Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи
ПРОВОРОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Эволюция микробно-растительных симбиозов:
филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты Специальность 03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации, представленной в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2009
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии Научный консультант академик Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор Игорь Анатольевич Тихонович Официальные оппоненты член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Илья Артемьевич Захаров-Гезехус академик Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор Марк Михайлович Левитин доктор биологических наук, профессор Константин Васильевич Квитко Ведущая организация Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова
Защита состоится У____Ф ______________ 2009 г. в У____Ф часов на заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Университетская наб., д. 7/9, кафедра генетики и селекции, аудитория №1.
С авторефератом диссертации, представленной в виде научного доклада, можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского госуниверситета.
Автореферат разослан У____Ф ______________ 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д 212.232.кандидат биологических наук ____________________ Л.А. Мамон
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Генетика симбиотических систем привлекает в настоящее время огромное внимание биологов как принципиально новое направление исследований, связанное с выходом всех направлений генетического анализа (классический, молекулярный, популяционный) на уровень межвидовых взаимодействий. Симбиозы - чрезвычайно удобные модели для развития экологической генетики, изучающей взаимное влияние генетических процессов и определяемых ими отношений организмов с внешней средой (Инге-Вечтомов, 2009). Применительно к симбиозам решение этой задачи подразумевает анализ генетических эффектов и экологических последствий, которые вызывают молекулярные процессы в тесно интегрированной надорганизменной генной системе. Изучая эти процессы, генетика симбиоза вносит в биологию уникальный вклад, обеспечивая системное использование молекулярных и экологических подходов и открывая возможность для разработки ряда дискуссионных проблем эволюционного учения (соотношение адаптивной и прогрессивной эволюции, становление отношений мутуализма и биологического альтруизма, действие отбора в надорганизменных системах).
Изучение эволюции симбиоза восходит к трудам А. де Бари (de Bary, 1879), который определил его как Усожительство разноименных организмовФ, включающее эволюционно связанные мутуалистические и антагонистические отношения. Наилучшими моделями для анализа эволюционной генетики симбиоза оказались бактерии, взаимодействующие с эукариотами, в первую очередь с растениями и животными. Среди них наиболее изучены клубеньковые бактерии (ризобии) - азотфиксирующие симбионты бобовых, которые доступны для детального молекулярного и популяционно-генетического анализа (Симаров и др., 1990; Young, 1992;
Spaink et al., 1998; Jones et al., 2007). Активное изучение генетики взаимодействия со стороны растений-хозяев позволяет приступить к анализу эволюции симбиоза как надорганизменной генетической системы, которая по уровню своей целостности приближается к геному свободноживущего (унитарного) организма (Тихонович, Проворов, 2003, 2009).
Использование филогенетических, популяционно-генетических и молекулярных подходов позволяет изучать симбиоз как продукт коэволюции партнеров, которая представляет собой совокупность макро- и микро-эволюционных процессов, осуществляемых в генетически интегрированных биосистемах (Проворов, 2001а). Однако, комплексное использование этих подходов ранее не проводилось, что существенно ограничивает возможности для выяснения взаимосвязей между эволюционными процессами, осуществляемыми на разных уровнях организации симбиоза: молекулярном, морфо-физиологическом и популяционном.
Наименее изученными остаются генетические механизмы эволюции мутуалистических симбиозов, которые, повышая экологическую приспособленность всех взаимодействующих партнеров, играют ключевую роль в формировании природных экосистем и экологически устойчивых агроценозов.
Недостаточная разработанность эволюционных основ симбиоза является причиной того, что знания о генетике надорганизменных систем мало используются для их улучшения и практического использования. В то же время, потенциальный вклад эволюционной генетики симбиоза в практику очень велик. Областью ее применения является, в первую очередь, сельское хозяйство, где микробно-растительные системы, улучшенные с помощью генетических методов, представляют собой реальную альтернативу широкомасштабному применению минеральных удобрений и пестицидов, которые являются основными источниками загрязнения биосферы. Поэтому весьма актуальна задача повышения эффективности микробно-растительных симбиозов, определяемой как влияние симбиотического взаимодействия на экологическую приспособленность (продуктивность) партнеров (Douglas, 1994).
Исходя из представлений о селекции как об эволюции, направляемой человеком (Вавилов, 1935), а также о возможности экстраполяции знаний о механизмах искусственной эволюции, происходящей при доместикации и селекции хозяйственно-ценных организмов, на естественные эволюционные процессы (Дарвин, 1991), мы вправе сформулировать задачу сравнительного изучения механизмов, лежащих в основе естественной и искусственной эволюции симбиозов. Такой подход позволяет использовать в селекционной, генно-инженерной и биотехнологической практике знания о природных коэволюционных процессах, которые направлены на максимально полное проявление адаптивного потенциала растений. Эти знания должны быть востребованы и при оценке эколого-генетических последствий широкомасштабного использования симбиотических организмов, в том числе и созданных генетическими методами, для конструирования высокопродуктивных, экологически безопасных агроценозов.
Цель и задачи исследований Цель работы заключалась в изучении филогенетических и популяционно-генетических закономерностей эволюции мутуалистического симбиоза, направленном на анализ генетических механизмов коэволюции растений и микроорганизмов, а также на разработку подходов и методов для создания экологически эффективных надорганизменных комплексов.
Для достижения это цели мы поставили перед собой ряд задач.
1. На примере групп перекрестной инокуляции бобовых растений изучить филогенетические закономерности эволюции специфичности, проявляемой при образовании эффективного (N2-фиксирующего) симбиоза, и проанализировать связь симбиотического потенциала со степенью окультуренности растений.
2. Охарактеризовать полиморфизм симбиотических систем, обусловленный разнообразием клубеньковых бактерий (Rhizobium leguminosarum bv. viceae, Sinorhizobium meliloti) и бобовых растений (люцерна, донник, пажитник, козлятник) для оценки адаптивной ценности и селекционного потенциала различных параметров симбиосистем (азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности).
3. Оценить относительные вклады растительных и бактериальных генотипов в определение экологической эффективности растительномикробного взаимодействия. На основе анализа связи между эффективностью и специфичностью симбиоза сформулировать основные принципы селекции хозяйственно-ценных симбиотических систем.
4. С целью анализа механизмов коэволюции бобовых растений и ризобий на повышение эффективности мутуализма разработать методику математического моделирования микроэволюционных процессов, происходящих при взаимодействии симбиотических бактерий с растениямихозяевами. С помощью созданных моделей охарактеризовать действие ключевых микроэволюционных факторов (мутационный процесс, перенос генов, различные формы отбора, генетико-автоматические процессы) при формировании генетической структуры микробно-растительных симбиозов.
5. Путем компьютерных экспериментов изучить связь эффективности симбиоза со специфичностью взаимодействия партнеров и с уровнем их изменчивости. Построить обобщенные схемы эволюции систем Урастение-микроорганизмФ, позволяющие анализировать популяционные механизмы становления мутуалистического симбиоза и разрабатывать приемы для генетического регулирования его эффективности.
Научная новизна Х Впервые изучена связь специфичности образования эффективного азотфиксирующего симбиоза и филогении бобовых растений. Показано, что корреляция таксономического деления со специфичностью образования эффективного N2-фиксирующего симбиоза отсутствует, хотя образование клубеньков является таксоноспецифичным признаком растений. Дикорастущие и малоокультуренные формы бобовых превосходят высоко окультуренные формы по эффективности симбиоза с ризобиями.
Х Установлено, что варьирование бобовых растений (люцерна, донник, пажитник, козлятник) и ризобий (Rhizobium leguminosarum bv.
viceae, Sinorhizobium meliloti) по азотфиксирующей (ацетиленредуктазной) активности и симбиотической эффективности характеризуется разными величинами статистических параметров (коэффициенты вариации, асимметрии, эксцесса), что свидетельствует о различиях эколого-генетических механизмов контроля, проявления и эволюции этих признаков.
Х С использованием метода двухфакторного дисперсионного анализа показано, что наиболее высокая экологическая эффективность характерна для симбиозов, в которых максимален вклад специфичности взаимодействия партнеров (неаддитивные генотипические эффекты) в определение симбиотических признаков.
Х Создана методика моделирования циклических микроэволюционных процессов в популяциях микроорганизмов, взаимодействующих с растениями. Действие основных форм отбора (Дарвиновский, частотнозависимый, групповой) и генетико-автоматических факторов (генетический дрейф, популяционные волны, миграция) приурочено к занятию бактериями определенных ниш в системах Ухозяин-средаФ.
Х Выявлена ведущая роль частотно-зависимого отбора, происходящего при конкуренции штаммов ризобий за образование клубеньков, в формировании экотипически полиморфных, панмиктичных бактериальных популяций. Показано, что этот тип естественного отбора является важным фактором становления взаимовыгодных отношений партнеров в стрессовых условиях, неблагоприятных для поддержания признаков мутуализма в популяциях микросимбионтов.
Х Предложена обобщенная схема микроэволюции азотфиксирующей симбиотической системы, в соответствии с которой популяционная динамика микросимбионтов следует стратегии Уутраты-приобретенияФ sym-генов, циркулирующих между симбиотически активными и асимбиотическими штаммами под контролем селективных и генетикоавтоматических факторов, индуцируемых хозяином.
Х Показано, что в генетически полиморфных симбиосистемах селективная ценность у специфичных по отношению к хозяину штаммов ризобий, способных формировать азотфиксирующие клубеньки лишь с некоторыми растительными генотипами, выше, чем у неспецифичных штаммов, эффективных в симбиозе со всеми растительными генотипами.
Однако общая эффективность симбиоза достигает максимального уровня при взаимодействии специфичных и неспецифичных мутуалистов.
Практическая значимость Х Сформулированы принципы координированной селекции бобовых растений и клубеньковых бактерий на повышение симбиотической активности: 1) широкое использование дикорастущих и малоокультуренных форм бобовых, сохранивших высокий природный симбиотический потенциал; 2) подбор комплементарных сочетаний генотипов партнеров, оптимальных для эффективного симбиоза. Использование обоих подходов наиболее результативно при снижении популяционной изменчивости растений до уровня, который обеспечивает возможность подбора штаммов бактерий, эффективных в симбиозе со всеми растительными генотипами, имеющимися в сортовых популяциях.
Х Показано, что применение УацетиленовогоФ метода измерения нитрогеназной активности в селекции бобовых растений более результативно при отбраковке симбиотически неактивных генотипов, чем при отборе генотипов с максимальной симбиотической активностью, который может проводиться лишь на фоне относительно однородного исходного материала.
Х Установлено, что основным условием реализации симбиотического потенциала активно фиксирующих азот штаммов ризобий, отобранных из природных популяций, либо полученных с помощью генетических методов, является подбор (конструирование) сортов растений, способных к эффективной передаче фиксированного азота из клубеньков и корней в надземные органы.
Х Результаты работы использованы при подготовке двух патентов (СССР и России) и двух методических рекомендаций по проведению генетико-селекционных работ с симбиотическими системами. Материалы исследований включены в лекционный курс УСимбиогенетикаФ и в магистерскую программу УЭкологическая генетикаФ (биолого-почвенный факультет СПбГУ, кафедра генетики и селекции). Автор являлся руководителем или со-руководителем четырех диссертаций, авторы которых удостоены ученой степени кандидата биологических наук.
Положения, выносимые на защиту Х Дикорастущие и малоокультуренные формы бобовых растений превосходят производственные сорта по эффективности симбиоза с клубеньковыми бактериями.
Х Азотфиксирующая активность и симбиотическая эффективность характеризуются разными параметрами генетической изменчивости, проявляемой со стороны обоих партнеров бобово-ризобиального симбиоза.
Х Координированная селекция партнеров бобово-ризобиального симбиоза должна быть направлена на подбор комплементарных пар генотипов партнеров: ризобий с высокой азотфиксирующей активностью и растений, способных полностью использовать биологический азот для построения биомассы.
Х Эволюция ризобий на повышение эффективности мутуалистического симбиоза с растениями происходит под действием специфичных для симбиоза форм отбора, индуцируемых при взаимодействии бактерий с хозяевами.
Х Высокая генетическая гетерогенность и панмиктичность популяций ризобий обусловлена частотно-зависимым отбором, действующим при конкуренции за образование клубеньков и обеспечивающим закрепление редких генотипов в бактериальных популяциях.
Х Повышение эффективности и специфичности бобоворизобиального симбиоза в ходе его эволюции обусловлено интенсивным отбором в пользу бактерий, способных к эффективному симбиозу лишь с некоторыми из доступных генотипов растений-хозяев.
Работа выполнена во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии, в лабораториях генетики и селекции микроорганизмов (1981-1992), биотехнологии (1992-2000) и биологии ризосферы (20002009). Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую благодарность руководителям этих лабораторий (докт. биол. наук, профессору Б.В.Симарову, докт. биол. наук, академику И.А.Тихоновичу, докт. биол. наук Л.В.Кравченко) за всестороннюю поддержку работы.
Математическое моделирование эволюции симбиоза проводилось совместно с канд. техн. наук Н.И.Воробьевым, которому автор приносит искреннюю признательность за плодотворное творческое содружество. Автор благодарен коллегам, совместно с которыми проводилось изучение симбиотических систем Улюцерна - Sinorhizobium melilotiФ (докт. биол. наук, проф..И.Иванов, докт. биол. наук А.И.Иванов Ю.Б.Саимназаров, канд. биол. наук Н.И.Сметанин, канд. биол. наук Т.А.Танривердиев), Упажитник - S. melilotiФ (докт. биол. наук Ю.Д.Сосков), Увика - Rhizobium leguminosarum bv. viceaeФ (канд. биол.
наук О.Н.Курчак), Угорох - R. leguminosarum bv. viceaeФ (канд. биол.
наук А.Н.Фесенко), Укозлятник - R. galegaeФ (канд. биол. наук Е.Н.Метлицкая), Уарахис - (Brady)Rhizobium sp.Ф (канд. биол. наук Д.З.Пулатова), Умаш - (Brady)Rhizobium sp.Ф (канд. биол. наук Д.З.Пулатова И.У.Бахромов). Большую помощь в проведении вегетационных опытов оказал канд. биол. наук С.Н. Федоров..
С.Н. Федоров Апробация работы Материалы диссертации были представлены в форме устных докладов и лекций на научных конференциях: УГенетика симбиоза и паразитизмаФ (1984: Тульская обл., Молочные Дворы), 11-е Всесоюз. совещ. "Плазмида" (1986: Пущино), 5-й съезд ВОГиС (1987: Москва), 7-й Всесоюз. симпоз.
"Молекул. мех-мы генет. процессов" (1990: Москва), Республик. конфер.
"Биологич. фиксация молекул. азота и азотный метаболизм бобовых растений" (1991: Тернополь), 9-й Баховский колл. по азотфиксации (1995: Москва), I съезд ВОГиС (1997: Минск), II съезд ВОГиС (2000: Санкт-Петербург), III и V съезды ВОГиС (2004, 2009: Москва), Всерос. Конф. УСельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI векахФ (2001: С.-Петербург), Научнопракт. конф. УСоврем. проблемы пр-ва кормов в условиях Сев.-Запада РоссииФ (2002: Петрозаводск), Научно-практ. конф. УСовременное состояние российской биотехнологииФ (2003: Пущино), 1-й, 2-й и 5-й Междунар.
Конгр. УБиотехнология: состояние и перспективы развитияФ (2002, 2003, 2009: Москва), 1-я, 2-я и 3-я Научные школы молодых ученых ВОГиС по Экологической генетике (1998, 2002, 2005: С.-Петербург), Школы молодых ученых УЭкологическая генетика культурных растенийФ (1998: Саратов;
2004: Уфа; 2005: Краснодар), Международной научной конференции УНаучное наследие Н.И.Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйстваФ (2007: Москва), Всероссийская конференция УФундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических системФ - пленарная лекция (2007: Саратов), Межрегиональная конференция УСтратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средойФ - пленарная лекция (2008: Саратов), 8-th Eastern Europ. Symp. "Nitrogenfix-92" (1992: Saratov, Russia), 1-st Europ. Nitrogen Fixation Conference (1994: Szeged, Hungary), 20-th EUCARPIA Meeting, Section Fodder Crops and Amenity Grasses - пленарная лекция (1996: Radzikow, Poland), 4-th Intern. Herbage Seed Conf. (1999: Perugia, Italy), 22-th EUCARPIA Meeting, Section Fodder Crops and Amenity Grasses (1999: St.-Petersburg, Russia), 16-th EUCARPIA Meeting, Genetic Resources Section (2001: Poznan, Poland), International Symposium on Transfer of Molecular Technologies from Model Legumes to Legume Crops (2002: Norwich, UK), 11-th International Congress on Molecular PlantMicrobe Interactions (2003: St.-Petersburg, Russia), 5-th International Workshop on Plant Genetic Resources УFitogen-2003Ф - пленарная лекция (2003: Sancti Spiritus, Cuba), FirstЕFourth Baltic Region Symposia and Postgraduate Courses УAgrobiotechnology Focused on Root-Microbe SystemsФ (2005: Kaunas, Lithuania; 2006: Hamburg, Germany; 2007: St.-Petersburg, Russia; 2008: Tune, Denmark), 5-th Conference on Mycorrhiza ICOM5 УMycorrhiza for Science and SocietyФ - пленарная лекция (2006: Granada, Spain); УPlant-Microbe Interaction 2008Ф - пленарная лекция (2008: Krakow, Poland), 8-th European Nitrogen Fixation Conf. (2008: Gent, Belgium).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 222 научных труда (144 - на русском языке), в т.ч. 117 статей в рецензируемых журналах (17 - в международных журналах, 75 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций). Диссертант является соавтором или соредактором 9 книг (учебники, монографии, сборники трудов международных научных конференций).
Материалы и методы Штаммы ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti: CIAM1723=425а, CIAM1752=406б, 281, 851, CIAM2502=852), гороха и вики(Rhizobium leguminosarum bv. viceae: CIAM1026=250a и CIAM0106=145a), козлятника (R. galegae: 740), маша (Bradyrhizobium sp. Vigna: CIAM190 и арахиса (B. sp. Arachis: CIAM0104) получены из коллекции клубеньковых бактерий ВНИИСХМ. Штамм S. meliloti СХМ1 получен из лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ВНИИСХМ. Рекомбинантные штаммы S. meliloti c дополнительными копиями генов транспорта дикарбоновых кислот получены из отдела генетики Билефельдского университета, ФРГ от проф. А. Пюлера.
Семена бобовых растений получены из коллекции ВИР имени Н.И.
Вавилова (отделы кормовых и зернобобовых культур). Линии люцерны 1-3 степени инбридинга (полученные из сорта Омская 192 M. varia) предоставлены Э.В.Квасовой и В.К.Шумным (Институт цитологии и генетики СО РАН).
Стерильные микровегетационные опыты проводили при выращивании растений на вермикулите с безазотной средой КрасильниковаКореняко (Фёдоров и др., 1986). Вегетационные опыты проводили при выращивании растений в сосудах с нестерильной почвой по стандартной методике (Проворов и др., 1989). Полевые мелкоделяночные опыты проводили с использованием стандартных методик рандомизации повторностей (Доспехов, 1972). Для статистической обработки данных использовали методы одно- или двухфакторного дисперсионного анализа, факторного анализа, корреляционного анализа, t-критерия Стьюдента, а также сравнения параметров экспериментально полученных распределений с нормальными (Лакин, 1990; Дубров и др., 1998).
Маркирование плазмид транспозоном Tn5-mob и их последующую мобилизацию проводили с помощью нереплицирующегося в ризобиях вектора pSUP5011.
Для моделирования популяционной динамики симбиоза использовали метод математической композиции, который позволяет использовать экспериментальные данные, полученные методами частной и популяционной генетики, для реконструкции интегральных процессов коэволюции микроорганизмов и растений. Созданные на основе моделей методики компьютерных экспериментов обеспечивают прогнозирование эволюции симбиоза, происходящей под действием различных форм отбора в сочетании с другими микроэволюционными факторами (мутагенез, перенос генов, генетический дрейф, миграция, популяционные волны), действующими в системах Ухозяин-средаФ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Рассматривая эволюцию мутуалистических симбиозов, мы будем исходить из того, что они являются продуктами коэволюции растений и бактерий, которая была изначально определена в терминах взаимного влияния селективных процессов, происходящих в популяциях партнеров (Mode, 1958; Janzen, 1980). Возникшее позднее представление о коэволюции как о сопряженном кладогенезе взаимодействующих организмов (Doyle, 1998; Schardl et al., 2008) позволило распространить понятие коэволюции и на макроэволюционные процессы. Обе формы коэволюции партнеров симбиоза связаны с их адаптацией друг к другу и к неблагоприятным внешним условиям, основанной на интеграции генных систем взаимодействующих организмов (Тихонович, Проворов, 2003, 2009).
1. Филогенетические закономерности макроэволюции симбиоза Симбиоз является важнейшим фактором эволюции организмов, определяющим становление многих групп растений, животных, грибов и бактерий (Douglas, 1994). Анализ макроэволюции симбиоза предусматривает выяснение:
1) связей между таксономией (структурой филогенетических групп) каждого из партнеров и их симбиотическими свойствами;
2) соответствия (конгруэнтности) филогений макро- и микросимбионтов, определяемого соотношением процессов кладогенеза, происходящего при их коэволюции.
Из литературы известно, что строгая приуроченность симбиоза к определенным группам организмов, а также совпадение их таксономического деления с симбиотической специфичностью, характерны для вертикально наследуемых, генетически облигатных отношений, при которых партнеры не могут существовать самостоятельно в связи утратой жизненно важных функций. Для факультативных и экологически облигатных симбиозов, партнеры которых могут осуществлять базовые жизненные функции в свободноживущем состоянии (к их числу относится бобоворизобиальный симбиоз), связь специфичности с филогенией может быть весьма разнообразной - от их полного совпадения до отсутствия какойлибо связи.
1.1. Связь симбиотической специфичности с филогенией бобовых Для бобово-ризобиального симбиоза связь специфичности с филогенией партнеров традиционно рассматривается в рамках теории групп перекрестной инокуляции (ГПИ) в соответствии с которой виды бобовых разделяют на ряд групп, внутри которых растения могут свободно УобмениватьсяФ микросимбионтами (Fred et al., 1932; Wilson, 1944; Проворов, 1992). При этом УистинныеФ ГПИ (четко отграниченные друг от друга группы растений, между которыми, как правило, происходит полная перекрестная инокуляция) охватывают лишь небольшую часть сем. бобовых (Fabaceae). Эти группы состоят из видов, относящихся либо к одному роду (например, виды Trifolium, вступают в симбиоз с Rhizobium leguminosarum bv. trifolii; виды Galega - в симбиоз с R. galegae), либо к нескольким близким родам из одной трибы (виды Pisum, Vicia, Lathyrus, Lens из трибы Viceae вступают в симбиоз с R. leguminosarum bv. viceae).
К началу нашей работы для большинства бобовых форма связи между таксономией и специфичностью симбиоза была неясна. По мнению Л.М. Доросинского (1970), само понятие специфичности бобоворизобиального симбиоза следует использовать только по отношению к его мутуалистическим (эффективным) формам, которые характеризуются высокой азотфиксирующей активностью и существенным повышением продуктивности растений, а не к образованию клубеньков, которое может быть результатом паразитарных отношений партнеров. Поэтому признак специфичности должен рассматриваться дифференцированно по отношению к клубенькообразованию и к формированию эффективного мутуализма, а соотношение этих форм специфичности с филогенетическими отношениями растений требует раздельного изучения.
Мы поставили своей задачей провести изучение структуры УистинныхФ ГПИ с целью анализа связи специфичности образования эффективного симбиоза с таксономией растений. В качестве основной модели была выбрана ГПИ люцерны, в которую входят роды люцерна (Medicago), донник (Melilotus) и пажитник (Trigonella) из трибы Trifolieae, вступающие в симбиоз с Sinorhizobium meliloti и S. medicae. При изучении специфичности 12 видов люцерны и донника по отношению к штаммам S.
meliloti различного происхождения мы показали (Проворов, Симаров, 1984б), что эти бобовые включают: 1) симбиотически не специализированные виды (Medicago borealis, M. caerulea, M. falcata, M. lupulina, M.
orbicularis, M. sativa, M. varia, Melilotus albus, M. officinalis), которые вступают в эффективный симбиоз со штаммами S. meliloti, выделенными из многих других представителей данной ГПИ; 2) узко специализированные виды, которые вступают в симбиоз только со штаммами из клубеньков этих же или немногих таксономически близких видов растений, а со штаммами иного происхождения формируют не фиксирующие азот клубеньки (Medicago arabica, M. hispida), либо вообще не вступают в симбиоз (M. laciniata).
Оказалось, что симбиотически не специализированные виды включают представителей всех четырех подродов люцерны (Medicago, Lupularia, Orbicularia, Spirocarpos), а также виды донника, и это позволило нам предположить, что внутри ГПИ люцерны связь таксономии растений со специфичностью эффективного симбиоза отсутствует. Для того, чтобы проверить это предположение, мы подвергли наши данные математической обработке, объединив их с данными из литературы. Эта обработка была проведена с помощью коэффициентов сходства, вычисляемых для видов А и В:
Sj = NAB / NA + NB + NAB, (1) где NA - число бактериальных штаммов, образующих эффективный симбиоз с видом А, но не с видом В; NB - то же для штаммов, эффективных только на виде В; NAB - то же для штаммов, эффективных с обоими видами растений (Проворов, 1985).
В результате ГПИ люцерны была разделена на три подгруппы, из которых наиболее многочисленная (1-я) состоит из симбиотически не специализированных видов, а 2-я и 3-я - из специализированных видов, причем для M. laciniata перекрестная инокуляция с другими видами люцерны часто не выявляется. Хотя специализированные виды 2-й и 3-й подгрупп относятся только к одному из подродов Medicago (Spirocarpos), при анализе всей совокупности данных мы не обнаружили связи между делением этого рода на подроды и на подгруппы специфичности (табл. 1 и 2).
Аналогичные результаты дало изучение специфичности образования симбиоза Rhizobium leguminosarum bv. viceae с различными видами рода Vicia, произрастающими в Среднеазиатском регионе (Курчак и др., 1995), а также проведенный на основании литературы анализ распределения видов клевера по подродам р. Trifolium и по подгруппам специфичности, выделяемым в ГПИ клевера (Проворов, 1992; Provorov, 1994) и видов бобовых, не входящих в истинные ГПИ (табл. 3). В последнем случае вероятность перекрестной инокуляции для видов из разных подсемейств или триб бобовых оказалась меньшей, чем для видов из одной трибы, а максимальная частота перекрестной инокуляции характерна для видов, представляющих один и тот же род. В то же время, специфичность образования эффективного (N2фиксирующего) симбиоза не зависит от таксономического родства растений.
Возможная интерпретация различий по специфичности симбиоза, проявляемой на уровне образования клубеньков и развития эффективного симбиоза, заключается в том, что образование клубеньков и симбиотическая азотфиксация возникли на разных этапах эволюции бобовых. Например, эволюция бобово-ризобиального симбиоза могла пройти через паразитарную стадию (образование не фиксирующих азот клубеньков) (Проворов, 1987, 1991; Provorov, 1994), о чем говорит наличие ряда УобщихФ генов, участвующих в развитии клубеньков и в защите растений от патогенов (Spaink, 1995; Brewin, 2004; Jones et al., 2007; Тихонович, Проворов, 2007).
Таблица 1. Распределение видов Medicago и Melilotus по подгруппам группы перекрестной инокуляции (ГПИ) люцерны (Проворов, 1985, 1992; Проворов и др., 1995) Виды растений* Результаты инокуляции различными Подштаммами Sinorhizobium meliloti группы Всего % штаммов с разными фе- ГПИ люцерштаммов нотипами ны Fix+ Nod+Fix - Nod - Medicago aculeata (S) 49 44,9 55,1 0 M. arabica (S) 160 23,2 75,0 1,8 M. borealis (M) 47 95,7 4,3 0 M. caerulea (M) 47 97,9 2,1 0 M. cancellata (M) 7 100 0 0 M. daghestanica (M) 3 67 33 0 M. falcata (M) 80 87,5 12,5 0 M. glutinosa (M) 25 36 40 24 M. hemicaerulea (M) 7 42,9 57,1 0 M. hispida (S) 124 19,4 68,5 12,1 M. laciniata (S) 214 3,7 51,4 44,9 M. littoralis (S) 49 89,8 10,2 0 M. lupulina (L) 129 84,5 13,2 2,3 M. mimima (S) 89 96,6 3,4 0 M. orbicularis (O) 120 77,5 20,0 2,5 M. polymorpha (S) 80 23,7 76,3 0 M. praecox (S) 80 89,9 6,3 3,8 M. quasifalcata (M) 7 100 0 0 M. rigidula (S) 80 96,2 0 3,8 M. rugosa (S) 49 20,4 79,6 0 M. sativa (M) 152 80,3 15,1 4,6 M. scutellata (S) 49 85,7 14,3 0 M. truncatula (S) 80 82,5 17,5 0 Melilotus albus 216 79,6 19,9 0,5 M. indicus 80 23,7 76,3 0 M. officinalis 129 93,0 7,0 0 *Для видов люцерны в скобках указана принадлежность к подродам: Medicago (M), Lupularia (L), Orbicularia (O), Spirocarpos (S).
Симбиотические фенотипы: Fix+ - образование N2-фиксирующих клубеньков, Nod+FixЦ - образование не фиксирующих N2 клубеньков, Nod - - клубеньки не образуются.
Выявленная в ходе филогенетического анализа эволюционная лабильность N2-фиксирующего симбиоза может быть связана с его необязательностью для онтогенеза растений, которая сочетается с высокой адаптивной ценностью симбиоза, проявляемой в условиях дефицита азота. Мы предположили, что специфичность мутуалистического взаимодействия может быть связана не с таксономией растений, а с их экологической специализацией.
Таблица 2. Анализ сходства различных видов Medicago по специфичности образования эффективного симбиоза (Проворов, 1992; Provorov, 1994) Сопоставляемые виды растений принадлежат: Коэффициенты сходства, Sj К одной и той же подгруппе ГПИ люцерны 1-й 0,920,2-й 0,860,К разным подгруппам ГПИ люцерны 1 - 2 0,230,1 - 3 0,050,2 - 3 0,070,К одному и тому же подроду Medicago 0,630,К разным подродам Medicago 0,620,Таблица 3. Связь симбиотической специфичности и таксономического родства у бобовых растений, не входящих в УистинныеФ группы перекрестной инокуляции, изученная на основании учета элементарных тестов на перекрестную инокуляцию (ЭТПИ)* Сопоставляемые Число ЭТПИ Доля (%) Доля (%) ЭТвиды растений при- Общее В которых положитель- ПИ, в котонадлежат к: изучали эф- ных ЭТПИ рых сформифективность от их общего ровался эфсимбиоза числа фективный симбиоз Одному роду 1051 731 86,60,87 76,21,Разным родам од- 1917 557 65,41,09 72,01,ной трибы Разным трибам 3256 860 56,20,86 75,01,одного подсемейства Разным подсемей- 2456 722 58,60,99 76,71,ствам Для всех бобовых 8680 2870 62,50,52 74,90,*Если бактериальный штамм, выделенный из растений вида А, формировал клубеньки на растениях вида В, то мы считали осуществленным 1 положительный ЭТПИ (который мог сопровождаться формированием эффективного или не эффективного симбиоза), а если клубеньки не формировались, то был получен отрицательный ЭТПИ. В таблице суммированы данные о 8680 ЭТПИ, выполненных с бобовыми, представляющими 132 рода из 31 трибы всех трех подсемейств сем. Fabaceae (Проворов, 1992; Provorov, 1994).
Для проверки этой гипотезы мы изучили специфичность симбиоза с различными штаммами S. meliloti, выделенными в Кавказском центре разнообразия рода Medicago, у трех экологически различающихся видов:
M. daghestanica и M. glutinosa - экологически специализированные (эндемичные) виды, M. hemicaerulea - вид с широкой экологической амплитудой. Оказалось (Проворов и др., 1995), что для эндемичных видов M.
daghestanica и M. glutinosa характерно образование более эффективного симбиоза с УгомологичнымиФ штаммами, выделенными из клубеньков этих же видов, чем с УгетерологичнымиФ штаммами из других видов. Однако для экологически пластичного вида M. hemicaerulea такого различия не выявлено: он формирует одинаково эффективный симбиоз со УсвоимиФ и УчужимиФ штаммами ризобий.
1.2. Эволюция симбиотрофного питания азотом у бобовых культур В связи с тем, что для большинства почв характерен дефицит подвижных форм азота, многие группы растений используют два типа азотного питания - симбиотрофный (кооперация с ризобиями, актиномицетами, цианобактериями, ризосферными или эндофитными бактериями) и автотрофный (самостоятельное усвоение азотных соединений, главным образом аммонийных и нитратных форм) (Проворов, 1996б).
Мы изучили динамику эффективного симбиоза в эволюции культурных растений, оценив баланс различных типов азотного питания у ряда видов бобовых, и сопоставили его со степенью окультуренности растений. Оказалось, что для мало окультуренной вики мохнатой (Vicia villosa) характерно преобладание симбиотрофного типа азотного питания, тогда как для высоко окультуренной вики посевной (V. sativa) - преобладание автотрофного типа (рис. 1).
Для математического анализа данных о соотношении альтернативных типов азотного питания был использован коэффициент симбиотической эффективности (Gibson, 1962):
MS E = 100% (2) MC где МS и МC - показатели продуктивности растений в условиях симбиотрофного или автотрофного питания азотом, соответственно. Используя коэффициент Е, мы сопоставили полученные нами результаты с данными литературы и выяснили (рис. 2), что преобладание автотрофного питания характерно для высоко окультуренных видов бобовых, а преобладание симбиотофного питания - для мало окультуренных видов.
Рисунок 1. Использование викой мохнатой (Vicia villosa) и викой посевной (V.
sativa) симбиотически фиксированного азота (N2) или азотных удобрений (N) в форме карбамида. Размеры столбиков соответствуют средним прибавкам (по сравнению с безазотным контролем) для массы растений (белые) или накопления в них азота (заштрихованные) в вегетационных опытах (Курчак, Проворов, 1995).
Важно отметить, что наиболее резкие различия по соотношению альтернативных типов азотного питания выявляются для растений, образующих недетерминированные клубеньки с Уамидным типомФ ассимиляции фиксированного азота (горох, люцерна, кормовые бобы, козлятник, клевер, вика), тогда как у бобовых с детерминированными клубеньками Ууреидного типаФ (соя, фасоль, маш; возможно, арахис) данные различия выражены гораздо менее резко. Эта закономерность может быть связана с тем, что специализированная система усвоения фиксированного азота, характерная для уреидных клубеньков, не участвует в ассимиляции азотных удобрений и в меньшей степени подвержена ингибированию продуктами азотного обмена, чем ассимиляторная система амидных клубеньков. Результаты сравнительного изучения динамики накопления азота в растениях Vicia sativa и V. villosa, проведенное с помощью изотопных (15N) методов (Kurchak et al., 2000), позволяют предположить, что снижение симбиотической активности при окультуривании растений связано с повышением чувствительности N2фиксирующей системы к азотным соединениям, в первую очередь, к накапливающимся в клубеньках продуктам N2-фиксации.
Повышенная эффективность симбиотрофного питания азотом у дикорастущих и мало окультуренных бобовых может быть выявлена и при анализе внутривидовой изменчивости, которую мы изучили на примере пажитника греческого (Trigonella foenum graecum), разделяемого на два подвида: дикорастущий индийский и окультуренный средиземноморский (Синская, 1950;
Сосков, Байрамов, 1990). В дикорастущих образцах и сортах пажитника выявляются растения, которые образуют фиксирующие N2 клубеньки (Fix+), не фиксирующие N2 клубеньки (FixЦ) и не образуют клубеньков (NodЦ). При этом индийский подвид обладает наибольшими частотами Fix+ и Nod+ растений, тогда как у средиземноморского подвида частоты Nod+ растений резко снижены, а Fix+ растения не выявляются (табл. 4).
Рисунок 2. Эффективность симбиотрофного питания азотом у бобовых культур.
Приведены средние значения коэффициентов эффективности (Е, формула 1) с доверительными интервалами: 1 - горох посевной (Pisum sativum), 2 - кормовые бобы (Vicia faba), 3 - вика посевная (V. sativa), 4 - люцерна культурная (Medicago sativa, M.
varia), 5 - вика мохнатая (V. villosa), 6 - козлятник восточный (Galega orientalis), 7 - клевер сходный (Trifolium ambiguum), 8 - фасоль обыкновенная (Phaseolus vulgaris), - соя культурная (Glycine max), 10 - маш (Vigna radiata), 11 - арахис (Arachis hypogaea). Серым цветом выделены виды растений с преобладанием симбиотрофного типа азотного питания над автотрофным типом. Для вики, маша и арахиса использованы собственные данные, для остальных видов - данные из литературы (см. обзор:
Проворов, 1996б).
Таблица 4. Симбиотические свойства различных подвидов пажитника греческого (Trigonella foenum graecum) Показатели* Микровегетационный опыт Полевой опыт И С Г И С Г % Nod+ 783,4 202,8 713,4 719,0 195,6 5813,растений % Fix+ 614,6 0 394,5 5512,6 0 3414,растений Число клу- 15,70,9 12,70,7 16,21,2 15,91,5 10,80,9 13,71,беньков на Nod+ растение Исследовали по 10 образцов индийского (И) и средиземноморского (С) подвидов, а также 9 межподвидовых гибридов (Г), анализируя по 30-40 растений каждого образца при инокуляции штаммами 851 и 852 S. meliloti (Проворов и др., 1987а;
Сосков и др., 1992).
*Фенотипы растений обозначены как в таблице 1.
С использованием УацетиленовогоФ метода мы показали, что у люцерны дикорастущие и мало окультуренные формы превосходят по азотфиксирующей активности сорта, что согласуется с данными, полученными ранее (Тихонович, 1991) для гороха (рис. 3).
Рисунок 3. Нитрогеназная активность (НА, измеренная ацетиленовым методом, мкМ С2Н4 на растение в сутки) у дикорастущих (мало окультуренных) форм (1) и производственных сортов (2) бобовых. Данные по люцерне, Medicago sativa, M. varia взяты из: Проворов, Тихонович, 2003; Provorov, Tikhonovich, 2003; данные по гороху, Pisum sativum ssp. sativum предоставил И.А.Тихонович.
Тот факт, что культурные растения обеднены наследственными факторами, обеспечивающими способность к симбиотрофному питания азотом, может быть связан с длительным возделыванием и селекцией растений в условиях достаточного, а иногда и избыточного снабжения азотом, при котором происходила автоселекция форм с преобладанием автотрофного типа азотного питания. Маш и арахис, для которых мы выявили преобладание симбиотрофного азотного питания (табл. 5), хотя и являются стародавними бобовыми культурами, возделываются главным образом в тропических регионах, на бедных почвах и при низких уровнях азотных удобрений (Жуковский, 1950). В то же время, люцерна, горох, соя и фасоль длительное время возделывались в условиях интенсивного земледелия, при высокой обеспеченности азотом.
Таблица 5. Отзывчивость маша (Vigna radiata) и арахиса (Arachis hypogaea) на инокуляцию ризобиями и на внесение минерального азота в форме NH4NO3 (Пулатова и др., 1998; Provorov et al., 1998) Варианты Маш (среднее по 2 сортам) Арахис (среднее по 3 сортам) опыта Масса Масса семян Масса Масса семян 1 растения (г на 1 м2) 1 растения (г на 1 м2) Инокуляция* 5,0 106,9 2,2 121,N60 4,6 (Ц) 91,6 (Ц) 1,5 (Ц) 99,7 (Ц) N120 4,9 103,5 1,6 (Ц) 110,0 (Ц) Инокуляция 5,5 (+) 116,0 (+) 2,5 (+) 125,5 (+) + NБез 3,7 (Ц) 78,6 (Ц) 1,1 (Ц) 87,2 (Ц) обработки НСР (0,05) 0,31 3,81 0,17 2,*Использовали производственные штаммы: CIAM1901 для маша, CIAM0104 для арахиса; (+) или (Ц) - достоверные отличия от варианта с инокуляцией. N60 и N120 - внесение удобрений из расчета 60 и 120 кг/га азота.
Однако продолжительное возделывание бобовых культур на высоком азотном фоне не может считаться единственной причиной их сниженной симбиотической активности. Данные об отрицательной корреляции между числом клубеньков и эффективностью каллусообразования у пажитника греческого (Provorov et al., 1996) позволяют предположить, что симбиотические свойства растений могли снижаться в результате отбора на высокую регенерационную активность (при селекции пастбищных и многоукосных культур). Выявленные нами отрицательные корреляции симбиотической эффективности с содержанием масла в семенах арахиса или крахмала в семенах маша (Саимназаров и др., 1997) могли быть причиной снижения симбиотической активности при селекции по биохимическому составу семян.
Итак, филогенетический анализ показал высокую эволюционную лабильность бобовых по способности к взаимодействию с ризобиями, а также позволил предположить, что динамика основных симбиотических признаков растений (клубенькообразующей активности и способности формировать эффективно фиксирующий N2 мутуалистический симбиоз) определяется разными эволюционными факторами. Для выявления этих факторов весьма важными представляются вопросы о том, каким образом эволюционная динамика симбиотических признаков связана с популяционной структурой сортов, изменяемой в ходе селекции, и как она реализуется в ходе коэволюции растений с полиморфными популяциями микросимбионтов.
2. Популяционная динамика эффективного симбиоза В основу изучения мутуалистических симбиозов должно быть положено представление об их генетический целостности (Тихонович, Проворов, 2003), которая проявляется на онтогенетическом уровне (УвстраиваниеФ микросимбионтов в индивидуальное развитие растения- или животного-хозяина) и на популяционном уровне (перекрестное влияние селективных процессов, происходящих в популяциях партнеров). Первым шагом к изучению популяционной целостности бобово-ризобиального симбиоза является анализ сопряженной изменчивости бактериального и растительного компонентов. Практически значимым результатом этой работы должна стать мобилизация генетических ресурсов растений и бактерий в целях селекции, генетического конструирования и биоинженерии хозяйственно-ценных симбиозов.
2.1. Полиморфизм ризобий по признакам симбиотической эффективности Основными признаками ризобий, характеризующими их симбиотический потенциал, являются: азотфиксирующая (нитрогеназная) активность, симбиотическая эффективность (влияние на продуктивность растений), а также способность конкурировать за образование клубеньков и хозяйская специфичность, проявляемая по отношению к разным видам и сортам растений (Доросинский, 1970; Мишустин, Шильникова, 1973; Симаров и др., 1990). Изучение взаимосвязи этих признаков необходимо для разработки экспресс-методов отбора эффективных симбиотических систем, которую обычно связывают с использованием УацетиленовогоФ метода (Hardy et al., 1968), основанного на способности нитрогеназы разрывать тройную связь не только в молекуле N2, но и в молекуле C2H2 (в последнем случае основным продуктом нитрогеназной реакции является этилен C2H4). Дешевизна и простота определения ацетиленредуктазной активности (АРА) позволяет использовать ее для того, чтобы: 1) исключать из селекции симбиотически неактивные генотипы (NodЦ, FixЦ), 2) среди активных (Fix+) растений и бактерий отбирать формы с максимальным проявлением признаков симбиоза.
Ранее при проведении селекции ризобий люцерны (S. meliloti) было показало, что для штаммов, контрастно различающихся по симбиотическим свойствам (например, Fix+ и FixЦ), наблюдается высокая корреляция АРА и симбиотической эффективности (массы растений). Однако если в испытание брали штаммы, различия которых по азотфиксирующей активности носят количественный характер (например, Fix+ и Fix++), корреляция этих признаков часто оказывается низкой и недостоверной (Федоров, Симаров, 1987). Следовательно, АРА наиболее пригодна для использования в качестве экспресс-метода на начальных этапах селекции, связанных с отбраковкой симбиотически неактивных штаммов, однако для выявления штаммов, обладающих максимальной эффективностью симбиоза, ее использование ограничено. Для выяснения природы этих ограничений, а также для поиска критериев отбора штаммов ризобий на повышение симбиотической эффективности, был проведен анализа ее взаимосвязи с АРА в системах УR. leguminosarum bv. viceae - горохФ и УSinorhizobium meliloti - люцернаФ.
2.1.1. Система УRhizobium leguminosarum bv. viceae - горохФ (аналитическая селекция) Простейшим подходом для изучения взаимосвязи между нитрогеназной активностью и симбиотической эффективностью является анализ их изменчивости у природных изолятов ризобий, полученных из почвы или клубеньков растений (аналитическая селекция). Мы исследовали коллекцию из 481 штамма ризобий гороха (R. leguminosarum bv. viceae) в серии из 52 вегетационных опытов, в результате которых было выявлено 7 эффективных штаммов, которые изучили в полевых опытах (работа проведена совместно с ВНИИ зернобобовых и крупяных культур, г. Орёл).
Полученные данные показали, что селекция штаммов на способность повышать накопление в растениях азота намного более результативна, чем на способность повышать массу растений (табл. 6). Корреляционный анализ полученных данных показал (табл. 7), что нитрогеназная активность (АРА) слабо связана с параметрами симбиотической эффективности - массой растений и накоплением в них азота. Низкие, хотя и достоверные корреляции выявлены по совокупности вегетационных опытов, в которых проверяли штаммы, контрастно различающиеся по симбиотической активности. Однако эти корреляции отсутствовали в полевых опытах, где изучались только эффективные штаммы. Следовательно, в данных условиях селекция ризобий по нитрогеназной активности мало эффективна, однако она может быть результативной по способности штаммов повышать накопление в растениях азота, которое хорошо коррелирует с их массой. Это различие связано с тем, что накопление азота отражает азотфиксирующую активность за весь период вегетации, тогда как АРА позволяет оценивать эту активность в течение небольших промежутков времени, когда она подвергается случайным колебаниям.
Важно отметить, что общее накопление азота в растениях достоверно коррелирует как с их массой, так и с концентрацией азота, хотя между двумя последними показателями связь отсутствует. Это показывает, что дополнительные количества азота, которые хозяин получает благодаря повышению азотфиксирующей активности бактерий, могут быть лишь частично использованы им для своего развития.
Таблица 6. Симбиотическая эффективность природных штаммов Rhizobium leguminosarum bv. viceae на горохе сорта Орловчанин (Орлов и др., 1995; Фесенко и др., 1995) Показатели 52 вегетационных опыта 8 полевых опытов Доля (%) штаммов, способных МИ 4,61,0 57,35,достоверно повышать: Nобщ 10,21,4 1Прибавки (%) по:* МИ 27,02,1 7,00,Nобщ 33,82,3 9,70,*Прибавки относительно контроля без инокуляции вычисляли только для эффективных штаммов, инокуляция которыми приводила к достоверному возрастанию симбиотических признаков: МИ - массы инокулированных растений, Nобщ - общего накопления азота.
Таблица 7. Корреляционный анализ симбиотических признаков при селекции штаммов Rhizobium leguminosarum bv. viceae на эффективность симбиоза с горохом (Орлов и др., 1995; Фесенко и др., 1995) Сопостав- 52 вегетационных опыта 8 полевых опытов а b а b ляемые r > 0 rminЕ rmax r > 0 rminЕ rmax признаки НА - МИ 34* Ц0,33Е+0,78 +0,21* 4 Ц0,30Е+0,52 +0,НА - N% 34* Ц0,48Е+0,65 +0,08 3 Ц0,29Е+0,34 +0,НА - Nобщ 36* Ц0,47Е+0,71 +0,21* 4 Ц0,25Е+0,60 +0,МИ - N% 26 Ц0,48Е+0,73 +0,04 6 Ц0,20Е+0,28 +0,МИ - Nобщ 52** +0,23Е+0,99 +0,87** 8 +0,58Е+0,92 +0,82** N% - Nобщ 49** Ц0,10Е+0,91 +0,58* 8 +0,09Е+0,88 +0,67** а Число опытов, в которых коэффициент корреляции положителен (достоверность корреляции для совокупности опытов оценивали с помощью критерия знаков; *Р0 < 0,05; **Р0 < 0,01). bГенеральные коэффициенты корреляции () определяли, вычисляя для каждого значения r величины z = 0,5 ln(1+r)/(1Цr), которые распределены по нормальному закону, после чего оценивали достоверность отличия z от 0 (*Р0 < 0,05; **Р0 < 0,01), а значения определяли по таблицам на основании средних величин z.
МИ - масса инокулированных растений, N% - концентрация в них азота, Nобщ - общее накопление азота, НА - нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.
2.1.2. Система УSinorhizobium meliloti - люцернаФ (рекомбинантные штаммы) Для более детальной характеристики процессов усвоения азота при эффективном симбиозе, который формируется благодаря повышению азотфиксирующей активности бактерий, мы использовали генетическую систему, созданную во ВНИИСХМ совместно с Билефельдским университетом (отдел генетики) и состоящую из рекомбинантных штаммов S.
meliloti, полученных путем амплификации генов, которые контролируют энергоснабжение нитрогеназы, связанное с транспортом в бактерии дикарбоновых кислот. Этот транспорт контролируется сукцинат-пермеазой DctA, синтез которой зависит от специфичных для гена dctA транскрипционных регуляторов DctBD и от неспецифичных регуляторов NifA и NtrA, вовлеченных также в регуляцию генов нитрогеназы (Jording et al., 1994). Штаммы изучали в стерильных опытах, при выращивании люцерны на безазотном субстрате (вермикулит), что позволило отказаться от использования АРА, проявляющей низкую корреляцию с массой растений, а для оценки N2-фиксирующей активности использовать накопление в них азота (Проворов и др., 1994а; Онищук и др., 2009). Для характеристики эффективности симбиоза наряду с массой растений, использовали накопление в них углерода, отражающее интенсивность фотосинтеза, который является источником энергии для азотфиксации (Streeter, 1995).
Анализ данных двух микровегетационных опытов (МВО) и вегетационного опыта (ВО) показал, что прибавки растений по массе были значительно ниже, чем по накоплению азота (рис. 4), что согласуется с данными, полученными на горохе (табл. 6). В ВО рекомбинанты в среднем превышали штамм Rm2011 по общему накоплению азота в растениях на 78%, а по их массе - лишь на 22% (рис. 4). Корреляционной анализ полученных данных показал, что масса люцерны тесно связана с общим накоплением в ней азота и углерода (табл. 8). В МВО №1 высокие корреляции отмечены при сопоставлении всех признаков, а в МВО №2 отсутствовали корреляции массы с концентрациями азота и углерода. Это различие может быть связано с тем, что в МВО №1 изучали штаммы, контрастно различающиеся по симбиотической активности (включая мутанты со сниженной или утраченной N2-фиксацией), а в МВО №2 изучали только высокоактивные рекомбинанты. Важно отметить, что в обоих опытах наблюдали высокие корреляции между концентрациями в растениях азота и углерода. По-видимому, активная N2-фиксация усиливает фотосинтез, благодаря чему достигается оптимальный баланс С:N в растениях. Стимулом для усиления фотосинтеза может быть также ускоренное поглощение бактероидами дикарбоновых кислот, связанное с активизацией сукцинат-пермеазной системы.
Рисунок 4. Симбиотическая активность рекомбинантов Sinorhizobium meliloti, полученных при введении дополнительных генов транспорта дикарбоновых кислот в штамм Rm2011 (Онищук и др., 2009). Приведены средние данные по 9 рекомбинантам: 2011-121 (dctABD), 2011-121Н6 (dctABD), 2011121SH2 (dctA), 2011-121/121SH2 (dctABD + dctA), 2011-H6/SH2 (dctABD + dctA), 2011-121HB4 (ntrA), 2011-SH2/HB4 (dctABD + ntrA), 2011-121HH5 (nifA), 2011SH2/HH5 (dctA + nifA) (Engelke et al., 1989; Jording et al., 1992).
Таблица 8. Корреляции симбиотических признаков люцерны, инокулированной рекомбинантами Sinorhizobium meliloti с дополнительными копиями генов транспорта дикарбоновых кислот (Онищук и др., 2009) Сопоставляемые признаки Опыт №1 Опыт №M - N% + 0,71* - 0,M - C% + 0,68* - 0,M - Nобщ + 0,84* + 0,81* M - Cобщ + 0,92** + 0,85* N% - C% + 0,83* + 0,92** Nобщ - Cобщ + 0,92** + 0,97** В микровегетационном опыте №1 изучены 23 контрастно различающиеся по азотфиксирующей активности штамма (4 мутанта фенотипа FixЦ, 6 мутантов Fix+/Ц, 13 рекомбинантов и штамм Удикого типаФ Fix+ и Fix++), в опыте №2 - рекомбинантов, генотипы которых указаны в подписи к рис. 4 (Fix+ и Fix++). М - надземная масса растений, N% и Nобщ - концентрация и общее накопление в них азота; C% и Cобщ - то же для углерода. Корреляции достоверны при *Р0 < 0,05;
**Р0 < 0,01.
Для изучения природы ограничений в проявлении признака повышенной симбиотической эффективности мы провели более детальное изучение группы из 9 рекомбинантов, полученных путем введения дополнительных копий УсимбиотическихФ генов в штамм дикого типа (указаны в подписи к рис. 4). Мы сопоставили проявление их симбиотических признаков на двух неродственных сортах люцерны: с. Зайкевича (M.
varia) и с. Du Puits (M. sativa), для которых в микровегетационном опыте раздельно исследовали влияние инокуляции на массу и элементный (N, C) состав корней и надземной части. При образовании эффективного симбиоза (сравнение растений в стерильном контроле и при инокуляции штаммом Rm2011) у обоих сортов наблюдали возрастание надземной массы растений, а также концентрации и общего накопления в ней азота (табл. 9). При этом концентрация азота в корнях резко возрастала у с. Du Puits, но не изменялась у с. Зайкевича. Очевидно, что при образовании эффективного симбиоза растения с. Зайкевича полностью передают фиксированный азот из клубеньков и корней в надземную часть, а у с. Du Puits значительная его часть остается в корнях.
При повышении активности симбиоза, связанном с активизацией сукцинат-пермеазной системы (сравнение рекомбинантов с исходным штаммом Rm2011), у растений обоих сортов возрастает масса надземной части и накопление в ней азота. Однако это повышение невелико и сопровождается значительным накоплением азота в корнях (31% дополнительно фиксированного азота у сорта Зайкевича, 62% - у сорта Du Puits).
У сорта Du Puits при этом возрастает также и масса корней, что требует дополнительных затрат углерода, еще более ограничивающих эффективность симбиоза.
Таблица 9. Продуктивность люцерны сортов Зайкевича (M. varia) и Du Puits (M.
sativa) при взаимодействии с эффективными рекомбинантами Sinorhizobium meliloti (указаны в подписи к рис. 4) в микровегетационном опыт №2 (Онищук и др., 2009) Признаки Надземная часть Корни Сорт Зайкевича Cорт Du Puits Сорт Зайкевича Cорт Du Puits Отклонения (%) при инокуляции штаммом Rm2011 по сравнению с контролем MИ +31,4* +36,0* Ц41,9* Ц61,6* N% +63,6* +69,1* - 5,2 +70,5* Nобщ +115,2* +130,0* Ц45,5* Ц35,5* Отклонения (%) при сравнении рекомбинантов с родительским штаммом Rm20MИ + 9,5* +15,3* - 8,5 +54,3* N% + 1,5 - 5,5 +33,7* + 2,Nобщ +10,9* + 8,7 +23,6* +57,5* Абсолютные значения массы (мг на пробирку) для растений MК 10,5 10,0 8,7 11,MИ 13,8 13,6 5,1 4,(Rm2011) *Отклонения статистически значимы (P0 < 0,05). МИ - масса инокулированных растений, МК - масса контрольных (не инокулированных) растений, Nобщ - общее накопление азота, N% - концентрация азота.
Важными особенностями анализа фенотипического эффекта бактериальных генов, контролирующих симбиотическую эффективность, является зависимость ее проявления от генотипов хозяина, которые вносят более значимый вклад в варьирование признаков симбиоза, чем бактериальные генотипы (см. табл. 17), а также сильное неконтролируемое варьирование этих признаков, обусловленное полиморфизмом растительных популяций (разд. 3.1). При сопоставлении результатов проведенных опытов не удалось выявить достоверные корреляции между величинами симбиотической эффективности рекомбинантов, содержащих дополнительные копии генов транспорта дикарбоновых кислот, что затрудняет определение относительной ценности этих генов при конструировании высокоактивных штаммов ризобий. Для решения этой задачи мы определяли уровни влияния амплификации генов dctABD, dctA, nifA, ntrA на показатели симбиотической эффективности с помощью факторного анализа.
Оказалось (табл. 10), что в МВО №1 и №2 с сортом Du Puits совместная амплификация структурного гена сукцинат-пермеазы dctA и специфичных для него регуляторов dctBD демонстрирует наибольшее влияние на симбиотическую эффективность (о чем говорят высокие величины факторной нагрузки для dctABD) по сравнению с амплификацией гена dctA или неспецифичных регуляторов nifA и ntrA. В ВО с сортом Du Puits факторные нагрузки для dctA и dctABD одинаково высоки, а для неспецифичных регуляторов nifA и ntrA они ниже, чем в МВО. В МВО №2 с сортом Зайкевича уровни влияния изученных генов на эффективность симбиоза оказались такими же, как в ВО с сортом Du Puits.
Таблица 10. Уровни влияния амплификации генов транспорта дикарбоновых кислот на показатели эффективности симбиоза Sinorhizobium meliloti с разными сортами люцерны Гены Величины факторных нагрузок* сорт Du Puits сорт Зайкевича МВО №1 МВО №2 ВО МВО №dctABD 0,720,02 0,650,05 0,630,10 0,650,dctA 0,390,06 0,380,06 0,650,05 0,580,nifA 0,290,07 0,340,07 0,170,01 0,210,ntrA 0,320,04 0,320,04 0,170,06 0,200,*Факторные нагрузки (приведены со стандартными ошибками) вычисляли для Min-вектора в многомерном пространстве, координатные оси которого характеризуют количества копий генов транспорта дикарбоновых кислот, а также параметры эффективности симбиоза - массу растений, содержание в них азота и углерода. Значения факторных нагрузок находятся в диапазоне 0Е1 (чем они выше, тем более значимо влияние амплификации гена, рассчитанное на одну копию).
Полученные данные позволяют предположить, что в неблагоприятных для симбиоза условиях (МВО с сортом Du Puits, где продолжительность азотфиксации составила 8-10 суток) лимитирующей стадией образования N2-фиксирующей системы оказывается активация синтеза сукцинат-пермеазы DctA, осуществляемая на уровне транскрипции структурного гена, в которой важную роль играют не только специфичные регуляторы dctBD, но и неспецифичные регуляторы nifA и ntrA. В более благоприятных условиях (ВО с сортом Du Puits, где период азотфиксации составляет 28-30 суток, а также МВО с сортом Зайкевича, который даже в условиях ограниченного роста обеспечивает активный отток продуктов N2-фиксации в надземную часть растений) эффективность симбиоза зависит от работы уже сформировавшейся пермеазной системы, и для ее повышения достаточно амплификации гена dctA. Одним из механизмов ингибирующего действия накапливающихся в клубеньках продуктов N2фиксации может быть блокировка образования дикарбоновых кислот, снижающая скорость синтеза пермеазы DctA (на уровне активности транскрипционных регуляторов).
Итак, использование симбиосистем (УRhizobium leguminosarum bv.
viceae - горохФ, УSinorhizobium meliloti - люцернаФ) показало, что возрастание азотфиксирующей активности бактерий (в результате аналитической селекции, либо генетического конструирования) повышает накопление азота в растениях более существенно, чем их массу. Из этого следует, что для полной реализации азотфиксирующего потенциала ризобий необходим подбор генотипов бобовых, способных полностью использовать для развития биомассы дополнительно получаемый азот. На примере двух сортов люцерны, изученных на отзывчивость к инокуляции генетически модифицированными штаммами S. meliloti, можно видеть, что Уузким местомФ, ограничивающим использование дополнительно фиксированного азота, является его передача из корней в надземную часть растений.
2.2. Полиморфизм бобовых растений по признакам эффективного симбиоза Детальное изучение симбиотического полиморфизма бобовых мы провели на примере культурных видов люцерны, донника и пажитника, входящих в ГПИ люцерны (табл. 11). Наименее изменчивой среди них оказалась люцерна, наиболее изменчивым - пажитник греческий, для которого проявление полиморфизма сильно зависит от генотипов микросимбионта: наиболее эффективны штаммы S. meliloti, выделенные из пажитника (851 и 852), менее эффективны штаммы 425а и 406б из люцерны, и неэффективен штамм 281 из донника (Проворов, Симаров, 1984а, 1986а).
Таблица 11. Изменчивость симбиотических признаков у бобовых растений из ГПИ люцерны, по данным микровегетационных опытов (Provorov, Simarov, 1990) Растения Изучено образцов Коэффициенты вариации (%) по Всего Fix+ Nod+Fix - Nod - НА MИ Люцерна* 133 133 0 0 27-41 13-Донник** 8 8 0 0 21-52 18-Пажитник*** 29 13 12 4 55*** 53*** *Объединенные данные по видам Medicago sativa, M. varia, M. falcata (штамм СХМ1).
**Объединенные данные по видам Melilotus albus, M. officinalis (штамм 281).
***Данные для с. Нахичеванская шамбала (штамм 852). МИ - масса инокулированных растений, НА - нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность (фенотипы растений обозначены как в табл. 1).
Изучение внутрисортовой изменчивости люцерны (при инокуляции штаммом СХМ1) показало, что у индивидуальных растений нитрогеназная активность более вариабельна, чем масса (табл. 12). При этом по нитрогеназной активности выявляется левосторонняя асимметрия (As>0), то есть в популяциях преобладают растения с низким уровнем проявления этого признака.
Подобной асимметрией характеризуется распределение неинокулированных растений по массе, однако образование симбиоза приводит к нормализации этого распределения.
Таблица 12. Характеристика внутрисортового полиморфизма люцерны по симбиотическим признакам (при инокуляции штаммом СХМ1) Сорта растений Cv As МИ НА МК МИ НА Зайкевича (v) 16 31 +0,29 +0,01 +0,54* Краснодарская 13 30 +0,58* +0,47 +0,ранняя (v) Краснодарская 72 (v) 19 30 +0,33 Ц0,11 +0,Терра (v) 14 27 +1,44* Ц0,32 +0,66* Спарта (v) 21 38 +0,41 +0,10 +0,Славянская 17 41 +1,04* Ц0,67* +0,местная (v) Омская 192 (v) 19 36 +0,03 Ц0,49 +1,08* Ташкентская 3192 (s) 17 40 +0,43 Ц0,74* +0,88* Береке (s) 26 39 +1,24* Ц0,03 +0,Вахшская 300 (s) 21 38 +0,81* +0,19 +0,82* Средние 18,31,20 35,01,59 +0,660,14* Ц0,160,12 +0,530,10* Для характеристики распределений использовали коэффициенты: Cv - вариации (%), As - асимметрии (*распределение достоверно отличается от нормального; Р0 < 0,05). В скобках после названий сортов указана их принадлежность к видам люцерны:
Medicago varia (v) или M. sativa (s) (Lesins, Lesins, 1979; Иванов, 1980).
МИ - масса инокулированных растений, МК - масса контрольных (не инокулированных) растений, НА - нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.
Закономерности, выявленные при изучении нитрогеназной активности у люцерны, подтвердились при изучении козлятника восточного, Galega orientalis сорта Гале (табл. 13). По данным микровегетационных опытов, около 15% растений этого сорта формируют неактивные (FixЦ) клубеньки, причем коэффициенты вариации и асимметрии распределений Fix+ растений по нитрогеназной активности для козлятника значительно выше, чем для люцерны.
Таблица 13. Полиморфизм козлятника восточного (с. Гале) по нитрогеназой активности (НА) при инокуляции штаммом 740 (Метлицкая и др., 1995) Изучено растений НА, мкМ С2Н4 на 1 Fix+ растение в сутки Опыт Всего % Fix+ Среднее Cv As Ex растений 1 389 93,6 0,150,006 77,7 +1,02* +0,2 402 80,8 0,120,007 108,6 +1,66* +2,30* 3 354 80,7 0,130,011 127,3 +1,69* +1,73* Коэффициенты (для Fix+ растений): Cv - вариации (%), As - асимметрии, Ex - эксцесса (*распределение достоверно отличается от нормального; Р0 < 0,05).
Межпопуляционное варьирование люцерны было изучено на двух наборах генотипов: таксономически разнородном (99 образцов Medicago sativa, M. varia, M. falcata, представляющих все мировые центры происхождения люцерны; рис. 5) и таксономически однородном (34 образца M. sativa Среднеазиатского генцентра). Результаты этих опытов оказались сходными, так как для обеих групп генотипов: 1) прибавка массы растений более изменчива, чем нитрогеназная активность (коэффициенты вариации 48-63% и 20-22%, соответственно); 2) эти признаки не коррелируют между собой и характеризуются различными параметрами распределения, что говорит о разном генетическом контроле.
В связи с отсутствием четкой связи между азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью со стороны как растений, так и ризобий, особый интерес приобретает вопрос о возможности использования УацетиленовогоФ метода в селекции активно фиксирующих N2 симбиотических систем. Мы показали, что если набор из различающихся по происхождению сортов бобовых испытывают на эффективность симбиоза с одним и тем же штаммом ризобий, то корреляции оказываются недостоверными: для выборки из 99 сортов люцерны (рис. 5) коэффициенты корреляции ацетиленредуктазной активности с относительными (в %) и абсолютными (в мг) прибавками массы растений составили +0,13Е+0,18 (Р0 > 0,05).
Аналогичные данные были получены и при анализе выборки из сортов люцерны Среднеазиатского генцентра (r = +0,04Е+0,30; Р0 > 0,05). Мы предположили, что отсутствие этой корреляции связано с высоким полиморфизмом изучаемых сортов растений, у которых способность индуцировать у находящихся в клубеньках бактерий нитрогеназную активность и ассимилировать продукты азотфиксации характеризуется разными закономерностями генетического варьирования. Если это предположение правомочно, то корреляции азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности должны проявляться на фоне генетически однородных выборок растений. Для проверки этого предположения мы использовали серию самофертильных линий люцерны (M. varia) сорта Омская 192.
Оказалось, что у полученных линий симбиотическая эффективность (относительные прибавки массы от инокуляции) вдвое ниже, чем у исходного сорта). Однако по нитрогеназной активности (АРА) подобного снижения не наблюдали, причём три линии характеризовались ее возрастанием (табл. 14). Корреляционный анализ показал, что связь АРА с массой растений отсутствует при сопоставлении разных линий люцерны, но выявляется для индивидуальных растений внутри линий (табл. 15). Это показывает, что селекция растений по АРА может приводить к повышению симбиотической эффективности только при работе с относительно однородным исходным материалом.
Для того, чтобы подтвердить возможность селекции растений на повышение симбиотической эффективности с помощью УацетиленовогоФ метода, мы провели опыты с козлятником восточным (Galega orientalis) - культурой с преобладанием симбиотрофного типа азотного питания над автотрофным типом (рис. 2). В микровегетационных опытах, результаты которых представлены в таблице 12, из сорта Гале были отобраны 107 растений с максимальной нитрогеназной активностью (Fix++) и 109 лишенных ее растений (FixЦ). Анализ развития этих растений в полевых опытах показал, что отбор на повышенную нитрогеназную активность сопровождался усилением развития козлятника, а также ускорением его перехода в генеративную фазу (табл. 16). Хотя полученные данные носят предварительный характер (Fix++ растения сравнивали с растениями фенотипа FixЦ, а не со всем исходным сортом), результаты работы позволили нам защитить методику отбора растений с повышенной симбиотической эффективностью, основанную на использовании ацетиленового метода, патентом России (№2083089 от 10.06.1997 г.). Возможность использования созданного исходного материала в селекции козлятника была показана в последующих работах (Raig et al., 2001).
Рисунок 5. Межсортовое варьирование люцерны по симбиотической активности. Симбиотические признаки 99 сортов и дикорастущих форм Medicago sativa (60), M. varia (27), M. falcata (12) изучены в стерильных микровегетационных опытах при инокуляции штаммом СХМ1. А - нитрогеназная активность: мкМ С2Н4 на растение в сутки. Б - симбиотическая эффективность: прибавка массы растений, мг (Provorov, Simarov, 1990).
Таблица 14. Симбиотические свойства самофертильных линий люцерны, полученных из сорта Омская 192 (Квасова и др., 1994) Признаки Омская 192 Линии* Число линий, отклоняющихся от исходного сорта** + - РМК 1048,7 1296,5 14 (8) 4 < 0,МИ 2356,9 2047,8 4 14 (9) < 0,dM% +126 +64 2 16 < 0,НА 4,90,27 5,00,28 9 (3) 9 (1) > 0,Р0 - вероятность нулевой гипотезы о том, что линии в среднем не отличаются от исходного сорта. В скобках указаны количества линий с достоверным отклонением от сорта Омская 192 (*средние рассчитывали для 21 линии; **из расчетов исключены 3 линии, в которых наблюдали выщепление Fix - растений).
МИ - масса инокулированных растений (штамм СХМ1), МК - масса контрольных (не инокулированных) растений, dM% - прибавка (%) массы растений над контролем без инокуляции, НА - нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.
Таблица 15. Корреляционный анализ симбиотических признаков самофертильных линий люцерны (Квасова и др., 1994) Сопоставляемые признаки Коэффициенты Вероятность накорреляции личия связи* dM% - НА (для разных линий) + 0,17 < 0,МИ - НА (для разных линий) + 0,24 < 0,МИ - НА (для индивидуальных растений + 0,55* > 0,в линии) МИ - масса инокулированных растений, dM% - прибавка (%) массы растений от инокуляции, НА - нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.
Таблица 16. Продуктивность растений козлятника, различающихся по способности к азотфиксации, в полевом опыте на 2-й год вегетации (Метлицкая и др., 1995) Признаки Фенотипы растений t-критерий Fix - Fix++ Стьюдента* Масса растений (г на 1 м2) 73283,5 1351154,5 3,52 (Р0 < 0,05) Высота растений, см 54,83,1 70,33,9 3,10 (Р0 < 0,05) % мощно развитых растений 35,07,5 62,76,7 2,74 (Р0 < 0,01) % растений, сформировавших плоды 52,57,9 82,35,3 3,12 (Р0 < 0,01) Итак, полученные данные показали, что со стороны как макросимбионта, так и микро-симбионта азотфиксирующая активность и симбиотическая эффективность характеризуются разными параметрами изменчивости, а значит их генетический контроль существенно различается. Поскольку растительный и бактериальный партнеры выполняют в азотфиксирующем симбиозе разные функции (ризобии фиксируют азот, бобовые обеспечивают нитрогеназу энергией и осуществляют ассимиляцию аммония), важным является сопоставление размаха изменчивости нитрогеназной активности и симбиотической эффективности, наблюдаемого со стороны растений и бактерий. Для такого сопоставления мы провели опыты, в которых либо один сорт растений инокулировали набором из различающихся по происхождению штаммов ризобий, либо набор из различающихся по происхождению сортов инокулировали одним и тем же штаммом. Оказалось (табл. 17), что хотя нитрогеназная активность является признаком бактерий, ее изменчивость в равной степени зависит от генотипов обоих партнеров, тогда как варьирование симбиотической эффективности определяется в основном генотипом растений. Таким образом, именно растение-хозяин является тем партнером, который оказывает решающее влияние на эффективность симбиоза, и генетическое улучшение растений, проводимое параллельно с селекцией или генетическим конструированием бактерий, является обязательным условием повышения симбиотической эффективности.
Таблица 17. Сопоставление межсортового варьирования растений с межштаммовым варьированием бактерий по симбиотическим признакам (Проворов, Симаров, 1992) Растение- Взято в опыт Коэффициенты вариации (%) хозяин по:
Сортов растений Штаммов бактерий НА dM% Люцерна 1 36 303,5 354,99 1 222,2 484,8* 34 1 202,5 637,9* Донник 1 36 283,3 263,8 1 246,0 9923,7* *Коэффициент вариации по величине прибавки массы растений (dM%) достоверно выше, чем по нитрогеназной активности (НА).
3. Популяционно-генетические модели симбиоза Для выяснения закономерностей эволюции мутуалистического симбиоза необходимо создание и сопряженный анализ экспериментальных и математических моделей, описывающих коэволюцию партнеров, которая основана на координированном действии в их популяциях естественного отбора. На примере бобово-ризобиального симбиоза мы проанализировали две группы моделей, которые позволяют исследовать связь эффективности симбиоза со специфичностью, проявляемой при взаимодействии партнеров, а также с уровнем их полиморфизма.
3.1. Экспериментальные модели Признаком, непосредственно отражающим коэволюционные процессы в системе симбиоза, является специфичность взаимодействия партнеров, которая в настоящее время активно изучается на молекулярногенетическом уровне (Овцына, Тихонович, 2004). Однако связь эффективности мутуализма со специфичностью взаимодействия партнеров остается мало изученной. Ранее Л.М.Доросинский (1970) показал, что при взаимодействии различных видов бобовых (соя, люпин) со штаммами Bradyrhizobium japonicum наибольшая эффективность симбиоза достигается при максимально выраженной специфичности взаимодействия растений и бактерий. Для того, чтобы выяснить, проявляется ли эта связь на внутривидовом уровне, на котором действует естественный отбор, мы с использованием методики двухфакторного дисперсионного анализа проанализировали данные о сорто-штаммовых взаимодействиях партнеров в различных бобово-ризобиальных системах. Этот подход позволил нам разложить общее варьирование признаков симбиоза на 4 составляющие, которые соответствуют аддитивным действиям сортовых и штаммовых генотипов, их неаддитивному взаимодействию (оно непосредственно характеризует специфичность симбиоза), а также эффектами УслучайныхФ факторов. В каждой системе эффективность симбиоза определяли по двум показателям - массе растений и общему накоплению в них азота, причем второй показатель повышается при инокуляции ризобиями более значительно, чем первый (раздел 2.1.1). Оказалось, что в пяти различных симбиосистемах накопление азота более жестко контролируется генотипами партнеров и в большей степени зависит от специфичности их взаимодействия, чем масса растений (табл. 18).
Связь между специфичностью и эффективностью симбиоза подтвердилась также при сопоставлении систем, образуемых люцерной и горохом, либо люцерной при выращивании на разных типах почвы (рис. 6). В обоих случаях наиболее эффективный симбиоз (у люцерны по сравнению с горохом, либо у люцерны при выращивании на серозёме по сравнению с чернозёмом) формируется при максимальном проявлении специфичности взаимодействия генотипов растений и бактерий. Выявленная связь между эффективностью и специфичностью симбиоза показывает, что координированная селекция партнеров должна быть направлена на подбор штаммов ризобий, используемых для инокуляции определенных сортов бобовых (или групп родственных сортов), то есть на создание высоко комплементарных сочетаний генотипов партнеров.
Важное значение для разработки методов координированной селекции партнеров имеет выяснение природы УслучайногоФ варьирования, которое во многих опытах оказывает большее влияние на признаки симбиоза, чем генотипы партнеров (табл. 18, рис. 6).
Таблица 18. Вклады генотипов симбиотических партнеров в общее варьирование показателей эффективности бобово-ризобиального симбиоза Система Параметры MИ Nобщ Ссылки Medicago sativa (M. dX +12,9 +14,4 Provorov et varia) - С 37,7 41,3 al., 19Sinorhizobium Ш 11,4 11,meliloti СШ 0 7,Z 50,9 39, dX +4,3 +9,8 Танривердиев и др., 19С 38 Ш 11 СШ 0 Z 51 dX +3,1 +15,1 Проворов и др., 1994а С 54,1 26,Ш 18,7 24,СШ 4,4 39,Z 22,8 9,Pisum sativum - dX +27,0 +33,8 Фесенко и Rhizobium С 30,8 31,6 др., 1995;
leguminosarum bv. Fesenko et al., Ш 14,9 13,viceae 19СШ 5,4 8,Z 48,9 46,Vicia villosa - dX +16,1 +30,2 Курчак и др., Rhizobium С 20,1 7,2 19leguminosarum bv.
Ш 15,9 2,viceae СШ 0 53,Z 64,0 37,Vigna radiata - dX +40,0 +55,0 Саимназаров Bradyrhizobium sp. С 60,4 53,1 и др., 19(Vigna) Ш 32,4 35,СШ 4,7 10,Z 2,5 1,Arachis hypogaea - dX +53,1 +90,Bradyrhizobium sp. С 9,1 10,(Arachis) Ш 77,8 81,СШ 1,2 1,Z 12,0 6,dX - относительная прибавка (%) при инокуляции, средняя для всех комбинаций Усорт-штаммФ. В каждом опыте общее варьирование признака разложено путем двухфакторного дисперсионного анализа на составляющие: С - аддитивное действие сортов растений, Ш - аддитивное действие штаммов бактерий, СШ - их неаддитивное взаимодействие, Z - случайное варьирование (Тихонович, Проворов, 1998).
Обычно это варьирование связывают с действием неконтролируемых факторов внешней среды, однако мы предположили, что его важным источником может быть также генетический полиморфизм растительных популяций, который затрудняет поиск комбинаций Усорт-штаммФ, обеспечивающих высокую эффективность симбиоза.
Рисунок 6. Вклады партнеров в изменчивость признаков, определяющих эффективность симбиотических систем. А - различные виды бобовых: люцерна, образующая высокоэффективный симбиоз (1); горох, образующий малоэффективный симбиоз (2). Б - люцерна на бедной сероземной почве, где образуется высокоэффективный симбиоз (1); на богатой черноземной почве, где образуется малоэффективный симбиоз (2) (Проворов, Тихонович, 2003; Provorov, Tikhonovich, 2003).
Для проверки этого предположения мы сопоставили отзывчивость на инокуляцию ризобиями и степень полиморфизма для двух популяций пажитника греческого - высоко изменчивой природной (кат. ВИРа №34807) и более однородной сортовой (Нахичеванская шамбала). Оказалось (рис. 7), что масса растений природной популяции возрастает при взаимодействии со всеми 5 испытанными штаммами S. meliloti, однако ее достоверное повышение (+45%) обеспечивает только штамм 852 (выделен из пажитника). У сортовой популяции реакция на штаммы ризобий различалась гораздо более сильно, причем для наиболее эффективных из них (851 и 852) прибавки составили +87% и +124%. Наследственная природа изменчивости пажитника, затрудняющей подбор эффективных в симбиозе с ним штаммов, была показана при анализе линий, различающихся по способности формировать N2-фиксирующие клубеньки (Проворов, Симаров, 1985). Аналогичные данные были получены при сопоставлении различных сортов вики посевной (Vicia sativa) и мохнатой (V.
villosa): сорта, однородные по массе растений, более отзывчивы на инокуляцию R. leguminosarum bv. viceae, чем изменчивые сорта (Курчак и др., 1995).
Итак, важной задачей координированной селекции растений и бактерий, наряду с созданием комплементарных сочетаний их генотипов, должно быть выравнивание сортовых популяций бобовых по признакам симбиоза. Оно обеспечивает возможность подбора штаммов бактерий, комплементарных всем (или большинству) имеющихся в сорте генотипов, что необходимо для максимального проявления генетических (аддитивных и неаддитивных) факторов симбиоза, выявляемых в ходе дисперсионного анализа. Иными словами, специфичность бактерий по отношению к сортовому генотипу определяется их специфичностью к индивидуальным растениям, составляющим сорт.
Рисунок 7. Отзывчивость двух популяций пажитника греческого (Trigonella foenum graecum) на инокуляцию Sinorhizobium meliloti. Масса контрольных (не инокулированных) растений принята за 100%; (+) и (Ц) - достоверные отличия от контроля (Проворов, Симаров, 1984а, 1986а; Provorov, Simarov, 1990).
3.2. Математические модели Одно из условий эффективной ко-адаптации партнеров в системе симбиоза заключается в том, что взаимодействие бактерий с хозяином становится фактором, непосредственно определяющим их эволюцию. К началу нашей работы было установлено, что бобовые растения контролируют распространение и численность природных популяций ризобий, то есть являются для них ведущим экологическим фактором (Доросинский, 1970). Кроме того, имелись данные о том, что при взаимодействии с хозяином у бактерий могут повышаться частоты мутационных и рекомбинационных событий, являющихся Уисходным материаломФ для эволюционных процессов (см. обзоры: Проворов, 2000, 2001б).
Для изучения роли растения-хозяина в эволюции бактерий мы предложили новый подход, основанный на том, что хозяин является индуктором действия микроэволюционных факторов (различные формы естественного отбора и генетико-автоматические процессы), принципиально изменяющих популяционную динамику микросимбионтов по сравнению со свободноживущими бактериями. Наиболее сильное влияние хозяина испытывают эндо-симбиотические популяции бактерий: действие в них отбора является непосредственным результатом симбиоза, а точнее, определяющих его обратных связей партнеров. Для того, чтобы изучить действие этих факторов, мы использовали методологию математического моделирования, которая позволяет синтезировать разнородные эмпирические данные, полученные методами генетики, микробиологии, биохимии, цитологии, молекулярной биологии и экологии, обеспечивая построение целостной картины эволюционного процесса. Компьютерные эксперименты, проводимые на основе математических моделей, позволяют анализировать совместное действие факторов, эффекты которых не могут быть определены в одном и том же биологическом опыте.
3.2.1. Предпосылки и задачи построения моделей При построении моделей бобово-ризобиального симбиоза мы преследовали следующие цели: 1) имитация процессов, приводящих к становлению характерных для ризобий пространственных и генетических структур популяций; 2) выяснение генетико-эволюционной природы связи, которую эффективность мутуализма проявляет со специфичностью взаимодействия партнеров, а также с уровнем их изменчивости (раздел 3.1); 3) прогнозирование эволюции мутуалистических симбиозов, основанное на использовании экспериментально определяемых системных параметров.
Особенности ризобиальных популяций, которые необходимо объяснить с помощью моделирования, заключаются в следующем.
1. Высокая генетическая гетерогенность, которая возрастает при взаимодействии бактерий с хозяином. Эволюционно значимая форма полиморфизма симбиотических микробов - это стабильное сосуществование симбиотически активных и асимбиотических штаммов, обозначенное нами как Уэкотипический полиморфизмФ (Проворов, Воробьев, 2000).
Даже в условиях постоянного взаимодействия с хозяином асимбиотические штаммы могут составлять более 90% от численности почвенных популяций ризобий.
2. Панмиктичность, которая может быть определена как отсутствие неравновесия по сцеплению различных генов, например как случайное комбинирование симбиотических (sym) генов (либо маркеров Symплазмид) с факторами УкоровойФ части генома. У ризобий, как и у многих патогенных бактерий, панмиктичность возрастает при взаимодействии с хозяевами, которые могут индуцировать перенос генов, играющий ключевую роль в эволюции симбиоза (Проворов, 1996г, 2001б, 2005).
3. Способность растительно-микробных систем эволюционировать в направлении усиления эффектов мутуализма. В случае бобоворизобиального симбиоза эта эволюция выражалась в: 1) усложнении структур клубенька; 2) возрастающей специализации нитрогеназы к выполнению симбиотических функций; 3) увеличении интенсивности азотфиксации, которая достигает максимальных уровней в эволюционно продвинутых симбиозах, образуемых УгалегоиднымиФ бобовыми (например, Medicago sativa, Galega orientalis) с быстрорастущими ризобиями (Sinorhizobium meliloti, Rhizobium galegae) (Sprent, 2001, 2007; Provorov, Vorobyov, 2008а) Известно, что в системе Ухозяин-средаФ ризобии осуществляют регулярную циркуляцию между экологическими нишами (УпочваризосфераклубенькипочваФ), в ходе которой происходят глубокие и закономерные преобразования пространственных и генетических структур микробных популяций. Исходя их этого, мы впервые создали полное математическое описание жизненного цикла ризобий, многие этапы которого характерны и для других экологически облигатных симбионтов высших организмов (Проворов, Воробьев, 1998а, 1998б, 2003, 2009). Моделируемый микроэволюционный цикл (рис. 8) включает три группы процессов.
1. Сапрофитное существование свободноживущей почвенной популяции бактерий. Поскольку большинство почв представляют собой трофически бедные экологические среды, мы считали, что здесь бактерии не размножаются (численность популяции постоянна), однако у них происходят генетические изменения (мутации, перенос генов), продукты которых вовлекаются в дальнейшие эволюционные процессы.
2. Конкуренция за обладание богатыми питанием симбиотическими нишами, предоставляемыми растением-хозяином (ризосфера, клубеньки).
Этот процесс осуществляется в форме миграции бактерий из почвы в симбиотические ниши (инокуляция), после чего происходит их колонизация (размножение бактерий до определенных уровней, соответствующих ёмкостям ниш).
Рисунок 8. Популяционная динамика ризобий в системе Ухозяин-средаФ.
3. Выход бактерий из симбиотических ниш в почву, где возникает временный избыток клеток (популяционная волна) и обостряется конкуренция за выживание, в результате которой часть клеток отмирает и популяция возвращается к равновесной численности.
Поскольку эндосимбиотические популяции ризобий принципиально отличаются по своей генетической и пространственной структуре от почвенных популяций, мы предположили, что ключевую роль в микроэволюции ризобий играет конкуренция за образование клубеньков. Для этой конкуренции характерна нелинейная динамика: если растение инокулируют смесью двух штаммов, их численности в клубеньках (N1, N2) и инокулюме (I1, I2) связаны эмпирически установленной зависимостью (Amarger, Lobreau, 1982):
a N1 I= c, (3) N2 I2 где УаФ и УсФ - константы, которые зависят от генотипов конкурирующих штаммов и растения-хозяина. Величина УсФ, которая отражает конкурентную способность штаммов (их соотношение в клубеньках при равном соотношении в инокулюме), может быть как больше, так и меньше 1, однако величина УаФ всегда меньше 1 (обычно 0,2I1/I2). Таким образом, в популяции ризобий, взаимодействующей с хозяином, происходит отрицательный частотно-зависимый отбор (ЧЗО), поддерживающий редкие генотипы.
3.2.2. Формирование высоко полиморфных, панмиктичных популяций Исходя из указанных предпосылок, мы построили базовую модель №1 (рис.
9), в соответствии с которой основную роль в эволюции системы играет ЧЗО, действующий при инокуляции клубеньков, и Дарвиновский отбор, действующий при размножении (в ризосфере или клубеньках) или отмирании (в почве) конкурирующих генотипов. В модели изучена простейшая микробная популяция, состоящая из родителя (Р) и его мутанта (М), обладающего измененной приспособленностью в нишах ex planta и in planta.
Рисунок 9. Блок-схема жизненного цикла ризобий, которая отражает их микроэволюцию, приводящую к установлению сбалансированного полиморфизма (модель №1). Микроэволюционный цикл разделен на 6 этапов, включающих: 1) возникновение мутантов с измененной экологической приспособленностью; 2) инокуляцию ризосферы бактериями, мигрирующими из почвы; 3) колонизацию ризосферы (размножение бактерий инокулюма); 4) инокуляцию клубеньков; 5) колонизацию клубеньков; 6) выход в почву бактерий из ризосферы и клубеньков и возвращение их общей численности к исходному уровню. Дарвиновский отбор действует на стадиях 3, 5 и 6, частотно-зависимый отбор - на стадии 4, мутационное давление - на стадии 1, генетико-автоматические факторы на стадиях 2 (миграция), 4 (генетический дрейф) и 6 (популяционная волна). UЕ - соотношения численностей мутанта и родителя; DЕ - относительные сдвиги этих соотношений, характеризующие давления отбора или мутационного процесса внутри экологических ниш. В компьютерных экспериментах использовали постоянные параметры: S, R, N - емкости почвенной, ризосферной и клубеньковой ниш; , f - доли ризосферной и клубеньковой ниш, заполняемые бактериями в процессе инокуляции, а также коэффициенты УаФ и УсФ из модели конкуренции, формула 3 (Проворов, Воробьев, 2003; Воробьев, Проворов, 2005).
Условия равновесия в системе задаются уравнением: DC.t = DM.tD2.tD3.tDS.t.
где использованы интегральные давления отбора, вычисленные по всем имеющимся в системе нишам (D2.t - для стадий 2 и 3, D3.t - для стадий 4 и 5).
Использованный подход позволил нам описать процесс установления сбалансированного полиморфизма в ассоциированных с растениями микробных популяциях при взаимодействии ЧЗО, давление которого зависит главным образом от коэффициента УаФ в модели конкуренции за образование клубеньков (формула 3), и Дарвиновского отбора, который зависит от относительных скоростей размножения (отмирания) бактерий в различных экологических нишах.
Оказалось, что финальная структура популяции, достигаемая при ее длительной эволюции, зависит от параметров, характеризующих давление ЧЗО и действие популяционной волны (рис. 10А), а скорость микроэволюции зависит также от частоты мутирования (РМ) и от интенсивности Дарвиновского отбора (Проворов, Воробьев, 2003; Provorov, Vorobyov, 2006). Анализ модели показал, что благодаря ЧЗО в системе поддерживаются штаммы, обладающие сниженной выживаемостью в почве (рис. 10Б).
К их числу могут относиться симбиотически активные штаммы, которые при высоком давлении ЧЗО не только сохраняются, но при определенных значениях системных параметров и доминируют в популяции.
Для того, чтобы проанализировать роль ЧЗО в установлении панмиктической структуры популяции, мы упростили модель №1, предположив, что растительные ниши ограничены клубеньками, при конкуренции за которые происходит этот отбор (Проворов, Воробьев, 1998а, 1998б; Provorov, Vorobyov, 2000). Анализ полученной модели №2 позволил нам проанализировать эволюцию микробных популяций, состоящих из 3-генотипов, между которыми осуществляется ключевой для эволюции ризобий перенос sym-генов, обеспечивающий формирование панмиктичных популяций. Моделируемая система состояла из Исходных Симбионтов (ИС) и авирулентных Местных Бактерий (МБ), которые при переносе sym-генов из ИС превращаются в вирулентные Новые Симбионты (НС), конкурирующие за образование клубеньков с ИС, а за выживание в почве - с авирулентными МБ.
Мы предположили, что авирулентные МБ включают два генотипа, А и В, которые в силу различной экологической приспособленности находятся в почве в разных соотношениях (генотип А доминирует, а генотип В встречается редко), однако они могут с равным успехом служить реципиентами переносимых из ИС sym-генов. Оказалось, что в ходе циклической микроэволюции симбиосистемы частоты рекомбинантов, возникающих из этих генотипов выравниваются и при одинаковой способности конкурировать за образование клубеньков их соотношение приближается к 1:1 (рис. 11-1). Благодаря этому достигается близкое к случайному комбинирование (равновесие по сцеплению) sym-генов и маркеров хромосомы, то есть популяция становится панмиктичной. Анализ этого варианта модели показал, что у ризобий панмиктичные популяции могут формироваться на фоне очень низких частот переноса sym-генов - менее 10-19 на реципиент (рис. 11-2).
Итогом анализа первых двух моделей стало создание схемы Уутратыприобретения sym-геновФ, описывающей формирование типичной для ризобий панмиктичной, экотипически полиморфной популяции (рис. 12).
Данная схема основана на тесной взаимосвязи этих свойств популяций, поскольку асимбиотические штаммы являются оптимальными реципиентами для переноса sym-генов, играющего ключевую роль в формировании панмиктичных популяций.
Рисунок 10. Установление равновесия в популяции ризобий при возникновении мутантов с изменениями относительной приспособленности (модель №1, рис. 9). s - конечный уровень относительной численности мутанта, LN - амплитуда популяционной волны, выраженная через соотношение емкостей клубеньковой и почвенной ниш. A: сплошные линии - мутанты с повышенной приспособленностью во всех нишах (почва, ризосфера, клубеньки); пунктирные линии - мутанты с пониженной приспособленностью во всех нишах (при разных величинах параметра УaФ из формулы 3). Б: сплошная линия - мутант, у которого приспособленность повышена in planta (в клубеньках), но снижена ex planta;
пунктирная линия - мутант, у которого приспособленность повышена ex planta, но снижена in planta (Provorov, Vorobyov, 2006) Рисунок 11. Эффективность действия частотно-зависимого отбора (ЧЗО) в популяции ризобий (модель №2). 1 - выравнивание численностей доминирующего (А) и редкого (Б) генотипов в популяции Местных Бактерий (m - номер микроэволюционного цикла). 2 - значения параметра УаФ модели (формула 3) конкуренции за образование клубеньков (отложены по оси абсцисс), в ходе которой осуществляется ЧЗО в пользу Новых Симбионтов, возникающих при различных исходных частотах rB (отложены по оси ординат). Серым цветом закрашена область действия ЧЗО (Проворов, Воробьев, 1998б).
Рисунок 12. Формирование популяции клубеньковых бактерий в соответствии со стратегией Уутраты-приобретенияФ sym-генов.
Исходная клональная популяция состоит из двух симбиотически активных штаммов (А и В), содержащих Sym-плазмиды pSymA и pSymB. В этой популяции происходит: 1 - возникновение авирулентных мутантов, обладающих повышенной выживаемостью в почве, путем утраты Sym-плазмид; 2 - формирование экотипически полиморфной структуры путем размножения авирулентных мутантов под действием Дарвиновского отбора; 3 - возникновение вирулентных рекомбинантов путем горизонтального переноса Sym-плазмид; 4 - формирование панмиктической структуры при размножении рекомбинантов под действием частотно-зависимого и Дарвиновского отбора (Проворов, Воробьев, 2000; Provorov, Vorobyov, 2008a).
Данные о том, что именно это направление переноса генов играет ключевую роль в формировании популяций ризобий, были получены нами (Проворов и др., 2004) при изучении рекомбинантов, возникающих при конъюгативной передаче УсимбиотическихФ плазмид между разными штаммами ризобий клевера (Rhizobium leguminosarum bv. trifolii). Оказалось (табл. 19), что при переносе плазмиды pSym343 в штамм 345а дикого типа его симбиотическая эффективность снижается, что может быть связано с функциональной несовместимостью привнесенной и резидентной Sym-плазмид. В то же время, при переносе pSym343 в авирулентный, лишенный собственной Sym-плазмиды мутант штамма 345а возникают рекомбинанты, которые не только приобретают способность занимать клубеньковую нишу, но и превосходят по эффективности симбиоза с клевером родительский штамм 345а. Очевидно, что именно эти рекомбинанты преимущественно подхватываются отбором и размножаются в популяции, обеспечивая ее панмиктичность.
Таблица 19. Симбиотические свойства рекомбинантов, полученных при переносе плазмиды pSym343 в штамм 345а Rhizobium leguminosarum bv. trifolii и его авирулентный (NodЦ) мутант (Проворов и др., 2004) Реципиент Общее число Число рекомбинантов, достоверно отличаюреком- щихся от штамма 345а дикого типа бинантов НА dM% < > < > 345а 16 6 0 8 345а (NodЦ) 16 0 16 0 НА - нитрогеназная активность, dM% - прибавка (%) массы растений от инокуляции.
Предложенная схема Уутраты-приобретенияФ sym-генов (рис. 12) предполагает, что экотипически полиморфные, панмиктичные популяции ризобий обладают наиболее высокой приспособленностью в системах Ухозяин-средаФ, так как благодаря этой структуре бактерии поддерживают обширные системы sym-генов лишь в небольшой части популяции, обеспечивая их распространение при взаимодействии с растениями.
3.2.3. Коэволюция бактерий и растений на повышение эффективности мутуализма Изучение популяционно-генетических механизмов эволюции микробнорастительных симбиозов представляет большой общебиологический интерес в связи с необходимостью выявления факторов становления мутуализма, которые не могут быть сведены к действию Дарвиновского отбора (Maynard Smith, 1989; Frank, 1994). Действительно, в системах мутуализма у партнеров могут поддерживаться УальтруистическиеФ признаки (гены), обеспечивающие выживание не своих непосредственных обладателей (что предусмотрено моделями Дарвиновского отбора), а партнеров по симбиозу. При этом условии эволюция мутуализма может быть блокирована Усимбионтами-обманщикамиФ (например, штаммами ризобий фенотипа Nod+FixЦ), которые, в отличие от Уистинных мутуалистовФ (штаммов Nod+Fix+), не выполняют функций, полезных для хозяина, хотя и инфицируют его (Frank, 1996; Simms, Taylor, 2002).
Поскольку в мутуалистической системе реципиентом адаптивно значимых (УальтруистическихФ) эффектов действия бактериальных sym-генов является хозяин, логично предположить, что именно он выполняет роль индуктора тех микроэволюционных процессов, которые обеспечивают формирование у микросимбионтов мутуалистических признаков. Эти процессы могут быть связаны с установлением между партнерами положительных обратных связей, которые в бобово-ризобиальном симбиозе определяются обменом С- и N-метаболитами: фиксация бактериями азота стимулирует растительный фотосинтез, продукты которого используются в клубеньках не только для поддержания нитрогеназной реакции, но и для размножения бактерий (Streeter, 1995; Kiers et al., 2003).
Однако, механизмы трансформации метаболических обратных связей партнеров в селективные давления, поддерживающие мутуализм, остаются неясными. К началу нашей работы был создан ряд моделей, объяснявших эволюцию признаков мутуализма у ризобий действием группового отбора (Jimenez, Casadesus, 1989; Olivieri, Frank, 1994; Simms, Bever, 1998; Bever, Simms, 2000; West et al., 2001, 2002), однако область применения этих моделей ограничена клональным размножением бактерий в клубеньках. В действительности, инфицирование клубеньков часто является смешанным, то есть активные клубеньки содержат, наряду с фиксирующими N2 Уистинными мутуалистамиФ, также и не фиксирующие N2 Усимбионты-обманщикиФ. В опытах по гибридизации ризобий вики было показано (Курчак и др., 2001), что смешанные инфекции часто происходят при инокуляции растений штаммами, имеющими общую Sym-плазмиду, которая контролирует конкуренцию за образование клубеньков. Таким образом, характерный для ризобий перенос sym-генов может служить препятствием для эволюции мутуализма, связанной с групповым отбором.
3.2.3.1. Конструирование и общая характеристика коэволюционных моделей Для изучения селективных процессов, направляющих эволюцию мутуализма в системе бобово-ризобиального симбиоза, мы модифицировали модель №1, предположив, что образование эффективного симбиоза индуцирует в популяции растений селективные процессы (коэволюционные ответы), которые вызывают закрепление признаков мутуализма в микробной популяции. Для анализа этих процессов необходимо было создать коэволюционную модель, которая описывает действие отбора в популяциях не только бактерий, но и растений.
Мы предположили, что индуктором коэволюции партнеров на повышение эффективности мутуализма являются обратные метаболические связи партнеров, которые носят положительный характер. Эффективность этих связей может быть достаточно велика, о чем говорят высокие корреляции между количествами азота и углерода, которые фиксируют партнеры при образовании варьирующих по эффективности симбиозов (раздел 2.1.2, таблица 8). Созданная нами модель (Проворов, Воробьев, 2009) учитывает метаболическую связь партнеров, проявляющуюся в том, что доля азотфиксирующего штамма в клубеньковой нише определяет репродуктивный потенциал как самих бактерий (суммарное количество клеток в симбиотических нишах по завершении их колонизации), так и растений (количество образованных семян).
Для того, чтобы охарактеризовать общий уровень эффективности мутуалистического симбиоза (ЭМС) мы вычисляли УпиковыеФ численности, достигаемые каждым из партнеров на t-том микроэволюционном цикле в финальном состоянии системы (t), отнесенные к максимально допустимым УпиковымФ численностям, которые могут быть достигнуты при 100% частоте N2-фиксирующих бактерий в клубеньковой нише.
3.2.3.2. Диморфные популяции ризобий На первом этапе работы (Provorov, Vorobyov, 2008b; Проворов, Воробьев, 2009) мы изучили простейшую коэволюционную систему, в которой оба партнера представлены диморфными популяциями: бактерии - мутантом (М) и родителем (Р), проявляющими разную азотфиксирующую способность; растения - двумя генотипами, каждый из которых образует азотфиксирующие клубеньки только с одним из штаммов ризобий. Мы исследовали влияние на эволюцию системы двух типов мутационных (РМ) сценариев:
1-й сценарий - мутант Мн фиксирует азот в симбиозе с обоими генотипами растений, а его родитель Рн лишен этой возможности (возникновение у бактерий способности к неспецифическому мутуализму);
2-й сценарий - мутант Мс фиксирует азот в симбиозе с 1-м, но не со 2-м генотипом растений, тогда как его родитель Рс обладает азотфиксирующей способностью по отношению только ко 2-му генотипу растений (изменение специфичности мутуализма).
При реализации первого сценария в качестве показателя эффективности симбиоза была использована доля неспецифичного мутуалиста Мн в финальной популяции, которая формируется при неограниченном возрастании числа микроэволюционных циклов (t). В этом случае поиск условий, оптимальных для эволюции мутуализма, сводился к выявлению режима микроэволюции, обеспечивающего высокую частоту Мн (например, его доминирование над Рн).
Компьютерные эксперименты, проведенные в вычислительной среде MathCad2000, показали, что в соответствии с динамикой партнеров могут быть выявлены два режима микроэволюции - колебательный и монотонный (последний является наиболее типичным для эволюции мутуализма, отражая характерную для него высокую генетическую стабильность;
Law, Lewis, 1983; Pellmur, Huth, 1996). Оказалось, что в финальной популяции (при t) неспецифичный симбионт Мн доминирует над Рн при более узком диапазоне условий (только в монотонном режиме), тогда как специфичный симбионт Мс может доминировать над Рс в обоих режимах (табл. 20).
Таблица 20. Влияние параметров отбора в растительной популяции на финальные численности микросимбионтов, специфичных (Мс) и неспецифичных (Мн) по отношению к растительным генотипам Колебательный режим Монотонный режим Варьирование параметра * Величины Мн Мс Величины Мн Мс параметра параметра 0,8 0,456 0,749 0,5 0,732 0,70,9 0,399 0,760 0,55 0,756 0,70,98 0,344 0,768 0,6 0,784 0,71,0 0,329 0,771 0,65 0,817 0,71,05 0,289 0,772 0,7 0,853 0,8Варьирование параметра ср* 1 0,075 0,602 1 0,579 0,51,5 0,206 0,705 1,3 0,720 0,62 0,344 0,768 1,5 0,784 0,73 0,586 0,843 2 0,880 0,84 0,763 0,885 3 0,952 0,9*Конкуренция в популяции растений при прорастании семян описывается форл P0 cp Qp11.t, где и - количества растемулой Qp11.t Qp21.t Qp21.t = л л cp Qp11.t + Qp12.t ний 1-го генотипа в начале и конце конкурентного процесса, Qp12.t - количество растений 2-го генотипа в начале конкурентного процесса, P0 - общее число растений к концу конкурентного процесса (cp>0, >0). Параметр определяет давление частотно-зависимого отбора (ЧЗО) в растительной популяции: при 0<1 ЧЗО является отрицательным, при >1 - положительным, при =1 ЧЗО отсутствует (Provorov, Vorobyov, 2008b; Проворов, Воробьев, 2009).
Таким образом, условия поддержания в моделируемой системе специфичных симбионтов наиболее широки, что согласуется с данными о том, что максимальная эффективность симбиоза коррелирует именно с высокой специфичностью взаимодействия партнеров (разд. 3.1). В то же время, связь эффективности симбиоза с полиморфизмом растений носит сложный характер: выявленное ранее (разд. 3.1) повышение эффективности симбиоза при снижении полиморфизма растений показано только для монотонного режима, наиболее характерного для мутуализма, тогда как в колебательном режиме возрастание эффективности симбиоза обычно сопровождается повышением полиморфизма растительной популяции (Воробьев, Проворов, 2008).
Итак, при моделировании эволюции диморфных популяций ризобий нам удалось подтвердить закономерности, выявленные при анализе экспериментальных моделей, однако селективные механизмы, определяющие эти закономерности, оставались неясными. Для их выяснения необходимо построить модель эволюции полиморфных популяций ризобий, которая позволит сопоставить давления отбора, действующего в пользу различных типов симбионтов в одном и том же компьютерном эксперименте.
3.2.3.3. Полиморфные популяции ризобий Для изучения эволюции мутуализма в полиморфных популяциях ризобий необходимо дать описание их мультиштаммовой конкуренции при занятии симбиотических ниш (ризосферы и клубеньков), для чего мы заменили параметры УaФ и УcФ из формулы (3), которые являются УобщимиФ для рассматриваемых штаммов, на индивидуальные параметры каждого штамма. Мы предположили, что при переходе ризобий к симбиозу инокуляция симбиотических ниш i-тым штаммом описывается формулой:
bi = U, (4) n.i o.i где и - частоты i-того штамма в новой и исходной нишах; веn.i o.i личина bi (индекс инокуляции) характеризует конкурентоспособность iN bi того штамма при занятии новой ниши; U = - нормирующая велиo.i i=N чина, удовлетворяющая условию: = 1 (N - общее число штаммов).
n.i i=Результаты вычислений, проведенных с использованием экспериментальных данных о конкуренции ризобий за образование клубеньков, показали гораздо большую точность модели (4) по сравнению с моделью (3) (Воробьев, Проворов, 2008). При этом модель (4) позволяет сохранить все базовые свойства изучаемой системы, в первую очередь - действие отрицательного ЧЗО: его давление при инокуляции каждой новой ниши определяется величинами 0 С использованием модели (4) мы проанализировали эволюцию систем, формируемых при возникновении у штамма-родителя (Р), который образует не фиксирующие N2 клубеньки с обоими растительными генотипами, трех типов мутантов: фиксирующий N2 в симбиозе только с 1-м растительным генотипом (М1), только со 2-м генотипом (М2) или с обоими генотипами (М3). При сопоставлении 4 возникающих при этом симбиосистем можно видеть (табл. 21), что максимальная гетерогенность (индекс генного разнообразия Н близок к 1) в финальном состоянии (при t) всегда достигается для бактериальной популяции, тогда как в растительной популяции величина Н=1 (соответствующая равным частотам двух генотипов) характерна только для симметричных систем УP+M1+M2Ф и УP+M1+M2+M3Ф. В асимметричных системах УP+M1+М3Ф и УP+M2+М3Ф гетерогенность растительной популяции имеет промежуточные значения (Н=0,565), что соответствует наличию доминирующего и минорного классов с частотами 0,83 и 0,17. Наиболее высокая ЭМС (близкая к 0,6) достигается в асимметричных системах, характеризуемых промежуточным уровнем полиморфизма растений (табл. 21). Таблица 21. Индексы генного разнообразия и эффективности мутуалистического симбиоза, характерные для различных микробно-растительных систем (Воробьев, Проворов, 2008). Системы Индексы генного раз- ЭМС (см. раздел Частоты (%) (их типы)* нообразия (Nei, 1978) 3.2.3.1) Fix+ Бактерии Растения Бактерии Растения симбиозов** Р+М1+М2 (С) 0,999 1,0 0,358 0,390 0,3Р+М1+М2+М3 (С) 0,999 1,0 0,524 0,532 0,5Р+М1+М3 (А) 0,995 0,565 0,602 0,608 0,6Р+М2+М3 (А) 0,995 0,565 0,602 0,608 0,6*Типы симбиотических систем: С - симметричные (растительные генотипы имеют равное число N2-фиксирующих симбионтов), А - асимметричные (для доминирующего растительного генотипа имеется два N2-фиксирующих симбионта, а для минорного генотипа - один симбионт). **Определяли на основании частот генотипических комбинаций партнеров, в которых образуются N2-фиксирующие клубеньки. Для того, чтобы изучить эволюционную динамику N2-фиксирующего симбиоза, мы проанализировали зависимость показателей финальной генетической структуры симбиоза (частоты генотипов партнеров при t) от системных параметров, характеризующих давления отбора в популяциях бактерий и растений, а также эффективность положительных обратных связей партнеров. Для этого мы вычислили относительные изменения показателей генетической структуры, происходящие при малых отклонениях системных параметров от базовых значений, использованных при проведении контрольных компьютерных экспериментов. По своему биологическому смыслу эти изменения близки к интенсивности отбора, индуцируемого в популяциях партнеров факторами внешней среды (Меттлер, Грегг, 1972), и мы будем далее называть эти изменения коэволюционными ответами, КЭТ (они моделируют чувствительность системы к частным изменениям ее параметров). Обратные связи партнеров. Для анализа коэволюции партнеров на повышение эффективности мутуализма мы вычислили величины КЭТ, характеризующие перекрестные влияния селективных факторов, действующих на растения и бактерии. Показано, что при усилении отбора в пользу любого из входящих в систему генотипов повышается частота не только этого генотипа, но и тех его партнеров, с которыми образуется N2фиксирующий симбиоз. Результаты компьютерных экспериментов позволили нам составить диаграмму селективных процессов, происходящих при эволюции N2фиксирующего симбиоза (рис. 13). Согласно этой диаграмме, положительная обратная связь, обусловленная обменом партнеров С- и Nметаболитами, преобразуется в обратную связь, обусловленную взаимным влиянием селективных процессов в популяциях партнеров. Величины КЭТ, вычисленные для партнеров симбиоза в зависимости от интенсивности метаболических обратных связей (0,029-0,037), близки к величинам, вычисленным для бактерий в зависимости от давления отбора в растительной популяции (0,029-0,040). Однако величины КЭТ, вычисленные для растений в зависимости от давления отбора в бактериальной популяции, значительно выше (0,212-0,254). Следовательно, при воздействии бактерий на растительную популяцию происходит усиление эффективности положительных обратных связей, которое может быть одним из основных факторов повышения эффективности симбиоза. Cильный коэволюционный ответ, наблюдаемый со стороны растений, может быть причиной того, что именно этот партнер играет ключевую роль в определении эффективности мутуализма (табл. 17). Специфичность симбиоза. Компьютерные эксперименты позволили выявить различия в динамике специфичных и неспецифичных бактериальных генотипов: при воздействии растения на бактериальную популяцию отбор в пользу мутантов М1 или М2, специфичных только к одному из растительных генотипов, более интенсивен (величины КЭТ выше), чем отбор в пользу мутанта М3, образующего эффективный симбиоз с обоими растительными генотипами (табл. 22). В то же время, максимальные величины ЭМС, вычисленные для популяций каждого из партнеров, достигаются в асимметричных системах (УP+M1+М3Ф и УP+M2+М3Ф), то есть при наличии неспецифичного мутуалиста М3, а минимальная - в симметричной системе УP+M1+М2Ф, где неспецифичный мутуалист отсутствует (табл. 21). Рисунок 13. Диаграмма селективных процессов, определяющих эволюцию мутуалистического симбиоза (построена на основании величин коэволюционных ответов, КЭТ). Рядом со стрелками представлены величины КЭТ, которые отражают давления отбора в популяции того партнера, на которого указывает стрелка. Величины КЭТ приведены для специфичных по отношению к хозяину мутантов М1 и М2 в системе УР+М1+М2+М3Ф (Воробьев, Проворов, 2008). Итак, анализ модели мультиштаммовой конкуренции позволил не только объяснить связь эффективности и специфичности симбиоза, выявленную на экспериментальных моделях (разд. 3.1) и подтвержденную при анализе математических моделей двух-штаммовой конкуренции (раздел 3.2.3.2), но и объяснить эту связь особенностями отбора, действующего при коэволюции растений и бактерий в системах мутуализма. Таблица 22. Коэволюционные ответы (КЭТ) для бактериальных мутантов, различающихся по специфичности в отношении растительных генотипов (Воробьев, Проворов, 2008) Факторы, в зависимо- Изучаемые системы Величины КЭТ для мусти от которых вычис- (М1Е3 - мутанты, Р - тантов ляли КЭТ родитель) Специ- Неспецифичных фичного (M1, M2) (M3) Метаболические обрат- P+M1+M2, P+M1+M3, 0,019- 0,0ные связи P+M2+M3 0,0P+M1+M2+M3 0,037 0,0Давления отбора в по- P+M1+M2, P+M1+M3, 0,029- пуляции растений P+M2+M3 0,0P+M1+M2+M3 0,019- 0,0020,034 0,0ЗАКЛЮЧЕНИЕ Цель нашей работы заключалась в изучении филогенетических закономерностей и популяционно-генетических механизмов эволюции мутуалистического симбиоза, необходимом для реконструкции процессов коэволюции растений и микроорганизмов, а также для создания хозяйственно-ценных надорганизменных комплексов. Используя модель бобово-ризобиального симбиоза, мы исследовали связь филогении растений со специфичностью, проявляемой ими при взаимодействии с бактериями. Оказалось, что специфичность, проявляемая бобовыми при образовании клубеньков, коррелирует с таксономическим делением растений, тогда как для специфичности, проявляемой при образовании эффективного (N2-фиксирующего) симбиоза, такой корреляции не обнаружено. Это показывает, что способность индуцировать и поддерживать азотфиксирующую активность у находящихся в клубеньках ризобий представляет собой эволюционно более лабильный признак растений, чем само образование клубеньков, и что генетические механизмы эволюции этих признаков существенно различаются. Данный вывод подтвердился при изучении симбиотических признаков у культурных бобовых, которое мы проводили, исходя из того, что окультуривание и селекция растений являются важнейшими факторами их эволюции, которые по своей формообразующей активности не уступают природным эволюционным факторам (Вавилов, 1935; Жуковский, 1950). Анализ полученных данных показал, что при доместикации и селекции бобовых происходило существенное снижение эффективности азотфиксирующих симбиозов, наблюдаемое на фоне сохранения растениями способности к образованию клубеньков. Это снижение определяется, в первую очередь, интенсивным использованием азотных удобрений, которое привело к авто-селекции растений, у которых баланс между симбиотрофным и автотрофным типами азотного питания сдвинут в пользу второго типа. На биохимическом уровне снижение симбиотической активности бобовых растений может быть связано с повышением чувствительности азотфиксирующей системы к ингибированию азотными соединениями, например, накапливающимися в клубеньках продуктами N2-фиксации. Определенную роль в снижении симбиотической активности растений могла сыграть селекция на повышение регенерационной активности, а также содержания в семенах С-соединений (крахмала, жиров), которое у некоторых бобовых (маш, арахис) проявляет отрицательную корреляцию с симбиотической активностью. Очевидно, что восстановление и преумножение симбиотического потенциала, утраченного бобовыми в ходе сельскохозяйственной деятельности человека, является одной из первоочередных задач селекции и генетической инженерии растений. Для оценки потенциала изменчивости азотфиксирующих симбиотических систем, который может быть использован для решения этой задачи, мы изучили генетический полиморфизм симбиозов, образуемых рядом бобовых растений с ризобиями (люцерна, донник и пажитник - с Sinorhizobium meliloti, горох - с Rhizobium leguminosarum bv. viceae). Оказалось, что основные признаки, характеризующие проявление мутуализма - N2-фиксирующая (нитрогеназная) активность и симбиотическая эффективность (влияние инокуляции бактериями на биологическую продуктивность растений) - существенно различаются по закономерностям своего варьирования, что может быть связано с разным генетическим контролем этих признаков. Отбор ризобий на повышение нитрогеназной активности обычно сопровождается более существенным ростом количества азота, чем биомассы растений, что может быть связано с их неспособностью к полной передаче фиксированного азота из корней и клубеньков в надземные органы. Связь между показателями азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности обычно не выявляется при сопоставлении генетически разнородных сортов бобовых, однако может быть достаточно четкой при анализе более однородного материала (например, индивидуальных растений внутри сортов или же линий, полученных из одного сорта). Селекция растений на повышение симбиотической эффективности может проводиться путем экспресс-анализа нитрогеназной активности Уацетиленовым методомФ, что было подтверждено нами в опытах с козлятником восточным, у которого путем отбора по нитрогеназной активности получены формы, способные развивать повышенную продуктивность при инокуляции ризобиями. Ранее аналогичные результаты были получены на горохе (Тихонович и др., 1987), у которого повышение биомассы выявлено при достоверном, но умеренном (на 30-40%) увеличении нитрогеназной (C2Н2 - редуктазной) активности, тогда как ее резкое (в 5-раз) возрастание может приводить к снижению массы растений, связанному с перерасходом энергии. По-видимому, повышение эффективности симбиоза требует отбора не только на повышение интенсивности работы нитрогеназы, но и на оптимизацию широкого комплекса признаков, связанных с ассимиляцией азота, снабжением симбиотического аппарата углеродом и энергией, а возможно также с процессами узнавания и сигнального взаимодействия партнеров. Полученные данные позволили выявить сопряженную изменчивость растений и микроорганизмов по ключевым показателям активности симбиоза, которая говорит о тесно скоординированной эволюции растений и микроорганизмов. Для ее изучения мы создали и проанализировали экспериментальные и математические модели, которые позволили нам исследовать связь эффективности мутуалистического симбиоза с его специфичностью и с уровнем полиморфизма партнеров. Анализ взаимодействия разных сортов растений и штаммов бактерий показал, что высокая эффективность (которую оценивали на основе биомассы растений или накопления в них азота) характерна для тех бобоворизобиальных систем, у которых в наибольшей степени проявляется специфичность взаимодействия партнеров (неаддитивные генетические эффекты, выявляемые при двухфакторном дисперсионном анализе). На основании этих данных, а также анализа динамики симбиотических признаков при окультуривании растений, мы сформулировали основные принципы координированной селекции партнеров на повышение симбиотической активности, которые заключаются в необходимости: 1) максимально широкого использования дикорастущих и мало окультуренных форм бобовых, в полном объёме сохранивших природный симбиотический потенциал, 2) подбора комплементарных сочетаний генотипов партнеров, оптимальных для эффективного симбиоза. Использование обоих подходов наиболее результативно при снижении популяционной изменчивости растений до уровня, который обеспечивает возможность подбора штаммов бактерий, специфичных для всего спектра имеющихся в сорте генотипов. С целью анализа популяционно-генетических механизмов коэволюции растений и микроорганизмов в системах мутуализма мы разработали методику математического моделирования популяционной динамики бобово-ризобиального симбиоза, реализуемой при действии микроэволюционных факторов (различные формы естественного отбора и генетикоавтоматические процессы), которые индуцируются при развитии клубеньков. В основу построения и анализа моделей было положено представление о растении-хозяине как о ведущем факторе эволюции симбиотических микроорганизмов, поскольку в системе Ухозяин-средаФ микросимбионты претерпевают регулярную смену экологических ниш (у ризобий она осуществляется по схеме УпочваризосфераклубенькипочваФ), в ходе которой происходят закономерные преобразования пространственной и генетической структуры микробных популяций. Построенные модели позволили нам приступить к изучению действия в симбиотических системах естественного отбора, которое исследовано гораздо менее полно, чем молекулярные механизмы эволюции симбиоза. Результаты компьютерных экспериментов позволили предположить, что одним из основных факторов эволюции симбиотических признаков ризобий является частотно-зависимый отбор, индуцируемый в почвенных или ризосферных популяциях при конкуренции за формирование клубеньков. Мы показали, что этот отбор может определять основные свойства популяций ризобий - их повышенную, по сравнению со свободноживущими бактериями, генетическую гетерогенность и панмиктичность. На основе построенных моделей была предложена обобщенная схема формирования ризобиальных популяций, в соответствии с которой их панмиктическая структура устанавливается в тесной связи с поддержанием сбалансированного (УэкотипическогоФ) полиморфизма по способности вступать в симбиоз с растениями. При изучении механизмов, направляющих эволюцию симбиоза на повышение эффективности мутуализма, мы исходили из того, что ключевую роль в этом повышении играют положительные обратные связи, которые основаны на обмене партнеров продуктами азотфиксации и фотосинтеза. Результаты проведенных нами компьютерных экспериментов показали, что закрепление или даже доминирование в популяции ризобий N2-фиксирующих Уистинных мутуалистовФ, которое происходит, несмотря на присутствие не фиксирующих N2, но вирулентных УсимбионтовобманщиковФ, может быть обеспечено положительной обратной связью партнеров в сочетании с частотно-зависимым отбором. Метаболические обратные связи партнеров индуцируют их популяционные обратные связи, обеспечивающие коэволюцию растений и бактерий на повышение эффективности симбиоза. Анализ наших моделей позволил объяснить многие важные закономерности, выявленные при эмпирическом изучении бобоворизобиальных систем, а также предложить эволюционно обоснованные подходы для их генетического улучшения. Использование модели мультиштаммовой конкуренции показало, что, корреляция эффективности и специфичности симбиоза может быть обусловлена тем, что при взаимодействии полиморфных популяций партнеров интенсивность отбора в пользу специфичных штаммов ризобий, образующих азотфиксирующие клубеньки лишь с некоторыми имеющимися растительными генотипами, выше, чем интенсивность отбора в пользу неспецифичных штаммов, которые образуют азотфиксирующие клубеньки со всеми растительными генотипами. Однако высокая эффективность симбиоза не может быть достигнута в отсутствии неспецифичных мутуалистов, которые обеспечивают оптимальную конфигурацию процессов отбора на повышение общей продуктивности системы и, по-видимому, поддерживаются в ней благодаря групповым формам отбора. Представленные результаты могут и должны быть использованы в генетико-селекционных программах создания сортов растений и комплементарных им бактериальных штаммов, сочетание которых обеспечивает высокую эффективность мутуализма в условиях конкуренции высокоэффективных производственных штаммов ризобий с неэффективными местными штаммами. При организации этой работы необходимо исходить из того, что в системах симбиоза обычно устанавливается равновесие между генотипами микросимбионтов, различающихся по характеру взаимодействия с хозяином (Уистинные мутуалистыФ и УсимбионтыобманщикиФ в системах трофического симбиоза; патогенные и биоконтрольные организмы в системах защитного симбиоза). Однако положение этого равновесия может быть существенно изменено в пользу полезных для хозяина форм благодаря отбору, происходящему в его популяциях и определяемого положительными обратными связями партнеров. В природных условиях установление этого равновесия является результатом длительного коэволюционного процесса, который в условиях агроценоза может быть существенно ускорен благодаря использованию методов селекции, генной инженерии и биотехнологии. Очевидно, что для Уискусственной эволюцииФ симбиоза необходим синтез знаний о генетике, молекулярной биологии, морфо-физиологической организации и экологии симбиоза, который не представляется возможным без использования эволюционных подходов. Поддержание в бобово-ризобиальных системах равновесия различных типов симбионтов показывает, что в популяциях партнеров действуют селективные факторы, направленные как на повышение, так и на снижение азотфиксирующей активности (Foster, Kokko, 2006), и следовательно в геномах бактерий должны существовать гены, функционирование которых обеспечивает как высокую, так и низкую интенсивность азотфиксации. Выявление генов обеих групп представляет большой интерес для конструирования хозяйственно-ценных штаммов ризобий, которое может быть связано как с усилением активности генов первой категории, так и элиминацией генов второй категории. Генетические модификации обоих типов описаны в литературе (Bosworth et al., 1992; Sharypova et al., 1998), и в сочетании с формированием оптимальной генетической структуры симбиосистемы эти модификации могут обеспечить существенное возрастание агрономической эффективности микробнорастительных симбиозов. Использование метода факторного анализа может оказаться полезным для оценки фенотипического проявления созданных генетических конструкций, которая затруднена влиянием растительного генотипа и неконтролируемых факторов среды на экспрессию бактериальных генов (разд. 2.1.2). Другой практически значимый аспект предложенной модели заключается в оценке эколого-генетических последствий интродукции в агроценозы генетически модифицированных растительных симбионтов. Распространение новых конструкций, содержащих гены симбиоза, среди местных бактерий создает риск возникновения рекомбинантов с непредсказуемыми инфекционными свойствами (Dresing et al., 1998; Selbitzska et al., 2006), для снижения которого предлагалось вводить в модифицированные штаммы ризобий факторы, подавляющие либо их рекомбинационную активность, либо выживаемость в почве. Анализ нашей модели показал, что эти меры будут эффективными лишь на фоне низкого давления ЧЗО, который вызывает размножение редких, в том числе и рекомбинантных генотипов (Проворов, Воробьев, 2003). Снижение давления ЧЗО может быть достигнуто путем селекции растений-хозяев, генотипы которых существенно влияют на параметр УаФ нелинейной модели конкуренции, определяющий давление ЧЗО (формула 3). Еще более радикальный подход для снижения нежелательных эффектов ЧЗО заключается в регуляции циклической микроэволюции бактерий, например, в использовании севооборотов, УразрывающихФ этот процесс. Завершая анализ представленных данных, отметим, что он подводит нас к необходимости изучения мутуалистического симбиоза как генетически интегрированной системы, целостность которой проявляется не только на организменном уровне (координация биохимических и онтогенетических процессов, осуществляемых партнерами под действием перекрестно передаваемых сигналов, регулирующих активность УсимбиотическихФ генов), но и на популяционном уровне (сопряженное действие в популяциях партнеров ключевых микроэволюционных факторов, в первую очередь, специфичных для симбиоза форм отбора). Наибольшая эффективность симбиоза достигается при поддержании в нем различных типов бактерий-мутуалистов, вне зависимости от их индивидуальной селективной ценности. Изучение генетико-эволюционной целостности мутуалистических симбиозов является важным условием для выяснения механизмов природной ко-эволюции партнеров, а также для использования полученных знаний в селекционной, генно-инженерной и биотехнологической практике. ВЫВОДЫ 1. Показано, что у бобовых растений, относящихся к группам перекрестной инокуляции люцерны (Medicago, Melilotus, Trigonella) и вики (Vicia), корреляция таксономического деления со специфичностью симбиозов, образуемых с клубеньковыми бактериями (Sinorhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum bv. viceae), отсутствует на уровне формирования эффективного (N2-фиксирующего) симбиоза, хотя проявляется на уровне развития клубеньков. 2. Установлено, что у люцерны (Medicago sativa, M. varia, M. falcata) и пажитника (Trigonella foenum graecum) дикорастущие и мало окультуренные формы существенно превосходят сорта по интенсивности образования клубеньков и N2-фиксирующей активности. Дикорастущие и мало окультуренные виды бобовых растений превосходят высоко окультуренные виды по активности симбиотрофного питания азотом. 3. Показано, что генетический полиморфизм бобово-ризобиальных систем по N2-фиксирующей активности и симбиотической эффективности, проявляемой со стороны растений-хозяев (люцерна, донник, пажитник, горох, козлятник) и их микросимбионтов, характеризуется разными параметрами, что говорит о различном генетическом контроле этих признаков. 4. Двухфакторный дисперсионный анализ варьирования показателей эффективности симбиозов (УSinorhizobium meliloti - люцернаФ, УRhizobium leguminosarum bv. viceae - викаФ) показал, что их наибольшая эффективность достигается при высокой комплементарности генотипов партнеров, когда вклад специфичных (неаддитивных) сорто-штаммовых взаимодействий в варьирование признаков симбиоза максимален. Эффективность симбиоза контролируется генотипами хозяев более строго, чем генотипами микросимбионтов, тогда как нитрогеназная активность в равной степени зависит от генотипов партнеров. 5. Сформулированы основные принципы координированной селекции растений и бактерий на повышение симбиотической активности: 1) максимально широкое использование дикорастущих и мало окультуренных форм растений, сохранивших природный симбиотический потенциал; 2) подбор комплементарных сочетаний генотипов партнеров, оптимальных для эффективного симбиоза. Использование обоих подходов наиболее результативно при снижении популяционной изменчивости бобовых до уровня, который обеспечивает возможность подбора штаммов бактерий, специфичных для всего спектра генотипов, имеющихся в сортовых популяциях. 6. Разработана методика моделирования циклических микроэволюционных процессов в популяциях микроорганизмов, взаимодействующих с растениями, которая позволяет представить преобразования пространственной и генетической структуры микробных популяций как составную часть онтогенеза симбиотической системы, связанную с обменом партнеров продуктами азотфиксации и фотосинтеза. Показана ключевая роль частотно-зависимого отбора в формировании экотипически полиморфных, панмиктичных популяций симбиотических бактерий. 7. Предложена обобщенная схема микроэволюции симбиотической бобово-ризобиальной системы, в соответствии с которой закрепление новых генотипов в популяциях микросимбионтов соответствует стратегии Уутраты-приобретенияФ sym-генов, осуществляемой под действием селективных факторов, индуцируемых хозяином. Показана важная роль асимбиотических штаммов, являющихся оптимальными реципиентами для переносимых sym-генов, в формировании эволюционно перспективной (высоко полиморфной, панмиктичной) структуры ризобиальных популяций. 8. Показано, что эволюция симбиотических бактерий происходит под влиянием положительных обратных метаболических связей с растением, которые индуцируют в бактериальной популяции селективные давления в пользу признаков мутуализма. В генетически полиморфных системах давление отбора в пользу специфичных симбионтов (фиксирующих N2 в симбиозе лишь с некоторыми из имеющихся растительных генотипов) выше, чем в пользу неспецифичных симбионтов (фиксирующих N2 со всеми растительными генотипами). Однако, наиболее высокая эффективность симбиотической системы достигается при поддержании в ней различных типов бактерий-мутуалистов. Основные труды по материалам диссертации 1. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Взаимодействие растений пажитника греческого (Trigonella foenum-graecum L.) с клубеньковыми бактериями люцерны // С.-х. биология. 1984а. Т. 19. № 6. C. 75-77. 2. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Специфичность взаимодействия клубеньковых бактерий люцерны с разными видами растений-хозяев // С.-х. биология. 1984б. Т. 19. № 7. С. 70-74. 3. Проворов Н.А., Симаров Б.В., Федоров С.Н. Влияние мутаций ауксотрофности и устойчивости к антибиотикам на симбиотические свойства клубеньковых бактерий // Изв. АН СССР, сер. биол. 1984. № 3. С. 337352. 4. Аронштам А.А., Баженова О.В., Зарецкая А.Н., Кучко В.В., Новикова Н.И., Проворов Н.А., Федоров С.Н., Фокина И.Г., Чернова Т.А. Генетические методы селекции клубеньковых бактерий (методические рекомендации). Под ред. Б.В. Симарова. Л., ВНИИСХМ, 1984. 37 с. 5. Проворов Н.А. Специфичность взаимодействия клубеньковых бактерий с бобовыми растениями и эволюция бобово-ризобиального симбиоза // С.-х. биология. 1985. Т. 20. № 3. С. 34-46. 6. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Наследование способности к симбиозу с Rhizobium meliloti в автофертильном потомстве пажитника греческого (Trigonella foenum-graecum L.) // С.-х. биология. 1985. Т. 20. № 11. С. 60-61. 7. Проворов Н.А., Симаров Б.В., Федоров С.Н. Симбиотические свойства разных типов мутантов клубеньковых бактерий // Изв. АН СССР, сер. биол. 1985. № 6. С. 870-884. 8. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Эффективность симбиоза пажитника греческого с Rhizobium meliloti // С.-х. биология. 1986а. Т. 21. № 6. С. 105107. 9. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Внутрисортовая изменчивость люцерны по активности симбиоза с Rhizobium meliloti // С.-х. биология. 1986б. Т. 21. № 12. С. 37-41. 10. Проворов Н.А. Коэволюция растений с симбиотическими и паразитическими микроорганизмами: сравнительный анализ // Миколог. фитопатол. 1987. Т. 21. № 2. С. 191. 11. Проворов Н.А., Морозова Т.Т., Байрамов С.С., Абдуллаев А.Ф., Симаров Б.В. Различия между индийским и средиземноморским подвидами пажитника греческого по способности к симбиозу с Rhizobium meliloti // Бюлл. ВНИИСХМ. 1987а. № 48. С. 33-36. 12. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Генетический контроль хозяйской специфичности клубеньковых бактерий // Успехи соврем. генетики. 1987. Т. 14. С. 90-114. 13. Проворов Н.А., Симаров Б.В., Зарецкая А.Н., Федоров С.Н., Кирносов М.М., Иванов А.И. Изменчивость культурных видов люцерны по способности к симбиотической азотфиксации // С.-х. биология. 1987б. Т. 22. № 6. С. 29-32. 14. Проворов Н.А., Шарыпова Л.А., Фокина И.Г., Симаров Б.В. Организация генов, контролирующих симбиотическую активность клубеньковых бактерий // С.-х. биология. 1987в. Т. 22. № 10. С. 63-75. 15. Проворов Н.А., Федоров С.Н., Симаров Б.В. Зависимость симбиотической активности клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) от метеорологических факторов // Труды ВНИИСХМ. 1989. Т. 59. С. 45-52. 16. Симаров Б.В., Аронштам А.А., Новикова Н.И., Шарыпова Л.А., Баженова О.В., Проворов Н.А. Генетические основы селекции клубеньковых бактерий. Л., Агропромиздат, 1990. 192 с. 17. Проворов Н.А., Аронштам А.А. Генетика симбиотической азотфиксации у клубеньковых бактерий // Итоги науки и техники, сер. микробиология (ВИНИТИ). 1991. Т. 23. С. 3-97. 18. Проворов Н.А. Происхождение и эволюция бобоворизобиального симбиоза // Изв. АН СССР, сер. биол. 1991. № 1. C. 77-87. 19. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Генетический полиморфизм бобовых культур по способности к симбиозу с клубеньковыми бактериями // Генетика. 1992. Т. 28. № 6. С. 5-14. 20. Проворов Н.А. Взаимосвязь между таксономией бобовых и специфичностью их взаимодействия с клубеньковыми бактериями // Ботанич. журнал. 1992. Т. 77. № 8. С. 21-32. 21. Новикова А.Т., Князева В.Л., Кожемяков А.П., Лазарева Н.М., Проворов Н.А., Орищенко Н.Г. Штамм бактерий Rhizobium meliloti для производства удобрения под пажитник. Патент СССР №1806124 от 09.10. 1992 г. 22. Сосков Ю.Д., Проворов Н.А., Байрамов С.С. Активность симбиоза Trigonella foenum-graecum L. с Rhizobium meliloti // Растит. ресурсы. 1992. Т. 28. № 4. С. 94-98. 23. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Пути использования адаптивного потенциала систем "растение-микроорганизм" для конструирования высокопродуктивных агрофитоценозов // С.-х. биология. 1993. № 5. С. 36-46. 24. Николаев Б.П., Проворов Н.А., Симаров Б.В., Шляков А.М. Исследование превращений фосфатов у свободноживущих и симбиотических форм клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) методом 31-Р-ЯМР спектроскопии // Микробиология. 1994. Т. 63. № 1. С. 29-37. 25. Квасова Э.В., Проворов Н.А., Симаров Б.В., Серина О.И., Сметанин Н.И., Шумный В.К. Варьирование симбиотических признаков люцерны при инбридинге // С.-х. биология. 1994. № 5. С. 64-68. 26. Танривердиев Т.А., Проворов Н.А., Логинов Ю.П., Симаров Б.В. Биохимический состав люцерны при образовании эффективного симбиоза с Rhizobium meliloti // Физиол. биохим. культурных растений. 1994. Т. 26. № 2. С. 170-174. 27. Проворов Н.А., Кирносов М.М., Грушин А.А., Симаров Б.В. Действие инокуляции Rhizobium meliloti на урожайность и биохимические показатели люцерны // Физиол. биохим. культурных растений. 1994а. Т. 26. № 3. С. 281-288. 28. Проворов Н.А., Джординг Д., Энгелке Т., Пюлер А. Повышение симбиотической эффективности клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) при введении дополнительных копий dct-генов, контролирующих транспорт дикарбоновых кислот // Генетика. 1994б. Т. (приложение). С. 127. 29. Проворов Н.А., Кругова Е.Д., Белозерова О.И., Крымская О.Н., Цымбал А.С., Старченков Е.П., Симаров Б.В. Проявление симбиотической активности в присутствии минерального азота у высокоэффективных штаммов Rhizobium meliloti, полученных с помощью генетических методов // Физиол. биохим. культурных растений. 1994в. Т. 26. № 3. С. 268-274. 30. Фесенко А.Н., Проворов Н.А., Орлова И.Ф., Симаров Б.В. Роль генотипа сорта гороха (Pisum sativum L.) и штамма Rhizobium leguminosarum в определении эффективности образуемого симбиоза // Генетика. 1994. Т. 30. № 6. С. 823-827. 31. Курчак О.Н., Проворов Н.А. Отзывчивость вики мохнатой (Vicia villosa Roth) и вики посевной (Vicia sativa L.) на инокуляцию ризобиями и на внесение карбамида // Физиол. растений. 1995. Т. 42. № 3. С. 484-490. 32. Курчак О.Н., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Эффективность симбиоза с клубеньковыми бактериями у различных видов рода Vicia L. // Растит. ресурсы. 1995. Т. 31. № 1. С. 88-93. 33. Проворов Н.А., Березко А.М., Магомедова Л.А., Курмагомедов М.К., Магомердмирзаев М.М., Симаров Б.В. Способность дикорастущих видов Medicago L. и Melilotus officinalis (L.) Pall, распространенных в Дагестане, к симбиозу с Rhizobium meliloti // Растит. ресурсы. 1995. Т. 31. № 2. С. 60-67. 34. Танривердиев Т.А., Проворов Н.А., Логинов Ю.П., Симаров Б.В. Отзывчивость сортов люцерны на инокуляцию Rhizobium meliloti в условиях северной лесостепи Тюменской области // Сибирский вестник с.-х. науки. 1995. № 1-2. С. 29-33. 35. Метлицкая Е.Н., Проворов Н.А., Симаров Б.В., Райг Х.А. Создание популяций козлятника восточного, различающихся интенсивностью развития и продуктивностью, путем селекции растений по нитрогеназной активности // Докл. РАСХН. 1995. № 6. С. 7-9. 36. Орлов В.П., Фесенко А.Н., Орлова И.Ф., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Симбиотическая эффективность клубеньковых бактерий гороха в полевых условиях // С.-х. биология. 1995. № 5. С. 85-88. 37. Фесенко А.Н., Орлова И.Ф., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Изучение симбиотических свойств клубеньковых бактерий гороха в вегетационных опытах // Докл. РАСХН. 1995. № 3. С. 24-26. 38. Курчак О.Н., Проворов Н.А., Лисова Н.Е., Галан М.С., Симаров Б.В. Отзывчивость видов и сортов вики на инокуляцию высокоэффективными штаммами Rhizobium leguminosarum bv. viceae // Физиол. биохим. культурных растений. 1995. Т. 27. № 5-6. С. 351-358. 39. Проворов Н.А. Коэволюция бобовых растений и клубеньковых бактерий: таксономические и генетические аспекты // Журн. общ. биологии. 1996а. Т. 57. № 2. С. 52-78. 40. Проворов Н.А. Соотношение симбиотрофного и автотрофного питания азотом у бобовых растений: генетико-селекционные аспекты // Физиология растений. 1996б. Т. 43. № 1. С. 127-135. 41. Проворов Н.А. Перспективы использования популяций некоторых видов семейства Fabaceae в селекции на повышение интенсивности симбиотической азотфиксации // Растит. ресурсы. 1996в. Т. 32. № 3. С. 124-134. 42. Проворов Н.А. Эволюция генетических систем симбиоза у клубеньковых бактерий // Генетика. 1996г. Т. 32. № 8. С. 1029-1040. 43. Шабаев В.П., Смолин В.Ю., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Влияние различных штаммов Rhizobium meliloti на массу люцерны и накопление азота растениями на фоне минерального азота // Изв. РАН, сер. биол. 1996. № 3. С. 351-358. 44. Фесенко А.Н., Орлова И.Ф., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Использование прямых и косвенных методов для оценки конкурентоспособности клубеньковых бактерий гороха // Приклад. биохим. микробиол. 1996. Т. 32. № 3. С. 352-355. 45. Саимназаров Ю.Б., Бахромов И.У., Пулатова Д.З., Проворов Н.А. Биохимические показатели семян маша и арахиса при взаимодействии с клубеньковыми бактериями // Физиол. биохим. культ. раст. 1997. Т. 29. № 6. С. 450-454. 46. Метлицкая Е.Н., Проворов Н.А., Райг Х.А., Симаров Б.В. Способ отбора бобовых растений на хозяйственно-ценные признаки. Патент РФ №2083089 от 10.06.1997. 47. Пулатова Д.З., Саимназаров Ю.Б., Бахромов И.У., Кожемяков А.П., Проворов Н.А. Подбор штаммов клубеньковых бактерий, образующих эффективный симбиоз с арахисом в условиях Средней Азии // Докл. РАСХН. 1998. № 2. С. 18-20. 48. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Популяционная генетика клубеньковых бактерий: моделирование циклических процессов в микробнорастительных системах // Генетика. 1998а. Т. 34. № 12. С. 1704-1711. 49. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Роль межштаммовой конкуренции в эволюции генетически полиморфных популяций клубеньковых бактерий. Генетика // 1998б. Т. 34. № 12. С. 1712-1719. 50. Тихонович И.А., Проворов Н.А. (ред.). Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. С.-Петербург, Наука. 1998. 194 с. 51. Проворов Н.А. Популяционная генетика клубеньковых бактерий // Журн. общ. биологии. 2000. Т. 61. № 3. С. 229-257. 52. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений. Под ред. С.Г.Инге-Вечтомова. СПб.: Наука. 2000. 539 с. 53. Якоби Л.М., Кукалев А.С., Ушаков К.В., Цыганов В.Е., Наумкина Т.С., Проворов Н.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями // С.-х. биология. 2000. № 3. C. 94-102. 54. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Эволюционная генетика клубеньковых бактерий: молекулярные и популяционные аспекты // Генетика. 2000. Т. 36. № 12. С. 1573-1587. 55. Курчак О.Н., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Плазмида pSym1-Rhizobium leguminosarum bv. viceae, контролирующая азотфиксирующую активность, эффективность симбиоза, конкурентоспособность и кислотоустойчивость // Генетика. 2001. Т. 37. № 9. C. 1225-1232. 56. Онищук О.П., Курчак О.Н., Шарыпова Л.А., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Анализ различных типов конкурентоспособности у Tn5мутантов клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meliloti) // Генетика. 2001. Т. 37. № 11. C. 1507-1512. 57. Проворов Н.А. Генетико-эволюционные основы учения о симбиозе // Журн. общ. биологии. 2001а. Т. 62. № 6. C. 472-495. 58. Проворов Н.А. Актуальные вопросы популяционной генетики бактерий // Успехи соврем. биологии. 2001б. Т. 121. № 6. C. 537-549. 59. Проворов Н.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробамиазотфиксаторами и эндомикоризными грибами // Журн. общ. биологии. 2002. Т. 63. № 6. С. 451-472. 60. Кравченко Л.В., Макарова Н.М., Азарова Т.С., Проворов Н.А., Тихонович И.А. Выделение и фенотипическая характеристика ростстимулирующих ризобактерий (PGPR), сочетающих высокую активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов // Микробиология. 2002. Т. 74. № 4. С. 521-525. 61. Проворов Н.А., Тихонович И.А. Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами // С.-х. биология. 2003. № 3. С. 11-25. 62. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Микроэволюция клубеньковых бактерий при возникновении мутантов с измененной выживаемостью в системе Урастение-почваФ // Генетика. 2003. Т. 39. № 12. С. 1594-1605. 63. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Симбиогенетика микробнорастительных взаимодействий // Экологич. генетика. 2003. Т. 1. № 0. С. 3646. 64. Кожемяков А.П., Проворов Н.А., Завалин А.А., Шотт П.Р. Оценка взаимодействия сортов ячменя и пшеницы с ризосферными ростстимулирующими бактериями на различном азотном фоне // Агрохимия. 2004. № 3. C. 33-40. 65. Румянцева М.Л., Андронов Е.Е., Сагуленко В.В., Онищук О.П., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Нестабильность криптических плазмид у штамма Sinorhizobium meliloti P108 в процессе симбиоза с люцерной Medicago sativa // Генетика. 2004. Т. 40. № 4. С. 454-461. 66. Проворов Н.А., Фокина И.Г., Румянцева М.Л., Симаров Б.В. Перенос Sym-плазмид в симбиотически активные и асимбиотические штаммы ризобий: свойства рекомбинантов и возможные эволюционные последствия // Экологич. генетика. 2004. Т. 2. № 2. С. 29-34. 67. Тихонович И.А., Борисов А.Ю., Цыганов В.Е., Овцына А.О., Долгих Е.А., Проворов Н.А. Интеграция генетических систем растений и микроорганизмов при симбиозе // Успехи соврем. биологии. 2005. Т. 125. № 3. С. 227-238. 68. Проворов Н.А. Молекулярные основы симбиогенной эволюции: от свободноживущих бактерий к органеллам // Журн. общ. биологии. 2005. Т. 66. № 5. C. 371-388. 69. Воробьев Н.И., Проворов Н.А. Действие Дарвиновского и частотно-зависимого отбора при формировании бактериальной популяции в системе Ухозяин-средаФ // Экологич. генетика. 2005. Т. 3. № 3. С. 3-11. 70. Проворов Н.А., Долгих Е.А. Метаболическая интеграция организмов в системах симбиоза // Журн. общ. биологии. 2006. Т. 67. № 6. C. 403-422. 71. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем // Успехи соврем. биологии. 2007. Т. 127. № 4. С. 339-357. 72. Проворов Н.А., Мыльников С.В. Генетические механизмы индивидуальных и кооперативных адаптаций // Экологич. генетика. 2007. Т. 5. № 1. С. 23-30. 73. Юрков А.П., Якоби Л.М., Степанова Г.В., Дзюбенко Н.И., Проворов Н.А., Кожемяков А.П., Завалин А.А. Эффективность инокуляции грибом Glomus intraradices и внутрипопуляционная изменчивость растений люцерны хмелевидной по показателям продуктивности и микоризообразования // С.-х. биология. 2007. № 5. С. 67-74. 74. Проворов Н.А., Воробьев Н.И., Андронов Е.Е. Макро- и микроэволюция бактерий в системах симбиоза // Генетика. 2008. Т. 44. № 1. С. 12-28. 75. Воробьев Н.И., Проворов Н.А. Моделирование эволюции бобово-ризобиального симбиоза при мульти-штаммовой конкуренции бактерий за инокуляцию симбиотических ниш // Экологич. генетика. 2008. Т. 6. № 4. С. 3-11. 76. Проворов Н.А. Растительно-микробные симбиозы как эволюционный континуум // Журн. общ. биологии. 2009. Т. 70. № 1. С. 10-34. 77. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Моделирование ко-эволюции бактерий и растений в системе мутуалистического симбиоза // Генетика. 2009. Т. 45. № 5. С. 581-594. 78. Онищук О.П., Румянцева М.Л., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Изменчивость штаммов Sinorhizobium meliloti по признакам, определяющим сапрофитную выживаемость и симбиотическую эффективность в условиях засоления // С.-х. биология. 2009. №1. С. 77-82. 79. Онищук О.П., Воробьев Н.И., Проворов Н.А. Симаров Б.В. Симбиотическая активность ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) с генетическими модификациями системы транспорта дикарбоновых кислот // Экологич. генетика. 2009. Т. 7. № 2. С. 3-10. 80. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего. Изд-во СПбГУ, Санкт-Петербург, 2009. 210 с. 81. Provorov N.A., Simarov B.V. Genetic variation in alfalfa, sweet clover and fenugreek for the activity of symbiosis with Rhizobium meliloti // Plant Breeding. 1990. V. 105. N 3. P. 300-310. 82. Provorov N.A. The interdependence between taxonomy of legumes and specificity of their interaction with rhizobia in relation to evolution of the symbiosis // Symbiosis. 1994. V. 17. N 2/3. P. 183-200. 83. Provorov N.A., Saimnazarov U.B., Tanriverdiev T.A., Simarov B.V. The contributions of plant and bacteria genotypes in the growth and nitrogen accumulation in inoculated alfalfa // Plant and Soil. 1994. V. 164. N 2. P. 213-219. 84. Fesenko A.N., Provorov N.A., Orlova I.F., Orlov V.P., Simarov B.V. Selection of Rhizobium leguminosarum bv. viceae strains for inoculation of Pisum sativum L. cultivars: analysis of symbiotic efficiency and nodulation competitiveness // Plant and Soil. 1995. V. 172. N 2. P. 189-198. 85. Provorov N.A., Soskov Y.D., Lutova L.A., Sokolova O.A., Bairamov S.S. Investigation of the fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) genotypes for fresh weight, seed productivity, symbiotic activity, callus formation and accumulation of steroids // Euphytica. 1996. V. 88. N 2. P. 129-138. 86. Provorov N.A. Coevolution of rhizobia with legumes: facts and hypotheses // Symbiosis. 1998. V. 24. N 3. P. 337-367. 87. Provorov N.A., Saimnazarov U.B., Bahromov I.U., Pulatova D.Z., Kozhemyakov A.P., Kurbanov G.A. Effect of rhizobia inoculation on the seed (herbage) production of mungbean (Phaseolus aureus Roxb.) grown at Uzbekistan // J. Arid Environments. 1998. V. 39. N 4. P. 569-575. 88. Provorov N.A., Vorobyov N.I. Population genetics of rhizobia: construction and analysis of an Уinfection and releaseФ model // J. Theor. Biol. 2000. V. 205. N 1. P. 105-119. 89. Kurchak O.P., Galan M.S., Orlova O.V., Provorov N.A., Simarov B.V. A potential for symbiotic nitrogen fixation in hairy vetch (Vicia villosa Roth) as compared with common vetch (Vicia sativa L.). In: Provorov N.A., Tikhonovich I.A., Veronesi F. (eds.). New approaches and techniques in breeding sustainable fodder crops and amenity grasses. Proc. 22-nd EUCARPIA Fodder Crops and Amenity Grasses Section Meeting St.-Petersburg, Russia. N.I.Vavilov All-Russia Research Institute of Plant IndustryФ. 2000. P. 151-155. 90. Provorov N.A., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Developmental genetics and evolution of symbiotic structures in nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycorrhiza // J. Theor. Biol. 2002. V. 214. N 2. P. 215-232. 91. Provorov N.A., Tikhonovich I.A. Genetic resources for improving nitrogen fixation in legume-rhizobia symbiosis // Genet. Res. Crop Evolut. 2003. V 50. N 1. P. 89-99. 92. Provorov N.A., Vorobyov N.I. Interplay of Darwinian and frequencydependent selection in the host-associated microbial populations // Theor. Population Biol. 2006. V. 70. N. 3. P. 262-272. 93. Tikhonovich I.A., Provorov N.A. Cooperation of plants and microorganisms: getting closer to the genetic construction of sustainable agro-systems // Biotechnology J. 2007. V. 2. N 7. P. 833-848. 94. Tikhonovich, I.A., Provorov, N.A. Beneficial plant-microbe interactions. In Y.T. Dyakov, V. Dzhavakhiya, T. Korpela (Eds.). Comprehensive and Molecular Phytopathology. Amsterdam. Elsevier. 2007. P. 365-420. 95. Provorov N.A., Vorobyov N.I. Simulation of plant-bacteria coevolution in the mutually beneficial symbiosis // Ecological Genetics. 2008. V. 6. N 2. P. 35-48. 96. Tikhonovich I.A., Provorov N.A. Molecular strategies and agronomic impacts of plant-microbe symbioses // Ecological Genetics. 2008. V. 6. N 2. P. 49-60. 97. Provorov N.A., Vorobyov N.I. Evolution of symbiotic bacteria in Уplant-soilФ systems: interplay of molecular and population mechanisms. In: Progress in Environmental Microbiology. Ed. Kim M.-B. Nova Science Publishers, Inc. New York, 2008a. P. 11-67. 98. Provorov N.A., Vorobyov N.I. Equilibrium between the Уgenuine mutualistsФ and Уsymbiotic cheatersФ in the bacterial population co-evolving with plants in a facultative symbiosis // Theor. Population Biol. 2008b. V. 74. N. 4. P. 345-355. 99. Tikhonovich I.A., Provorov N.A. From plant-microbe interactions to symbiogenetics: a universal paradigm for the inter-species genetic integration // Ann. Applied Biology. 2009. V. 154. N 3. P. 341-350. Список цитированной литературы 1. Вавилов Н.И. Селекция как наука // Теоретич. основы селекции. Т. 1. Общая селекция растений. М.; Л., 1935. С. 1-14. 2. Дарвин Ч. Происхождение видов путем естественного отбора. СПб.: Наука, 1991. 539 c. 3. Доросинский Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л.: Колос, 1970. 191 с. 4. Доспехов Б.А. Планирование полевого опыта и статистическая обработка его данных. М.: Колос, 1972. 336 с. 5. Дубров А.М., Мхитарян В.С., Трошин Л.И. Многомерные статистические методы. М.: Финансы и статистика, 1998. 352 с. 6. Жуковский П.М. Культурные растения и их дикие сородичи. М.: Советская Наука, 1950. 595 с. 7. Иванов А.И. Люцерна. М.: Колос, 1980. 349 с. 8. Инге-Вечтомов С.Г. Экологическая генетика: теория и практика // Исследования по генетике. 1999. Вып. 12. С. 3-10. 9. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352 с. 10. Меттлер Л., Грегг Т. Генетика популяций и эволюция. М.: Мир, 1972. 323 с. 11. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М.: Наука, 1973. 240 с. 12. Овцына А.О., Тихонович И.А. Структура, функции и возможность практического применения сигнальных молекул, инициирующих развитие бобово-ризобиального симбиоза // Эколог. генетика. 2004. Т. 2. № 3. С. 14-24. 13. Синская Е.Н. Пажитник - Trigonella L. // Культурная флора СССР. Т. 13. Вып. 1, М.; Л., 1950. С. 503-516. 14. Сосков Ю.Д., Байрамов С.С. Подвиды пажитника сенного // Научно-технич. бюлл. ВИР. 1990. Вып. 198. С. 23-26. 15. Тихонович И.А. Генетический контроль симбиотической азотфиксации у гороха. Автореф. дисЕ докт. биол. наук. Л.: ВНИИСХМ, 1991. 36 с. 16. Тихонович И.А., Алисова С.М., Четкова С.А., Берестецкий О.А. Повышение эффективности азотфиксации путем отбора линий гороха по активности нитрогеназы // С.-х. биология. 1987. № 2. C. 29-34. 17. Федоров С.Н., Симаров Б.В. Получение мутантов с измененными симбиотическими свойствами у Rhizobium meliloti под действием УФлучей // С.-х. биология. 1987. № 9. С. 44-49. 18. Федоров С.Н., Фокина И.Г. Симаров Б.В. Оценка симбиотических свойств клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) в лабораторных условиях // С.-х. биология. 1986. № 1. С. 112-118. 19. Amarger N., Lobreau J.P. Quantitative study of nodulation competitiveness in Rhizobium strains // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 44. P. 583588. 20. Bever J.D., Simms E.L. Evolution of nitrogen fixation in spatially structured populations of Rhizobium // Heredity. 2000. V. 85. P. 366-372. 21. Bosworth A.H., Williams M.K., Albrecht K.A., Kwiatkowski R., Beynon J., Hankinson T.R., Ronson C.W., Cannon F., Wacek T.J., Triplett E.W. Alfalfa yield response to inoculation with recombinant strains of Rhizobium meliloti with an extra copy of dctABD and/or modified nifA expression // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 60. P. 3815-3822. 22. Brewin N.J. Plant cell wall remodeling in the Rhizobium-legume symbiosis // Crit. Rev. Plant. Sci. 2004. V. 23. P. 1-24. 23. de Bary A. Die Erscheinung der Symbiose. Strassburg: Verlag Von Karl Trbner. 1879. 30 p. 24. Douglas A.E. Symbiotic Interactions. Oxford; New York; Toronto: Oxford Univ. Press, 1994. 194 p. 25. Doyle J.J. Phylogenetic perspectives on nodulation: evolving views of plants and symbiotic bacteria // Trends in Plant Sci. 1998. V. 2. P. 473-478. 26. Dresing U., Hagen M., Selbitschka W., Puhler A., Keller M. Reduced survival of RecA-deficient Sinorhizobium meliloti strain in sterile and nonsterile soil during heat stress // FEMS Microb. Ecol. 1998. V. 27. P. 327-338. 27. Engelke T., Jording D., Kapp D., Phler A. Identification and sequence analysis of the Rhizobium meliloti dctA gene encoding the C4dicarboxylate carrier // J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 5551-5560. 28. Foster K.R., Kokko H. Cheating can stabilize cooperation in mutualisms // Proc. Roy. Soc. B. 2006. V. 273. P. 2233-2239. 29. Frank S.A. Genetics of mutualism: the evolution of altruism between specie //. Theor. Biol. 1994. V. 170. P. 393-400. 30. Frank S.A. Host-symbiont conflict over the mixing of symbiotic lineages // Proc. Roy. Soc. Lond. B. 1996. V. 263. P. 339-344. 31. Fred E.B., Baldwin I.L., McCoy E. Root Nodule Bacteria and Leguminous Plants. Madison. Wisconsin: Univ. Wisconsin Stud. Sci., 1932. 350 p. 32. Gibson A.H. Genetic variation in the effectiveness of nodulation of lucerne varieties // Austral. J. Agric. Res. 1962. V. 13. P. 388-399. 33. Hardy R.W.F., Holsten R.D., Jackson E., Burns R.S. C2H2-C2H4 assay for N2 fixation: laboratory and field evaluation // Plant Physiol. 1968. V. (suppl.). P. 9-13. 34. Janzen D.H. When is it coevolution? // Evolution. 1980. V. 34. N 3. P. 611-612. 35. Jimenez J., Casadesus J. An altruistic model of Rhizobium-legume association // J. Heredity. 1989. V. 80. P. 335-337. 36. Jones K.M., Kobayashi H., Davies B.W., Taga M.E., Walker G.C. How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model // Nature Rev. 2007. V. 5. P. 619-633. 37. Jording D., Sharma P.K., Schmidt R., Engelke T., Uhde C., Phler A. Regulatory aspects of the C4-dicarboxylate transport in Rhizobium meliloti: transcriptional activation and dependence on effective symbiosis // J. Plant Physiol. 1992. V. 141. P. 18-27. 38. Jording D., Uhde C., Schmidt R., Phler A. The C4-dicarboxylate transport system of Rhizobium meliloti and its role in nitrogen fixation during symbiosis with alfalfa (Medicago sativa) // Experientia. 1994. V. 5. N 10. P. 874-883. 39. Kiers E.T., Rousseau R.A., West S.A., Denison R.F. Host sanctions and the legume-Rhizobium mutualism // Nature. 2003. V. 425. P. 78-81. 40. Law R., Lewis D.H. Biotic environments and the maintenance of sex - some evidence from mutualistic symbioses // Biol. J. Linn. Soc. 1983. V. 20. P. 249-276. 41. Lesins K.A., Lesins L. Genus Medicago (Leguminosae). Hague: Dr. W. Junk, 1979. 150 p. 42. Maynard Smith J. Generating novelty by symbiosis // Nature. 1989. V. 341. N 6240. P. 284-285. 43. Mode C.J. A mathematical model for the co-evolution of obligate parasites and their hosts // Evolution. 1958. V. 12. P. 158-165. 44. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. V. 89. P. 583-590. 45. Olivieri I., Frank S.A. The evolution of nodulation in Rhizobium: altruism in the rhizosphere // J. Heredity. 1994. V. 85. P. 46-47. 46. Pellmur O., Huth C.J. Evolutionary stability of mutualism between yuccas and yucca moths // Nature. 1994. V. 372. P. 257-260. 47. Raig H., Nommsalu H., Meripold H., Metlitskaja J. Fodder Galega. Estonian Res. Inst. Agricult., 2001. 141 pp. 48. Schardl C.L., Craven K.D., Speakman S., Stromberg A., Lindstrm A., Yoshida R. A novel test for host-symbiont codivergence indicates ancient origin of fungal endophytes in grasses // System. Biol. 2008. V. 57. P. 483-498. 49. Selbitschka W., Keller W., Miethling-Graff R., Dresing U., Schwieger F. Krahn I., Homann I., Dammann-Kalinowski T., Phler, A., Tebbe C.C. Longterm field release of bioluminescent Sinorhizobium meliloti strains to assess the influence of a recA mutation on the strainsТ survival // Microbial Ecol. 2006. V. 52. P. 583-595. 50. Sharypova L.A., Yurgel S.N., Keller M., Simarov B.V., Phler A., Becker A. The eff-482 locus of Sinorhizobium meliloti CXM1-105 that influences symbiotic effectiveness consists of three genes encoding an endoglucanase, a transcriptional regulator and an adenylate cyclase // Molec. Gen. Genet. 1998. V. 261. P. 1032-1044. 51. Simms E.L., Bever J.D. Evolutionary dynamics of rhizopine within spatially structured Rhizobium populations // Proc. Roy. Soc. Lond. B. 1998. V. 265. P. 1713-1719. 52. Simms E.L., Taylor D.L. Partner choice in nitrogen-fixing mutualisms of legumes and rhizobia // Integrat. Comparat. Biol. 2002. V. 42. P. 369-380. 53. Spaink H.P. The molecular basis of infection and nodulation by rhizobia: the ins and outs of sympathogenesis // Annu. Rev. Phytopathol. 1995. V. 33. P. 345-368. 54. Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. (eds.). The Rhizobiaceae. Molecular Biology of Model Plant-Associated Bacteria. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Acad. Publ., 1998. 566 p. 55. Sprent J.I. Nodulation in Legumes. Cromwell Press Ltd, Kew, 2001. 110 p. 56. Sprent J.I. Evolving ideas of legume evolution and diversity: a taxonomic perspective on the ocurrence of nodulation // New Phytol. 2007. V. 174. P. 11-25. 57. Streeter J. Integration of plant and bacterial metabolism in nitrogen fixing systems // Nitrogen Fixations: Fundamentals and Applications / Tikhonovich I.A., Provorov N.A., Romanov V.I., Newton W.E. (eds.) Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, Boston, London, 1995. P. 67-76. 58. West S.A., Kiers E.T., Pen I., Denison R.F. Sanctions and mutualism stability: when should less beneficial mutualists be tolerated? // J. Evol. Biol. 2001. V. 15. P. 830-837. 59. West S.A., Kiers E.T., Simms E.L., Denison R.F. Sanctions and mutualism stability: why do rhizobia fix nitrogen? // Proc. Roy. Soc. B. 2002. V. 269. P. 685-694. 60. Wilson J.K. Over five hundred reasons for abandoning the crossinoculation groups of legumes // Soil Sci. 1944. V. 58. P. 61-69. 61. Young J.P.W. Molecular population genetics and evolution of rhizobia // The Nitrogen Fixation and its Research in China / Hong G.F. (ed.) SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, 1992. P. 366-381. Подписано в печать 23.09.09 г. Заказ № 124. Тираж 2Отпечатано в типографии ООО ИПК УБионтФ 199026, Санкт-Петербург, Средний пр. ВО., д. 86, тел. (812) 322-68-
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии