2 (1.5)/127 (98.5) 14 (9)/141 (91) 0.0049 0.2 [0.04-0.7] 0.0 15 T 24 (18)/106 (82) 47 (30%)/108 (70%) 0.015 0.5 [0.3-0.9] d G 18 (14)/111 (86) 37 (24)/118 (76) 0.024 0.5 [0.3-0.96] d 15 7 (5)/122 (95) 20 (13)/135 (87) 0.025 0.4 [0.2-0.9] d - - - G/G - - 14 (11)/114 (89) 31 (20)/124 (80) 0.027 0.5 [0.2-0.97] d T 10 (8)/120 (92) 24 (15)/131 (85) 0.032 0.5 [0.2-0.99] - - T - A - - 26 (20)/103 (80) 18 (11)/137 (89) 0.035 1.9 [1.0-3.7] Носительство сочетания из трех аллелей d 15 - T - - - 1 (0.8)/129 (99.2) 14 (9.0)/141 (91.0) 0.0012 0.08 [0.01-0.6] 0.d - - - - G C 16 (12.5)/112 (87.5) 36 (23)/119 (77) 0.014 0.5 [0.2-0.9] d - - T - G - 8 (6)/121 (94) 23 (15)/132 (85) 0.015 0.4 [0.2-0.9] Носительство сочетания из четырех аллелей d 15 T G 0 (0)/130 (100) 14 (9)/141 (91) 0.0002 0.038 [0.0022-0.6] 0.00Жирным шрифтом выделены сочетания аллелей, частоты которых ассоциированы с оптимальным ответом на лечение ГА (ОШ больше 1).
*Соответствует замене CT в экзоне 6 гена IL7RA.
p - величина p по одностороннему точному критерию Фишера;
pperm - величина p после пермутационного теста (100 пермутаций).
Четыре биаллельных сочетания (DRB1*15+TGFB1*T), (CCR5*d+IFNAR1*G), (CCR5*d+DRB1*15) и (CCR5*d+TGFB1*T), являющиеся составными частями четырехаллельной комбинации, характеризуются близкими значениями p в диапозоне от 0.015 до 0.032 и ОШ от 0.4 до 0.5. Еще два выявленных негативных биаллельных сочетания содержат аллель CCR5*d в сочетании с аллелем DRB1*11 (pperm=0.049, ОШ=0.2) или генотипом TNF*G/G (p=0.027, ОШ=0.5).
Аллели генов CTLA4 и IFNB1 не входят ни в одно сочетание, значимо ассоциированное с эффективностью лечение ГА, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии вклада аллелей этих генов в эффективность лечения ГА.
Полученные результаты согласуются с представлением о суммировании независимых вкладов отдельных генов в формирование ответа на лечение. При этом в ряде случаев (это касается генов DRB1, TNF и IL7RA) удается наблюдать разнонаправленное влияние носительства различных аллелей одного гена на эффективность лечения ГА. Аллель CCR5*d входит во все сочетания (кроме одного), носительство которых выше в группе NR (диапазон ОШ от 0.038 до 0.5). Большинство негативных сочетаний содержало также аллели TGFB1*T и/или IFNAR1*G. В единичные сочетания вошли аллели TNF*G (в составе генотипа G/G) и IL7RA*С. Носительство аллелей DRB1*11 и DRB1*15 ассоциировано с отсутствием оптимального ответа на терапию ГА, а DRB1*4 - с оптимальным ответом.
На следующем этапе работы мы провели аналогичное фармакогенетическое исследование, исключив из рассмотрения группу с промежуточным ответом на лечение ГА и сравнивая "крайние" группы больных - R и DNR. В таблице 5 представлены результаты анализа совместного вклада аллелей/генотипов исследованных генов, полученные при сравнении "крайних" групп. Выявлены сочетания, состоящие из двух, трех и четырех аллелей, частота носительства которых была значимо выше в группе R или в группе DNR.
Полученные результаты свидетельствуют о вкладе в эффективность терапии ГА полиморфизма тех же генов, что и при сравнении R vs NR (см. табл. 4), за исключением гена TNF.
Таблица 5. Сочетания аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA, носительство которых ассоциировано с эффективностью терапии ГА при сравнении групп больных РС с оптимальным ответом (R) и с полным отсутствием ответа (DNR) на лечение ГА.
Аллели в составе сочетания Число носителей (%)/число неносители (%) сочетания CCR5 IFNG TGFB1 IFNAR1 IL7RA р ОШ (95% ДИ) pperm DRBR DNR wd 874T>A -509C>T 16725G>C Thr244Ile* n=130 n=Носительство сочетания из двух аллелей - 15 T 24 (18)/106 (82) 29 (35)/55 (65) 0.0066 0.43 [0.23-0.81] 0.0- - T - - T 39 (30)/89 (70) 14 (17)/70 (83) 0.016 2.2 [1.1-4.4] - - T - C - 53 (41)/76 (59) 22 (26)/62 (74) 0.018 2.0 [1.1-3.6] - 4 - - - T 19 (15)/110 (85) 5 (6)/79 (94) 0.036 2.7 [1.0-7.6] Носительство сочетания из трех аллелей d 15 - T - - 1 (1)/129 (99) 9 (11)/75 (89) 0.0012 0.065 [0.008-0.52] 0.0d - - T G - 8 (6)/121 (94) 13 (15)/71 (85) 0.025 0.4 [0.1-0.9] Носительство сочетания из четырех аллелей d 15 T G 0 (0)/130 (100) 9 (11)/75(89) 0.00018 0.072 [0.02-0.28] 0.00Жирным шрифтом выделены сочетания аллелей, частоты которых ассоциированы с оптимальным ответом на лечение ГА (ОШ больше 1).
р - величина p по одностороннему точному критерию Фишера;
pperm - величина p после пермутационного теста (100 пермутаций) *Соответствует замене CT в экзоне 6 гена IL7RA.
Для трех из семи выявленных аллельных сочетаний показана ассоциация с оптимальным ответом на ГА, все они являются биаллельными. Однако ни одно из них не выдерживало пермутационного теста. Среди благоприятных сочетаний присутствует сочетание (DRB1*4+IL7RA*T) (p=0.036, ОШ=2.7), которое ранее было выявлено при сравнении групп R vs NR, где оно выдерживало пермутационный тест (табл. 4), что связано, вероятно, с большим размером выборки. Два других биаллельных сочетания содержат ранее выявленный "благоприятный" аллель IFNG*T, в паре с "благоприятным" аллелем IL7RA*T (p=0.016, ОШ=2.2) или с аллелем IFNAR1*C (p=0.018, ОШ=2.0), альтернативным к ранее выявленному "неблагоприятному" аллелю IFNAR1*G.
Остальные сочетания ассоциированы с полным отсутствием оптимального ответа на лечение ГА; они включают аллели CCR5*d, DRB1*15, TGFB1*T и IFNAR1*G и были также выявлены ранее при сравнении групп R vs NR (см. табл. 4). Наиболее значимым сочетанием, выдерживающим пермутационный тест, является четырехаллельное сочетания (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G) (p=0.00018, pperm=0.0056, ОШ=0.072). Остальные би- и триаллельные сочетания являются его составными частями. Из них сочетания (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T) и (DRB1*15+TGFB1*T) также выдерживают валидацию пермутационным тестом (p=0.0012 и 0.066; pperm=0.013 и 0.049; ОШ=0.065 и 0.43, соответственно). Таким образом, данные, полученные при сравнении R vs DNR, убедительно подтверждают результаты, полученные при сравнении групп R vs NR.
В целом, сравнение "крайних" групп, использованное для кросс-валидации результатов, полученных при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА со всеми остальными больными, позволило подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA (позитивную или негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА у русских больных РС. В отношении гена TNF, ассоциацию аллелей которого с эффективностью лечения ГА мы наблюдали только при одном из двух проведенных сравнений (R vs NR, табл. 4), аналогичный вывод носит предварительный характер. Во всех случаях соблюдается закономерность: аллель того или иного полиморфного участка гена, входящего в ассоциированные с успешным лечением сочетания, является альтернативным к аллелю из "неблагоприятных" сочетаний. Это выявлено для генов CCR5, DRB1, IFNAR1 и IL7RA. При обоих типах сравнения не наблюдали участия генов CTLA4 и IFNB1 в формировании ответа на лечение ГА.
3. Анализ природы кумулятивного вклада аллелей CCR5*d, DRB1*15, TGFB1*T и IFNAR1*G в составе сочетаний в эффективность лечения препаратом ГА больных РС Полученные результаты свидетельствуют о кумулятивном (совместном) вкладе исследованных генов в составе сочетаний в эффективность терапии ГА больных РС.
Наблюдаемый кумулятивный эффект может возникать как в результате суммирования малых независимых вкладов аллелей отдельных генов (аддитивность), так и/или как следствие эпистатических взаимодействий между ними. Мы провели анализ возможных механизмов формирования кумулятивного эффекта аллелей CCR5*d, DRB1*15, TGFB1*T и IFNAR1*G в составе би-, три- и четырехаллельных сочетаний при сравнении групп R vs DNR.
Для выявления характера взаимодействия (эпистатического или аддитивного) между указанными аллелями при формировании ответа на ГА мы сравнили, опираясь на значения величин ОШ, шансы больных РС попасть в группу R или DNR в зависимости от носительства сочетания (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G) и всех возможных комбинаций входящих в него аллелей.
На рис. 1 представлены величины ОШ больных РС оказаться в группе R или DNR в зависимости от носительства различных комбинаций аллелей DRB1*15, TGFB1*T, CCR5*d и IFNAR1*G. В случае носительства одиночных аллелей TGFB1*T, CCR5*d и IFNAR1*G или биаллельных сочетаний (TGFB1*T+IFNAR1*G), (DRB1*15+IFNAR1*G), (CCR5*d+IFNAR1*G) и (TGFB1*T+CCR5*d) не обнаружено значимых различий в шансе больных оказаться в группе R или DNR, поскольку 95% ДИ величины ОШ пересекает 1. У носителей DRB1*15, биаллельных комбинаций (DRB1*15+TGFB1*T) и (DRB1*15+CCR5*d) или триаллельных комбинаций (DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G), (TGFB1*T+CCR5*d+IFNAR1*G) и (DRB1*15+CCR5*d+IFNAR1*G) величины ОШ находились в диапазоне от 0.59 до 0.27, т.е. носители имели в 1.7-3.7 раз больший шанс оказаться в группе больных с полным отсутствием ответа на лечение ГА, по сравнению с неносителями указанных сочетаний. У носителей наиболее значимых комбинаций из четырех и трех аллелей (DRB1*15+ TGFB1*T+CCR5*d+IFNAR1*G) и (DRB1*15+TGFB1*T+CCR5*d) шанс оказаться в группе с полным отсутствием ответа на лечение ГА был повышен 14-15 раз (величины ОШ составляли 0.072 и 0.065, соответственно) по сравнению с не-носителями указанных сочетаний.
Рис 1. Величины отношений шансов (ОШ) и значения 95% доверительного интервала (ДИ) для больных РС оказаться в группе с оптимальным ответом (R) или в группе с полным отсутствием ответа (DNR) на лечение ГА в зависимости от носительства различных комбинаций аллелей DRB1*15, TGFB1*T, CCR5*d и IFNAR1*G.
ОШ - отношение шансов, ДИ - доверительный интервал;
* ОШ (95%ДИ) посчитано с помощью метода Пето (Yusuf S. et al., 1985) для случая, когда четырехпольная таблица содержит нулевые значения.
Присутствие того или иного аллеля в рассматриваемом сочетании обозначено знаком "+".
При анализе механизмов кумулятивного эффекта мы исходили из того, что если два или более аллелей не взаимодействуют друг с другом, тогда величина ОШ в случае носительства сочетания этих аллелей приблизительно равна произведению величин ОШ входящих в сочетание отдельных аллелей, а их вклад в формирование изучаемого признака (отсутствие ответа на лечение) аддитивен. Чем больше отношение этих величин ОШ отличается от 1, тем более сильного эпистатического взаимодействия между генами можно ожидать.
Для каждого аллельного сочетания произведение величин ОШ входящих в сочетание отдельных аллелей обозначали как "ожидаемое ОШ" и сравнивали его с величиной "наблюдаемое ОШ" (полученной в эксперименте). Оценивали отношение величины Унаблюдаемое ОШФ к величине Уожидаемое ОШФ для всех возможных комбинаций аллелей, являющихся составными частями исследуемого четырехаллельного сочетания.
Для анализа выявленных различий в величинах Унаблюдаемого ОШУ и Уожидаемого ОШУ для всех возможных комбинаций из аллелей DRB1*15, TGFB1*T, CCR5*d и IFNAR1*G использовали диаграмму Венна, позволяющую графически отразить характер взаимодействия (аддитивность или эпистаз) различных компонентов выявленного "неблагоприятного" аллельного сочетания (рис. 2). Величина "наблюдаемое ОШ"/"ожидаемое ОШ" для всех биаллельных сочетаний и для большинства триаллельных сочетаний близка к 1. Наиболее сильно отличающиеся от 1 величины "наблюдаемое ОШ"/"ожидаемое ОШ" (темные области на диаграмме Венна) соответствуют триаллельному сочетанию (DRB1*15+TGFB1*T+CCR5*d) и четырехаллельному сочетанию (DRB1*15+TGFB1*T+CCR5*d+IFNAR1*G). В случае триаллельного сочетания отношение "наблюдаемого" ОШ к "ожидаемому" ОШ составило 0.2 и несколько увеличилось при добавлении аллеля IFNAR1*G.
Рисунок 2. Диаграмма Венна, характеризующая взаимодействия различных компонентов, входящих в аллельное сочетание (DRB1*15+TGFB1*T+CCR5*d +IFNAR1*G).
Каждый из эллипсов диаграммы соответствует одному из четырех аллелей, каждая область на диаграмме соответствует носительству одиночного аллеля или комбинации аллелей (в случае пересечения эллипсов). Величина отношения "наблюдаемого" ОШ для данного аллеля/аллельного сочетания к "ожидаемому" ОШ представлена в виде градиента оттенков серого цвета. Области, соответствующие одиночным аллелям, а также референсные области, показанные в виде кружков, соответствуют величине "наблюдаемое" ОШ/"ожидаемое" ОШ, равной 1. Чем темнее область пересечения эллипсов, тем сильнее величина этого отношения отличается от 1 и тем сильнее проявляется эпистатическое взаимодействие между аллелями, входящими в состав сочетания. Практически черные области предположительно свидетельствуют о нелинейном взаимодействии аллелей исследуемых генов (эпистазу). ОШ - отношение шансов.
Мы рассматриваем эти данные как указание на эпистатическое взаимодействие, возникающее на уровне аллелей DRB1*15, TGFB1*T и CCR5*d. Аллель IFNAR1*G, скорее всего, не вносит вклад в эпистатическое взаимодействие между названными аллелями, а уменьшение величины pperm с 0.013 до 0.0056 при дополнительном носительстве IFNAR1*G отражает аддитивный характер его вклада. Таким образом, мы наблюдаем кумулятивное взаимодействие аллелей DRB1*15, TGFB1*T, CCR5*d и IFNAR1*G, реализуемое по сложному механизму аддитивного и эпистатического взаимодействия между четырьмя генами иммунной системы при формировании ответа на лечение ГА.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Анализ ассоциации полиморфизма девяти генов-кандидатов, белковые продукты которых вовлечены в механизм действия иммуномодулирующего препарата ГА, с эффективностью лечения больных РС этим препаратом, проводили с помощью двух типов сравнения. Сначала сравнивали больных РС с оптимальным ответом на лечение ГА со всеми остальными больными (R vs NR), а, затем, используя подход сравнения "крайних" групп, сравнивали больных с оптимальным ответом на лечение ГА с больными, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (R vs DNR), что позволяет осуществить кросс-валидацию результатов анализа в группах R vs NR. Сопоставление результатов анализа ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов в составе сочетаний с эффективностью лечения ГА, полученных с помощью двух подходов, позволило показать и затем подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA (позитивную или негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА (Табл. 6). Полученные данные свидетельствуют об участии этих генов в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом ГА. Отсутствие значимых различий в распределении частот аллелей/генотипов генов DRB1 и CCR5 по отдельности при сравнении групп R vs DNR, которые были выявлены при сравнении групп R vs NR, может быть связано с уменьшением размера выборки.
При этом направленность влияния носительства того или иного аллеля на эффективность лечения ГА всегда сохраняется. Аллели CCR5*d; DRB1*4,*11,*15; TGFB1*T, IFNAR1*G и IL7RA*T входят в аллельные сочетание, валидированные хотя бы в одном из типов сравнения с помощью пермутационного теста. Для генов DRB1, IFNAR1, TNF и IL7RA показано участие альтернативных аллелей при формировании позитивного и негативного ответа на лечение ГА.
Таблица 6. Сопоставление результатов анализа ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов с эффективностью лечения ГА, полученных при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА (R) со всеми остальными больными (NR) и с больными, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение ГА (DNR).
Ген Аллель R vs NR R vs DNR CCR5 d# -* -* DRB1 4# +* + 11 -* Н.з.
15 -* -* IFNG T + + TGFB1 T -* -* TNF A + Н.з.
G/G - Н.з.
IFNAR1 G -* -* C Н.з. + IL7RA T +* + C - Н.з.
"+" - позитивная и "-" - негативная ассоциация с оптимальным ответом в составе аллельных сочетаний (p < 0.05). Н.з. - не значимо.
* Входят в сочетания, валидированные при пермутационном анализе (pperm < 0.05) # Ассоциация выявлена также при оценке индивидуального вклада аллелей.
Наибольшим уровнем значимости среди выявленных нами сочетаний обладают сочетание из двух аллелей (DRB1*4+IL7RA*T), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и сочетание из четырех аллелей (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T + IFNAR1*G), негативно ассоциированное с ним. Они выявлены при кросс-валидации результатов и выдерживают пермутационный тест хотя бы при одном типе сравнения.
Для оценки возможности использования этих сочетаний в качестве биомаркеров эффективности лечения больных РС препаратом ГА, мы вычислили для них величины, характеризующие чувствительность, специфичность и точность оценки (таблица 7).
Чувствительность для сочетания, позитивно ассоциированного с эффективностью лечения, оценивали как процент больных, несущих данное сочетание и оказавшихся в группе R (соответственно, для негативно ассоциированного с эффективностью лечения сочетания - в группе NR или DNR). Специфичность позитивно ассоциированного с эффективностью лечения сочетания оценивали как процент больных, не несущих данное сочетание, оказавшихся в группе NR или DNR (для негативно ассоциированного с эффективностью лечения сочетания - в группе R). Точность оценивали как процент правильно сделанных предсказаний.
Таблица 7. Чувствительность, специфичность и точность для сочетаний (DRB1*4+IL7RA*T), и (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G), ассоциированных с различной эффективностью лечения больных РС препаратом ГА.
Сравнение в Чувствительность Cпецифичность Точность Сочетание группах (Sensitivity) (Specificity) (Accuracy) R vs NR 0.15 0.95 0.DRB1*4+IL7RA*T R vs DNR 0.15 0.94 0.CCR5*d+DRB1*15+ R vs NR 0.09 1.0 0.TGFB1*T+IFNAR1*G R vs DNR 0.11 1.0 0.Как видно из табл. 7, носительство каждого из сочетаний характеризуется чрезвычайно высокой специфичностью, что позволяет очень четко выделить группы больных РС с различной эффективностью терапии ГА. При этом среди носителей сочетания (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G) не было носителей аллеля DRB1*4, т.о., группы больных, стратифицированные по носительству указанных аллельных сочетаний, не пересекаются. В то же время, наблюдается низкая чувствительность носительства каждого из композитных маркеров при обоих типах сравнения; вероятно, она обусловлена гетерогенностью полигенного ответа на лечение ГА.
Таким образом, выявленные сочетания могут служить высокоспецифичными композитными маркерами, и их носительство должно стать определяющим при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения данного больного РС.
Однако отсутствие у больного этих маркеров не может служить предсказательным признаком.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Впервые проведен фармакогенетический анализ эффективности лечения больных РС, русских по этнической принадлежности, иммуномодулирующим препаратом длительного применения ГА. Выполнено целостное систематическое исследование как индивидуального, так и совместного вклада функционально значимых полиморфных участков девяти генов иммунного ответа. кодирующих про- и антивовоспалительные цитокины (IFNG; TNF; IFNB1, TGFB1), рецепторы цитокинов и хемокинов (IFNAR1, IL7RA, СCR5), антигена цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), а также молекулы HLA-DRB1 HLA класса II, в формирование ответа на лечение этим препаратом.
Сравнение генетического статуса больных РС с оптимальным ответом на терапию ГА с больными РС без оптимального ответа и кросс-валидация результатов при сравнении "крайних" групп позволило выявить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA (позитивную или негативную) с эффективностью ответа на лечение этим иммуномодулирующим препаратом. Полученные данные свидетельствуют о полигенной природе формирования ответа на лечение препаратом ГА. Найдены высокоспецифичные композитные маркеры, носительство которых ассоциировано с различной эффективностью ответа больных РС на лечение ГА - биаллельное сочетание (DRB1*4+IL7RA*T), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и четырехаллельное сочетание (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T+IFNAR1*G), негативно ассоциированное с ним. Эти сочетания могут служить биомаркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных РС. Анализ природы кумулятивного эффекта аллелей CCR5*d, DRB1*15, TGFB1*T и IFNAR1*G в составе аллельных сочетаний при сравнении "крайних" групп показал, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический (нелинейный) характеры взаимодействия между исследуемыми аллелями при формировании ответа на лечение ГА.
Сопоставление полученных результатов с данными проведенного нами независимо фармакогенетического исследования с тем же набором генов эффективности лечения больных РС другим иммуномодулирующим препаратом первой линии - ИФНб, продемонстрировало перспективность выбранного дизайна эксперимента. Есть все основания рассчитывать на выявление дискриминирующих маркеров, которые еще до назначения терапии позволят выбирать иммуномодулирующий препарат первой линии, наиболее подходящий для каждого больного РС, из двух.
ВЫВОДЫ 1. При оценке индивидуального вклада полиморфизма генов IFNG (rs2430561), TNF (rs1800629), IFNB1 (rs1051922), TGFB1 (rs1800469), IFNAR1 (rs1012335) IL7RA (rs6897932), СCR5 (rs333), CTLA4 (rs231775) и HLA-DRB1 в эффективность лечения иммуномодулирующим препаратом глатирамера ацетатом (ГА) больных рассеянным склерозом (РС), русских по этнической принадлежности, у больных с оптимальным ответом на лечение наблюдали значимо более высокую частоту аллелей DRB1*4, DRB1*13 и CCR5*w (ОШ от 1.7 до 1.9), а также частоту носительства аллеля DRB1*4 (ОШ=1.9), чем у остальных больных (без оптимального ответа), получавших ГА. Частота аллеля CCR5*d была значимо выше в группе без оптимального ответа на ГА (ОШ=0.53).
2. При сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА с больными, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (сравнение "крайних" групп), значимых различий в распределении аллелей/генотипов анализируемых полиморфных участков не наблюдали.
3. Анализ совместного носительства аллелей/генотипов исследованных полиморфных участков выявил биаллельное сочетание (DRB1*4+IL7RA*T), значимо ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА при обоих использованных типах сравнения (ОШ=3.7 и 2.7). Аллели IFNG*T, TNF*А, IFNAR1*С и IL7RA*T формируют ряд других биаллельных сочетаний, значимо ассоциированных с оптимальным ответом больных РС на лечение ГА при одном из использованных типах сравнения (ОШ от 1.9 до 2.7).
4. Совместное носительство в составе би- и триаллельных сочетаний, включающих аллели CCR5*d, DRB1*15, TGFB1*T или IFNAR1*G, а также совместное носительство всех этих четырех аллелей, ассоциированы с отсутствием оптимального ответа при обоих типах сравнения. За единственным исключением (DRB1*15+TGFB1*T), эти сочетания включают аллель CCR5*d. Биаллельные сочетания аллеля CCR5*d с аллелем DRB1*11 или с генотипом TNF*G/G, негативно ассоциированные с оптимальным ответом на лечение ГА, выявлены только при сравнении с больными без оптимального ответа. ОШ для всех негативных ассоциаций лежат в пределах от 0.038 до 0.5.
5. Анализ природы кумулятивного эффекта аллелей CCR5*d, DRB1*15, TGFB1*T и IFNAR1*G в составе сочетаний, проведенный при сравнении "крайних" групп, показал, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический типы взаимодействия между исследуемыми аллелями.
6. Сравнение "крайних" групп, использованное для кросс-валидации результатов, полученных при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА со всеми остальными больными, позволило подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA (позитивную или негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА. Полученные данные свидетельствуют об участии этих генов в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом ГА.
7. Биаллельное сочетание (DRB1*4+IL7RA*T), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и четырехаллельное сочетание (CCR5*d+DRB1*15+TGFB1*T + IFNAR1*G), негативно ассоциированное с ним, значимость которых выдерживает пермутационный тест (pperm <0.05), могут служить высокоспецифичными композитными маркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных РС.
CПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ СТАТЬИ В НАУЧНЫХ ЖУРНАЛАХ 1. О. Ю. Макарычева, Е. Ю. Царева, М. А. Судомоина, О. Г. Кулакова, О. В. Быкова, Н.
В. Гольцова, Л. М. Кузенкова, А. Н. Бойко, О. О. Фаворова. Анализ сцепления и ассоциации аллелей генов провоспалительных цитокинов IL-6, IFNg и TNF с рассеянным склерозом с помощью теста неравновесной передачи аллелей (TDT).
Молекулярная биология, 2010, том 44, № 5, с. 1Ц7.
2. О.Ю. Макарычева, Е.Ю.Царева, М. А. Судомоина, О.Г. Кулакова, Б.В. Титов, О.В.
Быкова, Н. В. Гольцова, Л.М. Кузенкова, А.Н.Бойко, О.О. Фаворова. Семейный анализ сцепления и ассоциации полиморфизмов генов DRB1, CTLA4, TGFB1, IL4, CCR5, RANTES, MMP9 и TIMP1 с рассеянным склерозом. 2011. ActaNaturae, том 3, 1(8), стр. 91-98.
3. Е.Ю. Царева, О.Г. Кулакова, О.Ю. Макарычева, А.Н. Бойко, С.Г. Щур, Н.Ю. Лащ, Н.Ф. Попова, Е.И. Гусев, В.В. Башинская, Д. В. Львов, А. В. Фаворов, M. F. Ochs, О.
О. Фаворова. Фармакогеномика рассеянного склероза: ассоциация полиморфизма генов иммунного ответа с эффективностью лечения копаксоном. Молекулярная биология, 2011.45(6), стр. 963-972.
4. Tsareva E.Y., Kulakova O.G., Boyko A.N., Shchur S.G., Lvovs D., Favorov A.V., Gusev E.I., Vandenbroeck K, Favorova O.O. Allelic combinations of immune-response genes associated with glatiramer acetate treatment response in Russian multiple sclerosis patients.
Pharmacogenomics. 2012; 13(1):43-53.
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИЙ 1. Щур С.Г., Царёва Е.Ю., Макарычева О.Ю., Судомоина М.А., Кулакова О.Г., Бойко А.Н., Фаворова О.О. Фармакогенетика рассеянного склероза: эффективность лечения интерфероном-бета и глатирамера ацетатом в зависимости от носительства аллелей генов иммунного ответа. Материалы XVI Российского национального конгресса "ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО", г. Москва, 2009 г., стр. 566.
2. Царёва Е.Ю., Кулакова О.Г., Судомоина М.А., Макарычева О.Ю., Щур С.Г., Лащ Н.Ю., Бойко А.Н., Фаворова О.О. Ассоциация аллелей генов иммунного ответа и их сочетаний с характером течения рассеянного склероза и эффективностью его лечения иммуномодулирующими препаратами. Материалы XVII Всероссийской научной конференции "Нейроиммунология. Рассеянный склероз", г. Санкт-Петербург, 2009 г., Нейроиммунология, том 7, выпуск 1, стр 102-103.
3. Кулакова О.Г., Бойко А.Н., Царева Е.Ю., Макарычева О.Ю., Щур С.Г., Давыдовская М.Ф., Хачанова Н.В., Попова Е.В., Попова Н.Ф., Фаворова О.О. Генетические маркеры в прогнозе развития и лечения рассеянного склероза. Материалы Научнопрактической конференции с международным участием "Современные проблемы рассеянного склероза: теория и практика", г. Казань, 2010 г., Неврологический вестник, том 42, вып. 1, стр. 151.
4. Tsareva E.Yu., Lvovs D., Kulakova O.G. Pharmacogenetics of glatiramer acetate treatment in Russian patients with multiple sclerosis. Proceedings of the 11th course of the European School of Neuroimmunology, 2011, p. 8.
5. O.G. Kulakova, E.Yu. Tsareva, V.V. Bashinskaya, A.N. Boyko, S.G. Shchur, D.V.
LТvovs, А.V.Favorov, K. Vandenbroeck, O.O. Favorova. Pharmacogenetics of diseasemodifying treatment in patients Russian with multiple sclerosis Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2011, p. 372.
6. E.Yu. Tsareva, O.G. Kulakova, O.O. Favorova. Association of immune response genes polymorphism with glatiramer acetate treatment efficiency in multiple sclerosis patients Proceedings of the VII International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientists, Moscow, 2012, p. 213.
Список использованных сокращений. ВПРС - вторично-прогрессирующий РС; ГА - глатирамера ацета; ГКГ - главный комплекс гистосовместимости; ИФНб - интерферон-бета;
ЦНС - центральная нервная система; ПИТРС - препараты, изменяющие течение РС; ПЦР - полимеразная цепная реакция; РС - рассеянный склероз; РРС - ремитирующий РС; CCR5 - ген рецептора CC-хемокинов 5; CTLA4 - ген антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов; HLADRB1 - ген бета-1 цепи молекул главного комплекса гистосовместимости класса II; d - генотип с делецией; DNR (Definite Non-Responders) - больные, характеризующиеся полным отсутствием клинического ответа на лечение ГА; EDSS (Expanded Disability Status Scale) - расширенная шкала оценки степени инвалидизации; IFNAR1 - ген первой субъединицы рецептора для интерферонов типа I; IFNB1 - ген интерферона-бета; IFNG - ген интерферона-гамма; IL7RA - ген альфа-субъединицы рецептора интерлекина-7; NR (Non-Responders) - больные без оптимального клинического ответа на лечение ГА; R (Responders) - больные с оптимальным клиническим ответом на лечение ГА; TGFB1 - ген трансформирующего фактора роста бета 1;
TNF - ген фактора некроза опухолей; р - величина p по точному критерию Фишера; pperm - величина p после пермутационного теста (100 пермутаций); w - генотип дикого типа.