Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Искусных Игорь Юрьевич
ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ПРИ ОКСИДАТИВНОМ СТРЕССЕ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Специальность 03.01.04. - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Воронеж - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежский государственный университет (ФГБОУ ВПО ВГУ) Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии Цветикова Любовь Николаевна кандидат биологических наук, НИИ экспериментальной биологии и медицины "Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко", старший научный сотрудник Ведущая организация Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии
Защита состоится 28 мая 2012 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 390006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета Автореферат разослан 26 апреля 2012 года.
Ученый секретарь диссертационного совета Грабович М.Ю.
доктор биологических наук ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Окислительный стресс или некомпенсированное образование в клетке активных форм кислорода (АФК), является причиной систематического повреждения ДНК, белков и липидов, что может приводить к клеточной смерти и лежит в основе ряда патологических состояний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, токсическое поражение печени и сахарный диабет, относящихся к свободнорадикальным патологиям. В ответ на интенсификацию свободнорадикального окисления (СО) биосубстратов происходит активизация антиоксидантной системы (АОС) клетки.
Глутатионредуктазная/ глутатионпероксидазная (ГР/ГП) система является важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма (Владимиров Ю.А., 1972), поддерживающей на стационарном уровне интенсивность протекания свободнорадикальных процессов (Владимиров Ю.А., 1972, Kowaltowski A.J., Шишкина Л.Н., 2000). Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих обеспечивается детоксикация гидроперекисей и перекисей, являющихся основным источником гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона в присутствии ионов Fe2+ (Осипов А.Н., 1990, Skulachev V.P., 1997). Учитывая то обстоятельство, что большинство известных патологических состояний сопровождаются усилением СО (Ланкин В.З., 2001, Bakker S.J., 2000, Kowaltowski A.J., 1999) биосубстратов и изменением активности АОС, весьма актуальной проблемой представляется оценка состояния этих систем с целью ранней диагностики и выбора тактики лечения заболеваний.
Установлено, что при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом, может изменяться гормональный статус организма, в связи с чем, индукция оксидативного стресса может иметь опосредованный нейрогуморальный характер. Клеточные культуры являются удобной модельной системой для исследования оксидативного стресса, поскольку их использование позволяет исключить многие неспецифические факторы, сопровождающие индукцию оксидативного стресса. В этой связи, изучение экспрессии ГП и ГР на клеточных культурах in vitro при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода, является также актуальной задачей.
В настоящее время в литературе имеются данные относительно изменения функционирования некоторых звеньев антиоксидантной системы в тканях животных и человека (Gutterer J.M., 1999, Madamanchi N.R., 1992, Krauth-Siegel R.L., 1982) в условиях патологии. Однако имеющиеся сведения носят часто разрозненный, противоречивый и несистематизированный характер. Вместе с тем, представляет интерес выявление общих закономерностей и особенностей функционирования ГП/ГР АОС при оксидативном стрессе различной этиологии, в частности, вызванным развитием патологических состояний - адреналинового миокардита, токсического гепатита, сахарного диабета 2 типа (СД 2), а также индуцируемым АФК в клеточных культурах. Использование различных модельных систем позволяет выявить важнейшие молекулярные механизмы регуляции глутатионовой АОС с одной стороны, а также ее специфические особенности - с другой.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование экспрессии ГР и ГП в тканях крыс в условиях оксидативного стресса, вызванного индукцией свободнорадикальных патологий: адреналинового миокардита, токсического поражения печени, сахарного диабета 2 типа, а также воздействием пероксида водорода на клеточные культуры фибробластов.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
1.Корреляционный анализ активностей ГР, ГП и интенсивности свободнорадикальных процессов в тканях крыс при адреналиновом миокардите, экспериментальном токсическом гепатите (ЭТГ) и СД2.
2.Оценка уровня экспрессии ГП, ГР и Г6ФДГ в тканях крыс при адреналиновом миокардите, ЭТГ и СД2.
3. Исследование влияния пероксида водорода на метаболическую активность, особенности пролиферации и клеточную гибель фибробластов мыши линии L94.Исследование уровня экспрессии ГП и ГР в фибробластах линии L929 при воздействии пероксида водорода.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование экспрессионной регуляции ГР, ГП и Г6ФДГ при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом, а также индукции апоптотических процессов в клеточных культурах. Выявлены особенности экспрессии данных ферментов и проведен сравнительный анализ активности ГР/ГП-системы при оксидативном стрессе, вызванном адреналиновым миокардитом, ЭТГ, СД2. Осуществлен компьютерный дизайн олигонуклеотидов для определения уровня экспрессии генов ГП, ГР и Г6ФДГ. Установлено, что пероксид водорода подавляет метаболическую активность клеток и индуцирует апоптоз фибробластов линии L929, что сопровождается повышением степени экспрессии ГР и ГП.
Полученные данные представляют интерес с точки зрения регуляции образования АФК за счет изменений активностей ГР и ГП, взаимосвязанных с модификацией их экспрессии. Проведенные исследования способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК с помощью ключевых ферментов глутатионовой антиоксидантной системы при развитии свободнорадикальных патологий.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на Всероссийской научнометодической конференции с международным участием Фармобразование2010 (Воронеж, 2010), на научно-практической конференции Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии Томск, 2010), на научно-практической конференции с международным участием Актуальные проблемы современной науки и образования (УФА, 2010), на международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2010), на школе-конференции Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины (Москва, 2010), на конференции Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных проблем и прикладных научных задач, (Москва, 2010).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 13 публикациях - в 3 статьях и 10 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
1. В условиях оксидативного стресса, вызванного развитием адреналинового миокардита, выявлена корреляционная зависимость уровня ДК, параметров БХЛ, отражающих скорость свободнорадикальных процессов, и активностей ГП и ГР в сердце крыс, возрастающих за счет индукции синтеза ферментов de novo.
2. При токсическом поражении печени крыс интенсификация свободнорадикального окисления биосубстратов коррелирует с возрастанием активностей ГП и ГР, что сопряжено с увеличением уровня их экспрессии.
3. Развитие СД2 сопровождается интенсификацией свободнорадикальных процессов, что коррелирует с активацией ГП/ГР- системы. Однако в условиях данной патологии происходит индукция синтеза ГР и снижение уровня экспрессии ГП.
4. Воздействие пероксида водорода на фибробласты линии L929 приводит к снижению их метаболической активности, пикнозу и кариорексису, являющимися признаками апоптоза, развивающегося в клеточной культуре, и возрастанию степени экспрессии ГП и ГР.
5. Предложена схема процессов регуляции экспрессии ГП и ГР и их участия в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе различной этиологии.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 1страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (6 глав), заключения, выводов, списка литературы. Иллюстративный материал включает 59 рисунков и таблиц.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объекта исследования использовали взрослых лабораторных белых крыс (Rattus norvegicus L.), самцов, массой 150 - 200 г, содержащихся на стандартном рационе питания в виварии. Исследования проводились также на линиях клеток из коллекции клеточных культур Института Биофизики Клетки РАН: NCTC clone L929 - фибробласты, полученные из клеток подкожной соединительной ткани мышей С3H/An (Flow Laboratories, Великобритания, J.Nat. Cancer Inst. 1948, 9, 229);
Адреналиновый миокардит у крыс моделировали введением 0,1% раствора адреналина в дозе 0,15 мл на 100 г массы тела (Непомнящих Л.М., 2002). Контрольным животным вводили соответствующую аликвоту физиологического раствора.
Моделирование экспериментального токсического гепатита осуществляли пероральным введением 33% раствора ССl4 в вазелиновом масле из расчета 64 мкл ССl4 на 100 г веса животного (Федорова Н.Ю., 1999).
Сахарный диабет индуцировали внутримышечным введением протаминсульфата в течение 3-х недель в дозе 10 мг/кг массы тела животного в объеме 0,5 мл 0,9% NaCl, 3 раза в сутки (Ульянов А.М., 2000).
Определение диеновых конъюгатов (ДК) осуществляли на спектрофотометре Hitachi U1900 при 233 нм (Стальная И.Д., 1997).
Интенсивность свободнорадикальных процессов определяли методом индуцированной пероксидом водорода с сульфатом железа биохемилюминесценции (БХЛ) на биохемилюминометре БХЛ-007 с программным обеспечением.
Определение активности ферментов ГР, ГП и Г6ФДГ осуществляли на спектрофотометре Hitachi U1900 при 340 нм. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25С.
Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry, 1951) Экстракцию тотальной РНК осуществляли с использованием тризолового метода.
Электрофорез РНК и ДНК проводили в агарозном геле. Для окрашивания использовали бромистый этидий.
Обратную транскрипцию осуществляли на матрице выделенной РНК со случайными гексапраймерами.
ПЦР-амплификацию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) проводили на приборе АНК-32. В ходе эксперимента использовали набор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR Green I.
Определение относительного уровня экспрессии генов осуществляли с применением сравнительного метода пороговых циклов и программного обеспечения REST 2008 (Pfaffl M.W., 2002).
Оценку метаболической активности клеток проводили на основании МТТ-теста, основанного на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток.
Исследование жизнеспособности фибробластов L929, культивируемых в присутствии пероксида водорода, проводили на микроскопе Axiovert 2(Цейсс, Германия). Для проведения анализа использовали набор L-70LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Kit (Invitrogen, США).
Для оценки интенсивности апоптоза и анализа изменения ядерной морфологии клетки окрашивали красителем Hoechst (1 мкМ). Препараты просматривали во флуоресцентном микроскопе Axiovert 200 Цейсс.
Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 7-8-х кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. Результаты опытов сравнивали с контролем. В таблице и на рисунках приводятся средние арифметические значения активностей фермента и их стандартные ошибки.
Полученные данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, обсуждаются статистически достоверные результаты при р0,05 (Ллойд, Ледерман, 1990).
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность: научному руководителю диссертации д.б.н., проф. Т.Н. Поповой и коллективу лаборатории роста клеток и тканей Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН: д.м.н., проф. Б.К. Гаврилюку, асп. А.Л.
Попову, к.ф-м.н. И.И. Селезневой, к.ф-м.н. Г.А. Давыдовой за предоставление возможности работы с культурами фибробластов.
ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В СЕРДЦЕ КРЫС ПРИ РАЗВИТИИ АДРЕНАЛИНОВОГО МИОКАРДИТА Интенсивность патологического процесса в сердце при введении адреналина оценивали с помощью активностей АсАТ и сердечной изоформы креатинкиназы (КК-МВ) в сыворотке крови. Активность КК-МВ и АсАТ, являющихся маркерными ферментами повреждения миокарда, возрастала при адреналиновом миокардите в 7,2 и 2,6 раза соответственно по сравнению с контролем. Наблюдающиеся изменения активностей ферментов, являющихся критериями выраженности процессов цитолиза в тканях сердца (АсАТ, ККМВ), свидетельствуют о нарушении функционирования данных органов при патологии.
Динамика свободнорадикального окисления и состояние ГР/ГП антиоксидантной системы были исследованы в ткани сердца крыс в течение часов после индукции адреналинового миокардита. В результате проведенных исследований нами было установлено, что при развитии патологии сердечной мышцы происходит увеличение содержания ДК уже через 12 часов после введения адреналина в 3,6 раза. Максимальный уровень ДК, превышающий контрольное значение в 3,7 раза, наблюдался спустя 24 часа после введения данного гормона. На 30-м и 36-м часу развития адреналинового миокардита уровень ДК был повышенным в 3,6 раза относительно контроля. Полученные данные свидетельствуют об активации процессов ПОЛ и накоплении продуктов липопероксидации в ткани сердца животных, подвергнутых экспериментальному адреналиновому миокардиту.
Показано также, что светосумма хемилюминесценции (S) и интенсивность максимальной вспышки (Imax), отражающие интенсивность СО, значительно возрастали, достигая максимума через 24 часа после индукции патологии. S увеличивалась в 1,7 раз, по сравнению с контролем. Значение Imax возрастало в сердце в 3,9 раза относительно уровня контрольных значений. Через 24 часа после индукции патологии сердца наблюдалось повышение величины тангенса угла наклона кинетической кривой (tg2), характеризующего общую антиоксидантную активность, в 3,3 раза по сравнению с нормой. Это позволяет заключить, что в условиях патологии начинают действовать компенсаторные механизмы, направленные на снижение уровня СО в клетке.
Исследование изменения активности ГП в ходе развития адреналинового миокардита показало, что максимальная активность наблюдается через 24 часа после введения адреналина. При этом активность в расчете на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались соответственно в 1,5 и 1,4 раза.
Максимальный уровень ГР в сердце крыс при адреналиновом миокардите был зарегистрирован через 24ч после индукции патологии. Активность на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались в 1,9 и 1,8 раза соответственно. На 30-м и 36-м часу развития адреналинового миокардита удельная активность ГР была повышена в 1,5 и 1,4 раза соответственно.
Полученные результаты отражают увеличение антиоксидантного потенциала в сердце крыс на данных этапах развития адреналинового миокардита. Повидимому, наблюдаемые изменения активностей ГП и ГР, являющиеся защитной реакцией организма на интенсификацию СО биосубстратов при развитии адреналинового миокардита, могут быть как результатом их активации, так и стимуляции синтеза. Таким образом, очевидно, существует взаимосвязь между интенсивностью свободнорадикальных процессов и активностями ГР и ГП в кардиомиоцитах крысы. Согласно полученным результатам, в сердце при индуцированном адреналином миокардите наблюдается также увеличение активности Г6ФДГ. Так, активность Г6ФДГ в сердце, выраженная в количестве Е на грамм сырой массы и в виде удельной активности, увеличивается в 2,2 и 2,8 раза соответственно. Очевидно, активация Г6ФДГ, наблюдаемая при патологии, может иметь значение для работы ГР/ГП АОС, использующей НАДФН для восстановления глутатиона.
Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax и S имеют значения 0,9, 0,8, 0,6.
Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, Imax, S и активностью ГП: 0,7, 0,9, 0,8 соответственно.
Было проведено исследование экспрессии ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите у крыс. Для определения уровня экспрессии гена ГР из сердца крыс на 24ч развития адреналинового миокардита была экстрагирована тотальная РНК. Электрофореграмма выделенной РНК свидетельствует, что количество 28S рРНК значительно преобладает над 18S рРНК. Это позволяет сделать заключение об отсутствии деградации полученной РНК под действием рибонуклеаз. После проведения реакции обратной транскрипции были оптимизированы временные и температурные характеристики ПЦР-РВ и подобрана концентрация праймеров для обеспечения высокой эффективности амплификации. Анализ экспрессии гена ГР с учетом эффективности ПЦР позволил установить, что через 24 часа после индукции патологии уровень этих транскриптов увеличивается. Экспрессия ГР возрастала в 2,8 раза относительно нормы (рис.1).
Рис. 1 Уровень транскриптов генов глутатионредуктазы (а), глутатионпероксидазы (б) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (в) в сердце крыс контрольной группы (1) и на 24 час развития адреналинового миокардита (2), рассчитанный с помощью программного обеспечения Rest 20Оценка уровня экспрессии с гена глутатионпероксидазы в норме и при патологии осуществлялась с помощью программы REST 2008. Расчет разницы экспрессии с учетом пороговых циклов для генов Удомашнего хозяйстваФ и значений эффективности амплификации показал, что при адреналиновом миокардите происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГП в сердце крыс в 7,3 раза относительно нормы (рис. 1). Установлено, что экспрессия Г6ФДГ в сердце крыс при адреналиновом миокардите возрастала в 5,9 по сравнению с контролем (рис.1). Регенерация GSH в ходе ГР-реакции осуществляется при постоянном притоке в систему восстановительных эквивалентов, основными поставщиками которых в клетке являются дегидрогеназы пентозофосфатного пути. Поэтому, очевидно, развитие адреналинового миокардита сопровождалось индукцией Г6ФДГ, поставляющей НАДФН для функционирования глутатионовой АОС (Попова Т.Н., 2009).
ГЛАВА 4. ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ КРЫС Для оценки состояния клеток печени при развитии экспериментального токсического гепатита было проведено измерение активности ААТ и АсАТ в сыворотке крови животных. При токсическом поражении печени под действием CCl4 происходит увеличение активности ААТ и АсАТ в сыворотке крови подопытных животных. Так, активность ААТ на 4-е сутки развития ЭТГ увеличивалась в 7,7 раза, а активность АсАТ - в 4,9 раза по сравнению с группой контрольных животных. Это свидетельствует о развитии цитолитического синдрома, так как эти ферменты являются маркерами степени поражения ткани печени при токсическом гепатите.
Уровень свободнорадикального окисления и состояние ГР/ГП антиоксидантной системы были исследованы в ткани печени крыс в течение 125ч развития ЭТГ. Было установлено, что максимальный уровень ДК, превышающий контрольное значение в 1,8 раза, наблюдался спустя 96 часов после введения токсического агента. Полученные данные свидетельствуют об активации процессов ПОЛ и накоплении продуктов липопероксидации в ткани печени животных, подвергнутых ЭТГ.
Показано также, что светосумма хемилюминесценции (S) и интенсивность максимальной вспышки (Imax), отражающие интенсивность СО, значительно возрастали, достигая максимума через 96 часов после индукции патологии. S увеличивалась в 2,7 раз, по сравнению с контролем. Значение Imax возрастало в сердце в 2,0 раза относительно уровня контрольных значений. Через 96ч после индукции патологии печени наблюдалось повышение величины тангенса угла наклона кинетической кривой (tg2), характеризующего общую антиоксидантную активность, в 2,3 раза по сравнению с нормой. Это позволяет заключить, что в условиях патологии начинают действовать компенсаторные механизмы, направленные на снижение уровня СО в клетке.
Исследование изменения активности ГП в ходе развития ЭТГ показало, что максимальная активность наблюдается через 96 часов после введения тетрахлорметана. При этом активность в расчете на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались соответственно в 4,6 и 2,5 раза.
Максимальный уровень ГР в сердце крыс при ЭТГ был зарегистрирован также через 96ч после индукции патологии. Активность на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались в 1,5 и 2,1 раза соответственно.
Установлено, что на 96ч развития ЭТГ происходит увеличение удельной активности Г6ФДГ в печени крыс в 1,7 раза, относительно контроля. Индукция ЭТГ сопровождается также увеличением активности Г6ФДГ в печени, выраженной в количестве Е на грамм сырой массы, в 1,8 раза по сравнению с контролем.
Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax, S имеют значения 0,5, 0,6, 0,9.
Значения коэффициентов корреляции между концентрацией диеновых конъюгатов, Imax, S и активностью ГП: 0,9, 0,9, 0,9 соответственно. Это свидетельствует, что интенсивность СО взаимосвязана с активностью ГР/ГП системы. Увеличение интенсивности процессов пероксидации липидов приводило, вероятно, к увеличению нагрузки на ГР/ГП-систему, основным субстратом которой являются липопероксиды. Однако механизм, благодаря которому происходит активация ГП и ГР при интенсификации СО остается не вполне ясным. В связи с этим, было проведено исследование экспрессии ГР/ГП системы при ЭТГ у крыс.
Расчет разницы экспрессии с учетом порогового цикла для референсных генов и значений эффективности амплификации показал, что при ЭТГ происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3,0 раза относительно нормы (рис.2). С применением ПЦР-РВ выявлено также увеличение степени экспрессии ГП при ЭТГ (рис.2).
Рис.2 Уровень транскриптов генов глутатионредуктазы (а), глутатионпероксидазы (б) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (в) в печени крыс в норме (1) на 96 час развития ЭТГ (2), рассчитанный с помощью программного обеспечения Rest 20Относительная концентрация транскриптов ГП возрастала в 2,5 раза относительно контрольных значений (рис.2). Установлено, что экспрессия Г6ФДГ в печени крыс при ЭТГ увеличивается в 5,9 раз (рис.2). Увеличение экспрессии Г6ФДГ при ЭТГ, вероятно, связано с интенсивным потреблением глутатионовой АОС восстановительных эквивалентов в форме НАДФH и способствует регенерации восстановленного глутатиона (Попова Т.Н., 2008).
ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА Для наших исследований была выбрана модель сахарного диабета, основанная на введении протамин-сульфата (Ульянов А.М., 2000). В данной модели при связывании протамин-сульфатом эндогенного гепарина у здоровых крыс развивается состояние резистентности по отношению к гипогликемическому действию как эндогенного, так и экзогенного инсулина.
Развитие сахарного диабета контролировали с помощью определения концентрации глюкозы в крови и моче в течение 3-х недель развития СД2.
Показано, что на 2-ю неделю развития СД2 концентрация глюкозы в крови превышала нормальные значения.
Активность пероксидного окисления липидов определяли по накоплению молекулярных продуктов ДК в печени крыс в течение 3-х недель развития СД2.
Печень является интегральным органом, выполняющим регуляторногомеостатическую функцию в организме, регулирующим обмен углеводов, белков, липидов, пигментов, витаминов и минеральных веществ. При СД2 в печени происходят различные патогенетические процессы, приводящие к изменению регуляторных и биосинтетичеких свойств гепатоцитов. В результате проведенных исследований нами было установлено, что на 7-е и 14е сутки развития СД2 уровень ДК существенно не отличался от контроля.
Полученные данные свидетельствуют, что к 3-й неделе развития СДпроисходит активация процессов ПОЛ и накопление продуктов липопероксидации в ткани печени животных, подвергнутых воздействию протамин-сульфата. В условиях гипергликемии свободные радикалы также образуются в процессе аутоокисления глюкозы в ходе формирования конечных продуктов гликозилирования, которые, в свою очередь, также участвуют в патогенезе ангиопатий, способствуют нарастанию ишемии и интенсификации свободнорадикальных процессов в тканях при СД.
Известно, что важным фактором в патогенезе осложнений сахарного диабета является окислительный стресс (Балаболкин М.И., 2002). В этой связи для определения интенсивности свободнорадикальных процессов и общей антиоксидантной активности при СД2 был применен метод биохемилюминесценции (БХЛ). Через 7 суток после индукции СДдостоверных изменений параметров БХЛ не наблюдалось. Однако к 21 суткам происходило выраженное увеличение светосуммы хемилюминесценции (S) и интенсивности максимальной вспышки (Imax), отражающих интенсивность СО. S увеличивалась в 3 раза по сравнению с контролем. Значение Imax возрастало в печени в 1,6 раза относительно уровня контрольных значений.
Происходило повышение величины тангенса угла наклона кинетической кривой (tg2), характеризующего общую антиоксидантную активность, в 2,1раза по сравнению с нормой. Это позволяет заключить, что в условиях патологии начинают действовать компенсаторные механизмы, направленные на снижение уровня СО биосубстратов в клетке.
Максимальный уровень ГР в печени крыс при СД2 был зарегистрирован на 21-е сутки после начала индукции патологии. Активность на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались в 1,7 и 2,2 раза соответственно.
Исследование изменений активности ГП в ходе развития СД2 показало, что максимальная активность наблюдается также на 21сутки после индукции патологии. При этом активность в расчете на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались соответственно в 2,4 и 2,6 раза. По-видимому, наблюдаемые изменения активностей ГП и ГР, являются защитной реакцией организма на интенсификацию СО биосубстратов при развитии СД2.
Было проведено также изучение изменений каталитической активности Г6ФДГ в контрольных условиях и при СД2. Удельная активность Г6ФДГ в печени крыс с СД2 падала в 1,3 раза. Активность, выраженная в виде E/г сырой массы, уменьшалась в 1,6 раза. Известно, что при СД снижена интенсивность функционирования пентозофосфатного пути. Причинами снижения, как предполагают, являются подавление синтеза глюкокиназы и индукция глюкозо6-фосфатазы в печени, вследствие чего уменьшается доступность глюкозо-6фосфата для Г6ФДГ. Кроме того, Г6ФДГ индуцируется инсулином и кортикостероидами (Попова Т.Н., 2009), таким образом, в условиях инсулинорезистентности, характерной для СД2, экспрессия Г6ФДГ, повидимому, должна быть снижена.
Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax, S имеют значения 0,9, 0,6, 0,9.
Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, Imax, S и активностью ГП: 0,9, 0,8, 0,9 соответственно. Рассчитанные коэффициенты корреляции показывают, что интенсивность СО биосубстратов и активность ГР/ГП системы взаимозависимы.
Установлено, что на 21сутки развития патологии уровень транскриптов ГР увеличивается в 1,8 раза относительно нормы (рис.3). Выявлено, что при СД 2 типа наблюдается пониженный уровень мРНК ГП. Показано, что экспрессия гена ГП снижается в 1,9 раза на 21 сутки СД2 по сравнению с нормой (рис. 3).
Можно предположить, что уменьшение экспрессии ГП сопряжено с уменьшением резистентности клеток к инсулину. Показано, что у мышей с гиперэкспрессией ГП наблюдалось развитие гипергликемии и увеличение резистентности к инсулину (McClung J.P., 2004). Взаимосвязь изменения уровня селена и селенсодержащих белков с инсулиновой резистентностью описана в ряде работ (Lei X.G., 2005, Stapleton S.R., 2000). Уменьшение уровня экспрессии ГП, очевидно, связано с особенностями метаболизма при СД2. Повидимому, увеличение активности ГП может происходить не за счет синтеза de novo, а с помощью других механизмов. Возможно, это связано с конформационными перестройками в молекуле белка, вследствие фосфорилирования/дефосфорилирования. Это согласуется с данными, свидетельствующими об изменении кинетических параметров и регуляторных свойств фермента при оксидативном стрессе, развивающимся, в частности, при токсическом поражении печени (В.Г. Артюхов, 2008).
Рис. 3. Уровень транскриптов генов глутатионредуктазы (а), глутатионпероксидазы (б) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (в) в печени крыс контрольной группы (1) и на 21 день развития СД2 (2), рассчитанный с помощью программного обеспечения Rest 20Оценка экспрессии гена Г6ФДГ в образцах печени крыс при сахарном диабете показала, что содержание мРНК Г6ФДГ при патологии снижалось в 2,раза относительно нормы (рис.3).
ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ, МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ФИБРОБЛАСТОВ ЛИНИИ L9Методом дифференцированного флуоресцентного окрашивания живых и мертвых клеток было подтверждено наличие токсического эффекта пероксида водорода на фибробласты L929. Микрофотографии клеток, подвергнутых воздействию пероксида водорода в 50мкМ концентрации, представлены на рис. 4. Установлено, что пероксид водорода воздействуя на клетки линии L929, приводит к пикнозу и кариорексису, являющимися признаками апоптоза.
Нельзя исключить, что пероксид водорода проникает в клетки и, вступая в реакцию Фентона, приводит к интенсификации свободнорадикальных процессов. Оксидативный стресс, в свою очередь, способствует выходу цитохрома С из кристы митохондрий, который индуцирует запуск каскада реакций, ведущих к апоптозу, сопровождающегося фрагментацией и сморщиванием клеточных ядер.
Рис.4 Клетки линии L929 при инкубации с пероксидом водорода в концентрации 50мкМ:
флуоресцентное окрашивание SYTO 9 (1- контроль,2 - клетки, обработанные пероксидом водорода) и иодидом пропидия (3- контроль,4 - клетки, обработанные пероксидом водорода) Анализ результатов МТТ-теста позволил установить уменьшение активности фибробластов при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода. В положительном контроле МТТ - теста (среде, содержащей 10% ДМСО) наблюдалась практически 100% гибель клеток. При воздействии пероксида водорода происходило относительное уменьшение сигнала МТТ в 1,4 у фибробластов линии L929. Это может быть связано с уменьшением митохондриальной активности клеток. Нельзя исключить, что уменьшение митохондриальной активности клеток L929 происходит из-за интенсификации свободнорадикальных процессов. Под действием АФК в АТР/АDP-антипортере, белке внутренней мембраны митохондрий, может происходить окисление SH-группы Сys-56, что приводит к превращению этого переносчика адениннуклеотидов в неспецифический канал, проницаемый для любых низко молекулярных веществ. В результате в митохондриальный матрикс поступает вода и внешняя мембрана, площадь которой меньше площади внутренней мембраны, разрывается. При этом все белки, растворенные в межмембранном пространстве, включая цитохром С, выходят в цитозоль и индуцируют гибель клеток по пути апоптоза (Самуилов В. Д., 2001, Скулачёв В.П., 2000). Таким образом, массовый цитолиз приводит к уменьшению показателей клеточной активности.
После инкубации клеточной культуры фибробластов L929 с 50мкМ пероксидом водорода в течение 3ч из них была выделена РНК, которую использовали для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-РВ с геноспецифичными праймерами.
Проведенные исследования экспрессии гена ГР показывают, что при воздействии 50мкМ пероксида водорода уровень транскриптов Gsr увеличивается в 1,7 раза относительно нормы (рис.5).
Было обнаружено увеличение экспрессии ГП в 6,1 раза относительно контроля (рис. 5).
Рис.5. Уровень транскриптов глутатионредуктазы (а) и глутатионпероксидазы (б) в клетках культуры фибробластов линии L929: 1- контроль, 2- после инкубации с пероксидом водорода Возможно, что интенсификация транскрипции гена ГР и ГП вызвана активацией транскрипционного фактора NFkB свободными радикалами, образующимися в результате вовлечения пероксида водорода в реакцию Фентона. Поскольку пероксид водорода способен легко проникать через мембраны клеток и генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа, вызывать окисление SH-групп белков, пероксидное окисление ненасыщенных жирных кислот, то, очевидно, он может выступать в качестве фактора, индуцирующего апоптоз. Образование ОН может также осуществляться в реакции Хабера-Вайса, в которой также участвует Н2О2 и ионы металлов переменной валентности (например, Fe3+, Сu2+), восстанавливающиеся в ходе этого процесса (Попова Т.Н., 2008), что также может вносить вклад в усиление СО биосубстратов.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности координации функционирования ГР, ГП с интенсивностью протекания реакций Фентона и Хабера-Вайса.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Многоступенчатая система антиоксидантной защиты выполняет в организме функцию контроля за уровнем клеточных АФК и является показателем резистентности клеток к окислительному стрессу. Специфичность в распределении отдельных компонентов системы антиоксидантной защиты в тканях и разных компартментах клеток указывает, что она выполняет роль не столько подавления, сколько регуляции образования и взаимопревращений АФК.
Согласно полученным результатам к 24ч развития адреналинового миокардита происходит увеличение удельной активности ГР и ГП в сердце крыс в 1,8 в 1,4 раза соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Также показано, что происходит активация процессов СО биосубстратов в сердце в условиях данного патологического состояния.
Параметры биохемилюминесценции - Imax и S, отражающие уровень АФК, наиболее значительно возрастают к 24 часу развития адреналинового миокардита. Коэффициенты корреляции, характеризующие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax и S имеют значения 0,9, 0,8, 0,6.
Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, Imax, S и активностью ГП: 0,7, 0,9, 0,8 соответственно. Таким образом, показано, что имеет место зависимость между содержанием ДК, Imax, S и активностью ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите. Необходимо отметить, что согласно результатам определения показателей биохемилюминесценции в сердце крыс при адреналиновом миокардите происходит мобилизация АОС. Об этом свидетельствует увеличение tg2 кривой биохемилюминесценции. При этом уровень компенсаторных механизмов, направленных на снижение интенсивности свободнорадикальных процессов, оказывается недостаточным и в клетках миокарда в условиях адреналинового миокардита происходит увеличение содержания продуктов ПОЛ. Исследование экспрессии ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите у крыс показало, что активация ферментов происходит за счет гиперэкспрессии их генов в условиях патологии.
Установлено, что при адреналиновом миокардите происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР и ГП в сердце крыс в 2,8 и 7,3 раза соответственно относительно нормы.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют об интенсификации процессов СО биосубстратов в печени в условиях ЭТГ, причем степень выраженности данных процессов коррелирует с активацией ферментов глутатионовой антиоксидантной системы. Установлено, что параметры биохемилюминесценции - светосумма и интенсивность максимальной вспышки, отражающие интенсивность СО, в наибольшей степени возрастают к 96 часу развития ЭТГ печени крысы по сравнению со значениями в норме. Рассчитаны коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax, S в печени крыс при токсическом гепатите: 0,5, 0,6, 0,9. Значения коэффициентов корреляции между активностью ГП и концентрацией ДК, Imax, S: 0,9, 0,9, 0,9, соответственно. Исследование экспрессии генов ГП и ГР с учетом эффективности амплификации показало, что при интенсификации СО биосубстратов уровень экспрессии ГР возрастал в 3,0 раза, ГП в 2,5 раза по сравнению с контролем. Можно предположить, что интенсификация свободнорадикальных процессов способствует активизации ГР и ГП.
Рядом авторов выявлена интенсификация СО биомолекул при развитии СД2 (Смирнова О.М., 2003, Недосугова Л.В., 2006, Балаболкин М.И., 2002).
Кроме того, при оксидативном стрессе происходит усиленный синтез белков шаперонов, которые способствуют повышению внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона, необходимого для функционирования ГР/ГПсистемы. Проведенные исследования свидетельствуют об активации свободнорадикальных процессов к 21 дню развития СД2, причем степень выраженности данных процессов коррелирует с активацией ферментов глутатионовой антиоксидантной системы. Установлено, что параметры биохемилюминесценции, отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов, возрастают к 21 дню развития СД2 по сравнению со значениями в норме. Нами было показано, что при СД2 происходит повышение активностей ГР и ГП в печени крыс в 1,7 и 2,2 раза соответственно по отношению к активности данного фермента в норме. В ходе исследований было установлено, что на 21сутки развития патологии уровень транскриптов ГР увеличивается.
Однако уровень транскриптов ГП снижается. Экспрессия ГП снижалась в 1,раза, а ГР увеличивалась в 1,8 раза относительно нормы. Можно предположить, что уменьшение экспрессии ГП приводит к снижению инсулиновой резистентности клеток печени. Нельзя исключить, что увеличение активности ГП связано с конформационными перестройками в молекуле белка, вследствие фосфорилирования/ дефосфорилирования при оксидативном стрессе (В.Г.
Артюхов, 2008).
Установлено, что пероксид водорода в концентрации 50мкМ приводит к пикнозу и кариорексису клеток линии L929, являющимися признаками апоптоза. Нельзя исключить, что уменьшение митохондриальной активности клеток L929 происходит из-за интенсификации свободнорадикальных процессов. Оксидативный стресс, в свою очередь, способствует выходу цитохрома С из кристы митохондрий, который индуцирует запуск каскада реакций, ведущих к апоптозу. Показано, что при воздействии пероксида водорода происходит уменьшение сигнала МТТ в 1,4 у фибробластов линии L929. Это может быть связано с уменьшением митохондриальной активности клеток и их гибелью вследствие интенсификации СО биосубстратов. При воздействии 50мкМ пероксида водорода уровень транскриптов ГР и ГП увеличивается. По-видимому, увеличение экспрессии ферментов направлено на коррекцию свободнорадикального гомеостаза.
Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что изменение функционирования ГР и ГП при патологии взаимосвязано со скоростью СО биосубстратов. На основании проведенных исследований была создана гипотетическая схема процессов регуляции экспрессии и участия ГР и ГП в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе различной этиологии. Можно предполагать, что во всех исследуемых патологических состояниях интенсификация свободнорадикальных процессов способствует индукции ГР и ГП посредством активации NF-kB свободными радикалами. Свободные радикалы способны активировать NF-kB путем инактивации фактора IkBa (Nam H., 2004). NF-kB также регулирует гены, участвующие в воспалении, апоптозе, пролиферации и регенерации печени (Yamada Y., 1998). Можно предположить, что активация NF-kB индуцирует экспрессию ГП и ГР. Кроме того, высокая концентрация ГР и ГП при ЭТГ может быть связана с активацией белка Nrf. Согласно имеющимся данным, транскрипция антиоксидантных ферментов регулируется AREs - элементами.
Nrf2 и Nrf1 являются транскрипционными факторами, которые могут связываться с AREs и активировать гены ГП и ГР (Itoh K., 1999, Dhakshinamoorthy S., 2000, Nguen T., 2000, Yu R., 2000, He C., 2001, Huang, H., 2000, Kwak M., 2001). Однако, механизмы индукции оксидативного стресса при различных патологиях отличаются. При адреналиновом миокардите интенсификация СО происходит за счет аутоокисления адреналина, усиленной работы сердечной мышцы и гипоксии, которая, как известно, сопровождается активацией NO-синтазы и ксантинооксидазы, генерирующих АФК. В ходе развития ЭТГ происходит образование ССl3Х- продукта радикальной природы, обладающего высокой реакционной активностью и способностью эффективно взаимодействовать как с белками, так и с липидами, инициируя СО. В основе индукции оксидативного стресса при СД2 лежит образование продуктов неферментного гликозилирования и карбонильных интермедиатов на фоне гипергликемии, приводящих к генерации АФК. Воздействие пероксида водорода на клеточные культуры фибробластов линии L929 сопровождается интенсификацией СО биомолекул посредством вовлечения Н2О2 в реакцию Фентона. Однако, большинство исследованных путей индукции оксидативного стресса приводят к увеличению экспрессии ГР/ГП системы, направленной на коррекцию свободнорадикального гомеостаза. Исключением является подавление транскрипции ГП при СД2, которое, по всей видимости, связано с гипергикемией и существенными нарушениями метаболических процессов при патологии. Таким образом, развитие оксидативного стресса, как правило, сопровождается гиперэкспрессией ГР и ГП, что взаимосвязано с усилением синтеза Г6ФДГ, поставляющей восстановительные эквиваленты для ГР/ГП системы. Тем не менее, при патологических состояниях, сопряженных с многосистемными сдвигами в обменных процессах, таких как СД2, повидимому, происходит нарушение согласованности экспрессии ГР и ГП.
Характерно, что экспрессия Г6ФДГ при этом оказывается подавленной.
Выявленные изменения в экспрессионной регуляции данных ферментов могут являться дополнительным негативным фактором, усугубляющим течение патологического процесса.
Рис.6. Гипотетическая схема процессов регуляции экспрессии и участия глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе, индуцированном развитием патологических состояний: токсического гепатита (1), адреналинового миокардита (2), сахарного диабета 2 типа (3) и воздействием пероксида водорода на клеточную культуру фибробластов (4) Условные обозначения:
- Ингибирующий эффект; - Активирующий эффект; - увеличение, - уменьшение интенсивности процесса ВЫВОДЫ 1. Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax и S в сердце крыс при адреналиновом миокардите, имеют значения 0,9, 0,8, 0,6. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, Imax, S и активностью ГП: 0,7, 0,9, 0,8 соответственно.
2.При оксидативном стрессе, индуцированном развитием адреналинового миокардита, происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГП в сердце крыс в 7,3 раза относительно нормы.
3.При адреналиновом миокардите в сердце крыс экспрессия ГР возрастает в 2,раза. Экспрессия Г6ФДГ, поставляющей НАДФН для ГР-реакции, увеличивается при патологии в 5,9 раз по сравнению с контролем.
4. Корреляционно-регрессивный анализ свидетельствует, что коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax, S в печени крыс при токсическом гепатите составляют: 0,5, 0,6, 0,9.
Значения коэффициентов корреляции между активностью ГП и концентрацией ДК, Imax, S: 0,9, 0,9, 0,9, соответственно.
5.Содержание транскриптов ГП в печени крыс при токсическом гепатите возрастает в 2,5 раза относительно контрольных значений.
6.При экспериментальном токсическом гепатите происходит увеличение уровня транскриптов ГР в печени крыс в 3,0 раза относительно нормы.
Экспрессия гена Г6ФДГ возрастает при патологии в 2,5 раза относительно контрольных значений.
7. Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax, S в печени крыс при СД2 типа, имеют значения:
0,9, 0,6, 0,9. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, Imax, S и активностью ГП: 0,9, 0,8, 0,9 соответственно.
8. Установлено, что экспрессия гена ГП в печени крыс при СД2 снижается в 1,раза по сравнению с нормой.
9. Экспрессия ГР в печени крыс при СД2 типа увеличивается в 1,8 раза относительно нормы. Однако, содержание мРНК Г6ФДГ при патологии снижалось в 2,5 раза относительно контроля, что очевидно, было взаимосвязано с торможением пентозофосфатного пути.
10. Воздействие пероксида водорода на клеточную культуру фибробластов линии L929 приводит к уменьшению митохондриальной активности, пикнозу и кариорексису, что, по-видимому, связано с индуцированием апоптотических процессов.
11. При воздействии пероксида водорода экспрессия ГП в клеточной культуре фибробластов линии L929 увеличивается в 6,1 раза по сравнению с нормой.
Уровень экспрессии ГР в фибробластах L929 при воздействии пероксида водорода возрастает в 1,7 раза относительно контрольных значений.
12. Предложена гипотетическая схема процессов регуляции экспрессии ГП и ГР и их участия в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе различной этиологии.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ 1. Искусных И.Ю. Изучение количественной экспрессии гена глюкозо-6фосфатдегидрогеназы печени крыс в норме, при индукции апоптоза и действии тиоктовой кислоты на фоне патологии/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова// Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых Актуальные вопросы медицинской науки, Ярославль, 2009.- стр.26.
2. Искусных И.Ю. Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при адреналиновом миокардите/ И.Ю. Искусных// III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов Симбиоз-Россия 2010, Нижний Новгород, 2010.- С. 94-95.
3. Агарков А.А. Исследование уровня экспрессии гена глутатионредуктазы в печени крыс в норме и при токсическом гепатите/ А.А. Агарков, Т.Н. Попова, И.Ю. Искусных// Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ. Материалы 4-й всероссийской с международным участием научно-методической конференции Фармобразование-2010, Воронеж, 2010. - C.8-10.
4. Искусных И.Ю. Экспрессия селенсодержащей глутатионпероксидазы при канцерогенном действии тетрахлорметана/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, С.Г.
Ржевский, О.С. Мушарова// Сибирский онкологический журнал, V региональная конференция молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии, Томск, 2010. Цстр.52.
5. Искусных И.Ю. Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при токсическом гепатите/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, О.С. Мушарова, С.Г.
Ржевский, И.А. Тюрин// Первые международные Беккеровские чтения, Волгоград, 2010, С. 105-106.
6. Искусных И.Ю. Оценка давления отбора на ген селенсодержащей глутатионпероксидазы/ И.Ю. Искусных // Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных проблем и прикладных научных задач, Москва, 2010.- стр.23.
7. Искусных И.Ю. Повышение уровня экспрессии глутатионредуктазы при адреналиновом миокардите у крыс/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, С.Г.
Ржевский, О.С. Мушарова// Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Актуальные проблемы современной науки и образования, Уфа, 2010.- 117-118.
8. Искусных И.Ю. Экспрессия глутатионредуктазы при действии тиоктовой кислоты на фоне токсического гепатита/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Биология - наука XXI века, Пущино, 2010. - C.140-141.
9. Искусных И.Ю. Влияние мелатонина на экспрессию глутатионредуктазы у крыс с сахарным диабетом/ И.Ю. Искусных, С.Г. Ржевский, О.С. Мушарова// Школа-конференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины, Москва, 2010.- С.43-45.
10. Искусных И.Ю. Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при сахарном диабете/ И.Ю. Искусных, А.А. Агарков, Т.Н. Попова// Современные проблемы системной регуляции физиологических функций, Хургада, 2010.- C.89-90.
11.* Искусных И.Ю. Роль магнитосом в нарушении гомеостаза и развитии патологии/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова //Биомедицинская химия.-2010.- Т.56.- вып. 5.- C.
526-538.
12.* Iskusnykh I. Intensity of myocardial free-radical processes and expression of glutathione peroxidase and glutathione reductase genes in rats with adrenaline myocarditis/ I. Iskusnykh, T. Popova, O. Musharova// Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry.-2011.- v. 5.- no. 4.- p.357-362.
13.* Искусных И.Ю. Экспрессия глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы и уровень свободнорадикальных процессов при сахарном диабете у крыс/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, А.А. Агарков, С.Г. Ржевский // Молекулярная медицина.- 2012.-№ 1.-С. 49 - 52.
*Статьи № 11, 12, 13 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК.