Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ВОЛКОВА

Татьяна Олеговна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ

ИНДУКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И АПОПТОЗА

ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК in vitro

03.00.25. Гистология,  цитология,  клеточная биология

03.00.04. - Биохимия

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

МОСКВА

2009

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии  ГОУ ВПО Петрозаводский государственный университет и в группе молекулярной биологии Института биологии Карельского Научного Центра РАН.

Научный консультант:

чл.-корр. РАН,  доктор биологических наук, профессор

Немова  Нина  Николаевна

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор

Ярыгин Константин Никитич

доктор биологических наук, профессор 

Захарова Людмила Алексеевна

доктор биологических наук, профессор

Михельсон Виктор Михайлович

Ведущая организация: 

ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет

Защита  состоится  У Ф  2009 г. в  часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26.

  е-mail: idbras@bk.ru

  Факс: (495) 135-80-12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат  разослан У Ф  2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета 

кандидат биологических наук Абрамова Е.Б.

e-mail: ele0806@yandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биологии и медицины является изучение регуляции важнейших клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, при нормально протекающих физиологических процессах, а также при возникновении патологических состояний, в частности, злокачественных опухолей. В настоящее время  получено и охарактеризовано большое количество опухолевых линий различного гистогенетического происхождения,  культивируемых in vitro. Клетки таких иммортализованных линий являются прекрасной экспериментальной моделью для всестороннего изучения биологического действия реагентов с антиопухолевой активностью. Благодаря такому подходу, в последние годы достигнуты определенные успехи в изучении патогенеза и лечении многих опухолевых заболеваний.

Известно, что цитостатики, используемые в химиотерапии, способны индуцировать дифференцировку опухолевых клеток, в ряде случаев сопровождающуюся запуском апоптоза (Волкова и др., 2003; Robertson et al., 1997; Terui et al., 1998). В свою очередь, апоптоз наряду с делением клеток определяет функционирование тканей организма в условиях развития, роста, дифференцировки и при индукции патологических процессов. Последние годы ознаменовались всесторонним изучением апоптоза, однако, несмотря на многочисленные исследования, вопрос о регуляции механизмов процесса остается открытым. Во многих экспериментальных системах индукция апоптоза опухолевых клеток сопряжена с рядом трудностей, поскольку возникающие генетические изменения приводят к нарушению дифференцировки, пониженному восприятию со стороны апоптоз-индуцирующих сигналов, как правило, прогрессирующие во времени, развитию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Корреляция между нарушением дифференцировки и экспрессией генов, активируемых при развитии МЛУ, установлена во многих работах (Marks et al., 1995; Prados et al., 1998; Ueno et al., 1998). В связи с этим, представляется весьма актуальным поиск соединений, способных усилить дифференцировку резистентных опухолевых клеток, что будет играть существенную роль в развитии новых подходов к преодолению фенотипа МЛУ. Итогом такой дифференцировки могут стать замедление пролиферации, индукция апоптоза, а также модулирование чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису естественными клетками-киллерами (ЕКК) и Т-лимфоцитами. Механизм лизиса клеток-мишеней клетками-эффекторами тесно связан с особенностями их мембранного фенотипа  и с наличием ядерных и цитоплазматических белковых факторов, контролирующих индукцию и протекание как дифференцировки, так и апоптоза. Поэтому изучение механизмов указанных клеточных функций, а также поиск и направленный синтез химических соединений, регулирующих эти процессы, представляют несомненный интерес не только в изучении специфики развития и функционирования опухолевой клетки, но и для ведения эффективной терапии онкологических заболеваний.

Таким образом, обозначенная проблема заключается в том, что обработка клеток (in vivo или in vitro) антиопухолевыми агентами или иными химическими соединениями может сопровождаться запуском процессов дифференцировки и/или апоптоза, что оказывает непосредственное влияние на чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК. Биохимические механизмы такого влияния в зависимости от используемого реагента могут пересекаться на уровне сигнальных молекул клетки.

Цель настоящего исследования заключалась в сравнительном изучении нескольких групп структурно-различных химических реагентов индуцировать дифференцировку и/или апоптоз опухолевых (лейкозных) клеток, а также модулировать их чувствительность к лизису ЕКК.

В качестве специфических групп химических реагентов были использованы:  нуклеозиды (тимидин, цитидин, гуанозин), соли жирных кислот с укороченной углеводородной цепью (бутират, изобутират, изовалерат натрия), органические растворители (диметилсульфоксид - ДМСО), кортикостероиды и их  синтетические производные (гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон), константные  активаторы  протеинкиназы С (форбол-12-миристат-13-ацетат - ФМА), известные и новосинтезированные производные ряда хинолина (хинолин - Q, 2-метилхинолин - 2-MeQ, хинолин-1-оксид - QO, 2-метилхинолин-1-оксид - 2-MeQO, 4-нитрохинолин-1-оксид - 4-NQO, 2-метил-4-нитрохинолин-1-оксид - 2-Me-4-NQO,  2-(4Т-диметиламиностирил)хинолин-1-оксид - 2-DQO, 4-(4Т-диметиламино-стирил)хинолин-1-оксид Ц  4-DQO, 2-(4Т-нитростирил)хинолин-1-оксид - 2-NSQO, 4-(4Т-нитростирил)хинолин-1-оксид - 4-NSQO) и пиридина (4-(4Т-диметиламиностирил)пиридин-1-оксид - DPyO), циклофосфан и новосинтезированные  производные тиазофосфола.

Задачи исследования:

1. Изучить цитотоксический и антипролиферативный эффекты структурно-различных химических соединений  на опухолевые клетки. Определить EC50 изучаемых реагентов;
2. Установить, на основе данных по токсичности, дифференцирующее и апоптогенное действия исследуемых индукторов и их комбинаций на опухолевые клетки. Определить основные маркеры эритроидного и миелоцитарного путей дифференцировки клеток;
3. Изучить влияние химических реагентов на модуляцию активности каспаз в опухолевых клетках как возможных участников расхождения путей передачи сигнала от процессов дифференцировки к апоптозу;
4. Исследовать процессы биотрансформации стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина  микросомальными монооксигеназами и пероксидазой. Определить влияние на данные процессы митохондриального цитохрома С;
5. Изучить влияние стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина, а также производных тиазофосфола на процессы окисления и восстановления цитохрома С как одного из основных посредников передачи сигнала апоптоза в клетке. Установить условия возможного выхода цитохрома С из митохондрий в бесклеточной системе;
6. Выявить возможный механизм индукции апоптоза стирильными производными N-оксидов хинолина и пиридина в опухолевых клетках,  основываясь на результатах комплексной оценки биологического действия данных гетероциклов;
7. Определить модулирующее действие химических реагентов и их комбинаций на чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому лизису лейкоцитами человека и крыс. Установить их ведущую роль в модулировании процессов дифференцировки и/или апоптоза;
8. Провести сравнительный анализ биологического действия изучаемых соединений на клетки родительской линии К562, а также К562/2-DQO, К562/4-NQO, К562/ts-p53.

Научная новизна. В ходе работы получены новые данные по сравнительному влиянию нескольких групп структурно-различных химических реагентов на пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, а также изменение чувствительности опухолевых клеток к литическому действию ЕКК.

Впервые изучено цитотоксическое, антипролиферативное, дифференцирующее и апоптогенное действия  производных хинолина, пиридина и тиазофосфола на опухолевые клетки К562. Установлено, что в группе хинолиновых производных имеются соединения,  модулирующие только  дифференцировку, проявляющие апоптогенное действие или влияющие на оба процесса. Среди реагентов выявлены индукторы эритроидной и миелоцитарной дифференцировки клеток. Соединения  взаимодействуют с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот, нуклеозидами, нуклеотидами и ДНК. Наиболее сильный апоптогенный эффект проявляют индукторы, способные к наибольшему связыванию с ДНК, при этом их дифференцирующая активность может отсутствовать.

Впервые определен возможный механизм апоптоз-индуцирующего действия стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина на опухолевые клетки. Установлено, что в реализацию программы апоптоза вовлечены цитохром С, каспазы-9, -8 и -3. Клеточная активация гетероциклов может проходить при участии микросомальных монооксигеназ и пероксидазы. В зависимости от преобладания  в цитоплазме клеток окисленной или восстановленной форм цитохрома С, процессы биотрансформации ксенобиотиков замедляются или ускоряются, что может вносить существенный вклад в реализацию апоптоза.

Впервые показано, что среди исследуемых индукторов эритроидной дифференцировки клеток К562 только ДМСО способен блокировать апоптоз, индуцированный хинолиновыми ксенобиотиками, через снижение активности каспаз-9 и -8.

Впервые установлено, что каспазы участвуют не только в реализации апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток. Показано, что переключение дифференцировки с одного пути на другой, например, с эритроидного на моноцито-макрофагальный или мегакариоцитарный, влечет за собой переключение работы каспаз и модулирование апоптоза.

Впервые экспериментально определено влияние сочетанного действия индукторов эритроидной и миелоцитарной дифференцировки клеток К562 на их чувствительность к цитотоксическому лизису лейкоцитами периферической крови (ЛПК) человека. Установлено, что дифференцировка и апоптоз клеток-мишеней могут вносить вклад в изменение литической активности ЕКК. Обработка индукторами эритроидной дифференцировки в большинстве случаев приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к лизису, однако влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки во многом определяется последовательностью модулирования указанных клеточных процессов.

При обработке опухолевых клеток комбинацией бутирата натрия, ДМСО и ФМА,  впервые показано, что каждый реагент по-разному влияет на изменение цитотоксического индекса (ЦИ) в системе: бутират натрия повышает чувствительность опухолевых клеток к лизису ЛПК, ДМСО блокирует действие бутирата, ФМА способствует поддержанию ЦИ на стабильно высоком уровне.

Впервые экспериментально получены сублинии клеток К562, резистентные к производным ряда хинолина (К562/2-DQO и К562/4-NQO), и охарактеризованы по способности подвергаться индуцированным  дифференцировке и/или апоптозу по сравнению с родительской линией. Показано, что в клетках сублиний процессы индукции эритроидной дифференцировки протекают более интенсивно, при этом наблюдается резкое повышение экспрессии гена каспазы-3, но не каспазы-9. Апоптоз в данных условиях не индуцируется.

Впервые изучено влияние комбинаций химических реагентов на модулирование эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток К562/ts-р53. Показано, что указанные процессы в сублинии протекают более выражено по сравнению с родительскими К562. Установлено, что каспаза-3 участвует в индукции эритроидной дифференцировки клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Выполненная работа является фундаментальным исследованием, результаты которого представляют интерес как для клеточной биологии, биохимии, так и медицины. Полученные данные о включении исследуемых химических соединений в процессы дифференцировки и апоптоза опухолевых клеток открывают возможности для дальнейшего изучения молекулярных механизмов их модулирующего действия и поиска новых, более перспективных структурных аналогов этих соединений.

Предложены новые подходы для создания модуляторов, способных вызывать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток, усиливать их чувствительность к лизису ЕКК, что может повысить эффективность используемых в настоящее время методов противоопухолевой терапии.

Полученные данные свидетельствуют, что индукторы эритроидной дифференцировки повышают чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК, тогда как влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки и/или апоптоза зависит от процесса, первично модулируемого в клетках. При использовании комбинаций соединений каждое из них по-разному влияет на изменение цитотоксического индекса. Поэтому при выборе схем химиотерапии при лейкозах рекомендуется оценивать in vitro дифференцировочный статус клеток лейкозной популяции, цитотоксический индекс и резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам у каждого отдельного больного.

Кроме того, показано, что индукторы эритроидной дифференцировки модулируют уровень мутантного по Val 135 р53 белка в опухолевых клетках, что приводит к резкому повышению их дифференцировки и апоптоза. Поскольку способность цитостатиков регулировать активность белка во многом определяется типом химиотерапии, при выборе схем лечения онкологических заболеваний необходимо учитывать также их свойства.

По полученным данным индукция миелоцитарной дифференцировки опухолевых клеток, сопровождающаяся снижением их чувствительности к лизису ЕКК, протекает при участии каспазы-6. Результаты этих исследований следует учитывать при создании лекарств нового поколения, направленных на подавление экспрессии каспазы-6.

Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах по клеточной и молекулярной биологии, биохимии, для написания учебных и методических пособий, а также монографической литературы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Опухолевые (лейкозные) клетки способны подвергаться химически индуцированным  дифференцировке и  апоптозу  in  vitro,  при  этом  их пролиферативная активность замедляется или полностью блокируется.
2. Каспазы являются ключевыми ферментами не только процессов апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток.
3. В группах структурно-родственных химических реагентов выявлены соединения с разнонаправленными дифференцирующими и апоптогенными эффектами на лейкозные клетки. Подобная биологическая активность связана с особенностями их метаболической активации и разными внутриклеточными мишенями действия.
4. Дифференцировка и апоптоз вносят вклад в изменение чувствительности опухолевых клеток к лизису ЕКК, которое может являться следствием индукции только одного, либо двух указанных процессов.
5. Индуцированная в опухолевых клетках устойчивость к химическим соединениям оказывает влияние на протекание процессов дифференцировки и апоптоза. Дифференцировка протекает более интенсивно, при этом клетки остаются апоптоз-резистентными.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конференциях, съездах и симпозиумах: Международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 1998), Proceeding of the International young research school (Petrozavodsk, 1998),  Всероссийских симпозиумах Структура и функции клеточного ядра (С.-Петербург, 1999, 2001, 2002),  II съезде ВОГиС (С.-Петербург, 2000), Всероссийском симпозиуме Клеточная биология на пороге XXI века (C.-Петербург, 2000), VIII Всероссийском симпозиуме Биология клетки в культуре (С.-Петербург, 2001), International conference The Chemistry and Biological Activity of Nitrogen-Containing Heterocycles and Alkaloids (Moskow, 2001), 6-ой Санкт-Петербургской Ассамблее молодых ученых и специалистов (С.-Петербург, 2001), XII Международной конференции молодых ученых  Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы (С.-Петербург,  2001), Международной конференции Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере (Сургут, 2002), V, VI Международных симпозиумах Химия протеолитических ферментов (Москва, 2002, 2007), 6-, 7-, 8-, 12-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых Биология - наука 21го века (Пущино, 2002, 2003, 2004, 2008), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Всероссийской конференции Проблемы медицинской энзимологии, Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия (Москва, 2002), Научной конференции Карелия и РФФИ (Петрозаводск, 2002), V Конгрессе РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Москва, 2002), I , II Съездах Общества клеточных биологов (С.-Петербург, 2003, 2007), Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), III Научно-практической конференции с Международным участием Болезнь Ходжкина (Петрозаводск, 2004), Всероссийской медико-биологической научной конференции  молодых  учёных Фундаментальная  наука и клиническая медицина  (XI  Всероссийской конференции  Человек и его здоровье) (С.-Петербург, 2008), IV Съезде российских биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). Результаты работы обсуждены на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии Петрозаводского государственного университета 1 октября 2008 г. и апробированы на объединенном семинаре в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 15 декабря 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 16 статей, 34 тезиса докладов и 1 монография.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 разделов, включающих 5 глав обзора литературы, описание материалов и методов исследований, 3 главы результатов собственных исследований и обсуждение результатов, общего заключения, выводов, списка цитированной литературы, приложения. Представлен список публикаций автора по теме диссертации. Общий объем работы составляет 505 страниц, включая 46 таблиц и 79 рисунков. Список цитированной литературы содержит  840 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. Состоит из 5 глав, содержащих сведения об основных особенностях структурной и функциональной организации лейкозных клеток, механизмах индукции дифференцировки и апоптоза клеток, влиянии химических реагентов на указанные процессы. Представлены данные по механизмам модулирования литической активности ЕКК на опухолевые клетки, а также механизмам развития МЛУ.

Материалы и методы исследования.

В работе были использованы клетки эритромиелолейкозной линии человека К562 (Всероссийский банк клеточных культур, Институт цитологии РАН, С.-Петербург). Клетки сублиний К562/2-DQO и К562/4-NQO получены путем ступенчатой селекции в присутствии возрастающих концентраций 2-DQО и 4-NQO. Сублиния клеток, трансфецированных температурочувствительным мышиным геном р53, мутантным по Val 135 (К562/ts-p53), любезно предоставлена д.б.н., профессором Б.П. Копниным (Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН).

Для реализации поставленных задач использованы следующие методы исследования:

- клеточно-биологические (культивирование клеток, оценка пролиферации, численности и жизнеспособности клеток, определение ЕС50 клеток, получение резистентных к химическим реагентам клонов клеток и оценка их устойчивости к действию агентов группы МЛУ, фенотипирование маркеров дифференцировки клеток);

- биохимические (определение внутриклеточной концентрации гемоглобина, активности ферментов (-аминолевулинатсинтазы, гемоксигеназы, каспаз), суммарной внутриклеточной концентрации никотинамидных коферментов, анализ биотрансформации ксенобиотиков под действием микросомальных монооксигеназ и пероксидазы, выделение интактных митохондрий клеток и изучение условий выхода цитохрома С из внутреннего пространства органелл во внешнюю среду);

- молекулярно-генетические (определение характера повреждений ДНК с помощью ДНК-тропных красителей, ПЦР в режиме реального времени);

- иммунологические (оценка фагоцитирующей способности клеток, определение чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису ЛПК человека и клетками селезенки крыс).

2-NSQO, 4-NSQO и производные тиазофосфола любезно предоставлены к.х.н., ст.н.с. Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского Н - РАН  Хайловой Н.А. в 2001 г.; другие производные хинолина  - д.х.н., профессором кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ Андреевым В.П. в 1999 г. Состав и строение полученных соединений подтверждены данными элементного анализа, масс-, ИК-, ЯМР-спектроскопиями (1H, 13C, 15N).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биологическая активность структурно-различных химических реагентов на клетки родительской линии К562

1.1. Влияние нуклеозидов на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток. Биологическое действие нуклеозидов основано на способности вступать в конкурентные отношения с клеточными метаболитами, в частности, с предшественниками нуклеиновых кислот, что приводит к нарушению их синтеза и далее жизнедеятельности клеток. Нами изучено изменение процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток К562 при обработке цитидином, тимидином и гуанозином.

Обработка клеток возрастающими концентрациями (1Ц3 мМ) нуклеозидов в течение 1Ц4 суток приводила к дозо- и время-зависимому снижению пролиферации. Так, численность клеток на 2-е сутки составила 138,33±0,39 тыс./лунку при обработке 2 мМ тимидина и 95,33±0,47 тыс./лунку в условиях инкубации  с 1 мМ гуанозина. Численность клеток, обработанных 2 мМ цитидина, стабилизировалась к 3-м суткам и в течение последующего времени не изменялась. Уровень пролиферации необработанных клеток достигал 229,33±0,31, 410,42±1,05 и 723,58±0,97 тыс./ лунку  на 2-е, 3-и и 4-е сутки, соответственно.

Исследуемые нуклеозиды индуцировали синтез гемоглобина (одного из основных маркеров эритроидной дифференцировки) в клетках К562 (рис. 1), причем наиболее сильным индуктором выступал гуанозин. В клетках также имело место повышение активности  каспазы-9 и каспаз-3, -7, -10 (рис. 2).

Рис. 1. Концентрация гемоглобина в клетках К562, инкубированных в присутствии нуклеозидов в течение 2-х и 4-х суток

К - необработанные индукторами клетки (контроль); - - клетки, культивируемые с  цитидином; Т - с  тимидином; Г - с  гуанозином. Концентрация цитидина и тимидина - 2 мМ, гуанозина - 1 мМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05); ** достоверное отличие от контроля (р<0,01)

Рис. 2. Изменение активности каспазы-9 (а) и  каспаз-3, -7, -10 (б) в клетках К562, обработанных нуклеозидами в течение 2-х суток

1 - базовый уровень активности каспаз для нестимулированных клеток (контроль); 2 - активность каспаз в клетках, обработанных  цитидином; 3 - тимидином; 4 - гуанозином. Концентрация цитидина и тимидина - 2 мМ, гуанозина - 1 мМ. По оси ординат: изменение поглощения отщепленного 7-амино-4-трифлуорометилкумарина (AFC), определенное на СФ-46 при λ 395 нм

Нами выделены варианты, в которых индукция эритроидной дифференцировки и увеличение активности каспаз могли не сопровождаться фрагментацией ДНК опухолевых клеток (например, обработка 2 мМ тимидина в течение 2-х суток или 2 мМ цитидина в течение 4-х суток). Апоптоз в этих вариантах регистрировался позднее - на 3-и и 5-е сутки, соответственно. Поэтому мы предположили, что активация каспаз в данном случае необходима не только для успешного протекания апоптоза, но также для индукции и реализации эритроидной дифференцировки клеток. Использование ингибиторов ферментов экспериментально подтвердило наше предположение.

1.2. Влияние солей жирных кислот на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Известно, что масляная кислота и ее натриевая соль подавляют пролиферацию и индуцируют дифференцировку и апоптоз целого ряда линий, включая клетки миелоидного и лимфоидного происхождения (Hoessly et al., 1989, Bernhardt et al., 1999). В основе механизма внутриклеточного действия реагентов лежат ингибирование активности гистоновых деацетилаз (McCue et al., 1984), устойчивая активация JAK/STAT-пути и ингибирование серин-треонин-протеинфосфатазы (Park et al., 2001). Результаты по влиянию бутирата, изобутирата и изовалерата натрия на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток К562 представлены в таблице 1. Из результатов следует, что эритроидная дифференцировка, индуцированная в клетках натриевыми солями жирных кислот, как и в случае с использованием нуклеозидов, требует активации определенных групп каспаз, в частности, каспаз-3, -7, -10. Апоптотических изменений при этом может не регистрироваться (см. варианты обработки 2 мМ и 3 мМ изобутирата). Бутират натрия, как более реакционно-способный реагент, сильнее активировал каспазы, индуцировал апоптоз. Данный эффект имел место только при использовании 2 мМ и 3 мМ соединения. Пролиферация клеток во всех вариантах была достоверно блокирована.

Таблица 1

Биологическое действие солей жирных кислот с укороченной

углеводородной цепью на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Индукция эритроидной дифференцировки	Повышение активности каспаз		Усиление флуоресценции		Снижение [NAD++NADH]i
				Каспаза-9	Каспазы -3, -7, -10	ДАФИ	БЭ
БУТИРАТ НАТРИЯ	1 мМ	++	+		+	+
	2 мМ	++	++	+	++	+	+	+
	3 мМ	++	++	++	++	+	+	+
ИЗОБУТИРАТ НАТРИЯ	1 мМ	+
	2 мМ	+	++		+
	3 мМ	+	++		+

Примечание Ц  В таблице приведены показатели клеток, обработанных солями жирных кислот в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные реагентами, сравнивали с необработанными К562; У+Ф  изменение  исследуемого показателя  достоверно (р<0,05); У++Ф изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,01);  УЦФ изменение  исследуемого  показателя  отсутствует. Биологические эффекты изовалерата натрия аналогичны таковым изобутирата натрия

1.3. Влияние диметилсульфоксида и его комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

В ряде работ по изучению дифференцирующего действия ДМСО  на  клетки  опухолевых  линий  концентрация  реагента составляет 1,9Ц2,5 % (Baliga et al., 1993; Nathan et al., 1998). ДМСО, используемый в высоких концентрациях (порядка 2,5 % и выше), способен инициировать фрагментацию ДНК клеток (Marthyn et al., 1998). Нами было изучено модулирование пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток К562, обработанных ДМСО (0,1 %, 0,5 %, 1,5 %) на фоне тимидина (2 мМ) и бутирата натрия (2 мМ). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Биологическое действие ДМСО и его комбинаций с тимидином

и бутиратом натрия на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Индукция  эритроидной дифференцировки	Повышение активности каспаз		Усиление флуоресценции		Снижение [NAD++NADH]i
				Каспаза-9	Каспазы 3, -7, - 10	ДАФИ	БЭ
ДМСО	0,1 %	++	+		+
	0,5 %	++	+		+
	1,5 %	++	++	+	++	+	+	++
ТИМИДИН	2 мМ	++	++	+	++	+	+	+
ТИМИДИН + ДМСО	2 мМ+ 0,1 %		+	+		+
БУТИРАТ НАТРИЯ	2 мМ	++	++	+	++	+	+	+
БУТИРАТ  НАТРИЯ + ДМСО	2 мМ+ 0,1 %			+		+	+	+

Примечание Ц  В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение 4-х суток; клетки К562,  обработанные одиночными реагентами, сравнивали с необработанными К562; при оценке влияния на процессы комбинаций реагентов сравнение проводили по отношению к первому составляющему комбинации; У+Ф  изменение  исследуемого показателя  достоверно (р<0,05); У++Ф изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,01);  УЦФ изменение  исследуемого  показателя  отсутствует

Исследуемые соединения (одиночно и в сочетании) обладали выраженным антипролиферативным эффектом на клетки К562. При обработке клеток ДМСО наблюдалось дозо-зависимое повышение синтеза гемоглобина. Эритроидная дифференцировка и  увеличение активности каспаз-3, -7, -10 могли не сопровождаться фрагментацией ДНК (см. варианты обработки 0,1 % и 0,5 % ДМСО). Апоптоз в этих вариантах регистрировался на 5Ц6-е сутки. В культурах, обработанных 1,5 % ДМСО или комбинацией ДМСО с тимидином (бутиратом натрия), индукция эритроидной дифференцировки сопровождалась почти одновременным запуском апоптотических процессов, при этом активировалась каспаза-9. Возможно, в данном случае запуск апоптоза связан с возросшим токсическим эффектом сочетанного действия реагентов на клетки. Следует отметить, что при обработке клеток комбинацией тимидин+ДМСО наблюдался более интенсивный синтез гемоглобина по сравнению с тимидин-обработанными клетками. При замене тимидина на бутират подобного эффекта не регистрировалось.

Таким образом, рассмотренные группы химических реагентов индуцировали дозо- и время-зависимую эритроидную дифференцировку и/или апоптоз клеток К562. При инкубации клеток с комбинациями соединений в модулировании процессов имели место синергический или антагонистический эффекты. Наиболее выраженным дифференцирующим действием обладала комбинация тимидин+ДМСО, апоптоз-индуцирующим - бутират натрия+ДМСО.

1.4. Влияние кортикостероидов и их комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

В ряде работ показано, что используемые в терапии лейкозов кортикостероиды (глюкокортикоиды) способны индуцировать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток (Анисимов и др., 2001; Nakamaki et al., 1989; Yuksel et al., 2002). Реагенты имеют внутриклеточный рецептор связывания, ассоциированный с гетерогенными ядерными РНП, который, являясь лиганд-зависимым транскрипционным фактором, способен изменять активность генов, связываясь с их респонсивными элементами, либо взаимодействуя с другими транскрипционными факторами или белками-коактиваторами (Eggert et al., 1997). Кроме того, реагенты способны модулировать активность Ca2+-зависимых ферментов (Куцый и др., 1999). Нами проведены исследования по влиянию на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток К562 гидрокортизона, преднизолона, дексаметазона и их комбинаций с эритроидными индукторами.

