Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Для служебного пользования

Экз. № ______от________

уч. № ___  дсп

Нестеров Егор Алексеевич

совершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга и оценка ее эффективности

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Покров-2012

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт  ветеринарной  вирусологии  и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)	Балышева Вера Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор (ГНУ ВНИТИБП) доктор ветеринарных наук, профессор (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)	Еремец Владимир Иванович Хрипунов Егор Максимович

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко РАСХН (ВИЭВ), г. Москва.

Защита диссертации состоится  л24 мая  2012 г. в л14.00 ч. на заседании диссертационного совета Д.006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл.,  г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел/факс: (49243) 62125

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан л 19 апреля 2012 г.

Размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1. Общая характеристика работы

1.1

Актуальность работы

В последние годы блютанг стал международной проблемой, требующей пристального внимания ветеринарных служб всех стран. С 2006 г. в странах Северо-Западной Европы началась эпизоотия блютанга, вызванная возбудителем 8 серотипа, с клиническими проявлениями болезни у животных, в результате чего страны понесли финансовые потери в сотни миллионов долларов. Эпизоотические вспышки блютанга были зарегистрированы в Нидерландах, Бельгии, Германии, Люксембурге и Франции, затем Дании, Швейцарии и Великобритании [9]. Перемещение непривитых животных способствовало дальнейшему распространению инфекции [5, 9] и развитию последующей второй эпизоотии 2007 г. Кроме того, впоследствии, в Нидерландах, Бельгии, Германии от овец был выделен вирус блютанга  1 и 6 серотипов [9].

На конференции в Брюсселе, состоявшейся в январе 2008 г. и посвященной борьбе с блютангом, было принято решение, что наиболее эффективным способом борьбы является массовая вакцинация животных [7]. Европейская комиссия выделила значительные средства для разработки и производства инактивированных вакцин и проведению вакцинальных компаний.

Учитывая, что среди импортируемого в Россию КРС выявляли серопозитивных животных, от которых был выделен вирус блютанга, другие торгово-экономические связи с этими странами, а также изменение климатических условий, способствовавших расширению ареала переносчиков возбудителя болезни, существует реальная угроза заноса блютанга в РФ.

На начало наших исследований во ВНИИВВиМ были разработаны отечественные инактивированные вакцины против блютанга 4, 9, 12 и 16 серотипов, однако вакцины против 1, 6 и 8 серотипов, циркулирующих на территории ЕС, в РФ отсутствовали.

Поэтому исследования по совершенствованию технологии производства, конструированию вакцинных препаратов против блютанга, циркулирующего в настоящее время на европейском континенте, и изучению их эффективности являются своевременными и актуальными.

1.2. Степень разработанности проблемы

Инактивированная диэтиленимином сорбированная вакцина против блютанга овец разработана во ВНИИВВиМ В.А. Сергеевым, Н.П. Ананьевой-Рященко и Р.В. Кошелевой в 1980 г. [1, 2]. В 1996 г. в этом же институте И.Ф.Вишняков, В.И. Жестерев, М.Б. Новикова и др. изготовили инактивированную сорбированную вакцину против блютанга 16-го серотипа, где в качестве инактиванта вируса блютанга использовали 0,1% раствор А-24. В 2003 г. Сливко В.В. с соавторами [6] разработали инактивированную эмульгированную бивалентную вакцину против блютанга 4 и 9 серотипов. Эти вакцины прошли испытания на овцах, однако эффективность их применения для крупного рогатого скота не изучалась. К настоящему времени разработаны моно- и бивалентные инактивированные сорбированные вакцины фирмами Intervet (Bovilis BTV8), Merial (BTVPUR AISap), Fort Dodge (Zulvacа8 Bovis) [12]. Не изучены вопросы эффективности применения инактивированных вакцин для КРС [10]. Fort Dodge в 2009 г получила лицензию на производство комбинированных вакцин против блютанга 1 и 8 серотипов-Zulvac 1+8 Bovis и Zulvac 1+8 ovise для КРС и овец соответственно, однако технология их получения не опубликована. К этому времени нами также разработаны бивалентные инактивированные вакцины против этих серотипов. В доступной литературе нет сообщений о разработке трехвалентной вакцины против блютанга 1, 6 и 8 серотипов, хотя эпизоотическая ситуация, наблюдаемая в Европе в 2007-2008 гг., свидетельствует о необходимости и своевременности проведения исследований в этом направлении.

1.3 Цель и задачи исследований

Целью данной работы является совершенствование средств специфической профилактики блютанга крупного и мелкого рогатого скота на основе актуальных для РФ штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов и оценка их эффективности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить наиболее технологичные культуры клеток и оптимизировать условия культивирования 1, 6 и 8 серотипов вируса блютанга монослойным и суспензионным методами;

- изучить биологические свойства штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов, используемых при изготовлении инактивированной вакцины;

- провести сравнительную оценку эффективности сорбированных и эмульгированных форм экспериментальных образцов вакцин на животных;

- определить дозы и способ введения эмульгированных и сорбированных моно- и поливалентных вакцин против вируса блютанга, обеспечивающих формирование иммунитета у КРС, овец и коз;

- изготовить экспериментальные серии эмульгированных и сорбированных поливалентных вакцин против блютанга на основе штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов и изучить их иммунобиологические свойства;

- испытать в производственных условиях эффективность применения эмульгировнной вакцины против блютанга 8 серотипа на КРС и оценить влияние вакцинации на морфологические и биохимические показатели крови животных.

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые в России сконструированы бивалентная и трехвалентная инактивированные вакцины против блютанга 1 и 8 серотипов и 1, 6 и 8 серотипов соответственно и изучены их иммунобиологические свойства в опытах на крупном и мелком рогатом скоте, а также влияние вакцинации на состояние организма животных.

Определены вирусрепродуцирующие и технологические характеристики перевиваемых клеточных культур ПС,  ПСГК-60 и ВНК-21/13 и научно обоснованы перспективы их использования для получения вируссодержащего сырья вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов с целью изготовления инактивированных вакцин.

Усовершенствована технология изготовления инактивированной вакцины против блютанга, заключающаяся в использовании штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов, представляющих наибольшую опасность заноса в Россию; перевиваемой линии клеток - ПС, изменении режима инактивации препаратом А-24 и применении в составе вакцины адъюванта - Montanid ISA -70.

1.5 Практическая значимость работы

Усовершенствована технология изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга в моно-, би- и трехвалентных вариантах с использованием адъюванта Montanid ISA -70, позволяющая снизить расход вирусного сырья в 4,3 раза по сравнению с сорбированной вакциной, и в выборе универсальных взаимозаменяемых перевиваемых культур клеток. Для культивирования штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов наряду с перевиваемой культурой клеток ВНК-21/13 предложена культура клеток ПС, обеспечивающая стабильное накопление вирусного антигена.

Разработаны безвредные и иммуногенные бивалентные (против 1 и 8 серотипов) и трехвалентные (1, 6 и 8 серотипов) инактивированные сорбированные и эмульгированные вакцины против блютанга, которые рекомендованы для профилактики этой болезни у жвачных животных.

1.6 Апробация работы

Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы представлены, заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров 2008-2011гг.), Международных научно-практических конференциях ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (г. Покров, 2009 г.), ГНУ ВНИТИБП (г. Щелково, 2009 г.), РФФИ (г. Сергиев Посад, 2009 г.), Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (п. Краснообск, 2010 г.).

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

В соответствии с формулой специальности 03.02.02 - вирусология, занимающейся проблемами противовирусного иммунитета, инфекционности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, вызываемых вирусами заболеваний, включающей область исследований: изучение гуморального иммунитета, проблемы частной вирусологии, разработку мер предупреждения и иммунопрофилактики вирусных инфекций.

Полученные соискателем научные результаты соответствуют пунктам 7, 9, 10 паспорта специальности 03.02.02 - вирусология.

1.8 Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1.9 Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах, иллюстрирована 17 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 213 источников, из которых 156 - иностранные.

1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Биологические свойства штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов, характеризующие их особенности.

2.Технология изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга, позволяющая создать напряженный продолжительных иммунитет и предотвращающая вирусемию.

3.Результаты изучения иммуногенности экспериментальных моно- и полиштамных инактивированных вакцин и влияния вакцинации на морфологические и биохимические показатели крови животных.

4.Эффективность применения инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга 8 серотипа в хозяйстве.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной и методической помощи сотрудников лабораторий НЭО, Биофизики, Диагностики.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.1.1 Вирусы: В работе использовали штаммы вируса блютанга: 1 серотип, эпизоотический штамм 611, 5 пассаж в к/к ПП; 6 серотип, 5 пассаж в к/к ПП; 16 серотип, эпизоотический штамм Тапхар 11 пассаж в к/к ПСГК-60; 8 серотип, штамм BTV NET 2006-A (БТВ-8), 2 пассаж в к/к ВНК-21/13. Инфекционная активность вирусов - 5,5 - 6,5 lg ТЦД50/см3.

2.1.2 Специфические референс сыворотки овец или иммуноасцитические жидкости мышей к 1, 6, 8 серотипам вируса блютанга. Вирусы и сыворотки получены из лаборатории Музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.3 Перевиваемые культуры клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-60) кат. № 25, почки зеленой мартышки (VERO B), аттестованной по требованиям ЕССС Подчерняевой Р.Я., почки сайги (ПС) кат. № 31.1, сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13) кат. № 39.3. Культуры клеток получали в лаборатории Культур клеток с музеем клеточных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.4 Реактивы: 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан (А-24, теотропин), гидроокись алюминия (ГОА, с 6% сухого остатка), сапонин (10% р-р), парфюмерное масло Marcol - 52 (Франция), эмульгатор № 139, полученный из ООО НПО КВАРТАСИЛ, адъювант Montanid ISA-70 производство Seppiс (Франция). В работе использовали эти и другие реактивы, упомянутые по тексту диссертации, уровня не ниже ХЧ.

2.1.7 Животные: В опытах использовали клинически здоровых овец и коз 6-18 месячного возраста; телят чёрно-пёстрой и голштино-фризской породы 2-4-месячного возраста; нетелей голштино-фризской породы в возрасте 1-1,5 года; мышат-сосунов 1-2-суточных; куриные эмбрионы 9-10-суточные.

2.1.8 Культивирование вируса блютанга в перевиваемых культурах клеток ПСГК-60, ПС, VERO B и ВНК-21/13 проводили стационарным, роллерным или суспензионным способом. Множественность заражения составляла 0,01-0,0001 ТЦД50/кл. Инфицированную культуру клеток инкубировали при (370,5) 0С в течение 2 - 4 суток в зависимости от серотипа вируса, клеточного субстрата, множественности заражения и условий культивирования вируса.

2.1.9 Инактивацию вируссодержащего материала осуществляли препаратом А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан или теотропин) в конечной концентрации 0,05% при (370,5) 0 С в течение 72 часов.

2.1.10 Определение полноты инактивации вируса блютанга. Полноту инактивации вируса определяли путем проведения трех последовательных пассажей в культурах клеток ПС или VERO B и оценивали по отсутствию цитопатического действия вируса в трех последовательных пассажах.

2.1.11 Приготовление масляного адъюванта. Для приготовления масляного адъюванта использовали минеральное масло Marcol - 52 и эмульгатор № 139. Адъювант получали смешиванием 95 % масла и 5 % эмульгатора; или использовали адъювант Montanid ISAЦ70.

2.1.12 Оценка иммуногенности. Иммуногенность вакцины оценивали по титру вируснейтрализующих антител в крови вакцинированных животных и/или их контрольному заражению вирулентным вирусом. Перед вакцинацией у всех животных отбирали пробы крови для исследования сывороток на наличие вируснейтрализующих (ВН-) антител. Реакцию нейтрализации ставили по общепринятой методике с постоянной дозой вируса (1000 ТЦД50/см3) в культурах клеток VERO B и ПС.

2.1.13 Постановка ТФ ИФА. Для выявления анти-VP7 антител к вирусу блютанга использовали твердофазный вариант ИФА ID screen Bluetongue competition производства ID Vet (Франция). Оценку антигенной активности вируссодержащего культурального сырья проводили сэндвич-вариантом ТФ ИФА на основе тест-системы с моноклональными антителами 16Е11.2 к группоспецифическому белку VP7, разработанную д.б.н. профессором А. А. Стрижаковым.

2.1.14 Выделение вируса на куриных эмбрионах, мышатах-сосунах и культурах клеток. Выделение вируса на куриных эмбрионах проводили согласно Методическим положениям по лабораторной диагностике блютанга [4].

Для выделения вируса на 2-3-суточных мышатах-сосунах исследуемый материал вводили им интрацеребрально в дозе 0,02 см3. При выделении вируса в культурах клеток VERO В и ПС последние инокулировали подготовленными пробами крови и органов животных в разведениях 10-1 и 10-2. Учет вели по наличию цитопатических изменений на 3-5 сутки культивирования.

2.1.15 Выявление генома вируса блютанга. Для выявления генома вируса блютанга использовали: стандартный вариант ПЦР для выявления 10 сегмента РНК вируса; а также серотип-специфическую ПЦР. Исследования проводили совместно с сотрудниками лаборатории Биофизики.

2.1.16 Электрофорез и постановка иммуноблотта. Электрофоретическое разделение белков осуществляли в 10 % SDS-полиакриламидном геле (ПААГ-SDS) по Laemmli [11]. Иммуноблоттинг проводился по методу Tombin P.K. et al [13].

2.1.17 Статистическая обработка результатов исследований. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики [3] с использованием пакета программ Microsoft Office и определением критерия достоверности по Стьюденту.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Обоснование выбора штаммов вируса блютанга при разработке средств специфической профилактики

В 2007-2008 гг. эпизоотия блютанга в северо-западной части Центральной Европы, вызванная 8 серотипом, представляла серьезную угрозу заноса этого возбудителя в РФ. Позднее там же были выделены штаммы блютанга, относящиеся к 1 и 6 серотипу. Учитывая это, было принято решение о разработке инактивированной вакцины против этих серотипов вируса блютанга, взяв за основу работы, выполненные ранее при конструировании инактивированных вакцин против блютанга во ВНИИВВиМ.

3.2 Иммунобиологические свойства штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов

3.2.1 Культивирование вируса блютанга в перевиваемых культурах клеток. При культивировании вируса стационарным методом в клетках ПСГК-60, ВНК-21/13, ПС и VERO В при множественности заражения 0,01 ТЦД50/кл вирус блютанга 1, 6, 8 и 16 серотипов накапливался в пределах 5,83-6,75 lg ТЦД50/см3 (табл.1). Длительность культивирования зависела от серотипа вируса и составляла от 2 до 4 суток.

Таблица 1

Вирусрепродуцирующая активность различных культур клеток

в отношении вируса блютанга.

n=3

Культура клеток	Титр вируса (lg ТЦД50/см3)
	1 серотип	6 серотип	8 серотип	16 серотип
Vero В	6,50+0,18	6,50+0,12	6,25+0,22	6,38+0,17
ПС	6,63+0,12	6,63+0,12	6,50+0,16	6,75+0,17
ПСГК-60	6,38+0,12	5,83+0,34	6,38+0,12	6,25+0,22
ВНК 21/13	6,38+0,12	6,25+0,42	6,25+0,22	6,38+0,22

В результате проведенных исследований определены следующие оптимальные условия культивирования вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов: множественность заражения - 0,01-0,0001 ТЦД50/кл, поддерживающая среда Игла (МЕМ) с 2 % сыворотки КРС при рН 7,0-7,4; заражение односуточной культуры клеток со сформировавшимся монослоем. Использование 2 и 3 суточных культур клеток VERO В и ПС для культивирования вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов приводило к снижению титра вируса на 1,00-1,25 lg ТЦД50/см3.

При проведении 20 серийных пассажей 1, 6 и 8 серотипов вируса в перевиваемых культурах ПС и VERO В инфекционная активность составляла 6,00 - 6,50 lg ТЦД50/см3. К 30 пассажу титр вируса снизился и составлял для 1 серотипа 4,50, 6 - 5,00 и 8 - 4,75 lg ТЦД50/см3. Анализ нуклеотидных последовательностей 2 и 10 сегментов вируса блютанга 1, 25 и 30 пассажей методом нуклеотидного секвенирования (Applied Biosysterms 3130, USA) [8, 14] показал высокий уровень консерватизма исследованных сегментов генома. Уровень гомологии составил 99-100%. Таким образом, можно судить о стабильности структуры изучаемых сегментов в процессе длительного культивирования вируса.

3.2.2 Оценка антигенной активности вируссодержащего культурального сырья сэндвич-вариантом ТФ ИФА. Проведены исследования по определению протективных антигенов вируса блютанга в вируссодержащем сырье, полученном в разных клеточных системах и имеющем одинаковую инфекционную активность - 6,0 lg ТЦД50/см3. Стабильное накопление специфического антигена вируса блютанга наблюдали в культуре клеток ПС, титр которого в ТФ ИФА составлял 1:32 - 1:128. В культурах клеток ВНК 21/13 и ПСГК-60 его содержание в различных сериях вирусного сырья было неодинаковым и колебалось от 1:2 - 1:256 и 1:2 - 128 соответственно. Поэтому наряду с получением вирусного сырья в культуре клеток ВНК-21/13 предложен роллерный способ культивирования вируса блютанга в перевиваемой культуре клеток ПС, гарантирующий получение вируссодержащего материала со стабильной антигенной активностью в необходимых объемах.

3.2.3 Определение иммуногенности инактивированных препаратов, полученных на основе штаммов вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов. При изучении инактивации вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов препаратом А-24 установлено, что во время проверки полноты инактивации вирусного сырья в некоторых сериях материала выявляли вирус блютанга во 2 или 3 пассажах. Материал дополнительно выдерживали при (370,5) 0С 24 часа и проводили повторную проверку. Поэтому для полной инактивации оставшегося вируса, инфекционная активность которого ниже 1,0 lg ТЦД50/см3 и не всегда может быть обнаружена при титровании в результате случайного отбора проб, практическое время инактивации увеличили до 3 суток.

Для оценки иммуногенности инактивированного вирусного сырья приготовлены инактивированные сорбированные моновакцины, которыми иммунизировали овец (по 2 головы на каждый серотип) по 2 см3 внутримышечно. У животных, привитых вакцинами, приготовленными на основе штаммов 1, 6 и 8 серотипов вируса блютанга (инфекционная активность 6,50-6,75 lg ТЦД50/см3), выявляли ВН-антитела в титрах 1:2, 0-1:2, 1:2 соответственно. В крови привитых овец вирус не обнаруживали в трех последовательных пассажах в культуре клеток ПСГК-60. После контрольного заражения (106,0 ТЦД50) привитые животные оставались клинически здоровыми в течение 21 суток (срок наблюдения).

Таким образом, показано, что данный режим инактивации вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов обеспечивает полную потерю их инфекционной активности и сохраняет антигенность инактивированных препаратов.

3.3 Разработка производственной технологии культивирования вируса

При производстве инактивированных вакцин необходимо получать значительные количества вирусного сырья. Поэтому разрабатывали оптимальные параметры культивирования вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов роллерным и суспензионным способами, как наиболее производительными и технологичными. Вирус блютанга  культивировали в роллерных бутылях (3,5 л) и флаконах (0,5 л). Сосуды помещали на стеллажно-ярусный аппарат в горизонтальном положении и вращали вокруг своей оси со скоростью 10-12 об/час. При роллерном способе культивирования в культурах клеток ПС и ПСГК-60 инфекционная активность вирусного материала составляла от 6,000,25 до 6,860,17 lg ТЦД50/см3.

Выращивание вируса блютанга в суспензии клеток ВНК-21/13 проводили в реакторах объемом 5,0 дм3, 20 дм3 и 100 дм3. Перед масштабированием наработки клеточной и вирусной биомассы проводили предварительную оценку питательной среды и сыворотки согласно разработанным нами Методическим положениям по оценке питательных сред и сывороток крови для суспензионного культивирования клеток и вирусов, используя среду, состоящую из 0,25 % ФГМ-суспензионной и 0,5 % ГЛА на солевом растворе Эрла, взятых в объемном соотношении 1:1, рН 7,0-7,4. При оптимальных параметрах культивирования: исходной концентрации клеток 0,7-1,5 млн. кл/см3, множественности заражения 0,01-0,06 ТЦД50/кл накопление вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов составило 6,50-6,75 lg ТЦД50/см3. В результате проведенных исследований разработана технология культивирования вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов роллерным и суспензионным способами.

3.4 Выбор формы инактивированной вакцины против блютанга 8 серотипа и оценка ее эффективности на КРС

3.4.1 Приготовление сорбированной и эмульгированной форм инактивированной вакцины. Вирус блютанга 8 серотипа, полученный в суспензионной культуре клеток ВНК-21/13 с инфекционной активностью 6,00 ТЦД50/см3 инактивировали препаратом А-24 в конечной концентрации 0,05% при (37 ± 0,5) 0 С в течение 3 суток.

Сорбированную вакцину готовили путем добавления к инактивированному вирусному сырью ГОА (до конечной концентрации сухого остатка 0,6 %), материал тщательно перемешивали в течение 30-45 мин и оставляли  при температуре 4-6 0С для осаждения нагруженного антигеном гидроксала. Через 24 часа удаляли 1/3 надосадка, доливали вируссодержащий материал до первоначального объема и вносили сапонин (конечная концентрация 1,0 мг/см3). При изготовлении эмульгированной вакцины инактивированное сырье смешивали с масляным адъювантом, состоящим из 5% эмульгатора №139 и 95% минерального масла Marcol - 52 в соотношении 1:1. Смесь адъюванта и вирусного сырья эмульгировали и качество эмульсии оценивали по сохранению капли в воде и устойчивости при центрифугировании (2000 об/мин 30 мин).

3.4.2 Оценка иммунобиологических свойств инактивированных вакцин. Изучение иммунобиологических свойств инактивированных вакцин против блютанга 8 серотипа проводили на телятах и нетелях голштино-фризской породы. Сорбированную вакцину вводили подкожно по 2,0 см. Эмульгированную - внутримышечно по 2 и 3,0 см. Безвредность вакцин оценивали на 2 телятах (по одному на каждый препарат), которых прививали однократно в дозе 6 см3. Контрольное заражение (КЗ) вакцинированных телят и 1 невакцинированного (контрольного) проводили внутривенно эпизоотическим штаммом ВТV NET 2006-А в дозе 1000000 ТЦД50 через 28 суток после второй прививки.

Через 14 дней после повторной прививки у телят, вакцинированных эмульгированной вакциной в дозе 2,0 см3, титр ВН-антител составлял 1:2 и 1:16 (табл. 2). Иммунизация телят этой вакциной в дозе 3,0 см3  вызывала индукцию ВН-антител в более высоких титрах - 1:20 и 1:32. У телят, привитых сорбированной вакциной, ВН-антител не обнаруживали (<1:2). При исследовании сывороток методом ТФ ИФА титр антител у этих животных составлял 1:2.

После КЗ вакцинированные телята не заболевали блютангом и оставались клинически здоровыми в течение 60 суток после заражения (срок наблюдения). У контрольного теленка на 4-8 сутки отмечали повышение температуры тела до 40,7 C, угнетение, снижение аппетита, затрудненное дыхание, тахикардию и серозные истечения из носовой полости. Титр ВН-антител после КЗ на 20 и 49 сутки составлял 1:6 и 1:18 соответственно.

Таблица 2

Выявление специфических антител и вируса блютанга у КРС

n=3

Испытуемая вакцина	Кол-во животных в группе	Прививная доза (см3)	Титры антител через 14 дней после 2 прививки (разведение)		Выделение вируса (генома в ПЦР) после контрольного заражения (сутки)
			в РН	в ТФ ИФА	КЭ	КК	мы-ши	ТФ ИФА	ПЦР
Сорбиро-ванная	2	2,0х2	<1:2	1:2, 1:2	4, 7	-	-	-	4, 7, 20 -
Эмульгированная	2	2,0х2	1:2, 1:16	1:2, 1:16	н/и	-	-	-	-
	2	3,0х2	1:20, 1:32	1:16, 1:32	н/и	-	-	-	-
Контроль	1	0	0	0	4, 7, 20	4, 7	4, 7	7, 27	4-60

Примечание: (- ) - вирус не выделен; КК-культура клеток, КЭ- куриные эмбрионы; н/и - не исследовали

Из крови контрольного теленка вирус блютанга выделяли на куриных эмбрионах на 4, 7 и 20 сутки после КЗ, в культурах клеток VERO В и ВНК-21/13, а также на мышатах-сосунах - на 4 и 7 сутки. Методом ОТ-ПЦР геном вируса выявляли в течение 2 месяцев. В то же время гибель куриных эмбрионов наблюдали при инфицировании их эритроцитами, полученными от одного теленка, вакцинированного сорбированной вакциной на 4 и 7 сутки после КЗ. Геном вируса из крови этого теленка выделяли методом ОТ-ПЦР только на 4, 7 и 20 сутки.

На основании результатов сравнительных испытаний двух форм инактивированной вакцины показано, что сорбированная и эмульгированная вакцины после двукратной иммунизации защищали телят от заболевания при заражении вирулентным вирусом. У привитых инактивированными вакцинами телят наблюдали зависимость титра антител от кратности прививки, вводимого объема, формы вакцинного препарата. Следует отметить, что эмульгированная вакцина вызывала образование более напряженного иммунного ответа у животных.

3.4.3 Испытание инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга 8 серотипа на КРС различных возрастных групп. Учитывая, что эмульгированная вакцина индуцирует у телят синтез ВН-антител в больших титрах, чем сорбированная, проведены опыты по вакцинации этим препаратом телят 2-4- месячного возраста и нетелей голштино-фризской породы в возрасте 1,0-1,5 года. Животных (по 2 на каждую дозу вакцины) иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней; телят - в дозах 2,0 и 3,0 см3, нетелей - в дозах 3,0 и 5,0 см. Двух телят не вакцинировали (контрольные).

После вакцинации температура тела всех животных оставалась в пределах физиологической нормы. На месте введения эмульгированной вакцины у телят и нетелей обнаруживали ограниченные уплотнения диаметром до 4-6 см, на месте которых у отдельных животных образовывались гранулемы. Через 28 дней после второй прививки у телят, вакцинированных эмульгированной вакциной в дозе 2,0 см3, титр ВН-антител составлял 1:8 и 1:16, у животных в дозе 3,0 см3 - 1:8 и 1:20; у нетелей, привитых в дозе 3,0 см3 и 5,0 см3, титр ВН-антител был одинаков и составлял 1:8-1:16 (табл. 3).

Телят заражали вирулентным вирусом блютанга, штамм БТВ-8 через 28 суток после второй прививки. Вакцинированные телята после КЗ оставались клинически здоровыми в течение 60 суток (срок наблюдения). У невакцинированных телят на 3-8 сутки после КЗ отмечали повышение температуры тела до 40,5 0С с проявлением клинических признаков блютанга.

Полученные данные указывают, что инактивированная эмульгированная вакцина против блютанга в испытуемых дозах для телят - 2,0 и 3,0 см3 и нетелей - 3,0 и 5,0 см3 индуцирует образование ВН-антител в сравнимых титрах. Это свидетельствует о выраженном иммунном ответе животных, привитых этими дозами вакцины.

Таблица 3

Уровень ВН-антител у животных, привитых инактивированной эмульгированной вакциной против блютанга

n=3

Возраст	Прививная доза (см3)	Уровень ВН-антител
		1 прививка		2 прививка			КЗ
		Сроки взятия проб крови (сутки)
		7	14	7	14	28	7	14	30
Телята 2,5-4,0 мес	2,0		0, 0	1:2, 1:2	1:2, 1:6	1:8, 1:16	1:76, 1:80	1:64, 1:80	1:76, 1:80
	3,0	0, 0	0, 1:2	0, 1:2	1:2, 1:4	1:8, 1:20	1:40, 1:80	1:64, 1:80	1:80
Нетели 12-18 мес	3,0	0, 0	0	1:2,  1:2	1:2, 1:4	1:8, 1:16	1:80, 1:80	1:64, 1:76	1:80, 1:90
	5,0	0, 0	0, 1:2	1:2, 1:2	1:4, 1:4	1:8, 1:8	1:64 1:80	1:76, 1:80	1:80, 1:90
Телята* 3 мес	-	-	-	-	-	-	0, 0	1:4, 1:6	1:20, 1:32

* - невакцинированные

Таким образом, можно сделать вывод, что доза эмульгированной вакцины против блютанга составляет для телят 2,0 см3, нетелей - 3,0 см3.

3.4.4 Изучение влияния концентрации ГОА на сорбцию вируса блютанга. С целью повышения иммуногенной активности сорбированной вакцины была изучена зависимость сорбции гидроокисью алюминия (ГОА) вируса блютанга от ее конечной концентрации в вируссодержащем материале.

В вируссодержащую суспензию вносили предварительно пропущенную через коллоидную мельницу ГОА до конечной ее концентрации 0,6%, 1,2%, 1,8%. Смесь вирусного материала с ГОА перемешивали в течение 30-45 мин и оставляли при температуре (4-8) 0 С для осаждения нагруженного антигеном гидроксала. Через 24 часа отбирали пробы надосадочной жидкости для определения в ней титра несорбированного ГОА вируса. Наибольшую сорбцию вируса наблюдали при добавлении ГОА до конечной концентрации 1,2%. Поэтому для изготовления сорбированной формы вакцины в дальнейшем использовали ГОА с этой концентрацией.

3.5 Конструирование бивалентной инактивированной вакцины против блютанга 1 и 8 серотипов

Определение компонентного состава вакцины. При испытании иммуногенности экспериментальных образцов инактивированных сорбированных моновакцин на основе вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов, с исходной инфекционной активностью вируссодержащего сырья, полученного в культуре клеток ПС, 6,50 -6,75 lg ТЦД50/см3, у овец, привитых этими препаратами, выявляли ВН-антитела ко всем серотипам в одинаковых титрах 1:2 (п. 3.2.3). Учитывая это, при конструировании бивалентной вакцины соотношение штаммов вируса блютанга 1 и 8 серотипов в препарате составляло 1:1 при равной инфекционной активности вирусного сырья. При изготовлении сорбированной вакцины к инактивированному сырью добавляли ГОА до конечной концентрации сухого остатка 1,2 %, затем его концентрировали в 1,5 раза и вносили сапонин.

Одну серию эмульгированной вакцины готовили с масляным адъювантом Marcol - 52 в соотношении 1:1, другую - с адъювантом Montanid ISA -70 при соотношении вирусного сырья и эмульгатора 3:7 соответственно.

Иммуногенность приготовленных серий вакцин проверяли на серонегативных к вирусу блютанга 4 нетелях 7-8 месяца стельности и 8 телятах 2 - 3-месячного возраста.

У нетелей, привитых сорбированной вакциной, титр ВН-антител после второй прививки к обоим серотипам вируса составлял 1:32, эмульгированными вакцинами - 1:32-1:64 (табл. 4). У вакцинированных телят титр ВН-антител был несколько ниже и составлял 1:8-1:16 (табл. 5). На этом уровне ВН-антитела сохранялись в течение 60 суток (срок наблюдения).

Таблица 4

Уровень специфических антител у нетелей, вакцинированных бивалентными вакцинами против блютанга 1 и 8 серотипов

n=3

Вакцина (доза-3 см3)

№ животных

Титр ВН-антител

1 вакцинация

2 вакцинация

14 сутки

21 сутки

14 сутки

40 сутки

50 сутки

серотипы

1

8

1

8

1

8

1

8

1

8

Сорбированная (ГОА)

7788

1:4

1:2

1:4

1:4

1:16

1:16

1:32

1:64

1:32

1:32

0491

1:4

1:4

1:8

1:8

1:16

1:32

1:16

1:32

1:32

1:32

Эмульгированная Marcol - 52

8156

1:8

1:4

1:8

1:8

1:32

1:16

1:64

1:64

1:32

1:64

Эмульгированная Montanid ISA -70

2121

1:8

1:8

1:8

1:8

1:32

1:32

1:32

1:64

1:64

1:64

На 30 день после вакцинации по 1 теленку из каждой группы заражали внутривенно вирусом блютанга (2 теленка - первым серотипом, 2 - восьмым). Все телята оставались клинически здоровыми. Вирус блютанга не был выделен из всех проб крови в культурах клеток, геном вируса не обнаруживали после КЗ.

Таблица 5

Выявление специфических антител у телят, вакцинированных бивалентной вакциной против блютанга 1 и 8 серотипов

  n=3

Вид вакцины, доза введения	Титр ВН-антител
	21 сут. после 1 вакцинации		14 сут. после 2 вакцинации		30 сут. после 2 вакцинации
	1 серотип	8 серотип	1 серотип	8 серотип	1 серотип	8 серотип
Сорбированная (ГОА), 2,0 см3	1:2, 1:2	1:4,1:4	1:8, 1:8	1:8, 1:8	1:8, 1:16	1:16, 1:16
Сорбированная, (ГОА), 3,0 см3	1:2, 1:4	1:2, 1:4	1:8, 1:8	1:8, 1:16	1:8, 1:8	1:16, 1:16
Эмульгированная, 2,0 см3 (Мarcol - 52, Montanid ISA -70)	1:4, 1:4	1:2, 1:4	1:16, 1:16	1:16, 1:16	1:16, 1:16	1:16, 1:16
Эмульгированная, 3,0 см3(Мarcol - 52, Montanid ISA -70)	1:4, 1:8	1:4, 1:4	1:16, 1:16	1:16, 1:16	1:16, 1:16	1:16, 1:16

На месте введения эмульгированной вакцины с адъювантом на основе минерального масла Marcol - 52+ эмульгатор № 139 у животных обнаруживали ограниченные уплотнения диаметром до 5 см, на месте которых впоследствии образовалась гранулеммы (рис. 1). Поэтому в дальнейших исследованиях использовали адъювант Montanid ISA -70.

Рис. 1 Разрез мышечной ткани на месте введения инактивированных вакцин с адъювантами: 1) Мarcol - 52 + эмульгатор №139; 2) Montanid ISA -70

Полученные данные свидетельствуют, что двукратная вакцинация телят и нетелей бивалентной инактивированной сорбированной и эмульгированной вакцинами против блютанга индуцирует у животных образование ВН-антител в защитных титрах, что и при применении моновакцин.

3.6 Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга

В результате проведенных исследований усовершенствована технология изготовления инактивированной эмульгированной вакцины, заключающаяся в том, что: 1) Для полной инактивации культурального материала, содержащего вирус блютанга 8 серотипа препаратом А-24 при (370,5) 0С время инактивации составляет 72 часа при сохранении его иммуногенных свойств. 2) Использование в качестве адъюванта Montanid ISA -70 позволяет уменьшить расход вирусного сырья на 40% без снижения антигенной активности и исключить образование уплотнений, впоследствии проявлявшихся в виде гранулем. 3) Для культивирования вируса блютанга предложена перевиваемая культура клеток ПС и роллерный способ культивирования, обеспечивающие стабильное накопление вируса с инфекционной активностью не ниже 6,5 lgТЦД50/см3.

На основании проведенных исследований разработана Технологическая инструкция по изготовлению и контролю инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга, утвержденная директором института 21.01.2010 г.

Использование культуральной системы ПС, в которой протективный антиген накапливается более стабильно и повышение его содержания в прививной дозе путем концентрирования материала в 1,5 раза, а также увеличение прививной дозы (3,0 см3), позволило получить сорбированную вакцину, создающую более напряженный иммунитет и предотвращающей вирусемию.

3.7 Конструирование трехвалентной инактивированной вакцины против блютанга 1, 6 и 8 серотипов и изучение ее иммунобиологических свойств на крупном и мелком рогатом скоте

Экспериментальные серии трехвалентной вакцины конструировали с учетом усовершенствованной технологии. Сорбированную и эмульгированную инактивированные вакцины готовили аналогично изготовлению бивалентной вакцины. При конструировании эмульгированной вакцины использовали в качестве адъюванта Montanid ISA -70.

Иммуногенность экспериментальных серий трехвалентных сорбированной и эмульгированной вакцин против блютанга 1, 6 и 8 серотипов проверяли на телятах (возраст 2-2,5 месяца - 8 голов), овцах (возраст 1,0-1,5 лет - 4 головы) и козах (возраст 3-4 месяца - 2 головы, 8-14 месяцев - 7 голов).

Контрольное заражение животных проводили внутривенно смесью штаммов 1, 6 и 8 серотипов через 21 сутки после 2 прививки.

Эмульгированную вакцину вводили внутримышечно: телятам в верхнюю треть шеи по 3,0 см3, овцам по 1,5 см3, козам по 2,0 см3, 1,5 см3 и 1,0 см3 в область внутренней поверхности бедра; сорбированную вакцину - подкожно в тех же дозах.

Оптимальной иммунизирующей дозой вакцины для овец и коз являлось 1,5 см3 при исходной инфекционной активности вирусного материала не ниже 6,5 lg ТЦД50/см3.

У телят, вакцинированных сорбированной вакциной, на 21 сутки после первой и второй прививки уровень ВН-антител составлял 2,0 - 2,6 log2 и 4,0 - 4,4 log2 соответственно (рис. 2) и оставался практически на том же уровне в течение 70 суток (срок наблюдения). Аналогичные титры ВН антител были в сыворотках крови телят, привитых эмульгированной вакциной (рис. 3). Вакцинированные телята не заболевали блютангом после КЗ.

ВН-антитела накапливались в сравнимых титрах у телят, овец и коз, привитых трехвалентной сорбированной и эмульгированной вакцинами против блютанга. На 21 сутки после 2 прививки уровень ВН-антител у телят, овец и коз составлял 3,0-4,3 log2 (рис. 4 и 5).

Рис. 2 Динамика накопления ВН-антител у телят, привитых трехвалентной сорбированной вакциной

Из всех проб крови вакцинированных животных вирус блютанга не был выделен в культуре клеток и куриных эмбрионах, а его геном не обнаруживали методом ПЦР.

Рис. 3 Динамика накопления ВН-антител у телят, привитых трехвалентной эмульгированной вакциной

Рис. 4 Средние значения титра ВН - антител у животных, привитых трехвалентной сорбированной вакциной

Рис 5 Средние значения титра ВН - антител у животных, привитых трехвалентной эмульгированной вакциной

Методом иммуноблотинга было показано, что вирусспецифические антитела после иммунизации животных трехвалентной инактивированной вакциной против блютанга 1, 6 и 8 серотипов вырабатываются на антигены всех серотипов, входящих в состав вакцины (рис.6).

Рис. 6 Иммуноблоттограмма электрофоретически разделенных в 10% ДСН-ПААГ белков в восстанавливающих условиях. Трек 1 - специфический антиген вируса блютанга 1-го серотипа с антителами сыворотки крови телят, полученной на 7-е сутки после двукратной вакцинации. Трек 2- специфический антиген вируса блютанга 6-го серотипа с антителами сыворотки крови телят, полученной на 7-е сутки после двукратной вакцинации. Трек 3 - специфический антиген вируса блютанга 8-го серотипа с антителами сыворотки крови телят, полученной на 7-е сутки после двукратной вакцинации. Трек 4 - нормальный антиген.

Таким образом, результаты сравнительных испытаний двух форм (сорбированной и эмульгированной) инактивированной трехвалентной вакцины против блютанга показали, что оба препарата индуцируют образование ВН-антител в защитных титрах и предохраняют животных от заболевания блютангом при КЗ. Это свидетельствует о выраженном иммунном ответе животных, привитых этими дозами вакцины. По результатам исследований проведены комиссионные испытания (Акт от 24.05.2010 г.).

3.8 Определение физических свойств и иммуногенности инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга

Изучены физические свойства и иммуногенность инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга после длительного хранения (12 и 24 мес.).

В процессе хранения вакцины кинематическая вязкость почти не изменилась и была в пределах допустимых норм. В течение 12 и 24 месяцев хранения наблюдали отслоение масла не более 10%, что является допустимым в соответствии с требованиями СТО (№ 004955490061-2008) на вакцину.

Таким образом, результаты исследований физических свойств образцов эмульгированной вакцины показали высокую стабильность и гомогенность вакцинной эмульсии.

Вакцина после 24 месяцев хранения при (4-8) 0С сохраняла свою иммуногенность и вызывала образование ВН- антител после второй прививки в титрах 1:4-1:16 (табл. 6).

Таблица 6

Характеристика инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга в процессе хранения при (4-8) 0С

Наименование показателя	Характеристика	Через 12 месяцев	Через 24 месяца
Стабильность эмульсии	Эмульсия сметанообразной бледно-розового цвета.	Отделение масла  5-7% от объема	Отделение масла  9-10% от объема
Вязкость (мм2/с),	48,8	56,4	63,7
Иммуногенность (антигенная активность)	Стимулирует образование в крови вакцинированных животных вируснейтрализующих антител в титрах 1:4-1:16

3.9 Морфологические и биохимические исследования крови животных, привитых инактивированными вакцинами против блютанга

С целью изучения влияния вакцинации на организм анализировали морфологические и биохимические показатели крови животных после прививки.

Установлено, что на 3-7 сутки после вакцинации в крови КРС по отношению к первоначальному уровню увеличивалось содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов. С 3 по 21 сутки повышался показатель лейкоцитов, наибольший уровень которых отмечали на 3 день после иммунизации - 16,481,22 х 109/л. После второй прививки данный показатель был сравним с исходным уровнем. Так же фиксировали снижение числа лимфоцитов до 29,12,09 % от 100 лейкоцитов. Изменения, характерные для данных морфологических показателей крови, могли свидетельствовать о наличии местной воспалительной реакции, связанной с введением вакцины. Также с 7 по 21 и с 3 по 14 сутки в крови животных увеличивалось количество моноцитов и эозинофилов.

Причем, по данным общего анализа крови телят, овец и коз, иммунизированных эмульгированной вакциной, в которой использовали минеральное масло Marcol-52 и эмульгатор №139, увеличение уровня эозинофилов крови было в 2 раза выше, чем при использовании других образцов вакцин (рис. 7), что, вероятно, связано с повышенной аллергической реакцией организма на введение эмульгированной вакцины с адъювантом Marcol-52 + эмульгатор №139.

Биохимический анализ крови вакцинированных нетелей показал незначительное увеличение в плазме крови таких ферментов, как аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, понижение содержания альбумина, креатина и мочевины по сравнению с контрольной группой животных. Однако динамика отклонений данных показателей находилась в пределах физиологической нормы.

Рис. 7 Процентное содержание эозинофилов в крови телят на разные сутки после вакцинации инактивированными вакцинами против блютанга с разными адъювантами

Таким образом, вакцинация овец, коз и КРС инактивированной эмульгированной и сорбированной вакцинами против блютанга не оказала отрицательного воздействия на состояние животных. После применения вакцины динамика морфологических и биохимических показателей крови животных опытной и контрольной групп находились в пределах физиологической нормы.

3.9 Производственные испытания эмульгированной вакцины на КРС

В период с 31 марта 2010 года по 14 июля 2011 года проведена оценка эффективности 4 серии инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга 8 серотипа в хозяйстве Шихобалово Владимирской области. Нетелей на разных сроках стельности в количестве 160 голов вакцинировали двукратно инактивированной эмульгированной вакциной с интервалом 14 дней. Антигенную активность компонентов вакцины оценивали по уровню специфических антител в сыворотках крови вакцинированных животных в реакции нейтрализации на культуре клеток ПС.

Как видно из представленных на рисунке 8 результатов, в сыворотках крови 97% нетелей на 14 сутки после второй прививки титр ВН-антител составлял 1:2 - 1:16, из них у 70% животных - 1:8-1:16. Спустя 6 месяцев после иммунизации ВН-антитела сохранялись у 93% нетелей. К концу года лишь у 18% животных были выявлены ВН-антитела в титрах 1:2 - 1:4. (Акт об испытании инактивированной моновалентной вакцины против блютанга 8 серотипа от 29. 07. 2011 г.). 

Рис. 8 Процентное соотношение титров ВН-антител у нетелей после прививки эмульгированной вакциной против блютанга 8-го серотипа А) на 14 сутки; Б) через 6 месяцев после 2-й иммунизации; В) через 1 год после 2-й иммунизации

Применение вакцины не влияло на отелы и последующее развитие телят.

Таким образом, можно сделать вывод, что при испытании вакцины в производственных условиях на поголовье 160 нетелей инактивированная эмульгированная вакцина против блютанга является безвредной для КРС и индуцирует у них формирование напряженного продолжительного иммунитета в течение 6 и более месяцев.

4. Выводы

1. Усовершенствована технология изготовления инактивированной вакцины против блютанга, заключающаяся в использовании эпизоотически значимых для РФ штаммов  вируса блютанга 1, 6 и 8 серотипов, перевиваемой линии клеток-ПС, изменении режима инактивации препаратом А-24 и применении в составе вакцины адъюванта Montanid ISA-70.
2. Разработаны технологии изготовления инактивированных бивалентных и трехвалентных эмульгированной и сорбированной вакцин против блютанга. Вакцины безвредны и сохраняют свои иммунобиологические свойства при длительном хранении (24 мес.) при температуре от 4 до 8С.
3. Установлено, что при изготовлении инактивированной вакцины для полной инактивации вируса в культуральном сырье препаратом А-24 в конечной концентрации 0,05% при температуре (37С 0,5) 0С время инактивации составляет 72 часа.
4. Установлено, что сорбированная и эмульгированная формы препарата обладают выраженной иммуногенностью, но эмульгированная вакцина с использованием адъюванта Montanid ISA-70 является более технологичной, т.к. по сравнению с сорбированной для приготовления одинакового количества доз требуется в 4,3 раза меньше исходного вируссодержащего сырья.
5. Определены иммунизирующие дозы инактивированной  вакцины против блютанга, которые обеспечивают индукцию напряженного и продолжительного иммунитета у КРС и овец: 3 см3 и 1,5 см3соответственно при инфекционной активности вируссодержащего сырья не ниже 6,5 lg ТЦД50/см3.
6. В производственных условиях установлено, что инактивированная эмульгированная вакцина против блютанга безвредна и при двукратной иммунизации животным обеспечивает поддержание защитного уровня ВН-антител не менее 6 месяцев.
7. Установлено, что применение инактивированной эмульгированной вакцины не вызывает отрицательного воздействия на морфологические и биохимические показатели крови коров.
8. Показано, что в процессе хранения в течение 24 месяцев при положительных температурах (4-8) 0С инактивированная эмульгированная вакцина сохраняет исходные физические и иммуногенные свойства.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического применения:

1. Технологическая инструкция по изготовлению и контролю вакцины против блютанга поливалентной инактивированной, утвержденная директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 21.01.2010г., инв. № 218-НТД. ДСП15.02.

2. СТО на штаммы вируса блютанга, утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 20.01.2012г., инв. № 1-НТД

3. Методические положения по оценке питательных сред для суспензионного культивирования клеток и вирусов, утвержденные секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии академиком А.М. Смирновым 24.10.2009 г.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Инактивированная вакцина против катаральной лихорадки овец / В.А. Сергеев, Н.П. Ананьева-Рященко, В.П. Хижинская [и др.] // Ветеринария. - 1980. - №12. - С. 31-32.
2. Кошелева, Р.В. Инактивированная вакцина против катаральной лихорадки овец: методы инактивации и контроля: дис. Е канд. вет. наук / Р.В. Кошелева. - Покров, 1984.- С. 150. ДСП МО.04-277.
3. акин,аГ.Ф.аБиометрия:аучеб. пособие для биол. спец. вузов / Г.Ф. Лакин. -  4-еаизд., перераб. и доп.-аМ.:аВысшаяашкола,а1990.-аС. 352.
4. Методические положения по лабораторной диагностике блютанга / В.В. Куринов, М.Б. Новикова, И.В. Вялых, Е.А. Гаврилова, С.Ж. Цыбанов, А.В. Луницин, Д.В. Колбасов; утв. А.М. Смирновым, РАСХН. - Покров, 2011. - С. 19.
5. Особенности проявления и распространения блютанга в европейских странах в 2006-2007 годах и риск его возникновения на территории Российской Федерации. Информационно-аналитический обзор / В.М. Захаров, В.М. Гуленкин, А.К. Караулов, К.П. Николаева, С.А. Дудников, Н.С. Дудникова, О.Н. Петрова. - Владимир, 2007. Ц  С. 44.
6. Сливко, В. В. Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга: дис. Е канд. вет. наук / Сливко Вероника Владимировна. - Покров, 2003. - С. 132.
7. Bluetongue conference on vaccination, Brussels 2008 [Электронный ресурс]. ЦРежим  доступа:  http://ec.europa.eu/food/animal/diseases/controlmeasures/bluetongue_conference_en.print.htm. - Загл.  с экрана.
8. Design of primers and use of RT-PCR assays for typing European bluetongue virus isolates: differentiation of field and vaccine strains/ P.P. Mertens [et al.] // J. Gen. Virol. - 2007. -  Vol. 88, № 10. - P. 2811-2823.
9. Detailed country (ies) disease incidence. - OIE [Электронный ресурс]. - Режим доступа: . - Заглавие с экрана.
10. Evaluation of humoral response and protective efficacy of three inactivated vaccines against bluetongue virus serotype 8 one year after vaccination of sheep and cattle / R. Wckerlin, M. Eschbaume, P. Knig, B. Hoffmann, M. Beer // Vaccine. - 2010. - Vol. 28, № 27. - P. 4348Ц4355.
11. Laemmli, V.K. Cleavage of structural protection during the assemble of the bacteriophage T4 / V.K.Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 27. - P. 680 - 685.
12. Mellor, P.  Bluetongue: biology of animal infections / P. Mellor, M. Baylis, P. Mertens. - L.: Elsevier, 2009. -  Р. 483.
13. Tombin, P.K. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gel to nitrocellulose sheets./ P.K. Tombin, T. Staehelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1979. - Vol. 76. № 9. - P. 4350 - 4354.
14. Zientara, S. Bluetongue diagnosis by reverse transcriptase-polymerase chain reaction  /аS. Zientara; E.  Brard; C. Sailleau // Veterinaria italiana. Ца2004. - Vol. 40, № 4. - P. 531-537.

7. Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Эффективность инактивированной вакцины против вируса блютанга 8 серотипа / В.И. Балышева, Н.И. Закутский, О.Г. Лаптева, Т.Ф. Горшкова,а В.М. Балышев, С.Ж. Цыбанов, М.Б. Новикова, Г.П.Федоров, В.В. Дмитренко, Е.А. Нестеров // Ветеринария. - 2008. - а№11. - С. 20-22.

2. Нестеров, Е.А. Культивирование вируса блютанга в перевиваемых линиях клеток // Актуал. пробл. инфекц. патологии ветеринарной медицины: материалы конф. молодых ученых, посвящ. памяти И.Ф. Вишнякова / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2009. - С. 206-210.

3. Балышева, В.И. Создание инактивированной вакцины против блютанга для КРС. Изучение иммунного ответа и разработка эффективных схем применения / В.И. Балышева, Е.А. Нестеров // Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России: материалы науч. конф. ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии. - Сергиев Посад, 2009. - С. 131-135.

4. Балышева, В.И. Изучение антигенной активности бивалентной вакцины против блютанга/В.И. Балышева, Е.А. Нестеров, Н.И. Лошманова // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИТИБП. - Щелково, 2009. - С. 209-213.

5. Разработка инактивированной вакцины против блютанга и результаты ее испытания на КРС / В.И Балышева, Е.А. Нестеров,  А.В. Панферова, Т.Ф. Горшкова, О.Г. Лаптева // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня основания ГНУ ИЭВСиДВ. - Краснообск, 2010. - С. 109-115.

6. Инактивированная поливалентная вакцина против блютанга / В.И. Балышева, Е.А. Нестеров, Т.Ф Горшкова, О.Г. Лаптева // Вестник РАСХН. - 2011. - № 1. - С.72-74.

7. Особенности блютанга (эпизоотология, профилактика и меры борьбы) (Обзор литературы) / Н.И. Закутский, А.А. Коломыцев, А.В. Книзе, Е.А. Нестеров // Ветеринария. - 2012. - №2. - С. 21-26.

8. Список сокращений

А-24 - 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан;

ВН - вируснейтрализующие;

ГОА - гидроокись алюминия;

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия;

КЗ - контрольное заражение;

к/к - культура клеток;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ТФ ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ;

ТЦД - тканевая цитопатическая доза.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

г. Покров Владимирской области

Тираж 80 экз.

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии