Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии  

На правах рукописи

МОКШИНА Надежда Яковлевна

ЭКСТРАКЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ

-АМИНОКИСЛОТ И ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ Ц ЗАКОНОМЕРНОСТИ И НОВЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ РЕШЕНИЯ

02.00.02 Ц Аналитическая химия

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

2007 

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Воронежский государственный университет

Официальные оппоненты:  член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор

ЮРТОВ Евгений Васильевич 

доктор химических наук, профессор

УЛАХОВИЧ Николай Алексеевич 

доктор химических наук, профессор

СТРИЖОВ Николай Константинович 

Ведущая организация: Институт общей и неорганической

  химии  им. Н.С. Курнакова РАН

Защита диссертации состоится 18 октября 2007 г. в 1400 часов  на заседании диссертационного совета Д 212.101.10 по химическим наукам при Кубанском государственном университете по адресу: 350040, Краснодар, ул. Ставропольская, 149.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кубанского государственного университета.

Автореферат разослан л_______________________  2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат хим. наук Киселева Н.В.

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. -Аминокислоты с ароматическим ра-дикалом (фенилаланин, тирозин, триптофан) относятся к важнейшим биологически активным веществам, извлечение которых из различных сред (ферментационные растворы, культуральные жидкости, белковые гидролизаты и другие), последующее определение на уровне микроколичеств, в т.ч. раздельное - актуальная биотехнологическая и аналитическая задача. Индивидуальные -аминокислоты широко востребованы в пищевых и фармацевтических производствах в качестве добавок (например, в детское питание, рацион спортсменов), активных компонентов лекарственных препаратов нового поколения. Возрастающий спрос на -аминокислоты обусловлен быстрым развитием молекулярной биологии, генетики, биофизики, других разделов современной химии и биологии.

Комплексы -аминокислот с аскорбиновой (никотиновой) кислотой характеризуются большим фармакологическим эффектом, чем входящие в них отдельные компоненты. Известно, что в процессах метаболизма и катаболизма ароматических -аминокислот участвует аскорбиновая кислота. Никотиновая кислота и ее амид способны стимулировать аппетит животных и предупреждать снижение веса, относятся к метаболитам животного организма.

Приоритетная задача аналитической химии - разделение смесей биологически активных веществ (в первую очередь незаменимых аминокислот) и их селективное определение. Задача может быть решена с применением жидкостной экстракции и физико-химического анализа получаемых концентратов.

Среди методов разделения сложных смесей  ведущее положение занимают хроматография, экстракция, капиллярный электрофорез. Разработаны многочисленные способы экстракционного извлечения и концентрирования органических веществ для последующего их определения  различными методами.

Одно из перспективных направлений жидкостной экстракции связано с применением гидрофильных растворителей, до недавнего времени считавшихся непригодными для экстракции из водных сред вследствие полной или частичной растворимости в воде. Между тем, для извлечения -аминокислот и витаминов предпочтительны (прежде всего из-за малой токсичности)  протонные и амфипротонные растворители, в частности, алифатические спирты. Известно применение водорастворимых полимеров  для экстракционного извлечения металлов, однако в отношении биологически активных веществ такие полимеры практически не изучены.

Цель работы - реализация общей концепции по разработке методологии эффективного извлечения и определения (в т.ч. селективного) биологически активных веществ (ароматические -амино-кислоты, водорастворимые витамины) в фармацевтических препаратах и пищевых продуктах на уровне микроколичеств с применением экстракции органическими растворителями разных классов (алифатические спирты, сложные эфиры, полимеры поли-N-виниламидного ряда) и последующего детектирования спектрофотометрическим и электрохимическими методами.

Решались следующие задачи:

- установление общих закономерностей межфазного распределения ароматических -аминокислот и водорастворимых витаминов в системах органический растворитель - водно-солевой раствор;

- оптимизация условий образования систем вода - высаливатель - водорастворимый полимер и анализ спектральных характеристик образующихся фаз с целью изучения механизма экстракции -аминокислот;

- прогнозирование экстракционных параметров цвиттерлитов с применением корреляционных взаимосвязей между физико-хими-ческими свойствами экстрагентов и количественными характеристиками межфазного распределения -аминокислот и витаминов;

- разработка новых способов селективного спектрофотометрического определения -аминокислот и витаминов при их совместном присутствии в бинарных и тройных смесях;

- разработка экстракционных способов разделения сложных смесей -аминокислот и витаминов с последующим спектрофотометрическим анализом концентратов; раздельного определения -амино-кислот методами потенциометрического и кондуктометрического титрования экстрактов на основе гидрофильных растворителей.

Научная новизна. Разработана методология процессов извлечения, концентрирования, разделения и определения биологически активных веществ (ароматические -аминокислоты, водорастворимые витамины) на основе теории жидкостной экстракции. Установлены закономерности межфазного распределения фенилаланина, тирозина, триптофана, аскорбиновой и никотиновой кислот и их смесей в системах с индивидуальными экстрагентами и их многокомпонентными смесями в присутствии высаливателей.

Методами термического анализа и ИК-спектроскопии установлены механизмы взаимодействия -аминокислот и водорастворимых витаминов с гидрофильными спиртами и сложными эфирами, ассоциация распределяемых компонентов в разных фазах  и представлены схемы образования гидратно-сольватных комплексов аналитов с органическими растворителями. Методом корреляций установлены взаимосвязи экстракционных характеристик -аминокислот и витаминов со строением и свойствами органических растворителей. Для оценки влияния физико-химических характеристик растворителей на экстракцию применена модель Криговского-Фосетта, позволяющая прогнозировать коэффициенты распределения -аминокислот в системах с гомологами (алифатические спирты, алкилацетаты).

Новизна аналитических решений состоит также в обосновании применения для извлечения -аминокислот синтетических водорастворимых полимеров виниламидного ряда, существенно повышающих количественные параметры экстракции (коэффициенты распределения, степень извлечения). Методами УФ- и ИК-спектроскопии установлен механизм комплексообразования полимеров и -аминокислот; рассчитаны константы устойчивости комплексов. Применение водорастворимых полимеров в качестве экстрагентов  снижает экологический риск пробоподготовки - обязательной стадии анализа при определении микроколичеств биологически активных веществ в сложных пищевых и фармацевтических матрицах.

Установленные закономерности распределения ароматических -аминокислот и водорастворимых витаминов в экстракционных системах различной природы (гидрофильные растворители, их бинарные и тройные смеси, водорастворимые полимеры) позволяют значительно улучшить характеристики известных способов определения -ами-нокислот, а также их смесей с витаминами (экспрессная пробоподготовка, эффективное разделение, безреагентная реэкстракция).

Обоснованы новые подходы к раздельному определению -аминокислот (фенилаланин - тирозин, фенилаланин - триптофан, тирозин - триптофан, фенилаланин - тирозин - триптофан), а также -аминокислот и витаминов (аскорбиновая кислота - -аминокислота, никотиновая кислота - -аминокислота) в фармпрепаратах (например, в биологически активных добавках) и некоторых пищевых продуктах при концентрациях 1,110-5 - 5,510-4 моль/дм3.

Практическая значимость:

- на основании установленных закономерностей межфазного распределения разработаны составы  двух- и трехкомпонентных смесей растворителей для  эффективного извлечения фенилаланина, тирозина, триптофана, аскорбиновой и никотиновой кислот;

- применение водорастворимых полимеров для экстракции -аминокислот расширяет выбор экологически безопасных экстрагентов биологически активных веществ;

- разработан безреагентный способ спектрофотометрического определения -аминокислот и витаминов в бинарных и тройных смесях с применением уравнений Фирордта;

- разработаны экстракционно-спектрофотометрический способ разделения и селективного определения -аминокислот и витаминов, экстракционно-потенциометрический и экстракционно-кондукто-метрический способы определения -аминокислот непосредственно в экстрактах.

Методический аспект. Результаты исследования включены в лекционный курс и семинарские занятия по дисциплине Анализ лекарственных веществ,  практикум по аналитической химии на химическом и фармацевтическом факультетах Воронежского государственного университета. Изданы учебно-методические пособия Электрохимические методы в анализе лекарственных  и токсических веществ, Методы химического анализа окружающей среды и Методы определения аминокислот и витаминов, а также программа курса Анализ лекарственных веществ (Воронеж, 2003Ц2007), содержащие многие практические разработки диссертационной работы.

К защите представляются:

- установленные в оптимальных условиях количественные характеристики межфазного распределения ароматических -амино-кислот и водорастворимых витаминов;

- корреляционные зависимости коэффициентов распределения -аминокислот и витаминов от строения и свойств экстрагентов, природы высаливателя, состава экстракционной системы, строения и свойств экстрагируемого соединения;

- закономерности межфазного распределения -аминокислот в системах с водорастворимыми полимерами и результаты спектроскопического анализа экстрактов;

- способ спектрофотометрического раздельного определения -аминокислот и витаминов в бинарных и тройных смесях;

- способы экстракционного разделения смесей -аминокислот и витаминов с последующим селективным спектрофотометрическим анализом водных концентратов и электрохимическим анализом гидрофильных экстрактов.

Публикации.  По материалам диссертации опубликованы 130 работ, в том числе монография, 30 статей в реферируемых научных изданиях, 5 статей в зарубежных изданиях, 7 статей в вузовских журналах и сборниках научных трудов,  рефераты 88 докладов на международных, всесоюзных, всероссийских и региональных научных конференциях. Новизна аналитических решений подтверждена материалами Роспатента.

Апробация результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях, съездах, симпозиумах и конгрессах.

Международные: International Organic Substances Solvent Extraction Conference л ISECOS 92 (Voronezh, Russia,а1992); Toxic Organic Compounds in the Environment TOCOEN (Czech Republic: Znojmo, 1993; Lunacovice, 1996); 35 IUPAC Congress (Istanbul, Turkey, 1995); International Ecological Congress (Voronezh, Russia, 1996); XII, XXI International Symposium on Physico-Сhemical Methods of the Mixtures Separation УАrs SeparatoriaТ97Ф (Poland:  Minikowo, 1997; Torun, 2006);  Молодежь и химия (Красноярск, 1999); XLII - XLVIII  Zjazd Naukowy Polskiego Towarzystwa Chemicznego (Poland: Rzeszow,  1999;  Lodz, 2000; Katowice, 2001; Krakow, 2002; Lublin, 2003; Wroclaw, 2004; Poznan, 2005); Separation of Ionic Solutes SISТ99 (Stara Lesna, Slovakia, 1999); Всеукраинской (с международным участием) конф. по аналитической химии (Харьков, Украина, 2000); VI Polska Konferencja Chemii Analitycznej (Gliwice, Poland, 2000); VII International Symposi-um Forum Chemiczne (Warszawa, Poland, 2001); Международном Форуме Аналитика и аналитики (Воронеж, 2003); Международной конф. Межфазная релаксация в полиматериалах (Москва, 2003); Международном симпозиуме  Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии (Краснодар, 2005); III Международной конф. Экстракция органических соединений (Воронеж, 2005); International Congress on Analytical Sciences  (Moscow, 2006); Международной конф. по химической технологии (Москва, 2007).

Всесоюзные и Всероссийские: Всесоюз. конф. молодых ученых по экстракции  (Донецк, 1990); IX Всесоюз. конф. по экстракции ( Адлер, 1991); конф. л Аналитическая химия объектов окружающей среды (Санкт-Петербург - Сочи, 1991); Х - XIII Рос. конф. по экстракции (Уфа, 1994; Москва, 1998; Москва, 2001; Москва, 2004); Всерос. конф. Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств (Санкт-Петербург, 1996); III, VI Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды Экоаналитика (Краснодар, 1996; Самара, 2006); Всерос. конф. УАктуальные проблемы аналитической химииФ (Москва, 2002); Всерос. симпозиум Современные проблемы хроматографии (Москва, 2002); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); Всерос. конф. Аналитика России (Москва, 2004); VII конф. Аналитика Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2004); III Всерос. конф. Физико-химия процессов переработки полимеров (Иваново, 2006), 62 конф. по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2007).

Региональные: 1Ц4, 6, 8Ц10 Регион. конф. Проблемы химии и хим. технологии (Липецк, 1993; Тамбов, 1994, 1996, 2001, 2003; Воронеж, 1995, 1998, 2000).

На научных сессиях Воронежского госуниверситета доложены основные результаты диссертационной работы (1999 - 2006).

Обзорный доклад  Экстракция аминокислот сделан на заседании Польского химического общества в Политехническом университете г. Жешова  (Польша, 1994).

Обзорный доклад Закономерности экстракции -аминокислот и водорастворимых витаминов по материалам диссертации сделан на Российском семинаре по научным основам химической технологии (ИОНХ им. Н.С.Курнакова, 2007).

ичный вклад автора. Результаты, полученные в соавторстве и отраженные в диссертации, заключаются в теоретическом обосновании и постановке проблемы, разработке общих подходов к исследованию экстракции ароматических -аминокислот и водорастворимых витаминов, анализу водных концентратов и экстрактов различными физико-химическими методами. Все экспериментальные работы выполнены автором или под его руководством. Систематизация и анализ результатов, теоретическое обоснование, разработка и апробация новых способов анализа осуществлены непосредственно автором.

Структура и объем работы.  Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 400 источников, и приложения. Работа изложена на 330 страницах машинописного текста, включает 95 рисунков, 82 таблицы и 13 схем.  

ГЛАВА I. МЕТОДЫ АНАЛИЗА -АМИНОКИСЛОТ

И ВИТАМИНОВ

Представлен критический обзор современных методов извлечения, разделения и определения ароматических -аминокислот и водорастворимых витаминов. Особое внимание уделено экстракции и спектральным методам в анализе биологически активных веществ. Обобщены известные данные о межфазном распределении -амино-кислот, способах их разделения и селективного определения, известных методах определения аскорбиновой и никотиновой кислот в фармацевтических препаратах и пищевых продуктах. Сведения об экстракционном разделении -аминокислот и витаминов отсутствуют. Не изучено также влияние физико-химических параметров растворителей на межфазное распределение -аминокислот и витаминов.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Приведены структуры и свойства объектов исследования (фенилаланин, тирозин, триптофан, аскорбиновая и никотиновая кислоты). -Аминокислоты и витамины экстрагировали алифатическими спиртами С4 - С8 и алкилацетатами С2 - С5 в присутствии высаливателей (галогениды и сульфаты натрия и калия). В качестве экстрагентов применяли также водорастворимые полимеры полиЦNЦвиниламидно-го ряда (поли-N-винилпирролидон, поли-Nвинил-Nметилацетамид, поли-N-винилкапролактам), а также полиэтиленгликоль ПЭГ-5000. Оптимизированы условия  экстракции, рассчитаны количественные характеристики процесса.

-Аминокислоты и витамины в водно-солевой фазе после экстракции определяли спектрофотометрически по собственному светопоглощению в УФ-области спектра (СФ-56). Предварительно установлены спектральные характеристики объектов исследования.

Состав и строение образующихся в равновесной органической фазе комплексов, характер взаимодействий в системе аналит - экстрагент - водно-солевой раствор (внутри- и внешнесферная гидратация и сольватация) изучены  методами инфракрасной спектроскопии (лSpecord 75 IR)  и термического анализа (дериватограф системы Паулик, Паулик, Эрдей). 

Для экстракционно-спектрофотометрического определения -аминокислот, аскорбиновой и никотиновой кислот в бинарных и тройных смесях применяли расчетный метод Фирордта. Получены системы уравнений для селективного определения аналитов при совместном присутствии.

Гидрофильные экстракты анализировали электрохимическими методами (потенциометрическое и кондуктометрическое титрование). Методом симплекс-решетчатого планирования эксперимента установлен состав тройной смеси экстрагентов для практически полного извлечения -аминокислот. При расчете коэффициентов распределения -аминокислот и витаминов в системах экстрагент - водно-солевой раствор применяли методы математической статистики.

ГЛАВА III. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСТРАКЦИИ

АРОМАТИЧЕСКИХ -АМИНОКИСЛОТ И ВИТАМИНОВ

Экстракция фенилаланина, тирозина и триптофана. Изучена экстракция фенилаланина, тирозина и триптофана бутиловым, пентиловым, гексиловым и октиловым спиртами из водноЦсолевых растворов. Установлена общая закономерность: с увеличением неактивной части молекулы органического растворителя (с уменьшением относительного содержания функциональной группы) снижается его экстрагирующая способность. Такое явление обусловлено идентичным механизмом экстракции (ослабление водородной связи в системе спирт - распределяемое соединение). Высаливатели влияют на диэлектрическую проницаемость водного раствора и структуру воды. Вследствие гидратации больших количеств соли уменьшается содержание несвязанной воды, что приводит к снижению растворимости экстрагента в воде.

Надежные корреляции между коэффициентами распределения (lgD) -аминокислот и числом атомов углерода (n) в молекулах спиртов-гомологов применены для  прогнозирования коэффициентов распределения в системах с дециловым спиртом (тирозин), гексиловым и октиловым спиртами (фенилаланин); примеры приведены в табл. 1 и на рис. 1.

Таблица 1. Коэффициенты распределения (D) и степень извлечения (R, %) фенилаланина при экстракции спиртами С4 - С8 из водно-солевых растворов

Высаливатель	С4		С5		C6	С7		С8
	D	R	D	R	D	D	R	D
NaCl Na2SO4 10H2O K2SO4 KBr	2,4 1,9 1,6 2,1	16,0 10,0   9,8 10,1	2,1 1,7 1,4 1,8	15,9 11,2 10,1 13,8	1,9 1,6 1,3 1,5	1,8 1,5 1,2 0,8	15,2 13,0 10,7   7,4	1,6 1,3 1,1 0,6

Рис. 1. Зависимость lgD от числа атомов углерода в молекулах спиртов С4 - С10 при экстракции тирозина из растворов, содержащих NaCl (1), KCl (2), NaF (3), Na2SO4 10H2O (4), KBr (5) и K2SO4 (6)

Коэффициенты распределения -аминокислот в системах с алкилацетатами значительно ниже, чем при экстракции спиртами вследствие более гидрофильной природы примененных алифатических спиртов. Растворимость алкилацетатов в воде меньше, чем спиртов, поэтому исходные соотношения объемов фаз после экстракции эфирами изменяются незначительно. Приводим установленные в идентичных условиях коэффициенты распределения фенилаланина между спиртами С4 - С8 и водно-солевыми растворами (табл. 1).

Закономерности экстракции тирозина справедливы и для других ароматических -аминокислот. Существенные различия установлены между коэффициентами распределения -аминокислот в системах спирты - водно-солевые растворы: для фенилаланина они примерно в 3 раза ниже, чем для тирозина. Это объясняется особенностями строения -аминокислот, в частности, наличием в структуре тирозина полярной ОН-группы.

Характер изотерм экстракции  фенилаланина в присутствии высаливателей (рис. 2) подтверждает образование ассоциатов фенил- аланина в фазе экстрагента. По отдельным значениям со и соответствующим значениям св, а также по изотермам экстракции невозможно непосредственно рассчитать коэффициенты распределения -амино-кислот. Это объясняется непостоянством отношения со/св вследствие изменения коэффициентов активности -аминокислот при различных концентрациях в каждой фазе. Поэтому для изучения процессов, протекающих в органической фазе, коэффициенты активности принимали постоянными ( = 1). При этом меняется состояние -аминокислот в органической фазе,  при их высоких концентрациях образуются ассоциаты (рис. 2).

Для систем триптофан - бутиловый спирт - водно-солевой раствор на изотерме экстракции  максимум достигается при сtrp = 0,5 мг/см3, поэтому эксперименты проводили при этой концентрации -аминокислоты. Из всех изученных экстрагентов триптофан извлекается только бутиловым спиртом, другие спирты, а также алкилацетаты инертны в отношении триптофана (D 0). Образованию водородных связей между NН-группой триптофана и ОН-группами спиртов препятствует большой размер гетероцикла этой -аминокислоты.

св 103, моль/дм3

Рис. 2. Изотермы экстракции фенилаланина бутиловым (1,2) и пентиловым (3,4) спиртами в присутствии  NaCl (1,3) и  Na2SO4⋅10H2O (2,4)

Методом термического анализа вычислены теплоты испарения экстрагентов и органической фазы после экстракции -аминокислот. Испарение жидкости при температуре кипения описывается стандартным молярным изменением энтальпии (Н0кип) и энтропии (S0кип).  Процесс подчиняется правилу Трутона и аппроксимируется уравнением:

S0кип = Н0кип / Ткип 21 калмоль-1К-1 = 88 Джмоль-1К-1 .

По результатам термического анализа органической фазы после экстракции -аминокислот рассчитаны теплоты испарения, константы Трутона и параметры растворимости Гильдебранда (табл. 2). Во всех изученных экстракционных системах константы Трутона для равновесной органической фазы значительно выше, чем для индивидуальных растворителей. Это результат повышения степени ассоциации молекул растворителя и образования комплексов экстрагентов с -аминокислотами при их извлечении из водных растворов. Присутствие -аминокислоты в экстрагенте повышает параметр растворимости вследствие усиления межмолекулярных взаимодействий в системе -аминокислота - спирт - водно-солевой раствор.

Параметры Гильдебранда для пентилового спирта и системы триптофан - пентиловый спирт практически равны, поэтому извлечение триптофана спиртами с числом атомов углерода больше 4 невозможно. Для всех изученных экстракционных систем параметр Гильдебранда при извлечении фенилаланина превышает этот показатель для систем с тирозином и триптофаном, что подтверждает более прочную связь фенилаланина с экстрагентами по сравнению с другими -аминокислотами. При экстракции -аминокислот возрастает содержание воды в фазе экстрагента. Максимальная степень извлечения из водного раствора характерна для тирозина, однако при его экстракции гидратация растворителя уменьшается по сравнению с экстракцией фенилаланина и триптофана.

Таблица 2. Теплоты испарения экстрагентов, константы Трутона и параметры  Гильдебранда для систем -аминокислота Ц  спирт - водно-солевой раствор; высаливатель - хлорид натрия

Органическая фаза	Нисп104, Дж/моль	Sисп, Дж/мольК	, (Дж/см3)1/2
Бутиловый спирт (С4) С4 - тирозин С4 - фенилаланин С4 - триптофан	4,40 7,01 7,60 7,61	113 180 196 197	22,02 27,60 30,41 29,43
Пентиловый спирт (С5) С5 - тирозин С5 - фенилаланин С5 - триптофан	5,20 7,08 14,96 4,37	129 177 364 111	21,19 26,23 40,87 21,32
Гексиловый спирт (С6) С6 - тирозин С6 - фенилаланин	6,48 5,60 14,52	150 144 371	19,42 23,75 37,60
Гептиловый спирт (С7) С7 - тирозин С7 - фенилаланин	5,10 6,16 6,62	118 142 128	18,28 26,36 28,72

Методом ИК-спектроскопии установлено, что присутствие -аминокислот в равновесной органической фазе приводит к уширению полос поглощения в области 3670Ц3120 см-1 и появлению новых максимумов, характерных для ассоциатов спирт - вода (3550Ц3520 см-1), вода - вода (3430Ц3415 см-1), спиртЦ-аминокислота (3330Ц3285 см-1), вода - -аминокислота (3150Ц3120 см-1). Кроме того, в ИК-спектрах бутилового спирта после экстракции -аминокислот появляются дополнительные полосы поглощения, подтверждающие образование гидроксокомплексов с СООЦ-группами -аминокислот.

На основании данных об экстракции -аминокислот, а также полученных методами термического анализа и ИК-спектроскопии, можно заключить, что тирозин экстрагируется из водно-солевых растворов преимущественно по сольватному механизму,  фенилаланин и триптофан - по гидратному.

Экстракция аскорбиновой и никотиновой кислот. Для разработки надежного способа извлечения аскорбиновой кислоты из водных сред изучена экстракция витамина наиболее эффективными кислородсодержащими растворителями (алифатические спирты, алкилацетаты). В качестве примера приводим данные об экстракции аскорбиновой кислоты спиртами С4 - С7 из водно-солевых растворов  (табл. 3).

Таблица 3. Коэффициенты распределения  и степень извлечения

аскорбиновой кислоты в системах спирты С4 - С7  - водно-солевые растворы

Высаливатель	С4		С5		С6		С7
	D	R	D	R	D	R	D
NaCl	7,32	35	3,98	26	2,29	17	1,32
NaF	7,38	26	3,55	23	2,17	17	1,38
Na2SO4 10H2O	5,32	33	3,70	27	2,81	21	2,14
KCl	3,04	15	2,14	11	1,63	14	1,20
KBr	7,76	33	5,35	31	3,90	28	2,70
K2SO4	21,10	50	15,30	48	10,2	46	7,20

Коэффициенты распределения закономерно снижаются  в гомологических рядах спиртов и алкилацетатов. В оптимальных системах степень однократного извлечениия достигает 50 % и возрастает при введении в водный раствор хлорида натрия или сульфата калия. Как и коэффициенты распределения, степень извлечения аскорбиновой кислоты снижается при переходе  к высшим спиртам и алкилацетатам.

Изучена экстракция никотиновой кислоты растворителями разных классов. В равновесных водных растворах никотиновую кислоту определяли спектрофотометрически по собственному светопоглощению в УФ-области спектра при 262 нм. Установлена максимальная степень однократного извлечения никотиновой кислоты (45 %)  в системах с хлоридом натрия (рис. 3).

lgD

 

0.8

 

 

Рис. 3. Зависимость коэффициентов распределения никотиновой кислоты от числа атомов углерода в молекулах алкилацетатов при экстракции в присутствии NaCl (1), Na2SO4 10H2O (2), NaF (3), KCl (4) и KBr (5)

Коэффициенты распределения и степень извлечения никотиновой кислоты снижаются при переходе к высшим  гомологам, что согласуется с известными данными об экстракции органических соединений других классов. Методом последовательных экстракций установлено, что в результате трех экстракций алкилацетатами извлекается до 80 % никотиновой кислоты, наиболее эффективны системы этилацетат - Na2SО410Н2О (или NaCl). В этих условиях аскорбиновая кислота извлекается бутиловым спиртом в присутствии NaCl.практически полностью (R = 98 %).

Одновременное применение высаливателей и синергетических  смесей растворителей повышает эффективность экстракции витаминов в 3 - 4 раза  (табл. 4). Установлен синергизм при экстракции аскорбиновой кислоты бинарными смесями растворителей (рис. 4). Так, в системе  аскорбиновая кислота - бутиловый спирт - алкилацетат ЦводноЦсолевой раствор характер распределения витамина определяется содержанием более активного компонента смеси растворителей (бутиловый спирт).

Таблица 4. Коэффициенты распределения аскорбиновой и никотиновой

кислот в системах смесь экстрагентов - водно-солевой раствор 

Смесь экстрагентов	Высаливатель	Мольная доля второго   растворителя
		0,1		0,3	0,5	0,7	0,9
Аскорбиновая кислота
Бутиловый спирт - этилацетат	NaCl		8,0	9,2	13,4	22,1	26,0
	Na2SO410H2O		5,8	8,3	12,0	14,7	15,9
Бутиловый спиртЦ бутилацетат	NaCl		2,8	4,5	11,5	19,1	20,0
	Na2SO410H2O		2,5	3,6	7,4	9,8	11,2
Никотиновая кислота
Этилацетат - бутиловый спирт	NaCl		5,9	7,9	9,4	14,8	15,6
	Na2SO410H2O		5,4	7,2	9,5	11,7	12,4
Бутилацетат - бутиловый спирт	NaCl		3,9	4,5	8,2	9,7	10,5
	Na2SO410H2О		2,9	3,7	5,2	6,7	7,8

При повышении содержания спирта выше 0,4 мол. доли аддитивность коэффициентов распределения переходит в синергетический эффект (рис. 4), что обусловлено изменением активности воды и распределяемых гидрато-сольватов. Коэффициенты распределения увеличиваются при повышении содержания второго компонента (этилацетат) в смеси растворителей. При экстракции аскорбиновой кислоты смесью бутиловый спирт - бутилацетат зависимость коэффициентов распределения от содержания бутилового спирта имеет более сложный характер и описывается  S-образной кривой. 

Рис. 4. Зависимость коэффициентов распределения аскорбиновой кислоты от содержания бутилового спирта в смесях с этилацетатом (NaCl, 1а; Na2SO410H2O, 1б) и бутилацетатом (NaCl, 2а; Na2SO410H2O, 2б); пунктиром указаны линии аддитивности.

При экстракции смесями бутиловый спирт - алкилацетат с превалирующим содержанием эфира установлен антагонистический эффект, обусловленный десольватацией экстрагируемого витамина в органической фазе и соответствующим уменьшением его растворимости  в неводной фазе. Антагонизм можно позиционировать как явление, аналогичное высаливанию (лвсаливание). Проявление синергизма при экстракции аскорбиновой кислоты смесями с преобладающим содержанием бутилового спирта связано с образованием гидратоЦсольватов.  При экстракции никотиновой кислоты такими смесями растворителей более активными компонентами являются алкилацетаты.

Для количественной оценки синергизма при экстракции витаминов рассчитаны коэффициенты синергетности (Кс). Наибольшие  коэффициенты Кс характерны для аскорбиновой кислоты при  экстракции смесями бутиловый спирт - этилацетат, для никотиновой кислоты - в системах со смесями бутилацетат - бутиловый спирт (0,9:0,1). Сравнительно невысокие константы образования экстрагируемых комплексов К (табл. 5) подтверждают образование за счет водородных связей малоустойчивых смешанных сольватов в органической фазе. Степень сольватации аскорбиновой кислоты снижается в ряду бутиловый спирт > этилацетат > бутилацетат, что согласуется с соответствующими сольватными числами (табл. 5). При распределении никотиновой кислоты экстрагирующая способность растворителей возрастает в ряду бутиловый спирт >  бутилацетат > этилацетат.

Таблица 5. Сольватные числа и константы образования при экстракции

витаминов  смесями растворителей на основе бутилового спирта

Высаливатель	Второй компонент смеси - алкилацетат	Сольватное число	К
Аскорбиновая кислота
NaCl	Этилацетат	2,31	2,01
Na2SO410H2O	Этилацетат	0,63	1,98
NaCl	Бутилацетат	1,48	2,13
Na2SO410H2O	Бутилацетат	0,72	1,54
Никотиновая кислота
NaCl	Этилацетат	0,95	1,52
Na2SO410H2O	Этилацетат	0,57	1,73
NaCl	Бутилацетат	0,61	2,18
Na2SO410H2O	Бутилацетат	0,71	2,45

Влияние физико-химических свойств растворителей  на экстракцию -аминокислот и витаминов. Единым физическим параметром растворителя вряд ли возможно достаточно полно оценить процесс сольватации. Наиболее надежны корреляции между коэффициентами распределения -аминокислот и витаминов и диэлектрической проницаемостью, показателем преломления, межфазным поверхностным натяжением () и параметром растворимости Гильдебранда (). Так, с повышением параметра растворимости lgD -аминокислот при экстракции спиртами и алкилацетатами закономерно возрастают (рис. 5).

lgD

  I II

 

 

Рис. 5.  Зависимость lgD тирозина от параметров растворимости алкилацетатов (I) и спиртов (II) при экстракции в присутствии NaCl (1), Na2SO4 10 H2O (2), KCl (3), NaF (4), KBr (5) и K2SO4 (6) 

Полярность растворителей (экстрагентов) оценивали по сольватирующей активности и способности образовывать водородные связи с распределяемым веществом. Установлены корреляции между lgD  -аминокислот и витаминов от показателя преломления и диэлектрической проницаемости экстрагентов, примеры приведены на рис. 6 и 7. Такие же закономерности характерны и для других изученных соединений.

Показано, что количественная характеристика влияния растворителя на химические взаимодействия возможна на основе четырех параметров - по  два для описания неспецифической сольватации (обусловлена полярностью растворителя и дисперсионными взаимодействиями) и специфической (за счет электрофильной и нуклеофильной активности растворителя). При этом поляризация и поляризуемость молекул растворителя могут быть описаны неспецифическими параметрами Y и Р.

       

 

 

Рис. 6. Зависимость lgD фенилаланина от показателя преломления спиртов

С4 - С8 при экстракции в присутствии NaCl (1), KBr (2), Na2SO4 10 H2O (3)

и K2SO4 (4)

Параметр поляризации Y учитывает диэлектрическую проницаемость ε в виде функции Кирквуда  (ε - 1) / (2ε + 1)  или  функции  молярной  поляризации  (ε - 1)/(ε + 2). Диэлектрическая проницаемость относится к важнейшим факторам, влияющим на протекающие в растворах процессы. Параметр поляризуемости Р учитывает функции показателя преломления (n2 Ц1)/(2n2+1) или (n2Ц1)/(n2+2). При изучении процессов сольватации необходимо также принимать во внимание молекулярные свойства растворителя, в первую очередь донорное число DN, которое полуколичественно оценивает взаимодействие растворенного вещества с растворителем. Другой важной характеристикой сольватирующей способности растворителя является параметр Димрота-Райхардта Ет, оценивающий его полярность. Надежные корреляции между lgD и параметрами Y, Р, Ет и ДN (рис. 8 ) позволяют прогнозировать экстракционные характеристики -аминокислот.

Для оценки влияния спиртов на экстракцию -аминокислот из водных растворов предлагается модель Криговского-Фосетта - двухпараметрическое уравнение, учитывающее специфические взаимодействия между растворителем и растворенным веществом:

  А  =  Ао +  α Ет + β DN , 

Рис. 7. Зависимость lgD аскорбиновой кислоты от диэлектрической

проницаемости спиртов С4 - С7, при экстракции в присутствии NaCl (1),  Na2SO4 10 H2O (2), NaF (3), KCl (4) и KBr (5)

где А - характеристика растворенного вещества (например, коэффициент распределения -аминокислоты между экстрагентом и водно-солевым раствором); α и β  - коэффициенты  регрессии, описывающие чувствительность характеристики А к электрофильной и нуклеофильной активности растворителя соответственно; Ао - корреляционный параметр. В качестве примера приводим параметры Ао, α,  β, коэффициенты корреляции r и стандартные отклонения Sr для систем -аминокислота - спирт Цводно-солевой раствор (табл. 6).

Рис. 8. Зависимость коэффициентов распределения фенилаланина от параметра Димрота-Райхардта при экстракции спиртами С4 - С8 в присутствии NaCl (1), KBr (2), Na2SO4 ⋅10H2O (3) и K2SO4 (4)

Таблица 6. Корреляционные параметры уравнения

Криговского-Фосетта для расчета коэффициентов распределения

Высаливатель	A0	α	β	r	Sr
Т и р о з и н
NaCl	-59,46	0,84	0,94	0,9954	0,04
Na2SO410 H2O	-56,36	0,81	0,83	0,9996	0,01
KCl	-46,35	0,66	0,70	0,9199	0,15
Ф е н и л а л а н и н
NaCl	-6,33	0,10	0,07	0,9463	0,03
Na2SO410 H2O	-3,83	0,07	0,03	0,9614	0,02
KCl	-8,53	0,12	0,13	0,9440	0,02

Установлена применимость модели Криговского-Фосетта для оценки изменения большинства свойств, зависящих от характера растворителя. Преимущество модели состоит в том, что она позволяет одновременно охарактеризовать и кислотные, и основные эффекты в системе.

Для классификации и выбора органических растворителей применяются методы многомерного статистического анализа  с использованием в качестве базы данных различных физико-химических параметров (температура кипения, молярный объем, теплот испарения, дипольный момент, диэлектрическая проницаемость, молярная рефракция и другие), а также эмпирических параметров полярности. Установлены корреляции между экстракционными характеристиками -аминокислот и свойствами алифатических спиртов. Существенный вклад в коэффициенты распределения -аминокислот вносят молекулярные массы, параметры поляризации и поляризуемости экстрагентов.

ГЛАВА IV. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ -АМИНОКИСЛОТ

В СИСТЕМАХ С  ВОДОРАСТВОРИМЫМИ ПОЛИМЕРАМИ.

СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ

Экстракция  -аминокислот водорастворимыми полимерами. Среди широко применяемых экстрагентов немало токсичных, горючих и взрывоопасных растворителей. В этой связи принципиальное значение приобретают экстракционные системы, не содержащие органических растворителей (лзеленая экстракция). Примером может служить экстракция -аминокислот водорастворимыми полимерами в присутствии высаливателей. Отметим влияние на межфазное распределение -аминокислот молекулярной массы полимера (М),  в зависимости от которой -аминокислоты после экстракции содержатся в разных фазах. Скорость расслаивания системы водорастворимый полимер - водно-солевой раствор также связана с молекулярной массой полимера: с повышением М уменьшается количество полимера, необходимое для образования гетерогенной системы, и возрастает скорость процесса.

Изучена экстракция  фенилаланина, тирозина и триптофана водорастворимыми полимерами - поли-N-винилкапролактамом (ПВКЛ), поли-N-винилпирролидоном (ПВП), поли-N-винил-N-метилацет-амидом (ПВМА) и полиэтиленгликолем (ПЭГ-2000). Это экологически безопасные полимеры, в их присутствии при экстракции -аминокислот из водно-солевых растворов образуется вторая жидкая фаза. Принципиально важным свойством водорастворимых полимеров  является способность  взаимодействовать в водных средах со многими низко- и высокомолекулярными соединениями. Макромолекулы ПВП, ПВКЛ, ПВМА и ПЭГ характеризуются высокой комплексообразующей способностью по отношению к -аминокислотам.

Установлено, что наиболее устойчивые гетерогенные системы образуются  в присутствии высаливателей - (NH4)2SO4 и Na2SO3. Рассчитаны коэффициенты распределения и степень извлечения -ами-нокислот в системах -аминокислота - полимер - водно-солевой раствор (табл. 7 и 8).

Таблица 7. Коэффициенты распределения и степень извлечения

-аминокислот поли-N-винил-N-метилацетамидом;

высаливатель Na2SO3,  cсоли = 3,3 моль/дм3

-Амино-кислота	Концентрация -амино-кислоты, моль/дм3			D	R, %
	исходная	равновесная	в фазе полимера
Триптофан	1,2210-4	0,7810-4	0,4410-4	0,56	54,2
Тирозин	2,7610-5	2,1010-5	0,6610-5	0,31	39,2
Фенилаланин	3,6410-3	3,3910-3	0,2410-3	0,07	13,4

Степень извлечения -аминокислот возрастает в 1,5Ц2 раза при  двухкратной экстракции (R1 и R2, табл. 8). В системах с ПВП установлены наибольшие экстракционные характеристики -аминокислот по сравнению с другими изученными полимерами, что связано с повышенной стабильностью комплексов поли-N-винилпирролидона с -аминокислотами. Степень извлечения -аминокислот поли-N-винил-капролактамом  максимальна в системах с Na2SO3, другими полимерами - в присутствии сульфата аммония. Отметим, что наибольшие коэффициенты распределения -аминокислот достигаются при рН, равном изоэлектрической точке (аналогия с экстракцией органическими растворителями).

Для изучения механизма экстракции -аминокислот полимерами сняты ИК-спектры полимеров  и органической фазы  после экстракции. В фазе экстрагента возрастает содержание воды, что подтверждается увеличением интенсивности полос поглощения при 3400 - 3050 см-1, характерных для воды, и изменением интенсивности пиков при 1640 и 1480 - 950 см-1. Повышение содержания воды в органической фазе способствует образованию более прочных комплексов полимеров с -аминокислотами за счет межмолекулярной водородной связи.

Таблица 8. Коэффициенты распределения и степень извлечения

-аминокислот поли-N-винилпирролидоном;

высаливатель (NН4)2SO4, ссоли = 5,7  моль/дм3

Аминокислота	рН	D	R1,%	R2,%
Тирозин	2,00	1,78	54,8	87,1
	5,63	2,31	60,0	91,2
	9,01	0,26	17,2	37,2
Триптофан	2,00	1,26	44,2	80,4
	5,88	2,23	59,2	90,4
	9,00	0,37	20,0	47,3
Фенилаланин	2,00	2,01	55,6	89,0
	5,91	5,46	78,8	97,7
	9,02	3,58	73,2	95,3

Отметим одно из принципиальных преимуществ систем с водорастворимыми полимерами по сравнению с экстракцией традиционными растворителями (алифатическими спиртами, сложными эфирами): применение водорастворимых полимеров в качестве экстрагентов позволяет проводить безреагентную реэкстракцию -аминокислот.

Спектроскопическое изучение комплексов -аминокислот с водорастворимыми полимерами. Для определения -аминокислот в водных растворах и органической фазе сняты спектральные характеристики полимеров. По максимумам светопоглощения сделано заключение об образовании комплексов при взаимодействии полимеров с -аминокислотами, оптические свойства комплексов и исходных компонентов различны.

Изучено комплексообразование водорастворимых полимеров с -аминокислотами при разных молярных соотношениях компонентов. Установлена зависимость положения максимума светопоглощения смеси от концентрации -аминокислот в растворе и  температуры. Образование комплексов в системах фенилаланин - поли-N-винилпирро-лидон, фенилаланин - поли-N-винилкапролактам, триптофан - поли-N-винилкапролактам, триптофан - поли-N-винилпирролидон и триптофан - поли-N-винил-N-метилацетамид подтверждается соответствующими УФ-спектрами светопоглощения полимеров и -аминокис-лот при совместном присутствии. Так, на спектре  (рис. 9) проявляются максимумы светопоглощения индивидуальных компонентов (279 нм для триптофана и 200 нм для поли-N-винилпирролидона), а также новые максимумы вследствие образования комплексных соединений в растворе (228 и 246 нм).

Рис. 9. УФ-спектр светопоглощения смеси триптофан - поли-N-винилпирро-лидон 

Комплексообразование поли-N-винилкапролактама с -амино-кислотами происходит за счет водородных связей между СОО- и NН3+ - группами -аминокислот и поляризованными молекулами  воды из гидратного окружения С=О группы лактамного кольца молекулы полимера. Константы устойчивости комплексных соединений полимеров зависят от их молекулярной массы, что обусловлено в первую очередь увеличением числа контактов между частицей и звеньями цепи. Рассчитанные константы устойчивости комплексов триптофан - поли-N-винил-N-метилацетамид, фенилаланин - поли-N-винилкапро-лактам, триптофан - поли-N-винилкапролактам, фенилаланин - поли-N-винилпирролидон, триптофан - поли-N-винилпирролидон невелики (24,13; 46,38; 34,58; 72,10 и 63,40 соответственно). Это подтверждает образование "мягких" комплексов, что принципиально важно при создании лекарственных полимерсодержащих препаратов с быстрым высвобождением действующего компонента из комплексного соединения. 

ГЛАВА V. ЭКСТРАКЦИОННОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

И  СЕЛЕКТИВНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ -АМИНОКИСЛОТ

И ВИТАМИНОВ

Селективное спектрофотометрическое определение -ами-нокислот и витаминов в бинарных и тройных смесях. Спектрофотометрический анализ смесей, содержащих фенилаланин, тирозин, триптофан, аскорбиновую и никотиновую кислоты, основан на измерении светопоглощения компонентов в водных растворах и не связан с применением каких-либо реагентов.

Спектры светопоглощения изученных соединений при совместном присутствии в растворе перекрываются, что свидетельствует о невозможности их раздельного определения по светопоглощению в УФ-области спектра с применением градуировочных графиков. Для определения фенилаланина, тирозина,  триптофана, аскорбиновой и никотиновой кислот применен метод Фирордта. Предварительно рассчитывали молярные коэффициенты светопоглощения -аминокислот и витаминов при выбранных длинах волн. Метод Фирордта применим, если максимумы светопоглощения разделяемых веществ при характеристических длинах волн различаются минимум на 4Ц5 нм.

Результаты спектрофотометрического анализа смесей тирозина  и фенилаланина методом Фирордта показали, что при уменьшении концентрации одного из компонентов смеси  относительное стандартное отклонение Sr при определении каждой -аминокислоты возрастает, однако не превышает 5 %. При селективном определении -ами-нокислот в тройных смесях Sr достигает 10 %. Пределы обнаружения  фенилаланина, тирозина и триптофана методом Фирордта 5,46 10Ц4, 7,32 10Ц5 и 1,76 10Ц5 моль/дм3 соответственно.

Приводим результаты спектрофотометрического анализа  тройных смесей, содержащих -аминокислоты и аскорбиновую кислоту  (табл. 9). Проанализированы также бинарные смеси, содержащие аскорбиновую или никотиновую кислоты и -аминокислоты. Погрешность не превышает 1,2 % (определение аскорбиновой кислоты в смеси с триптофаном) и 1,0 % (определение никотиновой кислоты в смеси с фенилаланином).

Таблица 9. Спектрофотометрический анализ тройных смесей 

аскорбиновая кислота - -аминокислоты

Состав смеси, сi 10-4, моль/дм3				Результат анализа, сi 10-4, моль/дм3					Sr, %
Аскорбиновая кислота - фенилаланин - тирозин
сasc	cphe	ctyr	сasc		cphe	ctyr		Sasc		Sphe	Styr
0,567	6,053	1,381	0,536		5,863	1,314		6,5		4,2	5,2
0,283	3,026	0,689	0,248		2,623	0,617		12,3		11,2	10,6
Аскорбиновая кислота - тирозин - триптофан
сasc	ctyr	ctrp	сasc		ctyr	ctrp	Sasc			Styr	Strp
0,567	1,381	0,306	0,523		1,322	0,287	7,2			4,6	5,8
0,283	0,689	0,153	0,248		0,618	0,132	12,4			10,5	13,7
Аскорбиновая кислота - фенилаланин - триптофан
сasc	cphe	ctrp	сasc		cphe	ctrp	Sasc			Sphe	Strp
0,567	6,053	0,306	0,521		5,572	0,292	7,6			8,2	5,3
0,283	3,026	0,153	0,248		2,711	0,136	12,6			10,7	11,2

Экстракционное разделение бинарных смесей -амино-кислот и витаминов. Экстракционный способ разделения бинарных смесей -аминокислот и витаминов,включает концентрирование одного из компонентов в водном растворе.

С целью разделения фенилаланина, тирозина и триптофана изучена экстракция смеси этих -аминокислот из водно-солевых растворов бутиловым спиртом; высаливатели - галогениды и сульфаты натрия и калия. Результаты экстракционного разделения фенилаланина и тирозина показали, что максимальный фактор разделения достигается в системах с NaF и NaCl при концентрациях тирозина 0,05 мг/см3 и фенилаланина 3 мг/см3. В этих условиях степень извлечения фенилаланина достигает 95 %, тирозина - не более 4 %.

Концентрации -аминокислот в смеси выбраны с таким расчетом, чтобы содержание фенилаланина значительно превышало содержание тирозина. Это обусловлено тем, что растворимость фенилаланина выше растворимости тирозина, в биологических жидкостях поддерживается примерно аналогичное соотношение концентраций этих -аминокислот. Полученные факторы разделения подтверждают возможность практически полного экстракционного разделения -амино-кислот.

Факторы разделения фенилаланина и триптофана значительно ниже, чем при разделении тирозина и фенилаланина. Это связано с меньшими различиями в  растворимости фенилаланина и триптофана в воде, чем фенилаланина и тирозина. Кроме того, различия во взаимном влиянии протонодонорной фенольной группы тирозина и неполярного фенольного радикала фенилаланина проявляются в большей мере, чем индольного радикала триптофана и фенольного радикала фенилаланина.

При разделении бинарных смесей -аминокислот и витаминов (табл. 10) условия  экстракции (концентрации разделяемых компонентов, рН водно-солевых растворов, температура) такие же, как при экстракции индивидуальных компонентов. Наиболее эффективно разделяются системы тирозин - аскорбиновая кислота и тирозин - никотиновая кислота. Например, при извлечении 65 % тирозина в органическую фазу переходит только 2,5 % аскорбиновой кислоты. Разделение -аминокислот и никотиновой кислоты менее эффективно,  в системе фенилаланин - никотиновая кислота  разделение компонентов не происходит (влияние  циклического строения никотиновой кислоты).

Экстракционное разделение и селективное электрохимическое определение -аминокислот. Для раздельного определения фе-нилаланина и тирозина, а также тирозина и триптофана разработан экстракционно-потенциометрический способ с применением тройной смеси гидрофильных растворителей: изопропиловый спирт - этилацетат - ацетон для системы фенилаланин - тирозин и бутиловый спирт - этилацетат - ацетон для системы тирозин - триптофан. Преимущество способа - отсутствие стадии реэкстракции.

Для повышения полноты выделения органической фазы к анализируемому водному раствору -аминокислот добавляли кристаллический сульфат лития до получения раствора с содержанием соли 20 мас.%. На дифференциальной кривой потенциометрического титрования смеси тирозин - фенилаланин имеются два максимума: первый соответствует объему титранта, пошедшего на титрование фенилаланина, второй - суммарному содержанию -аминокислот в растворе.

Таблица 10. Степень извлечения (%)  и  факторы разделения

  триптофана (тирозина) и аскорбиновой кислоты при экстракции

бутиловым спиртом; саsc = 5,67710-5 моль/дм3,

стrp = 12,25510-5 моль/дм3, сtyr = 27,59310-5 моль/дм3

Высаливатель	саsc 10-5, моль/дм3	стrp(tyr)10-5, моль/дм3	R1		R2
Триптофан - аскорбиновая кислота
NaCl	2,363	12,135	56,6		1,75	73,4
Na2SO410H2O	2,567	12,024	54,8		1,99	58,1
NaF	2,245	11,894	59,4		2,94	50,3
KCl	3,497	12,113	37,1		1,24	45,6
KBr	3,978	12,106	29,7		1,51	28,4
Тирозин - аскорбиновая кислота
NaCl	1,989	26,891	64,9	2,64		70,1
Na2SO410H2O	2,367	27,106	58,2	1,84		74,5
NaF	1,878	26,527	66,9	3,92		49,5
KCl	2,934	26,951	48,3	2,45		37,2
KBr	3,777	27,045	33,4	1,99		24,6

Добавление к более активному растворителю (ацетон) этилацетата и изопропилового спирта значительно повышает коэффициенты распределения -аминокислот. В таких системах апротонный растворитель (этилацетат) способствует разрыву межмолекулярных водородных связей. Это усиливает сольватацию растворителем и увеличивает коэффициенты распределения. Положительный эффект проявляется в основном при малых концентрациях этилацетата.

При изучении экстракции тирозина и триптофана бутиловым спиртом установлено, что самоассоциация растворителя снижает вероятность образования водородных связей между -аминокислотой и экстрагентом. Коэффициенты распределения и степень извлечения тирозина и триптофана бутиловым спиртом приведены в табл. 11. Механизм сольватации тирозина и триптофана бутиловым спиртом и ацетоном различен, включает взаимодействия либо за счет свободной электронной пары СООН-группы кислоты, либо ОН-группы спирта. Таким образом, бутиловый спирт более эффективный экстрагент, чем ацетон, однако и в системах с бутиловым спиртом практически полное извлечение тирозина и триптофана из водно-солевых растворов не достигается, степень извлечения 90,7 и 91,7 % соответственно.

Таблица 11. Коэффициенты распределения и степень извлечения триптофана и тирозина в системе бутиловый спирт - ацетон;

высаливатель - сульфат лития

Смесь растворителей, мол.доли		Триптофан		Тирозин
бутиловый спирт	ацетон	D	R, %	D	R, %
1,0	-	110	91,7	98	90,7
0,9	0,1	254	96,2	192	95,1
0,8	0,2	340	97,2	305	96,8
0,7	0,3	432	97,8	318	97,1
0,6	0,4	548	98,2	600	98,4
0,5	0,5	440	97,7	386	97,4
0,4	0,6	297	96,7	260	96,3

С целью выбора титранта, обеспечивающего максимальный скачок на кривых кондуктометрического или потенциометрического титрования и надежность индикации точки стехиометричности, -аминокислоты титровали в среде бутилового спирта этанольными растворами гидроксидов калия или тетраметиламмония, а также диэтил- амина.Для селективного определения -аминокислот в бинарных смесях принципиальное значение имеет повышение электропроводности при нейтрализации обеих кислот. Наибольший излом на кривой кондуктометрического титрования смеси триптофан - тирозин характерен для экстракции смесью бутиловый спирт - ацетон. Это связано с тем, что ацетон снижает концентрации ионов Li+ и SО42- до уровня, не мешающего определению -аминокислот. В качестве эффективной среды для селективного определения триптофана и тирозина методом кондуктометрического титрования рекомендуется смесь бутиловый спирт (0,6 мол.доли) - ацетон (0,4 мол.доли). С целью повышения эффективности извлечения -аминокислот из водных растворов применена тройная смесь бутиловый спирт - ацетон - этилацетат. Сложность применения таких систем заключается в оптимизации соотношения компонентов смеси растворителей, задача решается методом симплекс-решетчатого планирования эксперимента.

В Ы В О Д Ы

1. Разработана методология процессов извлечения, концентрирования, разделения и определения биологически активных веществ - ароматических -аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан) и водорастворимых витаминов (аскорбиновая и никотиновая кислоты). Для решения аналитических задач применена экстракция частично или полностью растворимыми в воде органическими растворителями, их двух- и трехкомпонентными смесями. 

2. Разработаны теоретические аспекты экстракционных равновесий в системах -аминокислота (витамин) - гидрофильный растворитель (смесь растворителей) - высаливатель - вода. Установлены факторы, влияющие на экстракционные характеристики (коэффициенты распределения, степень извлечения, факторы разделения): строение и свойства распределяемых соединений, физико-химические параметры органических растворителей, состав экстракционной системы, природа и концентрация высаливателя. Методом симплексЦрешетчатого планирования эксперимента оптимизирован состав смесей экстрагентов, разработан алгоритм выбора эффективной экстракционной системы для решения конкретной аналитической задачи.

3. Метод корреляций применен для прогнозирования экстракционных характеристик -аминокислот и витаминов в системах с индивидуальными растворителями, получена количественная информация о коэффициентах распределения исследованных соединений. Методами термического анализа и ИК-спектроскопии изучен механизм межфазного распределения -аминокислот и витаминов, представлены схемы гидратно-сольватных взаимодействий компонентов в органической фазе.

4. Водорастворимые полимеры поли-N-виниламидного ряда (поли-N-винилпирролидон, поли-N-винилкапролактам, поли-N-винил-метилацетамид), а также полиэтиленгликоль ПЭГЦ5000 впервые применены для экстракции биологически активных веществ. Методами УФ- и ИК-спектроскопии изучен состав и строение комплексов -аминокислот и полимеров, механизм взаимодействия компонентов в экстрактах. Установлено, что с увеличением молекулярной массы полимеров их комплексообразующая способность уменьшается, экстрагирующая активность по отношению к -аминокислотам снижается. С применением экологически безопасных синтетических водорастворимых полимеров возможна безреагентная реэкстракция -аминокислот - при нагревании системы до  30 0С полимеры осаждаются, -аминокислоты остаются в водном растворе. Максимальные количественные характеристики достигаются в системах с поли-N-винилпир-ролидоном (степень извлечения -аминокислот 95 - 97 %).

5. Для селективного определения -аминокислот и витаминов при совместном присутствии применен спектрофотометрический метод. Вычислены молярные коэффициенты светопоглощения компонентов смесей, параметры уравнения Фирордта для расчета концентраций -аминокислот и витаминов в смесях. Погрешность раздельного определения -аминокислот в бинарных смесях не превышает 5 %, в тройных - 10 %. Погрешность определения аскорбиновой кислоты минимальна в смеси с триптофаном (1,2 %), никотиновой кислоты - в смеси с фенилаланином (1,0 %). Пределы обнаружения -аминокислот и витаминов 5,510-4 - 1,110-5 моль/дм3.  Спектрофотометрический метод применен для анализа готовых лекарственных средств, содержащих аскорбиновую и никотиновую кислоты.

6. На основании установленных закономерностей экстракции разработан алгоритм разделения смесей -аминокислот, а также -аминокислот  и витаминов в фармпрепаратах и некоторых пищевых продуктах. Оптимизированы условия эффективного разделения (концентрации высаливателя и отдельных компонентов смеси). Рассчитаны факторы разделения смесей -аминокислот, аскорбиновой или никотиновой кислот и -аминокислот. Максимальные факторы разделения фенилаланина и тирозина достигаются в системах с NaF или NaCl (710 и 450 соответственно), в этих условиях степень извлечения фе-нилаланина 95 %, тирозина - 4 %. Разработаны системы (на основе бутилового спирта) для эффективного разделения аскорбиновой кислоты и -аминокислот.

7. Теоретически обоснован и разработан комплекс способов определения микроколичеств -аминокислот и витаминов, включающий экстракционное концентрирование, спектрофотометрическое определение компонентов в водных растворах и электрохимическое (потенциометрическое и кондуктометрическое) титрование -аминокис-лот в неводных экстрактах.

Предложенные аналитические решения характеризуются селективностью, низкими пределами обнаружения, воспроизводи-мостью и правильностью результатов. Их новизна подтверждена патентами РФ. Разработки апробированы на реальных объектах, внедрены в практику аналитических служб.

Основные публикации по диссертационной работе

Монография

Мокшина Н.Я. Экстракция аминокислот и витаминов. - Воронеж: Воронеж. гос. технол. акад., 2007. - 246 с.

  Статьи в журналах, рекомендуемых ВАКом

1. В.Ф.Селеменев, Д.Л.Котова, Н.Я.Коренман, Г.Ю.Орос. Определение воды и ее перераспределения в ионообменниках методом термического анализа // Журнал аналитической химии. 1991. Т.46, № 2, с. 414 - 416.

2. В.Ф.Селеменев, Н.Я.Коренман, В.Ю.Хохлов. Извлечение тирозина бутиловым спиртом из водно-солевых растворов // Журнал прикладной химии. 1991.Т.64, № 12, с. 2707 - 2710.

3. Н.Я.Коренман, В.Ф.Селеменев. Экстракция тирозина спиртами - гомологами из водных растворов // Журнал прикладной химии. 1992. Т.65, № 1, с. 233 - 236.

4. Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев, Д.Л.Котова, Г.Ю.Орос. Экстракционно-сорбционное извлечение глутаминовой кислоты из микробиологических сред // Журнал прикладной химии. 1992. Т.65, № 12, с. 2748 - 2751.

5. В.Ф.Селеменев, В.Ю.Хохлов, Н.Я.Коренман, Е.В.Ловчиновская. Спектрофотометрическое определение фенилаланина и тирозина // Журнал аналитической химии. 1994. Т.49, № 4, с. 446 - 447.

6. Д.Л.Котова, Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев. Дегидратация катионообменника КУ-2-8 при выделении аминокислот из ферментационных растворов // Известия вузов. Химия и химическая технология. 1994. Т.37,  № 1, с. 37 - 40.
7. Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев, М.В.Матвеева, Ю.В.Крестникова. Экстракция тирозина и фенилаланина гидрофильными растворителями // Журнал аналитической химии. 1994, Т.49, № 11, с.1193 - 1196.
8. Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев, Д.Л.Котова. Экстракционно-сорб-ционное выделение фенилаланина из водно-солевых растворов гидрофильными спиртами // Журнал прикладной химии. 1994. Т.67, № 6, с.1051.
9. Н.Я.Мокшина, Д.Л. Котова, В.Ф.Селеменев. Физико-химические особенности взаимодействия компонентов при экстракции аминокислот бутиловым спиртом // Известия вузов. Химия и химическая технология. 1999. Т.42, № 2, с. 32 - 35.
10. Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев. Экстракционное разделение бинарных смесей ароматических аминокислот // Известия вузов. Химия и химическая технология. 1999. Т.42, №  4, с. 23 - 25.
11. А.В.Казначеев, О.Н.Хохлова, В.Ф.Селеменев, В.Ю.Хохлов, Н.Я. Мокшина. Спектрофотометрическое определение ароматических и гетероциклических аминокислот в их смесях // Журнал аналитической химии. 2000. Т.55, № 4, с. 375 - 377.
12. Н.Я.Мокшина, С.Копач, Я.Калембкевич, Г.Ю.Орос, Е.В.Иванова. Применение корреляционного анализа при описании межфазного распределения фенилаланина в системах с гидрофильными спиртами и ионогенными сорбентами // Сорбционные и хроматографические процессы. 2001.Т.1, № 3, с. 510 - 513.
13. Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев, Г.Ю.Орос. Расчет коэффициентов активности аминокислот в средах с переменной диэлектрической проницаемостью // Известия вузов. Химия и химическая техноло-гия. 2001. Т.44, № 5, с.17 - 19.
14. Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев. Корреляционные зависимости коэффициентов распределения аминокислот и физико-химических свойств экстрагентов // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2001. Т.44, № 6, с. 3 - 5.
15. Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев, Г.Ю.Орос. Явления синергизма при сорбции и экстракции биологически активных веществ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2002. Т.2, № 2, с. 166 - 174.
16. Н.Я.Мокшина, В.Ю.Хохлов, В.Ф.Селеменев, Ю.В.Шляхина. Сорбция аминокислот из водно-бутанольных растворов катионитом КУ-2-8 // Сорбционные и хроматографические процессы. 2002. Т.2, № 5Ц6, с. 545Ц548.
17. Г.Ю.Орос, Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев. Применение методов хроматографии и спектроскопии для идентификации пигментов белковых гидролизатов // Сорбционные и хроматографические процессы. 2003. Т.3, № 5, с. 545 - 548.
18. Н.Я.Мокшина, В.Ю.Хохлов, Ю.В.Шляхина, В.Ф.Селеменев. Фотометрическое определение витамина А и провитамина А при совместном присутствии // Вестник ВГУ. Серия Химия. Биология. Фармация. 2003. № 2, с. 53 - 55.
19. Н.Я.Мокшина, Р.В.Савушкин, В.Ф.Селеменев, О.В.Ерина, В.Л. Скопинцева. Некоторые закономерности экстракции аскорбиновой кислоты гидрофильными спиртами // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2004. Т. 47, № 10, с. 120 - 122.
20. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Экстракция тирозина и фенилаланина смесью гидрофильных растворителей из водно-солевого раствора // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2005. Т. 48, № 1, с. 109 - 112.
21. Ю.В.Шляхина, Н.Я.Мокшина, В.Ю.Хохлов, Н.Н.Медведева, В.Ф. Селеменев, Г.В.Шаталов. Спектроскопическое исследование комплексов поли-N-винилпирролидона с фенилаланином и валином // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2005.Т. 48, № 6, с. 131 - 133.
22. О.В.Ерина, Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев, Л.С.Нечаева. Экстракционно-фотометрическое определение рутина в водных растворах // Вестник ВГУ. Серия Химия. Биология. Фармация. 2005. № 1, с. 26 - 28.
23. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Экстракция некоторых алифатических аминокислот из водных растворов с применением смеси гидрофильных растворителей // Химическая технология. 2005. № 5, с. 44 - 46.
24. О.В.Ерина, Н.Я.Мокшина, В.Ф.Селеменев, Л.С.Нечаева. Экстракция рутина из водно-солевых сред // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2005. Т. 4, № 3, с. 364 - 366.
25. Н.Я.Мокшина, Р.В.Савушкин, Г.Ю.Орос, О.В.Ерина. Экстракция никотиновой кислоты из  водно-солевых сред // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6, № 2, с.332 - 336.
26. Н.Я.Мокшина, О.А.Пахомова, С.И.Нифталиев. Экстракция аспарагина гидрофильными растворителями из водных растворов // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2006. Т. 49, № 4, с. 8 - 11.
27. Ю.В. Шляхина, Н.Я Мокшина, В.Ю. Хохлов, В.Ф.Селеменев, Г.В. Шаталов. Применение водорастворимых полимеров для экстракционного извлечения ароматических аминокислот // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2006. Т. 49, № 6, с. 20 - 22.
28. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Распределение ти-розина и триптофана в системе вода - бутиловый спирт - ацетон - этилацетат - сульфат лития // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6, № 4, с. 642 - 647.
29. Н.Я.Мокшина, О.А.Пахомова, С.И.Нифталиев. Селективное определение ароматических аминокислот в экстрактах на основе гидрофильных растворителей // Химическая технология. 2006. № 7, с. 45 - 47.
30. Н.Я.Мокшина, О.А.Пахомова, С.И.Нифталиев. Оптимизация состава трехкомпонентного экстрагента для извлечения аспарагиновой кислоты и глутамина из водных сред // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т. 6, № 6, ч. 4,  с. 1414 - 1418.

Статьи в международных и российских журналах

31. В.Ф.Селеменев, Г.Ю.Орос, Д.Л.Котова, В.Ю.Хохлов, О.Н. Хохлова, А.Н.Зяблов, В.А.Углянская, Н.Я.Мокшина, И.В.Никифорук, Е.Ф.Сафонова, О.Ф.Стоянова.  Гидратационные свойства катионитов в аминокислотных формах // Теория и практика сорбционных процессов. 1999. Т. 25,  с.168 - 186.
32. Н.Я.Мокшина, Г.Ю.Орос, А.А.Загородний, И.В.Никифорук. Особенности образования ассоциатов аминокислот при их экстракции из водных растворов // Теория и практика сорбционных процессов.  2000. Т. 26, с. 136 - 138.
33. Н.Я.Мокшина. Синергизм при экстракции аминокислот с участием ионообменников из водных и микробиологических сред // Труды молодых ученых ВГУ. 2000. № 2, с. 109 - 112.
34. В.Ф.Селеменев, Н.Я.Мокшина, Г.Ю.Орос, А.Н.Мануковская. Определение тепловых эффектов и параметров растворимости при экстракции аминокислот методом термического анализа // Вестник Тамбовского университета.Серия естественных и технических наук. 2000. Т.5, № 5, с. 580 - 582.
35. N.Mokshina. Extraction and spectrophotometric deretmination of aromatic amino acids in aqueous solutions and albumins hydrolyzed albumins // Ecological Congress (USA). 2002. V.5, № 2, р. 1 - 4.
36. Н.Я.Мокшина, Р.В.Савушкин, В.Ф.Селеменев, В.Ю.Хохлов. Спектрофотометрическое определение аскорбиновой кислоты и аминокислот при совместном присутствии // Аналитика и контроль. 2004. Т.8, № 4, с. 346 - 348.
37. N.Ya. Mokshina. Spectral methods of extraction and determination of ascorbic acid in water solutions // Ecological Congress (USA). 2005. V.8, № 1, р. 21 - 23.
38. N.Ya.Mokshina, O.A.Pakhomova. Biologically active substance analysis utilizing spectral methods // Ecological Congress (USA). 2006. V. 9, № 1, р. 5 - 7.
39. N.Ya.Mokshina, O.A.Pakhomova. Determination of essential amino acids in the production of fermented solutions using extraction from a ternary mixture of hydrophilic solvents // Ecological Congress (USA). 2006. V. 9, № 1, р. 9 - 12.
40. N.Ya.Mokshina, O.A.Pakhomova. Extraction-potentiometric determination of some aliphatic amino acids in hydrophilic solvents // Ecological Congress (USA). 2006. V. 9, № 1, р. 25 - 27.
41. Н.Я.Мокшина, О.А.Пахомова, С.И.Нифталиев, И.В.Трепов. Селективное определение триптофана и фенилаланина в водном растворе // Химические науки-2006: Сб. науч. трудов. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2006. Вып. 3, с. 117 - 121.
42. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Моделирование процесса экстракции ароматических аминокислот в анализе фармацевтических препаратов // Фундаментальные исследования. 2007. № 2, с. 20 - 23.

Изобретения

43. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ селективного определения тирозина и фенилаланина в водном растворе. Патент № 2276784. Заявл.15.03.2005.Опубл. 20.05.2006.Бюл. № 14.
44. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ определения глицина в водном растворе. Патент № 2277085. Заявл. 15.03.2005. Опубл. 27.05.2006. Бюл.  № 15.
45. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ раздельного определения аспарагиновой кислоты и глутамина в водном растворе. Патент № 2294537. Заявл. 13.02.2006. Опубл. 27.02.2007. Бюл. № 6.
46. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ определения аспарагиновой кислоты в водном растворе. Патент № 2298072. Заявл. 16.11.2005. Опубл. 27.04.2007. Бюл. № 12.
47. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ определения лизина в водном растворе. Патент № 2299433. Заявл. 07.04.2006. Опубл. 20.05.2007. Бюл. № 14.
48. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ определения аланина в водном растворе. Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка № 2006122929/ 04 (024883).
49. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе. Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка № 2006105566 /04 (006022).
50. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ селективного определения триптофана и фенилаланина в водном растворе. Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка № 2006122128/04 (024029).
51. Н.Я.Мокшина, С.И.Нифталиев, О.А.Пахомова. Способ определения валина в водном растворе.  Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка № 2006122891/ 04(024845).

Материалы докладов

По материалам диссертации опубликованы рефераты 85 докладов, сделанных автором на международных, Всесоюзных, Всероссийских, региональных конференциях, симпозиумах, форумах и конгрессах в 1990Ц2007 гг.

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии