Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству
На правах рукописи
ощинин Максим Николаевич
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПЕРОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ
ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА СВИНЕЙ
06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук
(ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии)
Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор
Субботин Владимир Викторович
Официальные оппоненты:
Соколов Михаил Николаевич, доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, Лауреат премии Совета Министров СССР, ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии, заведующий отделом
Сидорчук Александр Андреевич, доктор ветеринарных наук, профессор, Лауреат премии Совета Министров СССР, ФГБОУ ВПО Московская Государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, заведующий кафедрой
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов
Защита состоится л 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии наук по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, 24, к.1, ВИЭВ, тел. (495) 970-03-69.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии
Автореферат разослан л 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук Ездакова И.Ю.
1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Сальмонеллезы все еще широко распространены в животноводческих хозяйствах и наносят отрасли существенный экономический ущерб. В последние годы заболеваемость крупного рогатого скота составляла 2,3-3,8%, мелкого рогатого скота - 2,5-9,9%, свиней - 3,4-14,1%, птицы (сальмонеллез + тиф-пуллороз) - 1,4-2,2%. Сальмонеллезы являются и значимой социальной проблемой, являясь причиной массовых вспышек пищевых токсикоинфекций у людей (J.G.Martel,1994; Г.Л. Пухлякова, 1994; А.Б. Кононенко, 1994; О.В. Бухарин, 2000; Л.А. Кафтырева, 2008).
Для специфической профилактики болезни используют живые вакцины из аттенуированных штаммов или инактивированные на основе цельноклеточных антигенов (Б.Ю.Шустер, 1987; В.И.Заерко, 1996; А.А.Шевцов, 2006; С.В. Ленёв и др.,2007 и др.). Живые вакцины более иммуногенны чем инактивированные, но многократные пассажи аттенуированных штаммов на животных с вторичными иммунодефицитами ведут к их реверсии в исходное вирулентное состояние, что нередко заканчивается вспышками болезни на вакцинированном поголовье. Инактивированные вакцины не обладают достаточной иммуногенностью (А.А. Сидорчук, 1989). Увеличение прививочных доз данных препаратов в большинстве случаев невозможно из-за их значительной реактогенности, которую связывают с эндотоксином возбудителя (Б.Б.Першин, 1980; М.А.Сидоров и др., 1991; М.А.Сидоров и др., 1992; А.А.Воробьев, 1998, Н.А.Солдатенко и др., 2009 и др.).
Установлено, что лизис сальмонелл гидроксиламином с последующим осаждением растворимых антигенов клеток солями кальция позволяет снизить токсигенность при сохранении антигенности материала. В.В.Кудрявцевым (1993) показано, что полученные таким образом антигены при внутримышечном введении лабораторным животным (мыши, кролики) и поросятам обладают как антигенными, так и иммуногенными свойствами и перспективны для разработки средств специфической профилактики.
В крупных свиноводческих предприятиях животных вакцинируют против целого ряда болезней бактериальной и вирусной этиологии. Этот затратный и трудоемкий процесс можно облегчить при условии использования групповых методов иммунизации, таких, как аэрозольный или пероральный, нашедших широкое применение преимущественно в птицеводстве и, в меньшей степени, в других отраслях животноводства.
Цель работы заключалась в изучении возможности перорального применения лизат-антигенов сальмонелл для создания специфического иммунитета к возбудителю болезни.
Задачи исследований:
- изучить реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения белым беспородным мышам в сравнении с корпускулярными антигенами;
- изучить антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл, динамику сывороточных и копроантител у лабораторных животных при разных схемах их пероральной иммунизации;
- дать изотипическую характеристику иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мышей линии BALB/c в процессе поствакцинального иммунного ответа при пероральном и подкожном введении лизат-антигенов;
- отработать оптимальную схему пероральной иммунизации мышей лизат-антигенами сальмонелл и изучить иммуногенность этих антигенов в опыте прямого заражения;
- изучить безвредность и антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации поросят и отработать оптимальную схему их пероральной иммунизации;
- изучить эффективность пероральной иммунизации поросят лизат-антигенами сальмонелл в условиях неблагополучного по сальмонеллезу свиноводческого хозяйства.
Научная новизна. Впервые в ветеринарной практике экспериментально обоснована возможность пероральной иммунизации свиней против сальмо-
неллеза с использованием лизатов клеток возбудителя.
Охарактеризованы реактогенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при их внутрибрюшинном, подкожном и пероральном введении. Установлено, что в зависимости от способа введения они менее реактогенны в сравнении с корпускулярными в 3,6-6,1 раза. Реактогенность лизат-антигенов наименее выражена при их пероральном введении, максимально - при внутрибрюшинном.
Установлена динамика сывороточных и копроантител к сальмонеллам при разных схемах пероральной иммунизации лабораторных животных (белые беспородные мыши, кролики).
Дана изотипическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мышей линии BALB/c в процессе поствакцинального иммунного ответа при пероральном введении лизат-антигенов сальмонелл в сравнении с их подкожным использованием.
Отработана оптимальная схема пероральной иммунизации мышей, обеспечивающая выраженный иммунный ответ, защиту от заражения высоковирулентными сальмонеллами и позволяющая отказаться от использования защитных веществ совместно с лизат-антигенами.
Доказана безвредность лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации ими поросят и установлена динамика специфических сывороточных и копроантител при различных схемах пероральной иммунизации поросят. Отработана оптимальная схема пероральной иммунизации поросят лизат-антигенами сальмонелл.
Практическая значимость. Результаты исследований позволяют рекомендовать метод лизиса сальмонелл гидроксиламином солянокислым для получения антигенов возбудителя, пригодных для групповой пероральной иммунизации поросят, которая обеспечивает формирование как местного мукозального, так и системного противосальмонеллезного иммунитета.
Разработаны методические рекомендации Лабораторная модель для оценки препаратов, содержащих инактивированные сальмонеллы и предназначенных для оральной иммунизации животных (рассмотрены и одобрены Ученым советом ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ, протокол № 42 от 20.03.2008 г.) и методические наставления Разработка метода и оценка эффективности пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза лизат-антигенами возбудителя, одобренные секцией Инфекционная патология животных Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.) и утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым (03.10. 2011 г.).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ Я.Р.Коваленко (Москва, 2006 г.); Международной научно-практической конференции Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов (Щелково, 2007 г.); Международной научно-практической конференции Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел (Москва, 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства (Новочеркасск, 2010 г.); Международной научной конференции Производство, эффективность и качество (Москва, 2011 г.); Международной научно-практической конференции Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп с.х. животных, рыб и пчел (Москва, 2011 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
- экспериментальные данные, характеризующие остаточную реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения лабораторным животным;
- схема пероральной иммунизации животных лизат-антигенами сальмонелл, обеспечивающая возможность отказа от защитных веществ;
- основные показатели иммунологической перестройки организма лабораторных животных в ответ на пероральное введение лизат-антигенов сальмонелл, обеспечивающие формирование местного мукозального и системного иммунитета к сальмонеллезу;
- схема пероральной иммунизации поросят против сальмонеллеза с использованием лизат-антигенов возбудителя.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в т.ч. 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ.
ичный вклад соискателя. Основная часть исследований выполнена лично автором. Опыты по изучению вирулентности штаммов сальмонелл проведены совместно с д.в.н., проф. Д.И.Скородумовым и к.в.н. Д.В.Беликовым (МГУПБ); глубинное культивирование штаммов сальмонелл для получения биомассы и последующего изготовления лизат-антигенов - совместно с к.в.н. Е.Э.Школьниковым, к.б.н. Л.В.Анисимовой и к.б.н. Л.А.Коротеевой (ГНУ ВНИТИБП); иммунологические исследования - совместно с к.б.н. И.Ю.Ездаковой (ГНУ ВИЭВ). Соискатель благодарит всех соавторов за помощь, оказанную при выполнении нашей работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 252 источника, из них 166 отечественных и 86 зарубежных и приложения. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 17 рисунками.
2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы
Работа выполнена в 2006-2011 гг. в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ РАСХН (задание 08.02, этап 08.02.02. Создать новые и усовершенствовать существующие средства и методы борьбы с возбудителями массовых инфекционных болезней молодняка продуктивных животных) на базе лаборатории микробиологии с музеем типовых культур и лаборатории иммунологии ГНУ ВИЭВ, на кафедре микробиологии и иммунологии МГУПБ, в отделе бактериальных препаратов ГНУ ВНИТИБП, КФХ Спыну Можайского района Московской области и ЗАО Скороднянское Белгородской области.
В опытах использовали 620 белых беспородных мышей и 60 мышей линии BALB/c живой массой 16-18 г., 12 кроликов породы Советская шиншилла живой массой 2-2,5 кг, 3066 поросят, живой массой 7-8 кг, 374 супоростных свиноматки. Штаммы S.tiphymurium № 415 и S.choleraesuis № 370 получены из ВГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора. Тинкториальные и культурально-морфологические свойства сальмонелл изучали общепринятыми методами. Их серологическую идентификацию проводили в РА на стекле при помощи сывороток сальмонеллёзных О-комплексных и монорецепторных О- и Н- агглютинирующих (ФГУП Курская биофабрика - фирма Биок), ферментативную активность определяли при помощи теста ЭНТЕРО-Рапид 24. Гидроксиламиновый антиген готовили в отделе бактерийных препаратов ГНУ ВНИТИБП по методу НИИВС им. Мечникова, разработанному для шигелл и других микроорганизмов (авторское свидетельство №1298981. Крейлин Л.С. и др.). Концентрацию микробных клеток определяли при помощи стандарта мутности ГИСК им. Тарасевича.
Для РНГА и РНАт использовали диагностикумы эритроцитарные сальмонеллёзные О-антигенные жидкие групп 6,7 и 1,4,12 (ФГУП НПО Микроген МЗ РФ); сыворотку диагностическую сальмонеллёзную адсорбированную сухую - А, В, С, Д, Е для РА - ПЕСТАЛ (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов). Подсчет форменных элементов крови производили общепринятыми методами.
Число розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (И.П.Кондрахин и др.,1985). Перитонеальные макрофаги получали методом адгезии на пластик (Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова, 2008). Фагоцитарную активность и фагоцитарное число определяли при помощи частиц латекса по стандартной методике. Количество Т- и В-лимфоцитов определяли в реакции иммунофлуоресценции с моноклональными антителами к CD2 и CD19 мыши (лDakoCytomation). Концентрацию иммуноглобулинов в биологических жидкостях мышей выявляли в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием биотин-антииммуноглобулинового и авидин-пероксидазного конъюгатов, по инструкции фирмы производителя (Sigma ImmunoChemicals). Результаты ИФА оценивали на фотометре Multiskan MCC/340 при длине волны 492 нм. Полученный цифровой материал по РА, РНГА и РНАт подвергали логарифмированию, для чего степень разведения при кратности 1:2 перевели в числовые значения (Сайдулин Т.С., 1992). Среднюю арифметическую (M) и стандартную ошибку (m) определяли по методикам, описанным И.П.Ашмариным и И.А.Ворбьёвым (1962). Достоверность разницы двух сравниваемых показателей определяли по таблице Стьюдента. Статистическую обработку проводили с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.
2.2. Результаты собственных исследований
2.2.1. Основные биологические свойства штаммов сальмонелл
По культуральным, морфологическим, тинкториальным, ферментативным свойствам изучаемые штаммы соответствовали роду Salmonella. Штамм № 370 по антигенной структуре относится к группе С1 и сероварианту S.choleraesuis, а штамм 415 - к группе В и сероварианту S.typhimurium. При определении величины LD50, которую рассчитывали методом Рида-Менча, установлено, что штамм S.choleraesuis № 370 вызывает гибель 50% животных, взятых в опыт и зараженных внутрибрюшинно в дозе 120 бактериальных клеток, а штамм S.typhimurium № 415 - в дозе 730 бактериальных клеток на голову. Полученные экспериментальные данные свидетельствовали о высокой вирулентности изучаемых штаммов сальмонелл, стабильности вирулентности и других биологических свойств, что позволило использовать эти штаммы для решения поставленных задач.
2.2.2. Реактогенность лизат-антигенов сальмонелл при различных способах их введения белым мышам
На белых беспородных мышах живой массой 16-18 г определяли величину LD50 при разных способах введения лизат-антигенов сальмонелл в сравнении с цельноклеточными (корпускулярными) антигенами (табл. 1).
Таблица 1
Сравнительная реактогенность корпускулярных и лизат-антигенов
сальмонелл при разных способах их введения белым мышам
Способ введения | Штаммы сальмонелл | Виды антигена | Величина LD50, микр. кл. |
внутрибрюшинно | S.choleraesuis № 370 | корпускулярный | 6,58109 |
изированный | 23,72109 | ||
S.typhimurium № 415 | корпускулярный | 6,18109 | |
изированный | 25,11109 | ||
подкожно | S.choleraesuis № 370 | корпускулярный | 11,61109 |
изированный | 60,99109 | ||
S.typhimurium № 415 | корпускулярный | 17,70109 | |
изированный | 79,90109 | ||
перорально | S.choleraesuis № 370 | корпускулярный | 24,07109 |
изированный | 128,46109 | ||
S.typhimurium № 415 | корпускулярный | 19,92109 | |
изированный | 121,99109 |
Для этого сформировали 36 групп по 10 животных. Каждой из групп корпускулярные антигены вводили в двукратно возрастающих дозах, а лизированные антигены - в дозах эквивалентных этим величинам в объеме 0,5 см3. За животными наблюдали в течение 10-ти суток, отмечая число павших и выживших в каждой из групп. Из таблицы 1 видно, что антигены из лизированных клеток сальмонелл обоих сероваров были менее реактогенны (в 3,6-6,1 раза) в сравнении с корпускулярными при всех способах их введения. Оба варианта антигенов наиболее реактогенны при внутрибрюшинном и наименее реактогенны при оральном способе введения.
2.2.3. Определение оптимальной схемы пероральной иммунизации
изат-антигенами сальмонелл в опытах на лабораторных животных
2.2.3.1. Динамика титров лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации кроликов
Из 12 кроликов сформировали 4 группы по 3 кролика в каждой. Кроликов группы № 1 иммунизировали перорально 3 дня подряд суточной дозой, эквивалентной 900 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена, кроликов группы № 2 - перорально, дробно, двумя циклами по 3 дня подряд с интервалом между циклами 16 дней суточной дозой, эквивалентной 450 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена, кроликов группы № 3 - аналогичным образом тремя циклами по 3 дня подряд с интервалом между циклами 16 дней суточной дозой, эквивалентной 225 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена. Животные группы № 4 служили неиммунным контролем. Антиген сальмонелл обнаруживался в фекалиях и в крови животных уже через 12 час. после первого его перорального введения. Выявляемые титры были тем выше, чем большая доза антигена использовалась для иммунизации (рис.1).
(а) (б)
Рис. 1. Динамика титров антигена в фекалиях (а) и крови (б) кроликов
В крови максимальные титры антигена выявляли на 3-и сутки. Максимальные титры антигена в фекалиях выявляли на 3-5 сутки. Их величина так же носила дозозависимый характер (12,30,3, 6,70,3, 4,70,6 log 2 при дозах эквивалентных 900109, 450109 и 225109 микр. кл. на голову в сутки соответственно). Общее время обнаружения или время циркуляции антигена в крови было практически одинаковым и равнялось 10-13 суткам при всех 3-х дозах. Третий цикл иммунизации осуществляли только минимальной дозой. В крови, при этом отмечали вдвое меньший подъем титров антигена, чем после первого цикла, а срок его циркуляции сократился с 13 до 4 дней.
2.2.3.2. Динамика титров антител к О-антигенам сальмонелл у кроликов, иммунизированных перорально лизат-антигенами сальмонелл
Величина титров специфических иммуноглобулинов в крови и фекалиях, а также длительность их циркуляции имели прямую пропорциональную зависимость от дозы антигена, используемой для иммунизации (рис.2).
Дробная иммунизация циклами по 3 дня позволяла поддержать титры специфических иммуноглобулинов в отдаленный от начала иммунизации срок (25-30 дней) на более высоком уровне, чем при иммунизации одним циклом, но при этом не позволила достичь тех максимальных величин тиров в ранний поствакциналный период (10-21 сутки), которые обеспечивает один трехдневный цикл в максимальной дозе.
(а) (б)
Рис. 2. Динамика титров антител в фекалиях (а) и крови (б) кроликов
Дробная иммунизация циклами по 3 дня не обеспечила и увеличения сроков обнаружения специфических иммуноглобулинов в крови и кишечнике кроликов.
2.2.3.3. Изучение параметров клеточного иммунитета кроликов после пероральной иммунизации лизат-антигеном сальмонелл
Кровь для исследования брали из ушной вены кроликов на 7-е, 25-е, 39-е, 54-е и 66-е сутки от начала первого цикла иммунизации. Динамика розеткообразующих клеток в процессе иммунного ответа представлена на рис. 3, из которого видно, что клеточный ответ регистрировался при всех 3-х схемах иммунизации и был наиболее выражен при одном 3-дневном цикле с использованием максимальной дозы. Повторные циклы иммунизации обеспечивали повторное увеличение количества Т- и В-лимфоцитов.
На 66-е сутки иммунного ответа число розеткообразующих клеток у опытных кроликов было достоверно большим, чем у контрольных.
Установлен статистически достоверный (р<0,05) рост фагоцитарной активности и отсутствие значимой разницы в динамике этого показателя при всех 3-х циклах. Таким образом, показано, что разделение дробной иммунизации на циклы не целесообразно, поскольку второй и, в особенности, третий циклы происходят на фоне формирующегося иммунного ответа и часть используемого
(а) (б)
| (в) | Рис. 3. Динамика Т- и В-клеток крови кроликов, перорально иммунизированных лизат-антигеном S.typhimurium в дозе 900 млрд.мк.кл. при 1 цикле иммунизации (а), 450 млрд.мк.кл. при 2 циклах иммунизации (б), 225 млрд.мк.кл. при 3 циклах иммунизации (в). |
при этом антигена блокируется факторами специфического и неспецифического иммунитета. Более целесообразно использовать дробную иммунизацию не деля ее на циклы, т.е. используя один, но более продолжительный, чем три дня подряд цикл перорального введения антигенов.
2.2.3.4. Антигенные свойства лизат-антигенов сальмонелл и определение оптимальной схемы при пероральной иммунизации мышей
Белых беспородных мышей (n=20) иммунизировали в течение 5-ти суток дозой антигена, эквивалентной 20 млрд. микр. кл. без протектора (1 гр.), с 1% пектина (2 гр.) и, сорбированным на отрубях (3 гр.). Мыши групп № 4, 5 и 6 получали аналогичные антигены в течение 10 суток подряд в суточной дозе, эквивалентной 10 млрд. микр. кл. Суммарная доза антигенов во всех группах составляла 100 млрд. микр. кл./гол. На 5-е, 10-е, 20-е, 25-е и 30-е сутки после последнего введения препаратов определяли величины сывороточных и копроантител к О-антигенам сальмонелл.
Из данных таблиц 2 и 3 видно, что уровень копроантител (15-20 сутки наблюдения) был в среднем выше уровня сывороточных на 4-5 разведений или в 16-32 раза. К концу месячного срока наблюдения этот показатель составил 3-4 разведения или 8-16 раз.
Таблица 2
Динамика сывороточных антител к S.typhimurium у перорально
иммунизированных мышей
Типы антигенов | Схема иммунизации | Срок исследования (сутки после иммунизации) и средние титры (n=3) сывороточных антител (log 2) | |||||
5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | ||
Без протекторв | 5 дней | 2 | 1,7 | 2 | 1 | 1 | 1 |
10 дней | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 1 | |
С 1% пектина | 5 дней | 1,7 | 2 | 1,7 | 1 | 1 | 1 |
10 дней | 3 | 3 | 2,7 | 2 | 2 | 1,3 | |
Сорбированный на отрубях | 5 дней | 2,7 | 2 | 3 | 4 | 2,7 | 2 |
10 дней | 2,7 | 2 | 3 | 3,3 | 3 | 3,3 | |
Контроль | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Таблица 3
Динамика копроантител к S.typhimurium у перорально иммунизированных мышей
Типы антигенов | Схема иммунизации | Срок исследования (сутки после иммунизации) и средние титры (n=3) копроантител (log 2) | |||||
5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | ||
Без протекторв | 5 дней | 5 | 10 | 11 | 8 | 7 | 5 |
10 дней | 11 | 10,7 | 8 | 8 | 6 | 4,7 | |
С 1% пектина | 5 дней | 5 | 7 | 7 | 7,3 | 7 | 6 |
10 дней | 7,3 | 6,3 | 5,7 | 6 | 6,3 | 6 | |
Сорбированный на отрубях | 5 дней | 4 | 7,3 | 8,3 | 6,3 | 6 | 5,7 |
10 дней | 4,3 | 8 | 6,7 | 6 | 5 | 4,7 | |
Контроль | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Таким образом, установлено, что 5-10-кратное введение антигена обеспечивает его длительный контакт с лимфоидной тканью кишечника. Иммунный ответ на антигены с протекторами и без них практически не отличался ни по своей величине, ни по длительности в исследуемые сроки.
2.2.4. Изотипическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мыши в процессе поствакцинального иммунного ответа
В опыте по определению уровня иммуноглобулинов в кишечнике и селезенке было использовано 60 мышей линии BALB/c. Сформировали 4 группы: мышей группы 1 иммунизировали в течение 10 дней подряд с кормом (per os) лизат-антигеном S.typhimurium штамм 415 и S.choleraesuis штамм 370 (1:1) в дозе 10 млрд. микробных клеток на мышь в сутки (n=20); мыши группы 2 (контрольные) получали корм без вакцины (n=10); мышей группы 3 иммунизировали однократно подкожно лизат-антигеном S.typhimurium штамм 415 и S.choleraesuis штамм 370 (1:1) в дозе 10 млрд. микробных клеток на мышь (n=20); мышам группы 4 (контрольные) вводили подкожно 0,2 мл физиологического раствора (n=10).
Исследование Ig в кишечнике и селезенке мышей линии BALB/c проводили методом ИФА на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки иммунного ответа.
Отмечался подъем уровня IgG (13 log 2, контроль 12 log 2) в селезёнке на 7-е и 14-е сутки при введении лизат-антигена per os. Увеличение IgM в кишечнике (4 log 2, контроль 2 log 2) в 2 раза по сравнению с контролем при пероральном введении происходило на 7-е, а при подкожном на 14-е сутки. При пероральном введении антигена отмечалось значительное повышение IgА в кишечнике (12 log 2, контроль 10 log 2) на 7-е сутки после вакцинации, а IgG на 21-е сутки (13 log 2, контроль 9 log 2).
2.2.5. Клеточный иммунный ответ у мышей при подкожной и пероральной иммунизации лизат-антигенами сальмонелл
Схема опыта аналогична представленной в разделе 2.2.4. Исследования в РИФ проводили на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после вакцинации. Отмечалось достоверное (p<0,05) увеличение количества лимфоцитов к 14-м суткам после вакцинации обоими способами (табл. 4). Увеличение количества нейтрофилов на 1-е сутки со снижением на 21-е, связано с общей активацией иммунной системы. Количество моноцитов достоверно возрастало на 1-7-е сутки при пероральной и в течение всего срока наблюдения при подкожной иммунизации. Повышение фагоцитарной активности и фагоцитарного числа у мышей после пероральной иммунизации отмечалось на 7-е сутки 49,3% (контроль 15,8%) и 4,5% (контроль 1,8%) соответственно.
Таблица 4
Динамика показателей иммунокомпетентных клеток мышей (n=60), Mm
Показатели, % | Группы животных и сроки исследований | |||||||||
Контроль | Опыт | |||||||||
2 | 4 | 1-е сутки | 7-е сутки | 14-е сутки | 21-е сутки | |||||
1 | 3 | 1 | 3 | 1 | 3 | 1 | 3 | |||
имфоциты | 83,0 1,3 | 81,0 1,3 | 85,4 2,9 | 87,6 1,3* | 91,2 1,7* | 89,2 2,9* | 96,4 1,0* | 95,0 0,9* | 95,2 1,1* | 91,0 1,3* |
Нейтрофилы | 6,8 1,24 | 6,2 1,1 | 11,8 2,2* | 8,4 1,3 | 6,2 1,1 | 7,8 3,2 | 3,0 0,54 | 4,0 1,14 | 4,2 0,8 | 7,8 1,15 |
Моноциты | 0,2 0,02 | 0,1 0,02 | 2,8 0,96* | 4,0 0,4* | 2,6 0,9* | 2,8 1,5* | 0,6 0,01* | 0,8 0,1* | 0,6 0,04* | 1,2 0,37* |
Примечание: * р<0,05
При сравнении данных, представленных на рис.4а и 4б, можно видеть повышение числа тимоцитов и спленоцитов на 1-е и 7-е сутки после введения антигена по сравнению с контролем, но также видно значительно меньшее количество Т- и В-лимфоцитов по сравнению с показателями при пероральной вакцинации.
(а) (б)
Рис. 4. Динамика Т- и В клеток при пероральной (а) и подкожной (б) иммунизации
2.2.6. Изучение иммуногенности лизат-антигенов при пероральной иммунизации мышей в опыте прямого заражения
В опыте прямого заражения перорально привитых белых мышей установлено, что LD50 для контрольных животных составила 2,6102 микр. кл. Для мышей получавших испытуемый препарат на фоне пробиотика LD50 - 1,8105 микр. кл., а без пробиотика - 1,1105 микр. кл.
Таблица 5
Результаты прямого заражения перорально привитых мышей
Заражающие дозы | Иммунные животные | Контроль (не иммунные) | |||||||
С пробиотиком | Без пробиотика | ||||||||
кол-во голов | пало | кол-во голов | пало | кол-во голов | пало | ||||
голов | % | голов | % | голов | % | ||||
5101 | 8 | 0 | 0 | 9 | 0 | 0 | 8 | 3 | 37,5 |
5102 | 10 | 1 | 10 | 9 | 2 | 22,2 | 8 | 6 | 75 |
5103 | 10 | 3 | 30 | 8 | 3 | 37,5 | 8 | 8 | 100 |
5104 | 10 | 6 | 60 | 10 | 6 | 60 | 8 | 8 | 100 |
5105 | 9 | 7 | 77,8 | 7 | 6 | 85,7 | 11 | 11 | 100 |
LD50 | 1,8105 | 1,1105 | 2,6102 | ||||||
Таким образом, пероральная иммунизация мышей предлагаемым методом позволила получить разницу в величине LD50 в сравнении с интактными животными в 423,1-692,3 раза, что свидетельствует о выраженной иммуногенности препарата. Пероральная иммунизация на фоне пробиотика позволяет повысить устойчивость животных к заражению вирулентной культурой сальмонелл (табл. 5).
2.2.7. Антигенные и иммуногенные свойства лизат-антигенов сальмонелл при пероральной иммунизации поросят
В КФХ Спыну Московской области, благополучном по сальмонеллезу, сформировали 7 групп поросят по 8 голов, подобранных по принципу аналогов. Поросята групп № 1, № 3 и № 5 получали лизат-антигены 10 дней подряд в дозах, эквивалентных соответственно 200, 400 и 600 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена на голову в сутки с 45 по 54 дни жизни. Животные групп № 2, № 4 и № 6 дополнительно с 15 по 45 дни жизни и в течение всего срока иммунизации получали пробиотикт Лактобифадол из расчета 10 г на голову в сутки. Контрольные животные (группа № 7) ни пробиотик, ни
Таблица 6
Динамика сывороточных антител у поросят, вакцинированных перорально лизат-антигенами сальмонелл (Мm, log2)
Дозы антигена и схема иммунизации, n=8 | Сутки поствакцинального иммунного ответа | ||||||||||
7 | 14 | 21 | 31 | 41 | |||||||
S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | ||
200 млрд. | 1 | 2,00,9 | 2,30,3 | 3,30,3 | 3,30,3 | 2,50,7 | 3,30,3 | 2,00,9 | 1,80,6 | 0 | 0 |
2 | 1,80,3 | 2,30,3 | 4,00,06 | 3,70,3 | 3,00,05 | 3,50,2 | 2,50,3 | 2,00,03 | 2,00,09 | 2,00,3 | |
400 млрд. | 3 | 2,20,4 | 2,30,3 | 3,60,3 | 4,00,6 | 3,30,5 | 3,50,9 | 1,80,6 | 2,60,7 | 0 | 1,00,6 |
4 | 2,60,6 | 2,60,3 | 4,50,03 | 4,70,3 | 3,50,2 | 3,50,3 | 3,00,2 | 2,60,3 | 2,00,06 | 2,00,2 | |
600 млрд. | 5 | 2,60,3 | 3,00,6 | 4,00,7 | 4,00,9 | 3,60,7 | 3,50,5 | 2,30,3 | 2,61,0 | 0 | 1,00,7 |
6 | 2,80,3 | 3,30,3 | 5,50,5 | 5,30,3 | 4,00,05 | 4,50,2 | 3,60,1 | 3,00,3 | 2,40,5 | 2,80,3 | |
Контроль | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1,00,5 | 0 | 1,00,3 | 0 | 1,00,3 | |
Таблица 7
Динамика копроантител у поросят, вакцинированных перорально лизат-антигенами сальмонелл (Мm, log2)
Дозы антигена и схема иммунизации, n=8 | Сутки поствакцинального иммунного ответа | ||||||||||
7 | 14 | 21 | 31 | 41 | |||||||
S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | S.typhim. | S.choler. | ||
200 млрд. | 1 | 5,60,3 | 5,010,6 | 7,30,7 | 7,30,6 | 7,30,9 | 7,01,0 | 5,00,6 | 4,60,6 | 3,51,5 | 3,00,9 |
2 | 5,50,7 | 7,01,0 | 8,30,7 | 8,30,2 | 8,50,3 | 7,50,2 | 5,60,3 | 5,50,3 | 4,00,7 | 4,00,3 | |
400 млрд. | 3 | 4,30,3 | 5,30,5 | 7,60,3 | 7,30,9 | 7,61,0 | 7,00,5 | 5,30,9 | 5,00,5 | 3,00,6 | 3,01,0 |
4 | 7,00,6 | 6,60,3 | 8,60,3 | 9,50,3 | 9,00,3 | 9,30,3 | 6,60,3 | 6,01,0 | 4,00,3 | 3,00,5 | |
600 млрд. | 5 | 5,60,7 | 7,00,6 | 9,30,3 | 9,00,6 | 8,00,3 | 7,60,3 | 6,60,3 | 6,01,0 | 4,00,6 | 4,00,7 |
6 | 7,60,3 | 8,00,3 | 10,60,3 | 10,30,3 | 9,50,3 | 10,00,2 | 7,00,6 | 6,30,3 | 5,01,0 | 5,00,3 | |
Контроль | 0 | 0 | 0 | 0 | 2,00,3 | 2,00,5 | 2,00,2 | 2,00,2 | 3,00,3 | 3,50,5 | |
Примечание: р<0,05
1,3,5 - антиген без пробиотика; 2,4,6 - антиген с пробиотиком
сальмонеллезные антигены не получали, иными препаратами против сальмонеллеза не прививались.
Интенсивность иммунного ответа носила дозозависимый характер (табл. 6 и 7). Максимума титры сывороточных антител достигали к 14 суткам, удерживались на этом уровне в течение 5-7 дней и далее снижались. Титры копроантител достигали максимума к 14-21 дню, после чего их уровень снижался.
Копроантитела обнаруживались в значительно большем количестве. Пиковый их уровень (14-21 дни наблюдения) к S.typhimurium был в среднем выше сывороточных на 4-5 разведений (в 16-32 раза), а к S.choleraesuis - на 3-6 разведений (в 8-64 раза). Более длительным был и срок обнаружения копроантител - 41 день после иммунизации (срок наблюдения).
Достоверных изменений лейкоцитарной формулы крови у опытных поросят в сравнении с контрольными выявлено не было. Установлен дозозависимый характер стимуляции фагоцитарной активности и увеличения числа нейтрофилов к 7-14-м суткам иммунного ответа.
Таким образом, изучаемый препарат в испытанных дозах безвреден для поросят 45-54-дневного возраста. Оптимальной является схема иммунизации, предусматривающая 10-кратное введение антигена в дозе, эквивалентной 600 млрд. микр. кл.на голову. Иммунизация на фоне пробиотика сопровождается тенденцией к повышению титров как сывороточных, так и копроантител, а также позволяет увеличить однородность иммунного ответа у поросят.
2.2.8. Производственные испытания метода пероральной иммунизации свиней лизат-антигенами возбудителя
В условиях неблагополучного по сальмонеллезу свиноводческого хозяйства (ЗАО Скороднянское Белгородской области) провели два производственных опыта.
В опыте 1 за 25-28 дней до ожидаемого опороса 302 свиноматки иммунизировали испытуемыми антигенами внутримышечно в дозе, эквивалентной 15 млрд. микр. кл./ гол. и через 10 дней в той же дозе. Всех полученных от свиноматок поросят разделили на 2 группы. Поросята группы № 1 (882 гол.) в течение 5 дней подряд ежедневно с 30 по 35 день жизни получали лизат-антигены в суточной дозе, эквивалентной 1а200 млрд. микр. кл./гол. Поросят группы № 2 (918 гол.) вакцинировали теми же антигенами внутримышечно, двукратно в 30-ти и 43-дневном возрасте в дозе, эквивалентной 5 млрд. микр. кл/гол. При отъеме от свиноматок в возрасте 35 дней из поросят группы №1 сформировали сектор численностью 644 головы, из поросят группы № 2 - сектор численностью 638 голов. В эти же сроки был укомплектован контрольный сектор численностью 643 головы из поросят, не вакцинировавшихся против сальмонеллеза.
Таблица 8
Динамика антител в сыворотках крови поросят (n=10)
Группы животных | Антитела к S.choleraesuis | Антитела к S.typhimurium | ||
Возраст поросят (сут.) | ||||
30 | 53 | 30 | 53 | |
№ 1 | 1:360 | 1:280 | 1:200 | 1:208 |
№ 2 | 1:340 | 1:460 | 1:164 | 1:384 |
№3 (контр.) | 1:285 | 1:84 | 1:114 | 1:33 |
Титры колостральных антител в 30-и дневном возрасте (табл.8) к двум сероварам сальмонелл в опытных группах не имели существенных различий и были достаточны для предотвращения массовых вспышек сальмонеллеза. Титры поствакцинальных антител свидетельствуют о том, что внутримышечная вакцинация обеспечивала более высокий уровень сывороточных антител, в сравнении с пероральной иммунизацией. Вместе с тем, об иммунологической эффективности пероральной иммунизации свидетельствует разница в тирах между животными данной группы и не прививавшимся контролем, где к 53-дневному возрасту обнаруживали лишь незначительные титры остаточных молозивных антител.
Из группы № 1 на откорм было передано 590 подсвинков, сохранность в ней составила 91,6%. Из группы № 2 - 546 подсвинков, сохранность составила 85,6%. В контрольной группе аналогичные показатели составили 518 голов и 80,5%. Средняя живая масса одной головы при передаче на откорм составила 30,4 кг, 29,0 кг и 29,4 кг в группах № 1, № 2 и контрольной группе соответственно.
В опыт 2 отобрали 72 свиноматки, трехкратно иммунизированные против сальмонеллеза вакциной ППД. Всех полученных от них поросят разделили на 2 группы. Поросята группы № 1 (опыт, 282 гол.) 10 дней подряд с 20-го по 30-й дни жизни получали лизат-антигены сальмонелл (S.choleraesuis) в суточной дозе, эквивалентной 600 млрд. микр. кл./гол. Поросята группы № 2 (контроль, 285 гол.) против сальмонеллеза не вакцинировались.
Рис. 5.Динамика титров антител в сыворотке и фекалиях поросят, n=10.
На рис. 5 представлена динамика антител в сыворотке крови и фекалиях поросят, которая свидетельствует об иммунологической эффективности испытанной схемы вакцинации. Об эпизоотической эффективности этой схемы свидетельствуют хозяйственные результаты данного опыта.
Из группы № 1 на откорм было передано 263 подсвинка, сохранность в ней составила 93,3%. Из группы № 2 - 238 подсвинков, сохранность - 83,5%.
Средняя живая масса одного поросенка при отъеме от свиноматок в опытной группе была 8,32 кг, в контрольной группе - 8,20 кг, при передаче на откорм - 31,6 и 30,2 кг соответственно. Таким образом, испытанная схема иммунизации позволила повысить сохранность поросят на 9,8 % и увеличить среднюю живую массу при передаче на откорм на 1,4 кг в сравнении с не привитым против сальмонеллеза контролем.
3. ВЫВОДЫ
1. Лизат-антигены из штаммов S.choleraesuis № 370 и S.typhimurium № 415 менее реактогенны по сравнению с корпускулярными антигенами (в 3,6-6,1 раза в зависимости от метода аппликации) при внутрибрюшинном, подкожном и пероральном способах введения белым мышам, что обеспечивает возможность иммунизации животных в более высоких дозах. Корпускулярные и лизированные антигены наименее реактогенны при пероральном способе введения.
2. Лизат-антигены сальмонелл, перорально введенные кроликам, выявляются в крови и фекалиях животных через 12 часов. Максимальные тиры О-антигена при 3-дневном цикле иммунизации выявляются на 3-5-е сутки, их величина имеет дозозависимый характер. Разделение дробной иммунизации на циклы не целесообразно, поскольку повторные циклы иммунизации проводятся на фоне развивающегося иммунного ответа.
3. Пероральная иммунизация мышей, предусматривающая введение антигена в течение 5-10-ти дней подряд обеспечивает длительное антигенное воздействие на иммунокомпетентные органы, что позволяет отказаться от использования протективных веществ без ущерба для интенсивности и длительности иммунного ответа, при этом уровни копроантител в 2-3 раза превышают уровни сывороточных антител.
4. Установлено, что местный иммунный ответ более выражен при пероральной иммунизации, чем при подкожной так как увеличивается уровень секреторных антител в кишечнике на 7-е сутки (IgA 12 log2, контроль - 10 log2, IgM 4 log2, контроль - 2 log2, ) и IgG на 21-е сутки (13 log2, контроль - 9 log2 ).
5. Пероральная иммунизация мышей лизат-антигенами сальмонелл в опыте прямого заражения повышает величину LD50 с 2,6102 микр. кл./гол. (интактный контроль) до 1,1105 микр. кл./гол., что свидетельствует о выраженной иммуногенности и эффективности предлагаемой схемы иммунизации. Пероральная иммунизация на фоне пробиотического препарата Лактобифадол позволяет повысить устойчивость животных к заражению вирулентной культурой сальмонелл (LD50 = 1,8105).
6. Лизат-антигены сальмонелл в дозах, эквивалентных 200, 400 и 600 млрд.микр. кл. корпускулярного антигена на животное в сутки, безвредны для поросят с 20-дневного возраста и при 10-кратном пероральном введении обеспечивают синтез специфических антител и активацию клеточного звена иммунитета. Оптимальной является суточная доза лизат-антигена, эквивалентная 600 млрд. микр. кл. корпускулярного антигена.
7. Пероральная иммунизация поросят испытуемыми антигенами на фоне пробиотического препарата Лактобифадол позволяет повысить титры сывороточных и копроантител, увеличить однородность иммунного ответа у поросят и увеличить среднесуточные привесы на 73,3-91,1% по сравнению с контролем и на 33,3-57,8% по сравнению с группами без применения пробиотика.
8. Экспериментально обоснована возможность пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза лизат-антигенами возбудителя. В условиях неблагополучного по сальмонеллезу хозяйства пероральная иммунизация лизат-антигенами сальмонелл позволила повысить сохранность поросят в сравнении с внутримышечным использованием этих антигенов на 6%, в сравнении с не вакцинированным контролем - на 11,1%, а живую массу поросят к моменту передачи их на откорм на 1,4 и 1,0 кг соответственно.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Для разработки средств специфической профилактики сальмонеллеза свиней предлагается использовать антигены возбудителя, получаемые путем лизиса бактериальных клеток гидроксиламином солянокислым. Лизат-антигены способны обеспечить эффективный и безопасный с эпизоотической точки зрения, технологичный в использовании метод групповой пероральной иммунизации, в результате которого у привитых животных формируется как системный, так и местный иммунитет. Предлагаемый метод может быть использован как самостоятельно, так и в сочетании с пробиотиком Лактобифадоло, что обеспечивает дополнительный неспецифический профилактический эффект.
Методические наставления Разработка метода и оценка эффективности пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза лизат-антигенами возбудителя могут быть использованы для разработки средств специфической профилактики сальмонеллеза свиней перорального применения.
Методические рекомендации Лабораторная модель для оценки препаратов, содержащих инактивированные сальмонеллы и предназначенные для оральной иммунизации животных используются в учебном процессе при подготовке ветеринарно-санитарных врачей (МГУПБ).
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Лабораторная модель для оценки препаратов, содержащих инактивированные сальмонеллы и предназначенных для оральной иммунизации животных / Д.И. Скородумов, Д.В. Беликов, В.В. Субботин, М.Н. Лощинин // Методические рекомендации - М.: МГУПБ, 2008.
2. Субботин В.В., Сидоров М.А., Лощинин М.Н. К вопросу о возможности энтеральной иммунизации свиней против сальмонеллеза инактивированными препаратами // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: Сб. науч. тр. - М.: ВИЭВ.- 2006.- С.139-141.
3. Влияние протективных веществ и иммунного статуса лабораторных животных на динамику прохождения сальмонеллёзных антигенов по желудочно-кишечному тракту /Д.В. Беликов, Д.И. Скородумов, В.В. Субботин, М.Н. Лощинин, Л.В. Анисимова, Л.Б. Соловьёв, Л.А. Коротеева // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы международной научно-практической конференции.- Щёлково: ВНИТИБП, 2007.-С.229-233.
4. Влияние агар-агара, пектина и предшествующей оральной иммунизации на динамику движения орально введенных антигенов сальмонелл по желудочно-кишечному тракту животных / Д.В. Беликов, Д.И. Скородумов, В.В. Субботин, М.Н. Лощинин, Е.Э Школьников, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева // Журнал Ветеринария и кормление.- 2008.-№1.-С. 6-7.
5. Лощинин М.Н., Субботин В.В. Антительный ответ у мышей при пероральной иммунизации против сальмонеллёза //Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчёл: материалы международной научно-практической конференции. - М.: Труды ВИЭВ, 2009.- Т.75.- С. 437-441.
6. Субботин В.В., Лощинин М.Н. Динамика гуморальных и секреторных антител у поросят, иммунизированных перорально против сальмонеллёза // Журнал Ветеринария и кормление. - 2009.- №5.- С. 4-5.
7. Лощинин М.Н., Субботин В.В., Ездакова И.Ю. Антителогенез при пероральной иммунизации мышей против сальмонеллёза // Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства: материалы всероссийской научно-практической конференции.- Новочеркасск, 2010.-С.56-59.
8. Изотипическая характеристика иммуноглобулинового профиля лимфоидных органов мыши в процессе поствакцинального иммунного ответа / И.Ю.Ездакова, Т.А.Чеботарева, В.В.Субботин, М.Н.Лощинин, Д.В.Рукавицын /. - М.: Труды ВИЭВ, 2010.-Т.76.-С.34-38.
9. Ездакова И.Ю., Субботин В.В., Лощинин М.Н. Количественная характеристика Т-, В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа. - М.: Труды ВИЭВ, 2010.- Т.76.- С.29-33.
10. Лощинин М.Н. Клеточный иммунный ответ у мышей при пероральной и подкожной вакцинации лизат-антигенами сальмонелл // Журнал Ветеринария и кормление. - 2011. - №2. - С. 46-47.
11. Лощинин М.Н., Субботин В.В. Эффективность пероральной иммунизации свиней против сальмонеллёза лизат-антигенами возбудителя // Ветеринарная медицина. - 2011.- №1.- С. 34-36.
12. Лощинин М.Н. Динамика показателей иммунокомпетентных клеток мышей линии BALB/c при пероральной и подкожной иммунизации лизат- антигеном S.typhimurium и S.choleraesuis // Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и др. возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчёл - М.: ВИЭВ, 2011. - Т. 77. - С. 254-256.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству