Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Сивожелезов Виктор Семёнович
Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания
03.01.02 Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
Пущино - 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институт биофизики клетки РАН Консультант:
Доктор физико-математических наук Роберт Валентинович Полозов
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Станислав Владимирович Никонов Доктор биологических наук Александр Владимирович Веселовский Доктор физико-математических наук Людмила Владимировна Якушевич
Ведущая организация:
Биологический факультет Московского Государственного Университета им.
М.В.Ломоносова
Защита состоится 15 апреля 2009г. в 14:00 часов на заседании Диссертационного совета Д002.038.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институт биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института биофизики клетки РАН.
Автореферат разослан л_____ марта 2010г.
Учёный секретарь Диссертационного совета Д 002.038.01, кандидат биологических наук Смолихина Татьяна Ивановна
Общая характеристика работы
Актуальность темы обусловлена, с одной стороны, огромным массивом экспериментальных данных, подтверждающих важность влияния электростатических сил на скорость образования, конфигурацию и устойчивость функциональных комплексов макромолекул. Такие данные имеются и для мутантных белков с искусственно модифицированными заряженными аминокислотами. В частности, известно, что экспериментально определённые константы скорости взаимодействий белков могут на несколько порядков превосходить величины, ожидаемые в предположении случайных столкновений за счёт предварительной ориентации при сближении, обусловленной электростатическими взаимодействиями.
С другой стороны, актуальность темы обусловлена фундаментальными свойствами электростатических полей, специфически организованных в биологических системах.
Одним из таких свойств является наличие знака у электростатических зарядов и потенциалов, которое усиливает физиологически значимые контакты между макромолекулами и препятствует нежелательным, приводящим к беспорядочному слипанию биомолекул (агрегации). Другим свойством является дальнодействие, благодаря которому, начиная с некоторых расстояний, электростатические силы оказываются единственными силами, действующими между биологическими макромолекулами.
Биологически значимой особенностью электростатических систем является также неустойчивость любых систем электрических зарядов (теорема Ирншоу), которая способствует динамичности молекулярных комплексов, их способности к изменению организации. Кроме того, энергия электростатического поля в диэлектрике является свободной энергией, то есть включает как энтальпийую, как и энтропийную составляющую. Из-за аномальной температурной зависимости диэлектрической константы воды (~1/T) следует, что энтропийная составляющая электростатической свободной энергии в воде преобладает над энтальпийной, так как сближение сильно сольватированных в воде противоположных зарядов приводит главным образом к высвобождению молекул воды из сольватных оболочек в объём. Таким образом, электростатические взаимодействия в воде энтропийно выгодны, так же как и гидрофобные взаимодействия. Поэтому распространенная точка зрения об исключительно гидрофобной природе аффинности белок-белковых комплексов нуждается в уточнении.
Электростатические взаимодействия могут определять аффинность связывания заряженных биополимеров, что подтверждено наличием чисто электростатических функциональных белковых комплексов.
Целью работы было определить, какие именно характеристики электростатических полей вокруг макромолекул определяют вклад электростатических сил в молекулярное узнавание белами других белков и ДНК. В работе было выдвинуто и доказано предположение, что такими характеристиками являются односвязные области положительного и отрицательного потенциала - так называемые скуты (в англоязычной литературе patches; в топологии - это односвязная область, ограниченная замкнутой кривой, в молекулярной биологии - область поверхности белка), и были исследованы их связи со структурой, функцией и эволюцией белков. Кроме того, исследованы электростатические потенциалы вокруг нуклеиновых кислот, где также обнаружены электростатические скуты.
В диссертации были поставлены следующие задачи:
1) Изучить зависимость электростатических потенциалов и полей белков от геометрической формы диэлектрической границы между молекулой и растворителем, а также дисперсии диэлектрической проницаемости растворителя.
2) Определить эффективные размеры и заряды белков, рассматриваемых как однородно заряженные частицы, из экспериментальных значений аффинностей и скоростей их комплексообразования при разных ионных силах.
3) Вычислить распределения электростатического потенциала вокруг белков и сравнить их с определенными из задачи 3) параметрами.
4) Сравнить распределения электростатического потенциала в нескольких семействах белков, определить инвариантные области (лскуты) потенциала внутри каждого из семейств и исследовать инвариантность образующих эти скуты заряженных аминокислот.
5) Вычислить и сравнить электростатические потенциалы промоторных ДНК, изучить их вклады в ДНК-белковое узнавание в зависимости от степени конденсации противоионов.
6) Исследовать роль электростатических потенциалов ДНК в ДНК-белковом узнавании, включая и стадию формирования атом-атомных ДНК-белковых контактов.
7) Вычислить электростатические потенциалы транспортных РНК, оценить величины конденсации противоионов на поверхности тРНК и влияние поля тРНК на заряды гистидиновых остатков аминоацил-тРНК синтетазы при ее связывании с тРНК.
8) Изучить, насколько электростатическое поле сильно заряженногог полимера может изменить скорость взаимодействия присоединенного к полимеру ферметна с ингибитором, заряженным противоположно по отношению к полимеру.
Научная новизна и значимость работы заключается в том, что скуты электростатического потенциала впервые введены здесь как параметры молекулярного узнавания на характерных расстояниях около 5 от молекулярной поверхности биомакромолекул, которые относятся к чисто электростатической стадии молекулярного узнавания. Эти расстояния задаются границей второй гидратной оболочки (~5 ), дебаевским радиусом экранирования при физиологическая ионная силе (8 от зарядов) и бьёррумовой длиной при низкой ионной силе (7 ) - расстоянием, на котором два элементарных заряда в воде взаимодействуют с энергией, равной энергии теплового движения.
Эти расстояния обоснованы также тем, что уравнение Пуассона-Больцмана теряет смысл из-за корреляций и флуктуаций в положениях противоионов и молекул воды, а также квантовых эффектов. На расстояниях же, больших 5-7 , энергия электростатического поля становится сопоставимой с энергией теплового движения, и поле не может вносить существенного вклада в узнавание. До настоящей работы в биологической литературе подобные скуты вычислялись непосредственно на молекулярной поверхности белков, но из-за неопределенностей, вносимых указанными эффектами, трактовать их физико-химическую природу не удавалось.
Наличие скутов выведено из экспериментальных зависимостей аффинностей белковых комплексов и скоростей их образования от ионной силы. Впервые обнаружено специфическое (функциональное) распределение скутов вокруг биополимеров. Если функция гомологичных белков идентична, то скуты вокруг них консервативны. Однако те заряженные аминокислоты, которые образуют скуты, не всегда являются консервативными. В отличие от консервативных аминокислот, ответственных за пространственную структуру белков, аминокислоты, образующие скуты, "консервативны" лишь настолько, настолько это необходимо для консервативности скута, но не обязательно консервативны в первичной структуре белка. Из этого следует, что электростатические поля являются тем физико-химический фактором, который подвержен эволюционному отбору, а сами скуты являются эволюционно обусловленной характеристикой. Наличие скутов оказалось достаточным для ранней стадии молекулярного узнавания, в противоположность необходимости электростатической комплементарности аминокислот контактирующих белков для узнавания, предполагавшейся ранее. Для ряда белков, а также для ДНК в B-форме, показан фокусирующий эффект потенциала на приближающийся партнербиомакромолекулу. Новым в методическом отношении является применение распределенных вычислений для расчетов электростатических потенциалов ДНК, белков и их комплексов. Кроме того, в рамках работы разработан высокоэффективный вариант многосеточного конечно-разностного метода для расчета электростатических потенциалов не только глобулярных (цитохромы, ДНК-связывающие белки), но и протяженных структур, например вытянутых (промоторные ДНК) и сплющенных (мембраны, тРНК).
Биологическая значимость скутов проявляется в ориентации и фокусировке биомолекул в поле других молекул при их сближении, нейтрализации зарядов фосфатов ДНК зарядами аминокислот лизина и аргинина, одномерной диффузии заряженного белка вдоль цепи заряженного полимера, индукции полем транспортной РНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе и других явлениях, изученных в настоящей диссертации.
Основными положениями, выносимыми на защиту, являются:
1) Наличие характеристического параметра поля вокруг макромолекулы - электростатического скута, важного для межмолекулярного узнавания.
2) Инвариантность размера, формы и положения электростатических скутов в семействах белков даже при отсутствии инвариантности в их первичных структурах заряженных аминокислот, образующих скуты, и следующая отсюда эволюционная обусловленность электростатических потенциалов белков.
3) Анизотропия электростатических потенциалов промоторных ДНК в направлении, перпендикулярном оси спирали ДНК, отличающая не только промоторные ДНК от периодических, но и промоторы один от другого, а также участки промоторов друг от друга.
4) Двойственность функции фосфатов ДНК при образовании атом-атомных контактов в системе гомеодомен-ДНК: образование электростатического скута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиновыми и аргининовыми остатками белка в интерфейсе ДНКбелковых комплексов.
5) Почти полное отсутствие конденсации противоионов на транспортных РНК в отличие от двуспиральных ДНК из-за различия в их геометрии. Как следствие, дополнительная индукция электростатическим полем тРНК зарядов на аминоацил-тРНК синтетазе посредством ионизации ее гистидинов для специфичности и надёжности узнавания.
Практическая значимость настоящей работы обусловлена необходимостью понимания механизмов электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот для создания белков с заранее заданными свойствами. Это особенно касается иммобилизации белков, лежащей в основе биосенсорных технологий. В частности, был выполнен расчёт электростатических взаимодействий, обеспечивающих ускорение реакции фермента трипсина с его ингибитором путём иммобилизации трипсина на поликатионной матрице. Результаты этого расчёта подтвердились экспериментально - константу скорости удалось увеличить более чем на два порядка. Выполненное в настоящей работе моделирование электростатических взаимодействий белков и нуклеиновых кислот составляет основу предсказаний свойств нековалентно иммобилизованных белков, являясь тем самым одним из направлений в новой междисциплинарной области науки - вычислительной бионанотехнологии.
Апробация результатов работы и публикации. Материалы, включенные в настоящую диссертацию, докладывались на Международной конференции по биосенсорам и биокомпьютерам (Санта-Клара, США, 1988), II Международной конференции по молекулярной электронике и биокомпьютерам (Москва, 1989), Международной конференции по вычислительной математике "CSAM-93" (Петербург, 1993), конференции по информационно-вычислительным технологиям "ИВТН-2002" (Москва, 2002), III съезде Российского биохимического общества, (С.-Петербург, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международной научной школе "Quantum Physics and Communication'' (Дубна, 2005), двух Международных научных школах ELBA Nanoforum - Proteome: Technologies And Applications (Портоконте, Италия, 2007) и Nanotechnology And Nanobioelectronics (Генуя, Италия, 2009), Международной конференции по распределенным вычислениям GRID2008 (Дубна, 2008), Международной конференции по математическому моделированию и вычислительной физике MMCP2009 (Дубна, 2009).
Работы по теме диссертации поддерживались грантами Государственного комитета по науке и технике СССР (1989-1990 гг., проект № 89), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 94-04-12471, 96-04-48778, 07-07-00234).
По теме работы имеется 56 публикаций, в том числе 33 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объём работы. Работа состоит из Введения, Литературного обзора, раздела Методы, раздела Результаты и обсуждение (7 глав), Заключения, Выводов и списка литературы (178 наименований). Полный объём работы составляет 186 страниц, число рисунков - 31, таблиц - 12.
Содержание работы Во Введении указано место настоящей работы на стыке теоретической молекулярной биофизики и структурной биоинформатики, и на этой основе дано обоснование выбора объектов исследования. Вкратце, для исследования из числа белков выбраны гембелки, ферменты и ДНК-связывающие белки, потому что вклад электростатических взаимодействий в узнавание с их участием показан наиболее чётко, причём изучены несколько гомологов каждого белка. Рассмотрены также ДНК и РНК, являющиеся сильными полиэлектролитами. Из ДНК-связывающих белков выбраны гомеодомены и сигма-субъединицы РНК-полимеразы, отличающиеся в функциональном, структурном и эволюционном аспектах. Из нуклеиновых кислот выбраны длинные промоторные ДНК как пример протяженных структур и транспортные РНК как пример квазиглобулярной сплющенной структуры.
В Литературном обзоре, во-первых, изложены имеющиеся по каждому из объектов настоящего исследования теоретические и экспериментальные предпосылки изучения электростатических полей биомакромолекул как факторов молекулярного узнавания. Во-вторых, описаны теоретические подходы к задачам моделирования этих полей и их связи с экспериментально определёнными параметрами межмолекулярного узнавания.
В разделе Методы, состоящем из 6 подразделов, представлены:
1) Вычисление распределения электростатического потенциала вокруг молекулы белка или нуклеиновой кислоты с учётом геометрической формы молекулы и больцмановского распределения ионов в растворителе. Это необходимо для адекватной, по крайней мере на расстояниях больше 5 от молекулярной поверхности, оценки экранировки электростатических полей вокруг всех биомакромолекул, рассмотренных в настоящей диссертации. Расчёт электростатического потенциала проводился путем решения уравнения Пуассона-Больцмана r r r r - ( (r )(r )) = 4 (0(r ) + 1((r ))) (1) где - потенциал, -диэлектрическая проницаемость, 0- плотность зарядов атомов r молекулы, для которой будем использовать выражение 0=izie( ri ) (где zi - заряд i-го r заряженного атома молекулы, ri - радиус-вектор этого атома, e - элементарный заряд), 1=izinie exp(-zie/kBT) - плотность зарядов ионов (где ni - концентрация ионов i-го типа, zi - заряд иона i-го типа. Уравнение (1) нелинейное, т.к. член 1 в правой части содержит неизвестный потенциал под экспонентой. Граничное условие для потенциала определяется тем, что на достаточном удалении от белковой глобулы потенциал не зависит от диэлектрической проницаемости внутри глобулы. Поэтому для численного решения бесконечную область заменим достаточно большим параллелепипедом , на границе которого примем r r zie exp(- r - ri ) = (2) r r 40 r - ri i Использовались два варианта зависимости диэлектрической проницаемости от координат:
1) Постоянная диэлектрическая проницаемость во всей области;
2) Ступенчатая зависимость:
r r p, если r - rp < rr (r ) = (3) r r , если r - rp rs r где p, s - диэлектрические проницаемости белка и воды, rp - радиус-вектор ближайшего атома белка, r0 - средний радиус этого атома белка плюс эффективный радиус молекулы растворителя (принят равным 1.4 ).
Применение к уравнению (1) с учётом (2) и (3) метода Галеркина [Федоренко, 1994] приводит к линейной алгебраической системе уравнений для определения коэффициентов u :
Au = f (4) которое решается многосеточным методом, в котором высокочастотные (быстро меняющиеся) компоненты поправки к текущему приближению решения ищутся на мелкой сетке, а для вычисления соответствующих гладких компонент используются более грубые сетки. Решение системы линейных уравнений на сетке L ищется итерациями с использованием вспомогательных сеток 0,L-1 (0- наиболее грубая сетка). На каждой итерации задача сводится к меньшей системе на сетке L-1, для решения которой рекурсивно применяется тот же алгоритм. Критерием окончания процесса решения является норма вектора невязки r=f-Au, являющаяся оценкой ошибки вычисления потенциала. В наших вычислениях она составляет менее 0,001 kBT/e. Вышеописанный метод лежит в основе разработанного нами оригинального программного обеспечения, реализованного как на индивидуальных процессорах, так и в распределённой вычислительной среде типа ГРИД. Программное обеспечение позволяет рассчитывать потенциалы как глобулярных, так и протяженных (вытянутых и сплющенных) структур.
2) Вывод выражений для напряженности электростатического поля с учетом структуры растворителя, основанный на формализме "нелокальной электростатики" т.е. при соотношении между электрическим смещением и напряженностью поля, заданном в интегральном виде. Эти выражения используются для учёта структуры растворителя при моделировании взаимодействия цитохрома С с мембраной. Было использовано основное r r уравнение электростатики, связывающее электрическое смещение D с полем E r r r div D(r ) = 4 (r ) (5) где - плотность заряда. Оно традиционно решается в предположении пропорциональности электрического смещения полю:
r r r r r D(r ) = (r )E(r ) (6) где - диэлектрическая константа. Последнее предположение означает, что диэлектрический отклик элемента объема на приложенное поле определяется только поляризацией этого элемента объема. В случае ориентационной поляризации каждый постоянный диполь среды будет ориентирован вдоль поля. Это будет не так для взаимодействующих друг с другом диполей, ориентация которых будет зависеть от ориентации соседних диполей. Такая зависимость в нелокальном формализме решения r r задач электростатики учитывается соотношением между D и E в виде r r r r r r r D(r ) = K(r,r ')E(r ')dr ' (7) где функция отклика K характеризует взаимную зависимость ориентации диполей. В изотропной среде r r r r K (r, r ')=K( r - r ' ) (8) r r' причем K становится постоянной для больших r - r, что отражает малость корреляции на больших расстояниях, так что в последнем случае вместо уравнения (7) имеем (6).
Решение уравнения (5) с учётом (7) и (8) даёт выражение для поля однородно заряженной плоскости, в зависимости от расстояния d от нее E(d) = [(1 l -1 s )exp(-d ) +1 s] (9) где =5 , l=6 и s=80 - длина корреляции диполей воды и диэлектрические константы в отсутствие и присутствие ориентационной поляризации соответственно.
3) Методика расчета эффектов модификации лизиновых групп Cyt С при его взаимодействии с мембранными белками. Эти выражения связывают вычисленную в предыдущем разделе напряжённость поля с наблюдаемыми значениями кинетических констант взаимодействия цитохрома С с мембраной. Модификация Cyt C изменяет заряды групп на его поверхности и, соответственно, изменяет энергию взаимодействия модифицированного Cyt C с партнером. Последнее было представлено как взаимодействие системы точечных зарядов с однородным электрическим полем. Разница в энергии между двумя положениями системы относительно поля для произвольного поля r E составляет r ri, r r r U = E(ri )dri (10) i q r i ri,где qi - i-й заряд, rri - его координаты. В случае поля однородно заряженной поверхности его напряжённость направлена нормально к поверхности, так что его можно рассматривать как скаляр и подставить из уравнения (9). Эффект модификации лизинового остатка определялся из уравнения теории активированного комплекса для константы скорости k = A exp(-G#/kBT) (11) где G# - свободная энергия активации. Если U есть изменение свободной энергии активации за счет модификации, то для модифицированного белка получаем k Aexp(- (G# +U ) kBT ) = = exp(-U kBT ) (12) k0 Aexp(- G# kBT ) где k0 и k - константы скорости для нативного и модифицированного белка, соответственно. Различные значения U, вычисленные по уравнению (10), соответствуют вариантам цитохрома C, модифицированным по различным лизинам, для которых величины k и k0 измерялась экспериментально. Таким образом, зависимость ln (k/k0) от U должна быть линейной. В свою очередь, U, как видно из (9) и (10), прямо пропорциональна поверхностной плотности заряда редокс-партнера Cyt C, которая априори неизвестна. Соотношение между поверхностной плотностью заряда и напряженностью поля в случае однородного поля определяется как E=/0, (13) причём плотность заряда может быть выражена в единицах напряженности однородного поля, даже если поле в действительности не является однородным, но является полем однородно заряженной плоской поверхности. Для "нелокального" случая поле на достаточном удалении от заряженной поверхности будет однородным. Дополнительная энергия активации рассчитывалась на единицу однородного электрического поля, U/Е.
Эту величину мы назовём фактором ориентации. Если отложить экспериментально найденные ln k против рассчитанных значений факторов ориентации для каждого из лизин-модифицированных вариантов Cyt C, получается прямая линия, из наклона которой можно определить неизвестное значение плотности заряда :
ln (k/k0)=(/0)(U/E) (14) 4) Методика интерпретации зависимостей скорости и аффинности белок-белковых взаимодействий от ионной силы. Методика позволяет из этих зависимостей оценить те особенности распределения заряда белков, которые проявляются в распределениях потенциалов вокруг них как электростатические скуты. Наиболее простым аналитическим выражением, описывающим зависимости констант скоростей взаимодействия молекул от ионной силы, является уравнение Веланда-Грэя. Оно использует выражение теории Дебая-Хюккеля для расчета парного взаимодействия однородно заряженных сферических частиц:
2 Z1Z2e2 e-R e-R lnk = lnk (15) 1+ + 80kBT (R1 + R2 ) R1 1+ R2 В нем параметрами являются k - константа скорости при бесконечной ионной силе, e - элементарный заряд, - выраженный в -1 обратный дебаевский радиус, равный 0.329 I1/2, I - ионная сила, Zi и Ri - заряды и радиусы частиц, 0 - диэлектрическая проницаемость вакуума, - диэлектрическая константа растворителя, kB - постоянная Больцмана, T - абсолютная температура. Здесь молекулы белка представлены непроницаемыми для растворителя сферами с однородным распределением заряда на поверхностях. Методом нелинейной регрессии определялись неизвестные параметры уравнения, при которых достигается наименьшая сумма квадратов отклонений экспериментальных точек от теоретической кривой (S). В качестве неизвестных параметров в уравнениях фигурировали k, Z1Z2 и R=R1=R2, так как заряды входят в уравнение в виде произведения, а независимое варьирование R1 и R2 не улучшает качества регрессии.
5) Пространственное выравнивание структур ДНК-белковых комплексов и идентификация инвариантных и вариабельных контактов в них. Для сравнения атоматомных контактов нескольких ДНК-белковых комплексов необходимо провести пространственное выравнивание интерфейсов. Однако применение общепринятых алгоритмов пространственного выравнивания белковых структур (по С-альфа атомам) или двуспиральных ДНК (по параметрам Дикерсона) необоснованно для интерфейсов белокДНК, поскольку топологии белковых альфа-спиралей и двойных спиралей ДНК сильно различаются. Мы разработали для пространственного выравнивания ДНК-белковых интерфейсов оригинальную процедуру, в которой попеременно (итеративно) совмещаются либо С-альфа атомы узнающих спиралей, либо атомы, участвующие в контактах во всех исследованных комплексах. Пространственное выравнивание производилось с использованием пакета программ MOLMOL.
Идентификация атом-атомных контактов проводилась по пороговому расстоянию 3,35 для полярных контактов, в том числе и для контактов через молекулу воды, и 3,9 для неполярных контактов. Инвариантными считались контакты, присутствующие во всех исследованных комплексах.
6) Методики химической модификации трипсина поликатионом, измерения скорости ингибирования трипсина соевым ингибитором (СИТ) и констант связывания соевого ингибитора с поликатионом.
Для исследования влияния электростатического поля поликатиона на взаимодействие трипсина с соевым ингибитором (СИТ) к поликатиону поли-N-этил-4-винилпиридинийбромиду с молекулярной массой 1.8105 ковалентно присоединяли трипсин. За кинетикой ингибирования трипсина соевым ингибитором следили спектрофотометрически по кинетике гидролиза этилового эфира бензоиларгинина. Таким образом, в исследуемой системе трипсин ковалентно присоединен к поликатиону, а СИТ в условиях эксперимента (pH 8) заряжен отрицательно.
Константы скорости ассоциации трипсина с ингибитором рассчитывались из кинетических кривых убывания концентрации активных центров трипсина в предположении второго порядка реакции.аКинетические кривые связывания трипсина (E)а с ингибитором (I)астроились в координатах ([E]0-[E])/[E]0[E]=y для [E]0=[I]0 или (для [E]0[I]0) ln([I]0[E]/[E]0[I])/([E]0-[I]0)=y от времениаt. Индекс л0 соответствует начальной концентрации. При этом тангенс угла наклона равен искомой константе скорости.
Константы диссоциации комплекса СИТ с трипсином (в том числе ковалентно связанным с поликатионом), были рассчитаны из кривых титрования трипсина СИТом.
Экспериментальные данные подгонялись к уравнению, связывающему концентрацию активных центров фермента E, с общими концентрациями фермента и ингибитора I0 и Eи концентрацией субстрата S:
I0 S E= KI(1+ ) + E0 (16) 1- E / E0 KM E где KM - константа Михаэлиса, KIа- константа ингибирования, в данном случае равная искомой константе аффинности фермент-ингибиторного комплекса.
Раздел Результаты и обсуждение состоит из следующих глав:
Глава 1. Влияние заряженного полимера на взаимодействие белков. В этой главе исследовано, насколько введение дополнительного электростатического поля путём присоединения к одному из взаимодействующих белков сильно заряженного полимера, противоположного по знаку заряда другому взаимодействующему белку, может повлиять на скорость образования и аффинность белок-белкового комплекса. Оказалось, что это влияние существенно - скорость и аффинность повысились более чем на два порядка, и наиболее вероятный механизм этого повышения состоит в том, что белок присоединяется к произвольному месту противоположно заряженного полимера, а затем диффундирует вдоль полимерной цепи, пока не произойдёт контакт с белком-партнёром. Трипсин был химически модифицирован сильно положительно заряженным полимером поли(Nвинилпиридиний)бромидом, и была сравнена скорость реакции модифицированного и нативного трипсина с отрицательно заряженным соевым ингибитором Кунитца. Из Табл.видно, что низкой ионной силе ковалентное присоединение трипсина к поликатиону приводит к 115-кратному увеличению константы скорости ассоциации трипсина с соевым ингибитором, причем присоединение трипсина к поликатиону приводит к увеличению скорости ассоциации, но не диссоциации фермент-ингибиторного комплекса. Повышение ионной силы до 0,35 М NaCl существенно снижает и саму скорость ассоциации ферментингибиторного комплекса, и эффект присоединения трипсина к поликатиону. Таким образом, электростатическое поле существенно влияет на кинетику взаимодействия между белками, и это влияние зависит от ионной силы, как и предсказывалось теорией Дебая-Хюккеля.
Таблица 1. Константы скорости связывания, (k1), диссоциации (k-1) и равновесная константа связывания (KA) трипсина с соевым ингибитором.
Объект изучения k1, (M сек)-1 k-1, сек-1 KA, M-Трипсин 4.3x106 3х10-5 1.4x10Трипсин-поликатион 5x108 10-5 5x10Трипсин + 0,35М NaCl 5.8x105 3.8x10-4 1.5х1Трипсин-поликатион + NaCl 7.7х106 10-4 7х10Увеличение константы скорости ингибирования трипсина ингибитором, вызываемое поликатионом, можно было бы объяснить концентрированием конъюгата СИТ-ЦКП на поликатионе. Такого рода эффекты хорошо известны из мицеллярного катализа. В этом случае наблюдаемая константа является эффективной величиной и должна зависеть от концентрации полимера. Мы же обнаружили, что варьирование концентрации поликатиона не приводит к изменению константы скорости ингибирования.
Таким образом, фактором, определяющим скорость процесса в целом, является частота столкновений поликатионных клубков друг с другом. Эта частота была оценена теоретически в предположении, что молекулы полимера представляют собой вытянутые эллипсоиды вращения. С учетом электростатического фактора частота столкновений полиэлектролитных клубков произвольными участками составила k=3108 М-1с-1.
Принципиально возможны два варианта переноса белковой глобулы при столкновении цепей поликатиона: 1) белковые глобулы неподвижны относительно полимерной цепи, и для ингибирования необходимо столкновение полимерных цепей строго определенными участками; 2) белковые глобулы подвижны и могут передвигаться относительно полимерной цепи; в этом случае достаточно столкновения произвольными участками. В первом случае необходимо ввести стерический фактор, примерно равный отношению линейных размеров белка и полимерного стержня. Частота столкновений для такой модели составляет 2.4106 M-1c-1, что значительно ниже экспериментально определяемого значения. Поэтому необходимо принять, что перенос белковой глобулы происходит практически при столкновении любыми сегментами, т.е. за время контакта двух полимерных цепей глобулы ингибитора успевают "обежать" всю полимерную цепь.
Получаемое для такой модели оценочное значение k=3108 M-1с-1 практически совпадает с экспериментальным. Таким образом, при низких значениях ионной силы раствора глобулы белка-ингибитора с высокой скоростью диффундируют вдоль цепи полимера, и этот процесс можно рассматривать как одномерную диффузию. Скорость такой диффузии может определяться временами перемещения отдельных сегментов полимерной цепи.
Из литературы известен факт, что и скорости, и аффинности большинства взаимодействий белок-белок и белок-ДНК в водной среде существенно зависят от ионной силы. Это даёт основание предполагать существенный вклад электростатики в белокбелковые взаимодействия. Для взаимодействий белков с нуклеиновыми кислотами, которые сами являются сильными полиэлектролитами, ключевым вопросом является экранировка их зарядов противоионами, в особенности конденсация противоионов. Этот вопрос рассмотрен в других главах работы.
Глава 2. Дисперсия диэлектрической проницаемости и вклад отдельных зарядов цитохрома C в его взаимодействие с мембраной. Существенность вклада электростатики во взаимодействия между биомакромолекулами требует изучения механизма межмолекулярных электростатических взаимодействий. В частности, в этой главе выяснено, необходимо ли допущение комплементарных заряд-зарядовых взаимодействий для описания влияния точечных замен лизиновых остатков белка цитохрома С на скорость его взаимодействия с мембраной. Оказалось, что такой необходимости нет, если учесть дисперсию диэлектрической проницаемости воды.
Первая же работа [Koppenol и Margoliash, 1982], где были выполнены точечные замены лизинов цитохрома C, показала, что вклады этих лизинов в свободную энергии активации наблюдаемого процесса переноса электрона между цитохромом и мембранным белком неодинаковы и различаются в несколько раз. Таким образом, кинетика взаимодействия белка с заряженными объектами не определяется суммарным зарядом белка. Поле мембраны вместе с белком было принято однородным. Тогда энергия взаимодействия этого поля с Cyt C будет равна произведению дипольного момента Cyt C на напряженность поля, а вклад замены каждого из лизинов будет определяться его вкладом в дипольный момент Cyt C. Однако расчет совпал с экспериментом лишь для половины лизинов, причем совпадение определялось положением данного лизина относительно некоего экватора сфероидальной молекулы Cyt C, почти перпендикулярного вектору его дипольного момента. Авторы сделали вывод, что лизины-исключения образуют комплементарные зарядовые контакты (солевые мостики) с мембранным белком.
В настоящей работе исследовался вклад дисперсии диэлектрической проницаемости среды в энергию взаимодействия цитохрома С с мембраной. На Рис.представлены логарифмы экспериментально измеренных бимолекулярных констант скорости переноса электрона между мембраной и Cyt С, отложенные против величин факторов ориентации, рассчитанных для модификаций по каждому из лизиновых остатков Cyt С (Уравнение 14). Эти величины представляют собой разности энергий активации модифицированных и нативного белка U, отнесенные к напряженности поля мембраны Е.
Поскольку поле мембраны принято однородным, эти величины пропорциональны дипольному моменту каждого из вариантов Cyt С. Ордината каждой точки на Рис.соответствует логарифму измеренной константы скорости модифицированного по определенному лизину Cyt С. Абсцисса - рассчитанному для этой модификации по одной из четырех моделей значению U/E. Наклон линий пропорционален эффективной плотности заряда на мембране.
Расчет (Рис.1) был выполнен для четырех моделей, в которых электростатическое поле мембраны моделировалось по-разному: 1 - однородное электрическое поле, 2 - поле однородно заряженной плоскости в среде с пространственной дисперсией проницаемости ("нелокальная электростатика"), 3 и 4 - поле однородно заряженного диска с радиусом при постоянной проницаемости и с дисперсией проницаемости соответственно. Модели 2 и 4, в которых учитывается пространственная дисперсия, дают гораздо лучшее согласие расчета с экспериментом, чем модели 1 и 3, то есть эффект модификации лизиновых групп Cyt С лучше описывается при использовании нелокальных моделей.
lg k/k -0. -1.0 40, U/E 1029 Кл м Рис.1. Зависимости логарифмов экспериментально измеренных констант скоростей переноса электрона с мембранного белка Cyt C-редуктазы на Cyt C для модифицированных Cyt C (k), отнесенных к константе для нативного Cyt C (k0), от величин факторов ориентации U/E, рассчитанных для каждой из модификаций. Каждая точка соответствует варианту Cyt C, модифицированному по определенному остатку.
Наклон линий соответствует эффективной плотности заряда на мембране. Нумерация точек и линий соответствует нумерации моделей (см.текст).
Модели 2, 3 и 4 дают существенно лучшее согласие с экспериментом по сравнению с исходной моделью 1. Следовательно, если учесть вклад дисперсии диэлектрической проницаемости посредством введения в расчет поправок на расстояние между каждым из терминальных азотов лизина цитохрома С и поверхностью мембраны, упомянутые исключения не возникают. Кроме того, оцененная из сравнения расчета с экспериментом плотность заряда на мембране оказывается более реалистичной, чем в работе [Koppenol & Margoliash, 1973].
Таким образом, для объяснения кинетики взаимодействия Cyt C c мембраной нет необходимости привлекать представление о комплементарных электростатических взаимодействиях.
Глава 3. Анализ зависимостей скоростей реакций биомакромолекул от ионной силы. В этой главе определяются характерные размеры взаимодействующих заряженных областей (доменов) белка. Они оценивается из зависимостей констант скоростей образования белок-белковых комплексов от ионной силы. Вводится понятие электростатического скута - области электростатического потенциала, образуемой таким доменом.
Зависимости констант скоростей реакций однородно заряженных сферических молекул от ионной силы выводятся аналитически и используются в работе для определения размеров взаимодействующих областей белка и их зарядов (Рис 2).
ln k 0.0 0.4 0.8 1.I1/Рис. 2. Зависимость от ионной силы экспериментально измеренной бимолекулярной константы скорости переноса электрона между Cyt B5 и Cyt C. Точки соответствуют экспериментальным значениям констант [Northrup и др., 1993]. Линии - теоретические кривые : сплошная - R=8.6 , штриховая - R=2 , пунктирная - R=15 . Произведения зарядов при этом равны 6, 22 и 84 соответственно. Истинные радиусы этих белков составляют около 15 , а произведение их зарядов около 50.
Из рисунка 2 следует, что ни заряды, ни радиусы взаимодействующих частиц, полученные из зависимостей от ионной силы, не соответствуют таковым для целых взаимодействующих белков, т.е. аппроксимация целых белков однородно заряженными сферами явно неадекватна. Учёт поправки на дипольный момент белков при вычислении констант аффинности и скорости не улучшает приближения. То есть, получаемые параметры - заряды и радиусы - могут соответствовать эффективным размерам и зарядам не целых белков, а неких взаимодействующих доменов белков. Если теперь рассчитать электростатический потенциала вокруг белка, то на эквидистантных поверхностях, отстоящих от молекулярной поверхности белка примерно на 5 , возникают области одного и того же знака потенциала (лскуты), причём по расположению относительно белка и размерам эти скуты потенциала могут быть образованы зарядами, включёнными в упомянутые домены этого белка. Лскуты являются важной характеристикой электростатического поля вокруг белка, которая и явилась основным объектом исследования в настоящей работе. Основанием для выбора такой характеристики является и то, что на меньших расстояниях скуты сильно искажаются.
Электростатические эффекты становится невозможно оценить в рамках макроскопической (использующей диэлектрическую константу) электростатики из-за выхода за границу ее применимости вследствие флуктуаций и корреляций в расположении противоионов и диполей воды и квантовых эффектов. На бльших же расстояниях энергия поля становится малой по сравнению с энергией теплового движения.
Глава 4. Электростатические скуты белков. В этой главе показана важная роль электростатических скутов в функции ряда белков. Сравнение электростатических скутов внутри семейств белков показало, что скуты являются эволюционно отобранной характеристикой белков.
4.1) Супероксид-дисмутаза. На Рис. 3 приведены распределения электростатического потенциала супероксид-дисмутазы для двух электростатических моделей. Ключевое значение для описания скорости диффузуонно-контролируемой реакции диспропорционирования супероксида имеет величина области, занимаемой положительным потенциалом вблизи активного центра, т.е. оценка величины мишени для супероксид-аниона (Рис. 3).
Рис.3. Карта изолиний распределения электростатического потенциала супероксиддисмутазы в плоском срезе через активный центр. Жирной линией показана молекулярная поверхность супероксид-дисмутазы, аппроксимирующая границу белок-вода. Цена масштабного деления 10 . Приведены изолинии 0,5, 1 и 2 kBT/e, положительные - сплошная линия, отрицательные - штриховая. Слева, диэлектрическая проницаемость принята равной 80 по всему объему. Вацентре, диэлектрической проницаемость принята 2 внутри белка и 80 вне белка при нулевой ионной силе. Справа, то же при ионной силе 0,15 М.
При использовании модели с постоянной диэлектрической проницаемостью по всему объему оцененные из размера мишени скорости реакции оказываются заниженными по сравнению с экспериментальными примерно на порядок. Учёт различия диэлектрических свойств белка и воды увеличивает размер мишени как раз примерно на порядок, а введение в модель ионной силы - к смещению изолиний положительного потенциала в сторону от активного центра, что соответствует понижению скорости реакции. То есть, зависимость последней от ионной силы отслеживается моделью качественно верно, в отличие от модели с постоянной диэлектрической проницаемостью, в которой повышение ионной силы приводит к увеличению мишени (не показано).
4.2) Цитохромы P450. Эти ферменты осуществляют метаболизм многих органических субстратов путём оксигенации - введения атома кислорода в субстрат. Для осуществления функции им нужен вовремя доставленный электрон. Во многих случаях эту функцию осуществляет специальный белок-кофактор, переносчик электрона. Нами обнаружен лоскут положительного потенциала, расположенный вблизи гемовой группы - акцептора электрона. Этот лоскут инвариантен у цитохромов P450 (Рис.4), требующих кофактора (у других электрон доставляется другим доменом самого цитохрома P450).
Рис.4. Электростатические лоскуты вокруг цитохромов P450: цитохром P450scc и два наиболее подобных ему по пространственной, но наиболее различающихся по первичной структуре. Слева направо: P450SCC, P450BM3, P4502C5. Здесь и далее, если не указано иначе: синий цвет - положительный потенциал > 1 kBT/e 25 мВ при 300 K, kB - постоянная Больцмана, T Цабсолютная температура, e - элементарный заряд, красный - соответствующий отрицательный потенциал.
Идентифицированы аминокислоты, создающие лоскут. Для одного из них, цитохрома P450scc, были предсказаны как константы связывания, так и скорости переноса электрона, подтвердившиеся экспериментально, при том что в отсутствие пространственной структуры этого белка предсказания были выполнены, исходя из весьма грубой модели, основанной на структуре его отдаленного гомолога (~10% идентичности аминокислот) - камфорного цитохрома P450.
Таким образом, показано, что лоскут положительного потенциала указывает на место контакта с белком-кофактором. Все такие кофакторы, как известно, отрицательно заряжены. Как выяснилось из пространственной структуры одного из них (адренодоксина), он содержит лоскут отрицательного потенциала, комплементарный лоскуту цитохрома P450. Несмотря на инвариантность обнаруженного электростатического лоскута, далеко не все из образующих его заряженных аминокислот инвариантны (Рис. 5).
Рис.5. Цитохром P450scc: электростатический потенциал (слева), заряженные аминокислоты, его образующие (справа). Помечены остатки, консервативные в цитохромах P450.
4.3) ДНК-связывающие белки.
Рассмотрены два семейства ДНК-связывающих белков - вторые домены сигма- субъединицы бактериальной РНК-полимеразы и эукариотические факторы транскрипции семейства гомеодоменов. Второй домен сигма70-субъединицы (далее сигма2-домен) узнаёт промоторную ДНК в области нуклеотида -10 от точки старта транскрипции у различных бактерий. Сигма70-субъединица функционирует в составе холофермента вместе с еще четырьмя субъединицами. Её второй домен отличается большим разнообразием аминокислотных последовательностей, в ряде случаев имеются длинные вставки.
Рис.6. Электростатические потенциалы второго домена четырех сигма70 субъединиц бактериальной РНК-полимеразы. Верхние рисунки отличаются от нижних поворотом вокруг горизонтальной оси на 180. Слева направо: E.coli sigma70, T.aquaticus sigmaA, E.coli sigmaE, S.coelicolor sigmaR.
Мы обнаружили (рис.6) скут положительного потенциала, общий для сигма2доменов различных биологических видов. При этом ароматические аминокислоты, примыкающие к этой области, по данным мутагенеза, связываются с ДНК, а узнавание на уровне атомных контактов происходит по механизму интеркаляции. Во время выполнения настоящей работы была расшифрована структура холофермента РНКЦполимеразы, и оказалось, что обнаруженный нами скут потенциала является инвариантным не только на сигма2-доменах, но и на всём холоферменте, и обращён вовне холофермента. При этом аминокислоты, образующие этот лоскут, за исключением одной, не являются инвариантными (рис.7).
Рис. 7. Инвариантная область электростатического потенциала сигма2 домена сигма субъединицы E. coli. (слева); аминокислотные остатки, образующие скут (справа).
Помечена единственная инвариантная аминокислота.
Факторы транскрипции семейства гомеодоменов в эукариотах ответственны за дифференциацию клеток по органам. К этому семейству в одном организме принадлежит множество похожих белков. Гомеодомены являются одними из наиболее консервативных белков, в т.ч. и из числа ДНК-связывающих белков. В отличие от сигма-субъединиц РНКполимеразы, гомеодомены могут специфически узнавать ДНК независимо от других доменов. Узнавание на уровне атомных контактов осуществляется гомеодоменами посредством водородных связей их аминокислот с основаниями ДНК. Мы показали, что у гомеодоменов имеется единственный лоскут положительного потенциала, расположенный с одной стороны молекулы (Рис.8). Именно эта сторона, по кристаллографическим структурам комплексов ДНК-гомеодомен, контактирует с большим желобом ДНК.
Рис. 8. Электростатические потенциалы гомеодоменов. Верхний и нижний отличаются поворотом на 180о вокруг оси Y. Слева направо: гомеодомены Pit-1, прный, гранёный, антеннапедия и Msx-1.
В отличие от сигма2-доменов, формы скутов положительного потенциала существенно отличны от друга у различных гомеодоменов, что на первый взгляд удивительно, так как все гомеодомены связываются в одной и той же области большого желоба ДНК и одинаково ориентированы относительно двойной спирали. Одно объяснение состоит в том, что у сигма2 скут расположен между двух его альфаспиралей, а у гомеодоменов - охватывает узнающую альфа-спираль, но не соприкасается с двумя оставшимися спиралями. Узнающая же спираль содержит именно те боковые группы аминокислот, которые образуют водородные связи с основаниями ДНК. Они располагаются непосредственно в области электростатического скута и искажают его.
Кроме того, сигма-субъединицам нет необходимости нейтрализовать фосфаты ДНК, так как интеркаляционные взаимодействия от электростатических полей зависят слабо.
Напротив, нейтрализация фосфатов ДНК необходима гомеодоменам, которые узнают основания ДНК посредством водородных связей, энергия которых сильно зависит от внешних электростатических полей. Поэтому функция лизинов и аргининов гомеодомена состоит не только в создании электростатического скута, но и в нейтрализации фосфатов ДНК, и эта дополнительная функция также может исказить форму лоскута.
Таким образом, общим в электростатических полях ДНК-связывающих белков оказывается электростатический скут, направляющий белок в большой желоб ДНК, а различия связаны, во-первых, с олигомеризационным состоянием белков, а во-вторых, с функциями, относящимися к стадиям молекулярного узнавания, следующим за чисто электростатической стадией. Для комплексов гомеодоменов с фрагментами промоторных ДНК эти стадии были изучены подробно (глава 6).
Полученные результаты указывают на необходимость при расчёте электростатических потенциалов белков не ограничиваться рассмотрением индивидуального белка, а исследовать целые семейства белков. При этом возникает большое число однотипных вычислительных задач, естественным способом решения которых является применение распределённых вычислительных сред, содержащих множество процессоров, чтобы потенциал каждого из множества белков вычислялся на индивидуальном процессоре. Программное обеспечение, разработанное для расчётов электростатических потенциалов, реализовано нами именно в такой среде типа ГРИД.
Глава 5. Распределение электростатического потенциала вокруг промоторных ДНК.
В этой главе исследованы характерные особенности электростатического потенциала промоторных ДНК, в том числе фрагментов промоторных ДНК, узнаваемых гомеодоменами. Установлено, что скуты электростатического потенциала, подобные белковым, возникают вокруг этих фрагментов ДНК при тех значениях степени конденсации противоионов, которые наблюдаются экспериментально. Для длинных промоторных ДНК оказалось, что анизотропия электростатического потенциала резко различается как между промоторами в целом, так и между участками одного и того же промотора. Как выяснилось их расчёта электростатических потенциалов ДНК периодических последовательностей, ДНК последовательности (АТАТАТЕ) имеет аномально низкую анизотропию.
При расчете электростатических потенциалов нуклеиновых кислот по уравнению Пуассона ЦБольцмана необходимо явно учесть конденсацию противоионов на ДНК, так как это уравнение в используемом нами приближении избытка соли не воспроизводит эффекта конденсации. Поскольку основной эффект конденсации, независимо от фактического расположения противоионов состоит в уменьшении остаточного заряда фосфатов ДНК, мы варьировали заряды на фосфатных атомах кислорода ДНК в пределах от -1.0 до -0.1 (Рис.9).
ДоляаСоастороныаконтактаасабелком Сапротивоположнойастороныа остаточногоа 1IG7а9ANTа3HDD 1FJLа1AU7 1IG7а9ANTа3HDDа1FJLа1AUзарядаа 0.1а 0.3а 0.4а 0.45а 0.5а 1.0а Рис.9. Электростатические потенциалы фрагментов промоторных ДНК, узнаваемых гомеодоменами. Расчеты выполнялись в предположении различных степеней конденсации противоионов на ДНК, указана соответствующая доля остаточного заряда ДНК. Слева направо, ДНК, узнаваемая соответственно гомеодоменами Msx-1, антеннапедией, гранёным, прным и Pit-1 (показаны соответствующие коды PDB).
Показан потенциал со стороны контакта с белком и с противоположной стороны.
Более тёмный цвет соответствует потенциалу < 1 kBT/e.
При отсутствии конденсации (заряд -1.0), электростатический потенциал отрицателен на всей поверхности.
Чередование отрицательных (лоскутов потенциала) и нейтральных участков возникает при некоторых значениях доли остаточного заряда, существенно различных для более коротких и более длинных ДНК. Так, для более коротких фрагментов ДНК, узнаваемых белками антеннапедия, Msx-1 и прным, выраженные лоскуты потенциала возникают при доле остаточного заряда 0,4-0,45, а для более длинных - граненого и Pit- - при 0,3. В литературе доли остаточного заряда на ДНК были оценены методом ЯМР Na, и они практически совпали с приведенными значениями.
Таким образом, скуты потенциала на ДНК появляются именно при экспериментально найденных долях остаточного (после конденсации противоионов) заряда ДНК. Лоскуты оказались расположены в желобах, а не вблизи фосфатов, что на первый взгляд удивительно, так как именно заряды фосфатов являются основными источниками поля на ДНК. Однако в том же ЯМР-исследовании определены места связывания противоионов Na+ на ДНК, и они оказались расположены именно в большом жёлобе (малый жёлоб почти недоступен для ионов из-за имеющегося там хребта гидратации). Из рисунка также видно, что лоскуты отрицательного потенциала в большом желобе, способствующие посадке на него белков, несколько более выражены со стороны контакта с белком, чем с противоположной стороны. Возможно, это связано с индуцированной белком искажением геометрической формы ДНК по сравнению с канонической B-формой, также способствующим ДНК-белковому узнаванию.
На рисунке 10 представлены электростатические потенциалы ДНК периодических последовательностей: поли -A, поли-AT, поли-G и поли-GC. Как и следовало ожидать, потенциалы также периодичны. Видно, что потенциал поли-AT резко отличается от остальных периодических последовательностей, а именно, лоскуты и синего (менее отрицательного), и красного (более отрицательного) потенциала меньше и по размеру, и по отличию от среднего потенциала. То есть, из периодических последовательностей поли-АТ наиболее электростатически однородна. Видимо, однородность электростатического фона необходима для более поздней стадии узнавания промоторов белками, и эту однородность могут обеспечить именно участки ДНК с последовательностью (АТАТАТЕ).
На рисунке 11 показаны электростатические потенциалы нескольких промоторов E. coli, которые качественно отличаются от периодических, а именно у промоторов очень силён дипольный момент в направлении, перпендикулярном оси спирали ДНК, причём у всех промоторов дипольный момент варьирует в зависимости от последовательности.
Напротив, потенциал периодических последовательностей более напоминает потенциал квадруполя. Из показанных здесь промоторов два верхних, uvrA и uvrB-P1, показывают гораздо большую анизотропию, чем другие. На каждом из промоторов видны отдельные участки, выделяющиеся как по отрицательности, так и по анизотропии.
Исследованы все промоторные последовательности E. coli - около 400. Для расчётов электростатического потенциала применено программное обеспечение, реализованное нами в среде распределённых вычислений ГРИД. Это первый известный нам пример применения распределённых вычислений для массового расчёта электростатических потенциалов биомакромолекул.
Рис. 10. Электростатические потенциалы ДНК периодических последовательностей.
Потенциал показан на расстоянии 15 от оси спирали, где расположена электрофоретическая граница скольжения длинных ДНК. Синий цвет - менее отрицательный потенциал, белый - промежуточный, красный - более отрицательный ( >-0,5, = -1 и < 1,5 kBT/e соответственно). Показаны две проекции, отличающиеся поворотом на 180 вокруг горизонтальной оси.
Рис. 11. Электростатические потенциалы ДНК некоторых промоторных последовательностей E. coli. Обозначения - как на предыдущем рисунке.
Глава 6. Атом-атомные контакты при узнавании ДНК гомеодоменами. В этой главе была оценена степень нейтрализации зарядов фосфатных групп ДНК, необходимая для узнавания отдельных аминокислот гомеодоменов отдельными основаниями ДНК посредством атом-атомных контактов, то есть специфического узнавания. Оказалось, что для этого недостаточна нейтрализация фосфатов противоионами и требуется их нейтрализация лизинами и аргининами белка. Была также поставлена задача идентифицировать и классифицировать атом-атомные контакты в интерфейсах гомеодомен-ДНК. Было найдено, что контакты разбиваются на два класса - инвариантные, характеристические для контактов гомеодоменов с ДНК, и вариабельные, обеспечивающие индивидуальную специфичность комплексов внутри семейства гомеодоменов.
Для оценки степени нейтрализации, необходимой для атом-атомного узнавания, были вычислены электростатические потенциалы тех же фрагментов промоторных ДНК, что представлены на рис.9, но на более близком (3 ) расстоянии от молекулярной поверхности. Варьируемым параметром был остаточный (после нейтрализации) заряд фосфатных групп. На этом расстоянии потенциал перестаёт зависеть от остаточного заряда фосфатов при доле последнего, меньшей 0,1 (не показано). То есть, даже если допустить максимально возможную нейтрализацию противоионами, соответствующую по теории Мэннинга остаточному заряду 0,24, этого оказывается недостаточно для специфического узнавания. Необходима нейтрализация зарядов фосфатных групп лизиновыми и аргининовыми аминокислотами белка. Таким образом, функция последних в узнавании ДНК гомеодоменами двояка: они и образуют электростатический скут на ранней стадии узнавания, и нейтрализуют заряды фосфатов, что необходимо на стадии атом-атомных контактов. Для последней мы, на примере пяти вышеуказанных комплексов, показали, что узнающая альфа-спираль гомеодомена образует как инвариантные, так и вариабельные контакты аминокислот с основаниями ДНК. В числе инвариантных оказались:
- высокоспецифичный аспарагин-адениновый контакт, общий для всех комплексов гомеодомен-ДНК;
- неполярные контакты гидрофобных аминокислот с метиловой группой тимина, служащие стереохимическим барьером, фиксирующим гомеодомен на ДНК;
- кластер молекул воды, контактирующих и с основаниями, и с аминокислотами и служащий для конформационной подвижности, необходимой для диссоциации комплекса.
Инвариантные контакты образуются в основном с мотивом ТААТ, распространённым среди ДНК, узнаваемых гомеодоменами. Инвариантные контакты выделяют комплексы гомеодомен-ДНК из всего множества ДНК-белковых комплексов, а вариабельные обеспечивают индивидуальную специфичность комплексов внутри семейства гомеодоменов. Отметим, что распространение найденных закономерностей на все ДНК-белковые комплексы потребует быстрого анализа большого числа структур этих комплексов (на сегодня известно около 1600, и это число быстро растёт). Здесь также возникает необходимость в распределённых вычислениях.
Глава 7. Распределение электростатического потенциала вокруг транспортных РНК. В этой главе выполнена оценка степени конденсации противоионов на тРНК. Транспортные РНК так же сильно заряжены, как и ДНК, но их квазиглобулярная форма резко отличается от квазицилиндрической формы двуспиральной ДНК, что может сказаться на конденсации и тем самым на эффективном заряде тРНК, который важен для её узнавания аминоацил-тРНК синтетазой. Оказалось, что, в отличие от двуспиральной ДНК конденсации противоионов около тРНК не происходит, и её суммарного заряда достаточно для индукции зарядов на синтетазе посредством ионизации её гистидинов, что важно для узнавания.
Рис. 12. Предсказанные электростатическими расчётами сдвиги pK флуоресцентных меток на расстоянии от тРНК, соответствующему положению этих меток (7.5 ).
Оранжевый, 1 единица pK; жёлтый, 0.5 единицы pK; зелёный, 0. Слева, суммарный заряд тРНК принят равным -40; справа, -76. Экспериментальные значения сдвигов pK находятся в диапазоне 0,24 - 1.18, с преобладанием бльших значений.
В литературе имеются измеренные сдвиги pK флуоресцентных меток, присоединённых к тРНК. Они находятся в диапазоне 0,24-1,18 единиц pK, причем преобладают бльшие значения. Поскольку эти сдвиги пропорциональны электростатическому потенциалу, мы рассчитали их и изобразили на той поверхности, на которой, исходя из длины спейсера, расположены метки (рис.12).
Если принять заряд тРНК равным -10 (максимальная конденсация), потенциал получился почти нулевой - сдвига pK не должно быть (не показано). Если принять его равным -40 (промежуточная степень конденсации), потенциал оказывается в пределах 0-0,5 единиц pK, за исключением узлов тРНК, недоступных для присоединения флуоресцентных меток. Наконец, если предположить отсутствие конденсации (заряд -76, по числу нуклеотидов), расчёт соответствует эксперименту. Таким образом, получается, что конденсация противоионов на тРНК не происходит или незначительна, что при таком большом заряде тРНК на первый взгляд кажется невероятным.
В литературе имеются теоретические оценки конденсации противоионов около плоских, цилиндрических и сферических поверхностей. Показано, что наличие или отсутствие конденсации определяется главным образом не величиной заряда, а геометрической формой поверхности. Около плоскости полная конденсация есть всегда (известный слой Штерна). Около сферы (аппроксимация глобулярного белка и в некоторой степени тРНК) конденсация не происходит никогда. Около цилиндра (двуспиральная ДНК в A, B, Z формах) величина конденсации зависит от плотности заряда и длины цилиндра. Последнее наблюдается в эксперименте (см. главу 5). При этом предельный переход от сферы или цилиндра к плоскости происходит при R >> 1, где и R - обратный дебаевский радиус и радиус сферы либо цилиндра соответственно, то есть при физиологической ионной силе (-1 = 8 ) радиус кривизны бльшей части поверхности тРНК (R 10 ) явно недостаточен для предельного перехода.
Рис.13. Распределение электростатического потенциала вокруг аргинил-тРНК синтетазы. Показаны поверхности равного потенциала +0.01 kBT/e (синий) and -0.kBT/e (красный). Левая панель, незаряженные, правая - заряженные гистидины.
Наличие такого огромного нескомпенсированногого заряда должно сказываться на узнавании тРНК аминоацил-тРНК синтетазой (Рис. 13). Поскольку заряд тРНК так велик, он будет сказываться уже при малых значениях электростатического потенциала синтетазы, показанных на рисунке. При этом в узнавании будут, помимо остатков лизина и аргинина тРНК-синтетазы, участвовать и её гистидиновые остатки.
Они, как видно из рисунка, вносят существенный вклад в формирование её электростатического потенциала, поскольку в поле тРНК будет происходить их ионизация и соответственно индукция зарядов. Такой механизм электростатического узнавания, потенциально важный, крайне редко обсуждается в литературе.
В Заключении указано, что в работа относится к новой междисциплинарной области науки - физической биоинформатике, и обоснована необходимость появления последней как с позиций биофизики, так и с позиций биоинформатики. Обсуждаются ограничения использованного теоретического похода и перспективы его развития как в плане усовершенствования электростатических расчётов, так и их распространения на бльшее число биополимерных объектов (вплоть до полных геномов и протеомов) с использованием распределённых вычислений.
ВЫВОДЫ 1) Разработан вариант многосеточного метода решения уравнения Пуассона-Больцмана и построен соответствующий высокоэффективный алгоритм для расчета электростатических потенциалов больших молекул с атомным разрешением: глобулярных белков, протяженных структур (длинные двухцепочечные ДНК до 1000 пар оснований, мембраны, тРНК). Алгоритм реализован в виде программного обеспечения, функционирующего в том числе и в распределенной вычислительной среде ГРИД.
2) Показано, что электростатический скут является характеристическим параметром поля вокруг макромолекулы, важным для межмолекулярного узнавания. В белокбелковом узнавании механизм электростатического узнавания посредством полей (электростатических скутов) является преобладающим. В этом случае именно скут ответственен за раннюю стадию узнавания. Значительно реже встречается механизм контактов заряженных атомов (зарядовая копмлементарность).
3) Найдено, что размер, форма и положение электростатических скутов в семействах белков инвариантны, даже если в их первичных структурах заряженные аминокислоты, образующие скуты, не являются инвариантными, указывая на то, что не только структуры белков, но и их электростатические потенциалы подвержены эволюционному отбору и поэтому эволюционно обусловлены.
4) Величина электростатического потенциала промоторных ДНК, являющаяся важной характеристикой при узнавании белками ДНК, определяется её первичной структурой и зависит от степени конденсации противоионов. Появление скутов отрицательного потенциала обусловлено степенью конденсации противоионов, равной наблюдаемой в эксперименте.
5) Электростатические потенциалы промоторных ДНК характеризуются протяжёнными участками однородного потенциала, чередующиеся с участками неоднородного потенциала, в частности анизотропного в направлении, перпендикулярной оси спирали.
По однородности электростатического потенциала промоторы E. coli резко различаются также на всей их протяженности. Из потенциалов ДНК периодических последовательностей наиболее однородным является потенциал поли (АТ).
6) Найдено, что при образовании атом-атомных контактов в системе гомеодомен-ДНК функция фосфатов ДНК двояка: образование электростатического лоскута и нейтрализация зарядов фосфатов ДНК лизиновыми и аргининовыми остатками белка в интерфейсе ДНК-белковых комплексов. Найдено два типа контактов: инвариантные контакты характеризуют семейство гомеодоменов и выделяют их среди всех ДНКбелковых комплексов. Вариабельные контакты специфичны для индивидуальных комплексов внутри семейства гомеодоменов.
7) Показано, что конденсация противоионов на транспортных РНК, в отличие от двуспиральных ДНК, практически не происходит из-за квазиглобулярной геометрической формы тРНК. Как следствие, электростатические поля тРНК дополнительно индуцируют заряды на аминоацил-тРНК синтетазе посредством ионизации ее гистидинов, что обеспечивает необходимую специфичность и надёжность узнавания.
8) На модельной системе трипсин+поликатион-соевый ингибитор (СИТ) экспериментально показано, что электростатические поля способны существенно (два порядка) увеличить скорость белок-белкового взаимодействия. Узнавание происходит посредством связывания СИТ с поликатоном (конденсация) и затем одномерной диффузии СИТ по цепи поликатиона к специфическому месту контакта.
Список публикаций Статьи в рецензируемых журналах 1. Изумрудов В.А., Савицкий А.П., Сивожелезов B.C., Зезин А.Б., Кабанов В.А., Березин И.В. (1987) Ускорение взаимодействия трипсина с соевым ингибитором в присутствии поликатиона. Доклады АН СССР, 294, 1501 -1505.
2. Lazarev P.I., Sivozhelezov V.S. (1991). Solvent Permittivity Dispersion Electrostatic Model Better Fits Kinetic Data. Topics in Molecular Organization and Engineering, 7, 149-160.
3. Постникова Г.Б., Целикова СВ., Сивожелезов B.C. (1992) Изучение переноса электрона в гем-белках.
X. Влияние рН, ионной силц и ионов цинка на скорость восстановления феррицитохрома С оксимиоглобином сердца свиньи. Мол. биология, 26, 880-890.
4. Postnikova G.B., Sivozhelezov V.S., Tselikova S.V. (1995) Controlling the electron transfer rate between oxymyoglobin and ferricytochrome С. The role'of histidines and electrostatic and steric interactions in the mechanism of the reaction. Mol. Engineering, 4, 431-439.
5. Sivozhelezov V.S. Interpretation of ionic strength dependencies of the electron transfer in the cytochrome С - cytochrome B5 system for the wildtype and lysine-mutated yeast cytochrome С Mol. Engineering, 1996, 6, 405-414.
6. Сивожелезов B.C., Комаров Ю.Е., Постникова Г.Б. (1996) Изучение переноса электрона в гемопротеинах. Применимость моделей электростатического взаимодействия молекул к описанию зависимости скорости реакции между миоглобином и цитохромом с от ионной силы. Биофизика, 41,1180-1192.
7. Сивожелезов B.C., Комаров Ю.Е., Постникова Г.Б. (1998) Применимость моделей электростатического взаимодействия молекул к описанию зависимости скорости реакции между миоглобином и цитохромом с от ионной силы. Биофизика, 43, 16-26.
8. Polozov R.V., Dzhelyadin T.R., Sorokin A.A., Ivanova N.N., Sivozhelezov V.S., Kamzolova S.G. (1999) Electrostatic potentials of DNA. Comparative analysis of promoter and nonpromoter nucleotide sequences. J.
Biomol. Struct. Dyn. vol.16, No.6, 1135-9. Моисеева С.А., Постникова Г.Б., Сивожелезов В.С. (2000). Окисление оксимиоглобина кашалота, катализируемое ионами ферроцианида: кинетика и механизм, Биофизика 45, 1019-1028.
10. Kamzolova S.G., Sivozhelezov V.S., Sorokin A.A., Dzhelyadin T.R., Ivanova N.N., Polozov R.V. (2000) RNA polymerase--promoter recognition. Specific features of electrostaticpotential of "early" T4 phage DNA promoters. J. Biomol. Struct. Dyn. vol.18 No.3, 325-334.
11. Hou S., Belisle C., Lam S., Piatibratov M., Sivozhelezov V., Takami H., Alam M. (2001)A globin-coupled oxygen sensor from the facultatively alkaliphilic Bacillus halodurans C-125. Extremophiles 5, 351-354.
12. Hou S., Freitas T., Larsen R.W., Piatibratov M., Sivozhelezov V., Yamamoto A., Meleshkevitch E.A., Zimmer M., Ordal G.W., Alam M. (2001) Globin-coupled sensors: a>
13. Dzhelyadin T.R., Sorokin A.A., Sivozhelezov V.S., Ivanova N.N., Polozov R.V., Kamzolova S.G. (2001) New approach in studying RNA polymerase-promoter recognition code. J. Biomol. Struct. Dyn., 18, 922923.
14. Т.Р.Джелядин, А.А.Сорокин, Н.Н.Иванова, В.С.Сивожелезов, С.Г.Камзолова, Р.В.Полозов. (2001) Особенности электростатического взаимодействия РНК-полимеразы Escherichia coli с промоторами ДНК фага Т4. Биофизика 46, 1022-1026.
15. Nicolini C., Erokhin V., Ghisellini P., Paternolli C., Ram M.K., Sivozhelezov V. (2001) P450scc engineering and nanostructuring for cholesterol sensing, Langmuir 17, 3719-3716. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов В.С., Постникова Г.Б. (2005) Окисление миоглобинов кашалота, лошади и свиньи, катализируемое ионами феррицианида. Кинетика и механизм.
Биофизика 50(1):39-48.
17. Сабурова Е.А., Дыбовская Ю.Н., Сивожелезов В.С., Елфимова Л.И. (2005) Электростатический вклад во взаимодействие некоторых белков с полиэлектролитами. Биофизика 50(3):423-418. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов В.С., Постникова Г.Б. (2005) Механизм катализируемого ионами ферроцианида окисления оксимиоглобина: химически модифицированный и мутантный миоглобины кашалота Биофизика 50(4): 631-640.
19. Sivozhelezov V., Nicolini C. (2005) Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor. J Theor Biol. 234, 479-485.
20. Pechkova E., Sivozhelezov V., Tropiano G., Fiordoro S., Nicolini C. (2005) Comparison of lysozyme structures derived from thin-film-based and>
21. Polozov, RV, Sivozhelezov, VS, Ivanov, VV, and Melnikov, YB. (2005) On a>
22. Polozov R.V., Montrel M., Ivanov V.V., Melnikov Y., Sivozhelezov V.S. (2006) Transfer RNAs:
electrostatic patterns and an early stage of recognition by synthetases and elongation factor EF-Tu.
Biochemistry 45, 4481-9440.
23. Sivozhelezov V., Pechkova E., Nicolini C. (2006) Mapping electrostatic potential of a protein on its hydrophobic surface: implications for crystallization of cytochrome P450scc. J. Theor. Biol. 241, 73-80.
24. Sivozhelezov V., Giacomelli, L., Tripathi, S., & Nicolini, C. (2006) Gene expression in the cell cycle of human T lymphocytes: I. Predicted gene and protein networks, J Cell Biochem 97, 1137-1150.
25. Sivozhelezov V and Nicolini, C. (2006) Theoretical framework for octopus rhodopsin crystallization.
Journal of Theoretical Biology 240, 260-269.
26. Sivozhelezov V and Nicolini, C. (2007) Prospects for octopus rhodopsin utilization in optical and quantum computation. Physics of Particles and Nuclei Letters 4(2):189-196.
27. Postnikova G.B., Moiseeva S.A., Shekhovtsova E.A., Goraev E.V., Sivozhelezov VS. (2007) Ferrocyanide - a novel catalyst for oxymyoglobin oxidation by molecular oxygen. FEBS Journal 274, 5360-5369.
28. Pechkova E., Sivozhelezov V., Nicolini C. (2007) Protein thermal stability: the role of protein structure and aqueous environment. Arch Biochem Biophys. 466, 40-48.
29. Sivozhelezov V., Braud C., Giacomelli L., Pechkova E., Giral M., Soulillou J.P., Brouard S., & Nicolini C.
(2008) Immunosuppressive drug-free operational immune tolerance in human kidney transplants recipients.
Part II. Non-statistical gene microarray analysis, J Cell Biochem 103, 1693-1730. Nicolini C, Bruzzese D, Sivozhelezov V, Pechkova E. (2008) Langmuir Blodgett based lipase nanofilms of unique structure-function relationship. Biosystems 94, 228Ц231. Covani U., Marconcini S., Giacomelli L., Sivozhelevov V., Barone A., Nicolini C. (2008). Bioinformatic prediction of leader genes in human periodontitis. J. of Periodontology, 79, 1974-1932. Chirgadze YN, Zheltukhin EI, Polozov RV, Sivozhelezov VS, Ivanov VV (2009). Binding regularities in complexes of transcription factors with operator DNA: homeodomain family. J Biomol Struct Dyn. 26, 687700.
33. Sivozhelezov V., Bruzzese D, Pastorino, L, Pechkova, E, Nicolini, C (2009). Increase of catalytic activity of lipase towards olive oil by Langmuir-film immobilization of lipase. Enzyme and Microbial Technology 44, 72-76.
Статьи в научных сборниках, тезисы, препринты 34. Buravtsev V.N., Lazarev P.I. (1990) The Role of Spatial Dispersion of Solvent Permittivity in Electrostatic Interactions in Proteins Molecular Electronics: Proceedings of Santa Clara Conference on Biosensors and Biocomputers. New York: Plenum Press, 97-104.
35. Fedoseyev A.I., Purtov S.V., Lazarev P.I, Sivozhelezov V.S. (1992) Mathematical modelling of 3D protein molecule potential in nonlinear media. Proceedings of the International Conference "Physique en Herbe-92", Marseille, 1992. p.233-236. Sivozhelezov V.S. (1993) Modeling electrostatic interactions of proteins Abstr. Int. Conf. CSAM-93, St.
Petersburg, 1993, p.137. Nicolini C., Sivozhelezov V.S. (1996) Ab Initio Molecular Design. In: Molecular Bioelectronics, Singapore, World Scientific Publishers, ISBN 9810226853, 9789810226855, 266 pps, p.77-110.
38. Гораев Е.В., Постникова Г.Б., Сивожелезов В.С (2002). Моделирование каталитического окисления миоглобина. Тезисы докладов конференции по информационно-вычислительным технологиям в науе "ИВТН-2002", Москва, c.139. Гораев Е.В., Моисеева С.А., Постникова Г.Б. Каталитическое окисление миоглобина ферроцианидом калия. Тезисы докладов III съезда Российского биохимического общества, С.-Петербург, 2002, c.40. Постникова Г.Б., Моисеева С.А., Шеховцова Е.А., Сивожелезов В.С., Целикова С.В. (2004) Каталитический эффект ферри- и ферроцианида на перенос электрона в гемсодержащих белках:
кинетика и механизм. Тез.докл. III Съезда биофизиков России, июнь 2004 г., Воронеж, т.1, с.87-88.
41. Постникова Г.Б., Шеховцова Е.А., Моисеева С.А., Гораев Е.В., Сивожелезов В.С. (2004) Каталитическое окисление оксимиоглобинов ионами меди. Тез.докл. III Съезда биофизиков России, июнь 2004 г., Воронеж, т.1, с.88-89.
42. Сабурова Е. А., Дыбовская Ю. Н., Авсеенко Н. В., Сивожелезов В. С. (2005) Применение расчетов электростатического поля белков при выборе ферментов для микрокапсулирования. В сб.
"Математика. Компьютер. Образование". Под общей редакцией Г.Ю. Ризниченко. Ижевск: Научноиздательский центр "Регулярная и хаотическая динамика", 2005. Том 3, ISBN 5-9397-2495-7, с. 923933.
43. Akishina T.P., Ivanov V.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S. (2005) Study of electorostatic potentials of DNA promotors. Abstracts of the 3rd International Workshop "Quantum Physics and Communication'' QPC 2005 Dubna, Russia, 30 June - 3 July, 2005, p. 38.
44. Nicolini C., Pechkova E., Sivozhelezov V. (2005) Protein-based quantum computation Part 1. Cytochromes and nanoparticles for electronic QC. Ibid., p. 42-44.
45. Sivozhelezov V., Nicolini C. (2005) Protein-based quantum computation. Part 2. Possible use of rhosopsins as efficient optical QC detectors. Ibid., p. 45-46.
46. Marconcini S., Giacomelli L., Sivozhelezov V., Barone A., Covani U. (2006) Prediction of Leader Genes in Human Periodontitis. Abstracts for presentations at the 92nd American Association for Peridontology Annual Meeting, San Diego, 47. Mayburov S, Nicolini C, Sivozhelezov V (2006). Quantum Effects and Genetics Code: Dynamics and Information Transfer in DNA Replication. Stanford University Library Arxiv preprint q-bio/0611009.
48. Giacomelli L., Sivozhelezov V., Orlando B., Chiappe G., Derchi G., Bezerra T., Barone A., and Covani U.
(2008) Periodontitis association with diabetes and heart ischemia: a data-mining study. Abstracts of the International Association for Dental Research 86th General Session & Exhibition, Toronto, 2008, Session #63, Abstract 0295, Toronto/techprogram/session_19425.htm 49. Иванов В.В., Зрелов П.В., Полозов Р.В., Катаев А.А., Сивожелезов В.С. (2008) К вычислительной биосенсорной нанотехнологии: электростатические свойства ферментов и полиэлектролитов. В сб.:
Ядерная физика и нанотехнологии. Под общей редакцией А.Н.Сисакяна. Дубна: ОИЯИ, 2008, ISBN 5-9530-0170-3, с.293-311.
50. Chirgadze Yu.N., Ivanov V.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S., Stepanenko V.A., Zrelov P.V. (2008) Recognition of Promoter Binding Regions in the Double-Chained DNA by Transcription Factors with the Use of Molecular Cartography. In: Distributed Computing and Grid-Technologies in Science and Education:
Proceedings of the Third International Conference (GRID'2008), Dubna, June 30 - Jule 4, 2008.- Dubna:
JINR, 2008, 400 p., ISBN 978-5-9530019-8-4, - p.233-237.
51. Akishina T.P., Ivanov V.V., Zrelov P.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S. (2008) Distributed Computations in Physical Bioinformatics Tasks. Там же, p.221-252. Akishina T.P., Zrelov P.V., Ivanov V.V., Polozov R.V., Sivozhelezov V.S. (2008) Distributed Computations in Physical Bioinformatics Tasks: Calculations of Physicochemical Characteristics and Interactions of Proteins (Protein Data Bank), Their Systematization and>
54. V.V. Ivanov, Stepanenko V.A., P.V. Zrelov, E.I. Zheltukhin, Yu.N. Chirgadze, V.S. Sivozhelezov, Polozov R.V. (2009)Toward Protein-DNA Stereochemical Recognition Codes. In: Mathematical Modeling and Computational Physics (MMCP'2009): Book of Abstracts of the International Conference, Dubna, July 7-11, 2009. - Дубна : ОИЯИ, 2009. - 228p. ISBN 978-5-9530021-5-8, p.152.
55. Akishina T.P., Ivanov V.V., Stepanenko V.A., Sivozhelezov V.S., Polozov R.V.. (2009) Toward>
56. Mayburov S, Nicolini C, Sivozhelezov V (2009). Influence of Protein Electrostatic Field on Hydrogen Bonding. Stanford University Library Arxiv preprint q-bio/0911.3563.