Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
КАТРЕЦКАЯ Галина Геннадьевна
ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ УСЛОВНО ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ НИЖНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ ПРИ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ПНЕВМОНИЯХ
03.02.03 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Пермь - 2012
Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Маслов Юрий Николаевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Гейн Сергей Владимирович доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития Самоделкин Евгений Иванович
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ, Екатеринбург
Защита состоится л______________2012 г. в ___часов на заседании Диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул.Голева, 13.
Факс: (342) 280 92 11.
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ ( и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан л_____________2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна Список сокращений ВП - внебольничные пневмонии, УПМ - условно патогенные микроорганизмы, КОС - коагулазоотрицательные стафилококки, НФГОБ - неферментирующие грамотрицательные бактерии, МПК - минимальная подавляющая концентрация, ИАА - индекс активности антисептиков, ФЭБ - формалинизированные эритроциты барана, ИХН - изотонический раствор NaCl, MRSA-метициллинрезистентные S.aureus MRSE- метициллинрезистентные S. epidermidis.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Заболевания нижних дыхательных путей занимают одно из первых мест в структуре заболеваемости и смертности населения.
Преобладающей формой среди них являются ВП (Синопальников и др., 2007). По расчетам специалистов, общее число больных ВП в Российской Федерации превышает 1500000 человек ежегодно. Среди некоторых категорий населения (военнослужащие, люди пожилого возраста) уровень заболеваемости ВП превышает 40Й, а смертность от этих инфекций среди пожилых людей составляет 15-30Й (Чучалин и др., 2006).
Эффективное лечение пневмоний (в том числе и внебольничных) невозможно без точной расшифровки этиологического фактора. Тенденции последних лет свидетельствуют об изменении микробного пейзажа при гнойно-воспалительных заболеваниях легких. В структуре этиологически значимых агентов при ВП, наряду с традиционными возбудителями (прежде всего, пневмококками, а также микоплазмами, легионеллами, хламидиями), обладающими природными факторами вирулентности, все чаще встречаются различные УПМ (Лукьяненко и др., 2009). Это представители нормофлоры верхних дыхательных путей: стрептококки, КОС, энтеробактерии, НФГОБ и другие (Козлов и др., 2009). В отличие от аналогичных авирулентных культур штаммы, выделенные от больных ВП, характеризуются приобретенными патогенными свойствами, такими как лекарственная устойчивость, наличие факторов персистенции и адгезии, способности к выделению ферментов, токсинов (фосфолипаз, гемолизинов и др.) и к пленкообразованию. Наличие подобных свойств повышает патогенный потенциал микробов, придавая им высокую экологическую пластичность и способность активно участвовать в воспалительном процессе (Бухарин и др., 2011).
Повышение уровня лекарственной устойчивости клинически значимой микрофлоры и, соответственно, снижение эффективности антибиотикотерапии ВП стимулирует поиски альтернативных способов лечения. В этом плане весьма привлекательны антисептики как общедоступные, распространенные и эффективные препараты для лечения инфекционных заболеваний (Гудкова и др., 2003).
Исходя из этого, проведение исследований, направленных на обнаружение и оценку факторов приобретенной вирулентности УПМ, выделенных из нижних дыхательных путей у пациентов с ВП, а также на лабораторное обоснование возможности применения антисептиков для терапии ВП, представляется актуальным и необходимым для улучшения микробиологической диагностики ВП, оптимизации лечения и предупреждения затяжного течения инфекции.
Цель исследования - оценка родовой и видовой структуры, а также приобретенных факторов вирулентности условно патогенной микрофлоры нижних дыхательных путей у пациентов с внебольничными пневмониями.
Основные задачи исследования 1. Уточнить этиологическую структуру внебольничных пневмоний в условиях пульмонологического отделения многопрофильного стационара.
2. Определить уровень и динамику лекарственной устойчивости условно патогенных микроорганизмов, выделенных из нижних дыхательных путей больных внебольничными пневмониями в диагностически значимых концентрациях.
3. Оценить с микробиологических и клинико-лабораторных позиций возможности использования антисептиков в лечении больных внебольничными пневмониями.
4. Исследовать факторы вирулентности (антагонистические, адгезивные свойства и способность к пленкообразованию) культур условно патогенных возбудителей внебольничных пневмоний.
Научная новизна. Уточнена этиологическая структура ВП у пациентов пульмонологического отделения многопрофильной больницы; показана доминирующая роль грамположительной кокковой флоры. Проанализирован спектр антибиотикорезистентности всех видов микрофлоры за 6 лет; составлена локальная база данных для эмпирической терапии внебольничных пневмоний.
Установлена высокая встречаемость пленкообразования и выраженность этого признака у исследованных микробных культур. Доказана высокая эффективность in vitro антисептиков: хлоргексидина, диоксидина и мирамистина - против возбудителей ВП и отсутствие токсического действия этих препаратов на процесс фагоцитоза.
Выявлена высокая антагонистическая активность культур клинически значимых микроорганизмов, выделенных из нижних дыхательных путей больных ВП. Впервые для исследования микробного антагонизма возбудителей ВП использован метод подавления биолюминесценции тест-штамма E.coli lum+ C-50. Обнаружена гетерогенность микробных культур по выраженности и направленности антагонизма, а также срокам его проявления, что указывает на множественность механизмов реализации данного признака. Разработана и использована в работе полезная модель Устройство для посева тест-штаммов для оптимизации изучения антагонизма микроорганизмов методом совместного культивирования.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление об этиологической структуре возбудителей внебольничных пневмоний. Обнаружена выраженная антагонистическая активность исследованных микроорганизмов, что расширяет представление о патогенезе данного заболевания.
Выявлен высокий потенциал антисептических препаратов в отношении этиологически значимых УПМ, выделенных из нижних дыхательных путей при ВП.
Показана целесообразность проведения микробиологических исследований чувствительности микробных культур к антисептикам для обоснованного выбора препарата. Сохранение чувствительности к антисептикам у антибиотикорезистентных штаммов свидетельствует о возможности применения антисептических препаратов в случаях неэффективной антибиотикотерапии.
Выявлена значимость исследования антагонистической активности бактериальных и грибковых культур как дополнительного фактора вирулентности.
Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии а также на кафедре эпидемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО ПГМА им.ак. Е.А.Вагнера при проведении лекционных и практических занятий для студентов и врачей-слушателей ФПК.
Получен патент на полезную модель № 112613 от 20.01.2012г. Разработанное устройство для посева тест-штаммов позволяет снизить трудозатраты и ускорить постановку тестов на выявление микробного антагонизма. Устройство внедрено в научном отделе филиала ФГУП НПО Микроген Пермское НПО Биомед.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Этиологически значимую микрофлору при внебольничных пневмониях характеризуют полиморфизм структуры с преобладанием грамположительной кокковой флоры (прежде всего, стрептококков и коагулазоотрицательных стафилококков), а также растущий уровень антибиотикорезистентности.
2. Исследуемые антисептики обладают высоким антимикробным потенциалом против этиологически значимой условно патогенной респираторной микрофлоры и не влияют на фагоцитарный механизм защиты организма больного.
3. Культуры условно патогенных микроорганизмов, выделенных в диагностически значимой концентрации из нижних дыхательных путей, обладают комплексом приобретенных факторов вирулентности.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации были представлены и обсуждены на Научных сессиях ПГМА (2008, 2009), Всероссийской научно-практической конференции НПО Биомед (Демидково, 2008), Научнопрактических конференциях молодых ученых (Пермь, 2008-2011), Международных дистанционных научно-практических конференциях (Пермь, 2009, 2010).
Всего по теме диссертации опубликовано 26 научных работ: 10 статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и получен 1 патент на полезную модель № 112613 от 20.01.2012 г.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, содержит 11 рисунков и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 198 наименований работ, в том числе 100 отечественных и зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО ПГМА им.ак. Е.А.Вагнера Минздравсоцразвития РФ (номер госрегистрации 0120.0800814).
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования Объектом исследования являлись микробные культуры, выделенные из мокроты пациентов, госпитализированных в пульмонологическое отделение МУЗ МСЧ №6 г.Перми с диагнозом Внебольничная пневмония, в течение 6 лет (2005-2010гг.).
Всего в анализе и экспериментах задействовано 820 культур.
Для доказательства этиологической значимости выделенных микроорганизмов использовали ряд общепринятых критериев. Пробы мокроты перед посевом подвергали бракеражу по внешнему виду (наличие/отсутствие слизистого отделяемого) и результатам микроскопии мазка из нативной мокроты (количество лейкоцитов 25, плоский эпителий 15 клеток в поле зрения). В исследованиях использовали микроорганизмы, чья концентрация в мокроте составляла не ниже 106 КОЕ/мл.
Выделение и идентификацию культур осуществляли общепринятыми методами с использованием диагностических таблиц и ключей (Приказ №535 МЗ СССР).
Чувствительность к антибиотикам определяли дискодиффузионным методом.
Постановку и оценку результатов проводили в соответствии с МУК 4.2.1890- 04.
Антимикробную активность антисептиков исследовали микрометодом серийных разведений в жидкой питательной среде (Красильников, 1995). Использовали стандартные растворы фурациллина 0,02%, хлоргексидина 0,05%, диоксидина 0,1% и мирамистина 0,01%. Определяли МПК в мкг/мл в отношении каждой культуры, после чего рассчитывали индекс активности (ИАА) - отношение рабочей концентрации препарата к МПК культуры. В данном разделе изучена 131 микробная культура: 34 - S.
aureus, 30 - КОС, 23 - Enterobacteriaceae sp., 21 - НФГОБ, 23 - Candida sp.
Влияние антисептиков на фагоцитоз изучали на 22 пробах крови: 12 здоровых волонтеров и 10 больных ВП. Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов в качестве объекта фагоцитоза использовали взвесь ФЭБ (Каплин, 1995). Проведено серии исследований. В первой серии оценивали влияние антисептиков (хлоргексидина, мирамистина, фурациллина) на объект фагоцитоза: антисептики воздействовали на ФЭБ (инкубация 20 мин при 37С), после чего добавляли пробы крови; во второй серии оценивали влияние антисептиков на фагоцитирующие клетки: образцы крови смешивали с антисептиками (инкубация 20 мин при 37С), а затем добавляли ФЭБ.
Рассчитывали процент активных (фагоцитирующих) лейкоцитов и фагоцитарный индекс. В качестве контрольного раствора во всех случаях использовали ИХН.
Адгезивность микроорганизмов изучали по методике (Брилис и др., 1986) с использованием нативных эритроцитов человека. 0,5%-ную взвесь эритроцитов смешивали с равным объемом бактериальной суспензии плотностью 109 кл/мл (взвесь суточных культур готовили в ИХН по стандарту мутности) и инкубировали 30 мин. при 37C. Далее готовили мазки, фиксировали смесью Никифорова и окрашивали по методу Романовского-Гимза. После микроскопии вычисляли средний показатель адгезии (СПА) - среднее число микробов, адгезированных на одном эритроците;
коэффициент адгезии (К) - процент эритроцитов, участвующих в адгезивном процессе и индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ) - среднее количество бактерий на одном участвующем в процессе адгезии эритроците, исчисляемое по формуле:
ИАМ = СПА х 100 / К При изучении антагонистической активности использовали:
- метод ингибирования биолюминесценции;
- метод совместного культивирования на плотной питательной среде;
- коэффициент Жаккарда.
Изучено 50 клинических изолятов УПМ, выделенных из нижних дыхательных путей больных с внебольничной пневмонией (S. aureus -30 культур, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa - по 10 культур каждой).
Для выявления феномена ингибирования биолюминесценции использовали лиофилизированную культуру генноинженерного штамма E.coli lum+ C-50 (Несчисляев и др., 2002). Готовили бесклеточные фильтраты суточных культур изучаемых бактерий и грибов, выращенных на сахарном бульоне. 0,5 мл регидратированного тест-штамма смешивали в кювете с 0,5 мл фильтрата либо его 10-кратного разведения в ИХН. В контрольную кювету вместо фильтратов добавляли 0,5 мл ИХН. Кюветы инкубировали при 37оС, производя регистрацию уровня свечения на люминометре Биотокс-10 через 5 мин, 1, 2 и 24 час. О наличии антагонистических свойств изучаемых культур судили по снижению интенсивности биолюминесценции тест-штамма по сравнению с контролем. Количественную характеристику антагонизма - индекс активности - вычисляли по трем параллельным измерениям (опыт/контроль) по формуле:
Хк - Хо где Хк - интенсивность биолюминесценции в контроле;
ИА = ------------- х 100, Хо - интенсивность биолюминесценции в опыте.
Хк С помощью данного метода изучено 52 культуры - 10 культур грамположительных кокков (Staphylococcus spp. - 7, Enterococcus spp. - 3), 15 - Enterobacteriaceae sp., (Klebsiella spр. - 9, E.coli - 3, Enterobacter spp. - 3.), 18 - НФГОБ (Pseudomonas spp. - 9, Acinetobacter spp.- 9 ) и 9 - Candida sp.
По методу совместного культивирования изучен антагонизм 89 микробных культур (38 культур КОС, 24 - S.aureus, 15 - Enterobacteriaceae sp., 12 - НФГОБ), обладающих гемолитической активностью. Взаимоотношения между ними выявляли при их совместном культивировании на кровяном агаре после посева взвесей суточных культур в виде взаимно перпендикулярных штрихов (Хуснутдинова и др, 2006).
Способность к совместному существованию различных видов, выделенных из одной пробы, определяли вычислением коэффициента Жаккарда. В зависимости от его величины взаимодействия между микроорганизмами расценивают как антагонистические (до 30%), синергические (более 30%) или мутуалистические (более 70%) (Меньшиков и др., 1990). Исследовано 85 проб мокроты, из которых выделено 190 культур УПМ, 182 (95,8%) которых были представлены в ассоциациях и 8 (4,2%) в монокультуре (6 штаммов Streptococcus pneumoniae, 2 штамма Haemophilus influenzae).
Способность формировать биопленки определяли по методике (Шагинян и др., 2007). Суточные бульонные культуры в разведении 1:100 инокулировали в лунки 96луночных планшетов по 150 мкл в 4 повторах. После 24 час. инкубации при 37C содержимое лунок (планктонную форму) аккуратно эвакуировали. Пленки окрашивали 45 мин внесением в лунки 170 мкл. 0,1% раствора кристалвиолета, промывали и вносили в лунки для экстракции красителя из пленки по 180 мкл 96% этанола.
Интенсивность окрашивания оценивали фотометрически (=540 нм.). Количественной характеристикой пленкообразования служили значения оптической плотности (ед.
ОП). Данная характеристика изучена у 94 культур.
Фосфолипазную активность грибковых культур определяли на среде Сабуро с добавлением яичного желтка и хлорида кальция при pH = 5,6 и инкубации до 10 суток.
Биометрический анализ проводили в программе Биостат с использованием tкритерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Родовая и видовая структура выделенной микрофлоры Всего выделено 820 культур микроорганизмов из которых 58% относилось к грамположительной кокковой флоре, представленной стрептококками (32,7%) и стафилококками (25,3%) (рис. 1).
0,13, грам+флора 27,грам-флора грибковая флора гемофильная палочка Рисунок 1. Общая структура микробного пейзажа нижних дыхательных путей больных внебольничными пневмониями, %.
Процент выделения S.pneumoniae составил 9,8%. Доля S.pyogenes и S.viridans составила 11%. Видовое распределение стрептококков за исследуемый период практически не менялось.
Выявлено постоянное увеличение доли КОС (преимущественно с гемолитической активностью). Начиная с 2006г., удельный вес КОС был сопоставим с долей выделенных S. aureus, а в 2010г. на долю S. aureus в общей структуре гноеродной микрофлоры приходилось 11,2%, в то время как КОС встречались в 14,2% случаев (рис. 2). Преобладали S.epidermidis с гемолитической активностью (50,6%) и S.haemolyticus (45.3%).
Среди грамотрицательной флоры (27,7%) представители семейства Enterobacteriaceae составляли 19,2%, а НФГОБ - 8,5%. Enterobacteriaceae sp.
преимущественно были представлены Klebsiella pneumoniae - 38,6%, E.coli - 30.7% и Enterobacter spp. - 28.8%; НФГОБ представлены Acinetobacter spp. - 53% и Pseudomonas spp. - 47%. Доля H.influenzae составила менее 1% (рис. 1).
Удельный вес грибковой флоры составил 13,4%. Преобладал вид C.albicans (62%), реже имели место - C.tropicalis (16,9%) и C.krusei (11%).
КОС S.aureus 2005 2006 2007 2008 2009 20Рисунок 2. Соотношение удельного веса КОС и S. aureus в общей структуре микрофлоры за 2005-2010гг.,% Антибиотикочувствительность изученной флоры и ее динамика За период 2005-2010гг. имело место повышение удельного веса резистентных культур. Так, доля S.viridans, резистентных к ампициллину, увеличилась с 13% до 53,5 %., S. pyogenes - увеличилась с 12 до 22%. В то же время все выделенные культуры S.pneumoniae остались чувствительными ко всем тестируемым антибиотикам.
Доля S. aureus, резистентных к оксациллину, оставалась достаточно стабильной (в пределах 20-25%), в то время как доля оксациллинрезистентных КОС возросла с 18% до 59% (рис.3).
S.aureus 20 КОС 2005г.
2006г.
2007г.
2008г.
2009г.
2010г.
Рисунок 3. Удельный вес оксациллинрезистентных стафилококков за 2005- 2010гг., % Среди грамотрицательных бактерий наблюдалось падение уровня чувствительности к бета-лактамным антибиотикам и аминогликозидам. Так, среди энтеробактерий доля резистентных к ампициллину культур выросла с 50% до 86%, к цефотаксиму - с 25% до 43%, а к амикацину - с 38% до 50%. Аналогичной была динамика формирования резистентности среди НФГОБ. Единственным препаратом, сохранившим 100%-ную активность против грамотрицательной флоры, остался ципрофлоксацин. Повышение частоты резистентности к антимикотикам среди Candida sp. происходило медленнее. Так, в 2005 г. к амфотерицину В были устойчивы 2,4 % культур, в 2006 г. - 3,7 %, а в 2010 г. - 7,8 %.
Таким образом, многолетнее наблюдение за условно патогенной микрофлорой, выделенной от пациентов пульмонологического отделения, позволило увидеть, помимо общих тенденций (Чучалин, 2006), своеобразие структуры этиологически значимых микроорганизмов по видовому спектру и уровню антибиотикорезистентности, что может (и должно) стать основой для формирования взвешенной и обоснованной стратегии антимикробной терапии.
Антимикробная эффективность антисептиков Исследование показало высокую чувствительность всех групп микроорганизмов к антисептикам. В большинстве случаев значения ИАА намного превышали минимальный уровень (ИАА=4), необходимый для эффективного воздействия на микрофлору слизистых (Красильников, 1995). Все изученные антисептики обладали высокой активностью в отношении стафилококков. Против Enterobacteriaceae sp.
наибольшую активность проявили диоксидин, хлоргексидин и фурациллин, а против НФГОБ эффективными оказались диоксидин и хлоргексидин. Антигрибковая активность была присуща хлоргексидину и мирамистину (табл.1).
Таблица 1. Индекс активности антисептиков против различных УПМ, Mm Препараты S.aureus КОС Enterobacte- НФГОБ Candida riaceae sp. sp.
Хлоргексидин 397,850,4 422,451,8 148,446,1 138,951,7 57,110,Диоксидин 201,935,8 203,649,5 264,659,4 356,670,6 Фурациллин 37,222,4 29,95,8 6,9782,039 4 Мирамистин 39,318,269 68,625,11 4 4 9,42,В целом наиболее высокоэффективным препаратом оказался хлоргексидин, немногим меньшую активность проявил диоксидин, на третьем месте по эффективности находился мирамистин. Важно, что чувствительность к антисептикам была свойственна и культурам с лекарственной устойчивостью (табл. 2). Это еще раз подтверждает перспективность применения антисептиков в лечении гнойновоспалительных заболеваний при низкой эффективности антибиотикотерапии.
Таблица 2. Удельный вес чувствительности/устойчивости антибиотикорезистентных культур к антисептикам, % Хлоргекси Фурацил- МирамисДиоксидин Факторы дин лин тин Культуры устойчивости чув. уст. чув. уст. чув. уст. чув. уст.
MRSA/МSSA S. aureus 100 0 100 0 100 0 100 23,5 76,MRSЕ/МSSЕ КОС 100 0 100 0 52,6 47,4 100 63,3 36,БЛРС Enterobacte+ - 87,5 12,5 93,75 6,25 37,5 62,5 6,25 93,riaceae sp.
69,6 30,Полирезист.
НФГОБ + - 100 0 100 0 0 100 0 147,6 52,+ - Candida sp. 86,7 13,3 0 100 0 100 93,3 6,65,2 34,Влияние антисептиков на фагоцитирующие клетки Проведенное исследование не выявило выраженного угнетающего влияния антисептиков на фагоцитарную функцию лейкоцитов в группе здоровых волонтеров (рис.3). В обеих сериях в большинстве случаев угнетающий эффект антисептиков не наблюдался.
У пациентов с ВП фагоцитарная активность лейкоцитов оказалась достоверно выше, чем в группе здоровых лиц (табл. 3). Эта закономерность не зависела от варианта постановки и прослеживалась по всем изученным показателям.
Здоровые Больные 2 1,8 1,1,6 1,1,4 1,1,2 1,1 0,8 0,серия 0,6 0,0,4 0,серия 0,2 0,0 Рисунок 4. Фагоцитарный индекс лейкоцитов периферической крови здоровых волонтеров и больных внебольничными пневмониями Таким образом, проведенные исследования в целом не выявили снижения показателей фагоцитоза под влиянием антисептиков, что можно считать дополнительным аргументом в пользу их возможного применения для лечения ВП и ее осложнений, в том числе, вызванных полирезистентными вариантами бактерий.
Адгезивные свойства возбудителей внебольничных пневмоний Адгезия является первым, определяющим этапом колонизации. Кроме того, адгезия микроорганизма на твердой поверхности является первой фазой образования биопленок - высокорезистентных форм существования, способных противостоять защитным факторам организма человека и антимикробным препаратам. Нами была изучена адгезивность 50 бактериальных культур, а именно S.aureus (30 культур), K.pneumoniae и P.aeruginosa (по 10 культур каждого вида).
Выявлено, что все изученные культуры бактерий обладали выраженными адгезивными свойствами. Так, средний показатель адгезии у грамположительных культур колебался от 1,89 до 4,87 и составил в среднем 3,030,277 (рис.5), у грамотрицательных культур этот показатель варьировал от 1,98 до 4,08 и составил в среднем 3,3650,31 (p>0,05). Индекс адгезивности грамположительных культур колебался от 2,74 до 4,87 и составил в среднем 3,740,227. Этот же показатель для грамотрицательных культур варьировал от 2,54 до 4,47 и составил в среднем 4,140,(p>0,05). Таким образом, все изученные культуры бактерий, выделенные при ВП, обладали выраженными адгезивными свойствами. Уровень адгезивности грамположительных и грамотрицательных бактерий практически не отличались.
Полученные результаты позволяют рекомендовать исследование и учет показателей адгезии в качестве дополнительного критерия при решении вопроса об этиологической роли УПМ при развитии ВП.
грам+ культуры 4,3, 3,грам - культуры 3,СПА ИАМ Рисунок 5. Средний показатель адгезии (СПА) и индекс адгезивности микроорганизма (ИАМ) исследуемых культур.
Антагонистические свойства исследуемых культур (тест подавления биолюминесценции) Данные теста подавления биолюминесценции свидетельствовали о наличии весьма выраженных антагонистических свойств у представителей УПМ, выделенных из нижних дыхательных путей. Все изученные культуры дали положительный результат.
В то же время степень и динамика ингибирования индикаторного штамма оказались различными, поэтому в зависимости от выраженности антагонистического эффекта мы разделили культуры на три группы. Представители первой группы (50% от общего числа) обладали выраженным антагонизмом, стабильным во времени и присущим как цельным, так и разведенным фильтратам. Во вторую группу (умеренный антагонизм), составившую 36,5% от всей выборки, вошли культуры, чьи цельные фильтраты давали полное подавление свечения биосенсора, но при разведении эффект существенно снижался. Это проявлялось либо в отсроченной (к 24 часам) активности, либо, напротив - к непродолжительному подавлению свечения, которое наблюдалось только в первых измерениях. У культур, составивших третью группу, антагонистическая активность была слабой и наблюдалась лишь у цельного фильтрата. Доля таких штаммов составила 13,5% от всей выборки.
Степень выраженности антагонизма в каждой из выборок представлена на рис.
6. Обращают на себя внимание, прежде всего, высокая активность грамположительных кокков и энтеробактерий, а также низкая доля слабых антагонистов во всех изученных группах (самый высокий показатель их присутствия принадлежит НФГОБ - 22%, а среди дрожжеподобных грибов таких культур не оказалось вовсе).
30 слабая 10 умеренная сильная Рисунок 6. Выраженность антагонистической активности культур в тесте подавления биолюминесценции, % Среди грамположительных кокков самыми активными антагонистами показали себя энтерококки. Цельные фильтраты всех культур энтерококков давали практически полное подавление тест-штамма (99,60,3)%, разведенные фильтраты также обладали хорошей активностью - (82,35,6)%. Культуры S.aureus подавляли свечение биосенсора сильнее, нежели культуры КОС. Для изолятов S.aureus показатель угнетения тесткультуры цельными фильтратами составил (93,03,9)%, а разведенными - (36,514,6)%. Антагонизм культур КОС появлялся только после 24 ч. воздействия на тест-штамм, а в первые часы все фильтраты проявляли лишь стимулирующий эффект.
Средний показатель подавления биолюминресценции культурами КОС составлял (97,50,7)% и не зависел от концентрации фильтратов, В выборке Klebsiella sp. 2/3 культур обладали стабильным, продолжительным действием на индикаторный штамм, которое фиксировали как в цельных (92,82,2)%, так и в разведенных (65,68,6)% фильтратах. У остальных культур антагонистические свойства были существенно слабее (от 13 до 33%), либо давали только отсроченный эффект. Фильтраты E.coli и Enterobacter spp. в цельной форме обладали весьма высокой активностью (99,20,3)%, но в разведенном виде их активность была существенно ниже - (67,019,7)%. При этом E.coli показали себя как стабильные антагонисты, чье воздействие сохранялось с первых минут до конечной точки эксперимента (24 часа), а Enterobacter spp. - как более слабые ингибиторы, поскольку их эффекты были поздними (отсроченными).
Среди Candida sp. стабильный и выраженный антагонизм во всех временных интервалах проявило 44,4% культур: процент угнетения тест-штамма их цельными фильтратами составил (96,31,6)%, а разведенными - (74,36,9)%. У остальных штаммов показатели угнетения в первые 2 часа наблюдения в большинстве случаев колебались от 14 до 34%, а через сутки антагонистический эффект цельных фильтратов исчезал. Разведенные же фильтраты, напротив, не обладая эффектом угнетения через 02 ч, демонстрировали хорошую активность через 24 ч (от 75 до 99%).
В изученной выборке P.aeruginosa присутствовали 4 культуры, обладающие сильным антагонизмом: показатели активности цельных и разведенных фильтратов составили (98,40,6)% и (64,68,3)%, соответственно. Умеренной антагонистической активностью, проявляющейся в поздние сроки, характеризовались 3 культуры, а у культур зафиксирован слабый, кратковременный антагонистический эффект, выявленный лишь в цельном фильтрате в первых измерениях.
Среди культур Acinetobacter spp. отмечено аналогичное распределение.
Обнаруженные у 3 культур выраженные антагонистические свойства (активность цельных и разведенных фильтратов составила (99,00,5)% и (60,510,6)%, соответственно) практически не уступали показателям активности P.aeruginosa - общеизвестного антагониста (р >0,05). Умеренные поздние эффекты угнетения тестштамма отмечены у 3 культур Acinetobacter spp.. Еще 3 штамма обладали слабой непродолжительной антагонистической активностью.
Антагонистическая активность исследуемых культур при совместном культивировании При совместном культивировании определение антагонистических свойств культур проводили по двум направлениям. Прежде всего, оценивали их способность ингибировать рост других микробов, а, кроме того, фиксировали подавление гемолитической активности микробов-симбионтов.
При использовании данного метода наибольшую антагонистическую активность проявили культуры P. aeruginosa: 10 штаммов из 12 (83,3%) подавляли рост всех изолятов стафилококков и энтеробактерий (рис. 7).
Оставшиеся 2 (16,7%) культуры P. aeruginosa, не угнетая рост стафилококков и энтеробактерий, обладали подавляющим эффектом в отношении гемолитической активности у 29 (76,3%) культур КОС, 12 (50%) штаммов S.aureus, а также у культур E.сoli - 8 (53,3%).
На втором месте по выраженности антагонистической активности стояли культуры S.aureus. Большинство из них - 19 (79%) культур, проявили антагонизм в отношении энтеробактерий и КОС (10 (66,7%) и 21(55,3%) культур, соответственно).
Два штамма S.aureus (8,3%) обладали также способностью ингибировать гемолитическую активность у 8 (53,3%) штаммов энтеробактерий и 12 (31,6%) культур КОС без подавления их роста.
Штаммы КОС также в большинстве случаев обладали способностью угнетать рост энтеробактерий. Так, 24 штамма КОС (63%) подавляли рост 8 культур, принадлежавших к семейству Enterobacteriaceae. Кроме того, 4 штамма КОС (10,5%) проявили влияние на 26,6% энтеробактерий (то есть, на 4 культуры) в виде угнетения гемолитической активности при сохранении у данных микроорганизмов способности к росту.
Таким образом, в тесте совместного культивирования наибольшую активность в конкуренции за выживаемость показали культуры P.aeruginosa и S.aureus. Достаточно выраженную способность к угнетению роста конкурирующей микрофлоры показали также культуры КОС. Выявленная антагонистическая активность диагностически значимых УПМ представляется весьма важным вкладом в общий потенциал персистентных свойств данной микрофлоры.
1способность к подавлению 60 роста способность к угнетению гемолитической активности P. aeruginosa S.aureus КОС Рисунок 7. Антагонистическая активность микроорганизмов, % Анализ симбиотических связей с применением коэффициента Жаккарда В данном фрагменте использованы результаты бактериологических исследований 85 проб мокроты, в том числе 70 проб, отвечающих общепринятым критериям бракеража (Приказ №535) и 15 проб, не отвечающих этим требованиям.
Исходя из этого, выявленные в первом случае симбиотические связи трактовались как свойства этиологически значимых микроорганизмов. Данные, полученные при исследовании выбракованных проб мокроты, использовали как контрольные, отражающие межмикробные взаимодействия микрофлоры полости рта и верхних дыхательных путей в норме. Из проб мокроты, соответствующих критериям бракеража, выделено 190 штаммов условно патогенных микроорганизмов, 182 (95,8%) из которых были представлены в ассоциациях и лишь 8 (4,2%) - в монокультуре. Монокультурами были представлены 6 культур S.pneumoniae и 2 культуры H.influenzae, что подтверждает известную недружелюбность этих видов. Из контрольных проб мокроты было выделено и подвергнуто математическому анализу 24 культуры микроорганизмов.
Анализ симбиотических связей между этиологически значимыми микроорганизмами, выделяемыми в ассоциациях, свидетельствовал о преобладании в этих ассоциациях антагонистических взаимоотношений: в 84% случаев (21 ассоциация из 25 оцененных) значение коэффициента Жаккарда не превышало 30%. В остальных случаях между видами-ассоциантами установлено лишь слабое синергическое взаимодействие. Это были ассоциации S. pyogenes + Candida sp. (коэффициент Жаккарда 31,4%), Enterobacteriaceae sp. + S. pyogenes (37,5%), а также ассоциация КОС + Enterobacteriaceae sp. (38,1%). Самое высокое значение коэффициента Жаккарда, свидетельствующее о наличии определенной экологической общности микроорганизмов, участвующих в воспалительном процессе, выявлено для сочетания Enterobacteriaceae sp.+ Candida sp. - 42,3% (табл. 4).
Табл. 4. Значения коэффициента Жаккарда для микробных ассоциаций, выделенных из нижних дыхательных путей при пневмониях, %, (n=182) № Ассоциации микроорганизмов Коэффициент Жаккарда, % Значения коэффициента Жаккарда менее 1. S. aureus+ S. pyogenes 28,2. КОС+ S. pyogenes 26,3. S. pyogenes + дрожжи 4. КОС+ S.viridans 20,5. Enterobacteriaceae sp.+ дрожжи 18,6. КОС+ C.albicans 17,7. S. aureus+ S.viridans 8. S. aureus+ C.albicans 14,9. S. aureus+НФГОБ 13,10. КОС + НФГОБ 12,11. НФГОБ+ S.viridans 12. C.albicans+ S.viridans 9,13. НФГОБ+ C.albicans 8,14. S. aureus+ Enterobacteriaceae sp. 8,15. S. aureus+дрожжи 6,16. Enterobacteriaceae sp. + S.viridans 6,17. НФГОБ+ Enterobacteriaceae sp. 5,18. S. aureus+ КОС 19. S. pyogenes +НФГОБ 4,20. C.albicans+ дрожжи 4,21. НФГОБ+ дрожжи 3,Значения коэффициента Жаккарда более 22. Enterobacteriaceae sp.+Candida sp. 42,23. КОС+ Enterobacteriaceae sp. 38,24. S. pyogenes+ Enterobacteriaceae sp. 37,25. S. pyogenes+ Candida sp. 31,Уровень межмикробных связей в ассоциациях, представленных УПМ, полученными из проб мокроты, не прошедших бракераж, оказался существенно выше.
Так, значения коэффициента Жаккарда для ассоциаций КОС и S.viridans, КОС и дрожжи, S.viridans и дрожжи, составил 80%, 50% и 42,9%, соответственно. Эти результаты, на наш взгляд, отражают реально существующие симбиотические связи между микроорганизмами, постоянно обитающими в верхних отделах дыхательных путей. С другой стороны, отсутствие таких показателей у микробов-ассоциантов, участвующих в воспалительном процессе, свидетельствует о существенных отличиях между воспалительными и природными ассоциациями. Если между представителями нормофлоры верхних дыхательных путей преобладают симбиотические связи, то у микробов-участников воспалительного процесса более выраженными оказываются антагонистические свойства.
Табл. 5. Значения коэффициента Жаккарда для микробных ассоциаций, выделенных из верхних дыхательных путей, %, (n=24) № Ассоциации микроорганизмов Коэффициент Жаккарда,% 1. КОС+ S.viridans 2. КОС+ дрожжи 3. S.viridans+дрожжи 42,Для подтверждения этого положения сопоставим показатели ассоциаций КОС + S.viridans, которые присутствовали как в мокроте больных ВП, так и в контрольном отделяемом, верифицированном как отделяемое верхних дыхательных путей. В первом случае коэффициент Жаккарда свидетельствовал об антагонистических отношениях между данными симбионтами - 20,8%, а во втором - об их высокой экологической общности на уровне мутуализма - 80% (табл.4 и 5).
Фосфолипазная активность культур Candida sp.
Изучение 23 культур C. albicans выявило наличие фосфолипазной активности у 87% из них (то есть, у 20 культур). Образование мицелия у большинства культур (19, то есть 82,6%) наблюдалось уже после 24-48 часов инкубации на средах для первичного посева (кровяном агаре). Таким образом, культуры дрожжеподобных грибков, изолированные из мокроты пациентов с внебольничными пневмониями, обладали факторами, обеспечивающими инвазию и альтерацию тканей хозяина.
Пленкообразующая способность Образование биопленок позволяет решить комплекс проблем, возникающий при колонизации УПМ организма хозяина: сохранение местоположения, противостояние влиянию иммунных факторов, сохранение жизнеспособности вопреки воздействиям антимикробных препаратов. Следовательно, можно было предполагать наличие способности к пленкообразованию у культур, выделенных от пациентов с ВП.
Действительно, способность к формированию биопленок в эксперименте обнаружена у всех исследованных штаммов. Наиболее высокие значения выявлены у штаммов S. aureus и КОС (табл. 6). Чуть меньшую активность культуры НФГОБ и Candida sp., а наименее выраженным было пленкообразование у Enterococcus sp. и Enterobacteriaceae sp.
Представленные данные по изучению способности УПМ, выделенных из мокроты пациентов пульмонологического отделения с диагнозом Внебольничная пневмония, свидетельствуют о том, что все полученные клинические штаммы микроорганизмов обладают функцией пленкообразования, а следовательно, способностью к колонизации воздухоносных путей и легочной ткани.
Таблица. 6. Пленкообразующая способность клинических штаммов, ОП540, Mm Культуры К-во культур, абс. ОП540, Mm S. aureus 32 0,4370,0КOС 13 0,3600,0Enterococcus sp. 6 0,3050,0Enterobacteriaceae sp. 16 0,2970,0НФГОБ 19 0,3440,0Candida sp. 8 0,3220,0Контроль 6 измерений 0,0890,0Наличие этого свойства повышает клиническую значимость выделенных культур, поскольку биопленка является мощным фактором противостояния защитным силам организма и антимикробным препаратам. Разная способность к формированию биопленок может свидетельствовать о различиях в вирулентных свойствах исследуемых штаммов.
ВЫВОДЫ 1. Среди выявленных в мокроте этиологических агентов внебольничных пневмоний в пульмонологическом отделении многопрофильной больницы ведущую роль играет грамположительная кокковая флора: стрептококки - 32,7% и стафилококки - 25,3%.
Доля грамотрицательных бактерий составила 27,7%, а доля грибковой флоры - 13,4%.
Отмечен рост удельного веса коагулазоотрицательных стафилококков (с 5,9% в 2005г.
до 14,2% в 2010 г.).
2. В течение исследуемого периода отмечен рост уровня лекарственной устойчивости условно патогенных микроорганизмов, выделенных из мокроты больных внебольничными пневмониями. Доля оксациллинрезистентных коагулазоотрицательных стафилококков возросла с 18% до 59%. Процент резистентных к ампициллину S.viridans увеличился с 13% до 53,5%, а у S. pyogenes данный показатель вырос с 12% до 22%. Уровень резистентности Enterobacter spp.
вырос к ампициллину - с 50% до 86%, к цефотаксиму - с 25% до 43%, а к амикацину - с 38% до 50%. Аналогичной была динамика формирования резистентности среди НФГОБ. Среди Candida sp. отмечено повышение частоты резистентности к амфотерицину В от 2,4% в 2005г. до 7,8% в 2010г. Полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения локального микробиологического мониторинга для повышения эффективности эмпирической терапии.
3. Антисептические препараты обладают мощным антимикробным потенциалом против респираторной микрофлоры, в том числе, антибиотикорезистентной. Наиболее высокоэффективным препаратом оказался хлоргексидин, немногим меньшую активность проявил диоксидин, на третьем месте по эффективности находился мирамистин. Антисепики не оказывают угнетающего действия на активность фагоцитирующих клеток, что обосновывает их применение для лечения внебольничных пневмоний.
4. Практически все культуры условно патогенных возбудителей внебольничных пневмоний обладают антагонистическими свойствами. Выраженный антагонизм выявлен у культур энтерококков, стафилококков и неферментирующих грамотрицательных бактерий. Применение комплекса методов определения антагонистической активности повышает информативность данной характеристики микробных культур.
5. Все изученные культуры бактерий обладали выраженными адгезивными свойствами.
Индекс адгезивности грамположительных бактерий - 3,740,227, практически не отличался от такового у грамотрицательных бактерий - 4,140,39 (p>0,05). Полученные результаты позволяют рекомендовать показатели адгезии в качестве дополнительного критерия этиологической значимости условно патогенных микроорганизмов.
6. Способность к формированию биопленок обнаружена у всех исследованных штаммов. Наиболее высокие значения выявлены у штаммов S. aureus, коагулазоотрицательных стафилококков и неферментирующих бактерий (оптическая плотность биопленок составила 0,4370,023, 0,3600,037, 0,3440,032, соответственно).
Наличие этого свойства повышает клиническую значимость выделенных культур, поскольку биопленка является мощным фактором противостояния защитным силам организма и антимикробным препаратам.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 1. Катрецкая Г.Г., Морозова Н.С., Гулая О.А. Лабораторные аспекты применения антисептиков при внебольничных пневмониях // Вестник уральской медицинской академической науки. 2011. №4/1. С. 2. Катрецкая Г.Г. Факторы вирулентности условно патогенной микрофлоры нижних дыхательных путей при пневмониях // Бюллетень физиологии и патологии дыхания.
2012. Вып. 43. С. 61-65.
3. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Несчисляев В.А., Черешнев В.А. Антагонистические и адгезивные свойства условно патогенной микрофлоры, выделенной из нижних дыхательных путей при внебольничных пневмониях // Вестник уральской медицинской академической науки. №1 (38). 2012. С.79-81.
Статьи в других журналах и сборниках 4. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П., Годовалов А.П., Кузьменко Т.Ю., Дорофеева Т.А. Этиологическая роль условно-патогенных микроорганизмов в патологии нижнего отдела дыхательных путей // Естествознание и гуманизм / Межвузовский сборник научных трудов // Томск. 2007. Том 4. № 3. С.84-85.
5. Катрецкая Г.Г., Быкова Л.П., Маслов Ю.Н., Годовалов А.П., Кузьменко Т.Ю.
Изучение роли условно-патогенных микроорганизмов и их адгезивных свойств, при гнойно-воспалительных заболеваниях нижнего отдела дыхательных путей // Вестник Военно-медицинской академии. Приложение. 2008. Ч.II. №2. С.374-375.
6. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П., Годовалов А.П. Анализ структуры и уровня антибиотикорезистентности условно-патогенной микрофлоры нижних дыхательных путей у больных пневмонией // Вестник Военно-медицинской академии.
Приложение. 2008. Ч.II. №2. С.463-464.
7. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П., Годовалов А.П., Кузьменко Т.Ю.
Изучение адгезивных свойств бактерий, выделенных при воспалительных заболеваниях нижних дыхательных путей // Журнал инфекционной патологии. 2008. Том 15. № 1-4.
Актуальные вопросы инфекционной патологии. Материалы Всероссийской научно-практ.
конференции с международным участием, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета, 2728 ноября 2008 г. Иркутск. С.97-98.
8. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П., Годовалов А.П. Участие условнопатогенной микрофлоры в развитии пневмонии // Инфекции в практике клинициста.
Антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах Материалы научно-практ. конференции с международным участием 27-28 марта 2008.
Харьков. 2008. С.155-157.
9. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П., Годовалов А.П., Братчикова Е.А.
Изучение грибов рода Candida в развитии гнойно-воспалительных заболеваний нижних дыхательных путей // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов: Материалы конф.. Пермь. 2008. С.168-170.
10. Быкова Л.П., Катрецкая Г.Г., Годовалов А.П. Анализ структуры, уровня антибиотикорезистентности и адгезивных свойств условно-патогенной микрофлоры нижних дыхательных путей у больных пневмонией // Материалы научной сессии 20года/ ГОУ ВПО ПГМА им.ак.Е.А.Вагнера Росздрава. - Пермь, 2008. - С. 349-3 11. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П., Годовалов А.П., Братчикова Е.А.
Антимикотикочувствительность грибов рода Candida, выделенных при гнойновоспалительных заболеваниях нижних дыхательных путей // Инфекционные болезни:
современные проблемы диагностики и лечения. Материалы Российской научнопрактической конференции, 3-4 декабря 2008 г. Санкт-Петербург. 2008. С.107-108.
12. Маслов Ю.Н., Гребенкин Б.Е., Катрецкая Г.Г., Братчикова Е.А. Структура этиологически значимой микрофлоры и уровень ее лекарственной устойчивости у больных пневмонией // Клинические и морфологические аспекты гнойной хирургии.
Научно-практическая конференция молодых ученых. Пермь, 2008. С.30-35.
13. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н. Структура этиологически значимой микрофлоры, адгезивные свойства и уровень ее лекарственной устойчивости у больных пневмонией // Вестник Российской военно-медицинской академии. Приложение. 2009. №1. (25) Ч.II С. 570-571.
14. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Братчикова Е.А. Сравнительный анализ уровня чувствительности к антибиотикам и антисептикам микрофлоры нижних дыхательных путей // Национальные приоритеты России. Спецвыпуск №2. 2009/ Материалы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию теории акад.Е.И.Павловского о природной очаговости болезней, Омск. 24-25 ноября 2009. С. 228-230.
15. Маслов Ю.Н., Катрецкая Г.Г., Шайдуллина Е.В., Братчикова Е.А. Показатели антисептикограммы микробных культур как эпидемиологический маркер // Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты) Материалы международной дистанционной научно-практической конференции. Пермь. 2009. С. 83-85.
16. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н. Характеристика условно патогенной микрофлоры, выделенной из нижних дыхательных путей у больных при внебольничной пневмонии // Миниинвазивные хирургические технологии в лечении заболеваний и травм жителей Прикамья/ Материалы научно-практической конференции в рамках 15-й международной выставки "Медицина и здоровье", Пермь. 2009. С. 96-99.
17. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П., Годовалов А.П., Братчикова Е.А.
Видовая структура, адгезивные свойства и чувствительность к антимикробным препаратам этиологически значимой микрофлоры у больных пневмонией // Материалы научной сессии 2009 года/ ГОУ ВПО ПГМА им.ак.Е.А.Вагнера Росздрава. Пермь. 2009.
С. 116-117.
18. Катрецкая Г.Г., Калина Н.Д., Хохрякова В.П. Изучение факторов адаптации условно-патогенной флоры микрофлоры, выделенной из нижних дыхательных путей при внебольничной пневмонии // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков. 25-26 февраля 2010 года. Том II. / Под ред. В.А. Лазаренко.
Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. 2010. С.39-41.
19. Катрецкая Г.Г. Факторы адаптации условно патогенной флоры микрофлоры, выделенной от пациентов с внебольничной пневмонией // Молодые ученые в медицине.
Материалы ХV Всероссийской конференции, Казань, 2-3 апреля 2010. С.93-94.
20. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Дорофеева Т.А. Динамика микробного пейзажа нижних дыхательных путей при внебольничных пневмониях // Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты). Международная дистанционная научно-практическая конференция. Пермь. 2010. С. 113-115.
21. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н. Факторы патогенности условно патогенной микрофлоры при пневмониях // Научно-практическая конференция молодых ученых в рамках 16-й международной выставки Медицина и здоровье. Пермь, 2010. С.34-38.
22. Маслов Ю.Н., Гулая О.А., Морозова Н.С., Барламов П.Н., Катрецкая Г.Г. Влияние антисептиков на фагоцитарную активность лейкоцитов у больных внебольничной пневмонией // Сборник трудов 20-го научного конгресса по болезням органов дыхания.
Москва. 16-19 ноября 2010. №7. М. 2010. С. 259-260.
23. Маслов Ю.Н, Катрецкая Г.Г., Несчисляев В.А.. Устройство для посева тестштаммов // Патент на полезную модель № 112613 от 20.01.2012 г.
24. Катрецкая Г.Г., Хохрякова В.П., Калина Н.Д. Характеристика условно патогенной микрофлоры при внебольничных пневмониях // Материалы научно-практической конференции молодых ученых Инновационные технологии на службе здравоохранения Прикамья Пермь, 2012. С.50-52.