Рис. 3. Концентрация гемоглобина в клетках К562, обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток

1 - необработанные индукторами клетки (контроль); 2 - клетки, культивируемые с  гидрокортизоном; 3 - с преднизолоном; 4 Ц  с дексметазоном; концентрация реагентов - 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля  (р<0,05)

Из результатов следует, что гидрокортизон и преднизолон не модулировали эритроидную дифференцировку и апоптоз клеток (рис. 3, табл. 4). Напротив, дексаметазон подавлял синтез гемоглобина, стимулировал экспрессию CD11b, CD14 и CD41-антигенов (табл. 3) и фрагментацию ДНК клеток (табл. 4). При одновременном внесении в среду 5 мкМ дексаметазона и 2 мМ тимидина (или бутирата) параметры флуоресценции БЭ и ДАФИ при связывании с ДНК резко возрастали, активировались каспазы--3, -7, -9, -10. Аналогичный эффект имел место также при замене дексаметазона на преднизолон или гидрокортизон.

Таким образом, кортикостероиды способны индуцировать миелоцитарную дифференцировку клеток К562. Повышенная активация каспаз-9 и -3, -7, -10, а  также выраженная  фрагментация ДНК клеток, обработанных

Таблица 3

Процент клеток К562, экспрессирующих CD11b, CD14 и CD41-антигены,

после инкубации с кортикостероидами в течение 4-х суток

РЕАГЕНТ	CD11b+-клетки, %	CD14+-клетки, %	CD41+-клетки, %
Контроль	24,41,3	36,3±1,9	11,7±1,8
Гидрокортизон	25,71,9	38,1±1,7	11,9±1,5
Преднизолон	29,21,6*	38,9±2,1	14,8±2,7
Дексаметазон	34,71,8*	45,8±1,7*	19,8±1,6*

Примечание - Концентрация реагентов - 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05)

Таблица 4

Параметры ΔДАФИ и ΔБЭ флуоресценции нуклеоидов клеток К562,

обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток

РЕАГЕНТ	ΔДАФИ	ΔБЭ
Контроль	36,90±0,07	6,20±0,10
Дексаметазон (10 мкМ)	48,07±0,08*	9,28±0,02*
Преднизолон (10 мкМ)	37,02±0,12	6,53±0,09
Гидрокортизон (10 мкМ)	36,92±0,13	6,40±0,08

Примечание Ц  Клетки инкубировали в 96-луночных микропланшетах по 0,02 млн. клеток/лунку; показатели ΔДАФИ и ΔБЭ для тимоцитов, обработанных 5 мкМ дексаметазона в течение 6 час: 47,86±0,34* и 9,14±0,18* (необработанные клетки: 40,81±0,22 и 6,83±0,34, соответственно); * достоверное отличие от контроля  (р<0,05)

комбинациями реагентов с тимидином или бутиратом натрия, усиленные по сравнению с обработкой только эритроидными агентами, свидетельствуют об  участии этих каспаз в индукции апоптоза опухолевых клеток.

1.5. Влияние ФМА и его комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Нефизиологические активаторы протеинкиназы С (ПКС) форболовые эфиры способны индуцировать мегакариоцитарную и/или моноцито-макрофагальную дифференцировку лейкозных и нормальных клеток крови (Rosson, OТBrien, 1998). ПКС участвует в активации мегакариоцитарных промоторов  посредством функциональной кооперации с GATA-1 (Racke et al., 2001). В некоторые модели клеточной дифференцировки вовлечен ERK/MAPK-киназный каскад (Dass et al., 2000; Kim et al., 2001; Dorsey et al., 2002). Из полученных нами результатов следует, что ФМА оказывал выраженное антипролиферативное и цитотоксическое действие на клетки К562. Одиночная или сочетанная с эритроидными индукторами обработка клеток ФМА, как в случае дексаметазона, приводила к подавлению синтеза гемоглобина, повышению экспрессии CD11b, CD14 и CD41-антигенов, увеличению фагоцитарной активности клеток. Нами установлено, что каспаза-9 является одной из ключевых каспаз, участвующих в апоптозе, индуцированном нуклеозидами или солями жирных кислот (см. выше). При добавлении к реагентам ФМА активность каспазы-9 снижалась (рис. 4б), ингибировался апоптоз (табл. 5). Активация каспазы-6 (рис. 4в) наблюдалась при индукции моноцито-макрофагальной и ингибировании эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток (табл. 5), т. е. в присутствии ФMA. Каспаза-3 (рис. 4а) в зависимости от условий участвовала как в протекании дифференцировки, так и в апоптозе клеток. Таким образом, не исключено, что именно с подобным перераспределением функций клеточных каспаз связано ингибирование форболовым эфиром нуклеозид- и бутират-индуцированного апоптоза.

Таблица 5

Параметры ΔДАФИ и ΔБЭ нуклеоидов клеток К562, обработанных ФМА,

тимидином, бутиратом натрия, а также комбинациями реагентов

в течение 2-х суток

РЕАГЕНТЫ	ΔДАФИ	ΔБЭ
Необработанные клетки	36,05±0,14	6,02±0,11
ФМА (100 нМ)	35,82±0,29	6,22±0,60
Тимидин (3 мМ)	41,04±0,21**	7,18±0,08*
Бутират натрия (3 мМ)	40,96±0,18**	8,02±0,18*
Тимидин (3 мМ) + ФМА (100 нМ)	37,00±0,09*	6,32±0,11*
Бутират натрия (3 мМ) + ФМА (100 нМ)	36,88±0,17*	6,20±0,18

Примечание - Условия опыта см. в примечании к табл. 4; * достоверное  отличие от контроля (р<0,05); ** достоверное отличие от контроля (р<0,01); различия достоверны в парах: необработанные клетки К562 и клетки, инкубированные с тимидином или бутиратом натрия; клетки, обработанные комбинациями тимидин + ФМА или бутират натрия + ФМА и клетки, растущие в присутствии только тимидина или бутирата, соответственно

Рис. 4. Изменение активности каспазы-3 (а), каспазы-9 (б) и каспазы-6 (в) в клетках К562, обработанных ФМА, тимидином и комбинацией реагентов в течение 2-х суток

1 - базовый уровень активности каспаз для нестимулированных клеток; 2 - активность каспаз в клетках, обработанных тимидином; 3 - ФМА; 4 Ц  тимидином + ФМА. Концентрация тимидина - 3 мМ, ФМА - 100 нМ. По оси ординат: изменение поглощения отщепленного 7-амино-4-трифлуорометилкумарина (AFC), определенное на СФ-46 при λ 395 нм

1.6. Влияние хинолина и его N-оксидированных производных в комбинациях с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Среди большого спектра реагентов, применяемых в онкологической практике, особую группу составляют производные N-содержащих гетероциклов. Реагенты являются конкурентными структурными аналогами ключевых молекул клетки (азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов, различных коферментов и т. д.) и высокоэффективны для лечения опухолей различного гистогенетического происхождения и локализации. Широкое применение многих из них ограничивается повышенной токсичностью. Поэтому поиск соединений, обладающих высокой противоопухолевой активностью и низкими побочными эффектами представляет несомненный интерес. Нами было изучено биологическое действие комбинаций производных хинолина  с эритроидными агентами  на клетки К562. Результаты показали, что только N-оксидированные производные ингибировали эритроидную и индуцировали миелоцитарную дифференцировку клеток.

Таблица 6

Биологическое действие хинолина и его производных в комбинации с индукторами эритроидной дифференцировки  на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Ингибирование эритроидной дифференцировки	Изменение активности каспаз			Усиление флуоресценции		Снижение [NAD++NADH]i
				Каспаза-9	Каспаза-3	Каспаза-8	ДАФИ	БЭ
ДМСО	0,1 %	+			+
ДМСО + Q	0,1%+ 0,3 мкМ	+
ДМСО + QO	0,1%+ 10 мкМ	+	+		+
ДМСО + 4-NQO	0,1% + 1нМ	++	+		+				+

Примечание Ц  В таблице приведены  показатели клеток, обработанных реагентами в течение 2-х суток, изменение эритроидной дифференцировки регистрировалось после 4-х суточной обработки; клетки К562, обработанные ДМСО, сравнивали с необработанными К562; при оценке влияния на процессы комбинаций реагентов сравнение проводили по отношению к первому составляющему комбинации; У+Ф  изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,05); У++Ф изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,01); У+++Ф изменение  исследуемого  показателя  достоверно  (р<0,001);  УЦФ  изменение исследуемого показателя отсутствует;  - определяемый показатель по сравнению с контролем снижается

4-NQO и 2-Me-4-NQO проявляли выраженное апоптоз-индуцирующее действие, которое блокировалось добавлением ДМСО (табл. 6). В пробах ингибировались активность каспаз-9, -8 и флуоресценция БЭ и ДАФИ, снижалась активность каспазы-3. С тимидином и бутиратом натрия подобного эффекта не обнаружено.

1.7. Влияние стирильных N-оксидированных производных хинолина, пиридина и производных тиазофосфола на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Данная группа ксенобиотиков включает новосинтезированные соединения, поэтому биологическую активность стирильных производных хинолина и пиридина сравнивали с предыдущей группой реагентов, а производных тиазофосфола - с широко используемым цитостатиком циклофосфаном. Нами показано, что при попадании в клетку данные гетероциклы биотрансформируются под действием цитохрома Р-450 и пероксидазы. Интересно то, что спектр внутриклеточных метаболитов соединений неодинаков, а их биологическая активность в десятки раз может превышать таковую вещества-родоначальника. Результаты по биологическому действию реагентов на клетки К562 представлены в таблицах 7 и 8.

Индукция эритроидной дифференцировки  регистрировалась в условиях обработки 2-NSQO, 4-NSQO (2 суток), DPyO (4 суток; в табл. 8 2-суточные данные), циклофосфаном и третбутиламиновым производным тиазофосфола. При этом наблюдалось повышение активности каспаз, флуоресценции ДАФИ, БЭ, снижение концентрации никотинамидных коферментов (в клетках индуцировался апоптоз). При инкубации с DPyO, 2-DQO, 4-DQO признаки апоптоза регистрировались раньше достоверного увеличения маркеров дифференцировки. Индукция моноцито-макрофагальной дифференцировки клеток отмечена с анилиновым производным тиазофосфола (4 суток) и  2-DQO (к концу 5-х суток). В результате достаточно убедительно можно сделать заключение, что каспаза-8 не задействована в протекании эритроидной дифференцировки, а участвует в  апоптозе, индуцированном реагентами.

Таблица 7

Биологическое действие стирильных N-оксидированных производных

хинолина и пиридина на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Дифференци-ровка		Повышение активности каспаз			Повышение флуорес-ценции		Снижение [NAD++NADH]i
			Индукция эритроидной [Hb]i	Моноцито-мак- рофагальная, мегакариоци- тарная	Каспаза-9	Каспазы-3,-7,10	Каспаза-8	ДАФИ	БЭ
2-DQO	1 мкМ	+			+	++	+	++	+	++
4-DQO	1 мкМ	+			+	++	+	+	+	+
DPyO	1 мкМ	+		не определяли	+	++	+	+		+
2-NSQO	1 мкМ	+	+	не определяли	+	++	+	+	+	+
4-NSQO	1 мкМ	+	+	не определяли	+	++	+	+	+	+

Примечание Ц  В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение  2-х суток,  изменение активности каспазы-9  регистрировали после 1-х суток; клетки К562,  обработанные реагентами, сравнивали с необработанными К562; У+Ф  изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,05); У++Ф изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,01); УЦФ изменение  исследуемого  показателя  отсутствует

В настоящее время известно, что выход цитохрома С из митохондрий в цитоплазму клетки является очень важным этапом в активации каскадов каспаз и запуске апоптоза. Изучаемые ксенобиотики модулируют процессы окисления и восстановления цитохрома С, влияя на его функциональную активность в электрон-транспортной цепи митохондрий или после выхода в цитоплазму клеток. На рисунке 5 представлен график восстановления цитохрома С микросомами без и в присутствии 2-NSQO. Добавление 2-NSQO в среду инкубации вызывало снижение скорости восстановления, которое со временем прогрессировало. 

Прединкубация микросом с 2-NSQO не изменяла скорости восстановления белка по  сравнению  с предыдущим вариантом. После полного  по-

Таблица 8

Биологическое действие циклофосфана и производных тиазофосфола на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление  пролиферации	Дифференци-ровка		Повышение активности каспаз			Повышение флуорес-ценции		Снижение [NAD++NADH]i
			Индукция эритроидной [Hb]i	Моноцито-мак- рофагальная, мегакариоци- тарная	Каспаза-9	Каспаза-3	Каспаза-8	ДАФИ	БЭ
ЦИКЛОФОСФАН	30мкМ	++	+	не определяли	+	++		++	+	+
ТРЕТБУТИЛАМИНОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ	30мкМ	++	+	не определяли	++	++	+	++	+	+
АНИЛИНОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ	30мкМ	++			++	+	+	++	+	+

Примечание Ц  В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение  4-х суток; клетки К562,  обработанные  реагентами, сравнивали с необработанными К562;  У+Ф  изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,05); У++Ф изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,01); УЦФ изменение  исследуемого  показателя  отсутствует

давления NADPH-цитохром С-редуктазной активности добавление в среду NADH (но не NADPH и/или цитохрома С) частично возобновляло восстановление цитохрома С. При использовании 4-NSQO наблюдалась аналогичная закономерность, однако подавление вышеуказанной активности микросом происходило медленнее, и добавление в среду NADH полностью возобновляло восстановление белка. Окисление цитохрома С данные реагенты ингибировали в одинаковой степени. Обнаруженная нами биологическая активность производных хинолина может вносить существенный вклад в протекание апоптоза опухолевых клеток.

Поскольку в нашей системе инкубация клеток с реагентами приводила  к модуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза, далее изучили  изменение чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису ЕКК в наиболее значимых вариантах.

Рис. 5. Восстановление цитохрома С микросомами клеток К562 без (1) и в присутствии 10 мкМ 2-NSQO (2Ц5)

Цитохром С и NADPH добавляли сразу после введения в суспензию микросом 2-NSQO (2) или после 5 мин преинкубации микросом с указанным реагентом (3). На 10 мин регистрации в систему 2 были добавлены NADH (50 мкМ) (4) или NADPH (50 мкМ) (5)

1.8. Изменение чувствительности клеток к лизису ЕКК периферической крови человека и селезенки крыс при обработке химическими реагентами.

Анализ влияния реагентов на процессы дифференцировки, апоптоза и чувствительность клеток К562 к лизису ЛПК человека показал следующее (табл. 9).

При обработке клеток эритроидными индукторами чувствительность к лизису ЛПК повышали: бутират натрия, 2-NSQO, 4-NSQO (на 2-е сутки), DPyO, третбутиламиновое производное тиазофосфола (на 4-е сутки). Увеличение чувствительности к лизису сопровождалось повышением дифференцировочного статуса клеток и индукцией апоптоза. С бутиратом индуцировалась только эритроидная дифференцировка. С тимидином и циклофосфаном наблюдалась тенденция к повышению чувствительности клеток к лизису, хотя в вариантах индуцировались эритроидная дифференцировка и апоптоз клеток. ДМСО не изменял величину ЦИ в системе.

При обработке клеток индукторами миелоцитарной дифференцировки: дексаметазоном, ФМА, QO, 4-NQO, анилиновым производным тиазофосфола,  два  первых  соединения на  4-е сутки  понижали  чувствительность

Таблица 9

Влияние химических реагентов на процессы дифференцировки, апоптоза и чувствительность клеток К562 к лизису  ЛПК человека

Комбинации реагентов	Модулирование  дифференцировки				Модули-рование апоптоза		Модулирование чувствительности к лизису ЛПК
	эритроидной		миелоцитарной
	2 суток	4 суток	2 суток	4 суток	2 суток	4 суток	2 суток	4 суток
Тимидин			не определяли	не определяли			0	*
Дексаме-тазон	0		0		0		0
Тимидин +  дексаме-тазон			не определяли	не определяли			0 (тим.) 0 (декс.)	0 (тим.) (декс.)
ФМА					0	0	0
Тимидин + ФМА			не определяли	не определяли	0	0	0 (тим.) 0 (ФМА)	0 (тим.) * (ФМА)
Бутират натрия			не определяли	не определяли	0
ДМСО			не определяли	не определяли	0	0	0	0
Бутират + ДМСО	0	0	не определяли	не определяли	0 0		(бут.) 0 (ДМСО)	(бут.) 0 (ДМСО)
Бутират + ФМА			не определяли	не определяли	0 0	0	0 (бут.) (ФМА)	0 (бут.) (ФМА)
ДМСО + ФМА			не определяли	не определяли	0 0	0 0	0 (ДМСО) 0 (ФМА)	0 (ДМСО) * (ФМА)
Бутират + ДМСО + ФМА		0 0	не определяли	не определяли			(бут + ДМСО) 0 (бут.+ ФМА) (ДМСО+ ФМА)	(бут.+ ДМСО) 0 (бут.+ ФМА) (ДМСО+ ФМА)
QO	0		0		0	0	0	0
4-NQO	0		0
Тимидин + QO	0		не определяли	не определяли			(тим.) (QO)	(тим.) (QO)
Тимидин + 4-NQO	0		не определяли	не определяли			(тим.) 0 (4-NQO)	(тим.) 0 (4-NQO)
Бутират  +QO	0		не определяли	не определяли			0 (бут.) (QO)	(бут.) (QO)
Бутират + 4-NQO	0		не определяли	не определяли			(бут.) 0 (4-NQO)	(бут.) 0 (4-NQO)
ДМСО+QO	0		не определяли	не определяли	0 0	0 0	0 (ДМСО) 0 (QO)	0 (ДМСО) 0 (QO)
ДМСО + 4-NQO	0		не определяли	не определяли	0		(ДМСО) (4-NQO)	(ДМСО) (4-NQO)
2-DQO, 4-DQO	0	0	0	*			0	0
DPyO	0		не определяли	не определяли	0		0
2-NSQO, 4-NSQO			не определяли	не определяли
Циклофосфан	0		не определяли	не определяли	0		0	*
Третбутил-аминовое производное тиазофосфола	0		не определяли	не определяли	0		0
Анилиновое производное тиазофосфола	0		0		0		0	0

Примечание - Концентрации реагентов указаны в тексте и подписях к рисункам; при характеристике биологического действия комбинаций соединений в каждом случае представлены две строки: верхняя характеризует модулирование процессов по отношению к первому составляющему комбинации, нижняя  - по отношению ко второму составляющему; модулирующее действие на процессы одиночных реагентов оценено по отношению к необработанным клеткам; - процесс индуцируется, - процесс ингибируется, 0 - влияние на процесс отсутствует, * - в модулировании процесса имеет место тенденция (0,05<p<0,1)

клеток к литическому действию ЛПК. Дексаметазон также индуцировал апоптоз  клеток. 4-NQO на 2-е сутки проявлял апоптоз-индуцирующее действие и повышал чувствительность клеток к лизису. Дифференцирующий эффект реагента проявлялся к 4-м суткам. 2-DQO и 4-DQO первично индуцировали апоптоз, однако, чувствительность клеток к лизису не модулировали. Подобный эффект отмечен для QO и анилинового производного тиазофосфола, вместе с тем наблюдалось повышение дифференцировочного статуса клеток, а в случае производного тиазофосфола индукция апоптоза. При использовании комбинаций соединений, когда наблюдалось снижение индуцированной эритроидной дифференцировки (тимидин +дексаметазон, ФМА, QO или  4-NQO; бутират натрия + дексаметазон, ФМА, QO или  4-NQO; ДМСО+ФМА, QO или  4-NQO), имела место неоднотипность действия реагентов на чувствительность клеток к лизису ЛПК. В комбинациях с тимидином повышение чувствительности клеток к лизису регистрировалось с QO или  4-NQO. В этих условиях индуцировался апоптоз, дифференцировка ингибировалась к 4-м суткам. Замена производного хинолина на дексаметазон или ФМА приводила к усилению апоптоза в вариантах с дексаметазоном и ингибированию процесса в вариантах с ФМА, чувствительность клеток к лизису ЛПК по сравнению с тимидином не менялась. Если сравнивать с клетками, обработанными дексаметазоном (или ФМА), то величина ЦИ в опытных пробах к 4-м суткам возрастала, однако, была сопоставима с уровнем необработанных клеток. В результате, в данных комбинациях основной вклад в повышение чувствительности опухолевых клеток к лизису ЛПК вносил тимидин. В вариантах тимидин+QO имел место эффект синергизма действий  реагентов. Для комбинации тимидин+4-NQO подобного не обнаружено. Аналогичная закономерность прослеживалась при замене тимидина на бутират натрия. В культурах с бутиратом+ФМА величина ЦИ не отличалась от проб, инкубируемых только с бутиратом, хотя регистрировалось ингибирование апоптоза. Апоптоз ингибировался и в клетках, обработанных ДМСО+4-NQO, величина ЦИ тоже снижалась. В результате, ДМСО - единственный эритроидный агент, который при совместном внесении с  4-NQO, способен снизить его стимулирующее действие на чувствительность клеток К562 к литическому действию ЛПК.

При использовании комбинации, когда введение второго реагента приводило к увеличению дифференцировочного статуса клеток (бутират натрия+ДМСО) по сравнению с культурами, обработанными бутиратом, регистрировалось снижение их чувствительности к лизису ЛПК. Увеличение апоптоза имело место к 4-м суткам. В данном варианте, также как в предыдущем, ДМСО отрицательно влиял на изменение ЦИ в системе.

Наиболее сложной комбинацией соединений в модулировании чувствительности клеток К562 к лизису являлась бутират+ДМСО+ФМА.  Нами установлено, что каждый реагент по-разному влиял на изменение ЦИ: бутират натрия повышал чувствительность клеток к лизису ЛПК, ДМСО блокировал его действие, ФМА в составе комбинации способствовал поддержанию ЦИ на достаточно высоком уровне.

Использование в качестве эффекторов клеток селезенки крыс в большинстве случаев не привело к изменению чувствительности клеток К562 к лизису. Увеличение ЦИ отмечено при обработке бутиратом+ФМА, снижение при обработке тимидином+дексаметазон (или ФМА). Подобный эффект связан с видовыми различиями рецепторных структур взаимодействующих клеток.

Таким образом, обработка опухолевых клеток агентами, индуцирующими дифференцировку, в зависимости от концентрации, времени инкубации и способности клеток подвергаться дифференцировке и/или апоптозу, может усилить или ослабить их чувствительность к лизису ЕКК. Изменение чувствительности во многом определяется типом используемого индуктора и связано с процессом, затронутым в опухолевых клетках в первую очередь. Поэтому при клиническом использовании комбинаций антиопухолевых препаратов необходимо учитывать изменения в процессах дифференцировки и апоптоза, возникающие под действием или на фоне каждого составляющего комбинации.

2. Биологическая активность структурно-различных химических реагентов на клетки сублиний К562/4-NQO и К562/2-DQO

Одной из главных причин неудачного использования цитостатиков в клинике является индукция у опухолевых клеток фенотипа МЛУ (Krishna, Mayer, 2000). В настоящее время представляется актуальным поиск соединений, способных усилить дифференцировку резистентных опухолевых клеток, что рассматривается в качестве одного из терапевтических подходов при лечении опухолей (Prados et al., 1998). Итогом такой дифференцировки могут стать замедление или полное прекращение пролиферации, индукция апоптоза, модуляция чувствительности опухолевых клеток к лизису ЕКК. Нами были получены сублинии клеток К562, резистентные к 2-DQO и 4-NQO, и охарактеризованы по способности подвергаться дифференцировке и апоптозу по сравнению с клетками родительской линии.

Клетки сублиний были протестированы на чувствительность к ДНК-интеркалирующему агенту БЭ, ингибитору сборки микротрубочек колхицину, 2-DQO и 4-NQO.  Результаты представлены в таблице 10. Клетки К562/4-NQO оказались высокоустойчивыми к БЭ и 2-DQO, но были чувствительны к колхицину. Клетки К562/2-DQO показали одновременно высокую устойчивость ко всем реагентам, однако их устойчивость к БЭ была ниже по сравнению с клетками К562/4-NQO.

Таблица 10

Чувствительность клеток К562/4-NQO и К562/2-DQO

к цитостатическим агентам

иния клеток	ЕС50, мкМ
	Бромистый этидий	Колхицин	4-NQO	2-DQO
К562	2,5	0,002	1,06	79,7
К562/4-NQO	39,8	0,0004		398
К562/2-DQO	7,9	0,120	79,0

Далее нами показано, что в клетках К562/4-NQO, и особенно К562/2-DQO, процессы эритроидной дифференцировки протекали более интенсивно по сравнению с родительской линией. Причем обнаруженный эффект имел место только при обработке тимидином (рис. 6), но не бутиратом натрия или ДМСО. Резкое увеличение содержания гемоглобина в клетках сублиний обусловлено повышением синтеза белка (в частности, -глобина, рис. 7), а не увеличением численности клеток в культурах. 

В условиях индуцированной тимидином дифференцировки клеток К562/2-DQO наблюдалось резкое повышение экспрессии гена каспазы-3, но не каспазы-9 (рис. 8). Для клеток К562/4-NQO подобного эффекта не отмечено. Экспрессия генов каспаз в необработанных клетках К562/4-NQO и К562/2-DQO снижена. Снижение экспрессии также имело место при обработке тимидином+дексаметазон. При этом в отличие от родительских, в клетках сублиний апоптоз не индуцировался.

Рис. 6. Влияние обработки клеток К562, К562/4-NQO и К562/2-DQO тимидином на  содержание гемоглобина за 2 (а) и 4 (б) суток

1 - необработанные клетки К562 (контроль); 2, 3, 4 - клетки К562, обработанные 1, 2 и 3 мМ тимидина, соответственно; 5 - необработанные клетки  К562/4-NQO; 6, 7, 8 - клетки К562/4-NQO, обработанные 1, 2 и 3 мМ тимидина, соответственно; 9 - необработанные клетки К562/2-DQO; 10, 11, 12 - клетки К562/2-DQO, обработанные 1, 2 и 3 мМ тимидина, соответственно. Различия достоверны (p<0,05; p<0,01) в парах: 2-6, 2-10; 3-7, 3-11; 4-8, 4-12

Рис. 7. Электрофореграмма ПЦР-продуктов гена -глобина клеток родительской линии К562 и сублиний К562/2-DQO, К562/4-NQO

1 - маркер длин фрагментов pUC19/Msp I (0,5 мкг/мкл, 501-67 bp); 2 - клетки К562, обработанные тимидином; 3 - необработанные клетки К562; 4 - необработанные клетки К562/4-NQO (сублиния, резистентная к 1,010-6 М 4-NQO); 5 - необработанные клетки К562/4-NQO (сублиния, резистентная к 1,010-7 М 4-NQO); 6 - необработанные клетки  К562/2-DQO (сублиния, резистентная к 7,610-5 М 2-DQO); 7 - клетки К562/2-DQO, обработанные тимидином. Концентрация тимидина - 2 мМ, время обработки - 2 суток

Рис. 8. Относительная экспрессия генов каспазы-9 (а) и каспазы-3 (б) в клетках родительской линии К562 и сублиний К562/2-DQO, К562/4-NQO

1 - необработанные клетки К562; 2 - клетки К562, обработанные тимидином; 3 - необработанные клетки К562/2-DQO; 4 - клетки К562/2-DQO, обработанные тимидином; 5 - необработанные клетки К562/4-NQO; 6 - клетки К562/4-NQO, обработанные тимидином. Концентрация тимидина - 2 мМ, время обработки - 2 суток. Относительная экспрессия гена (Сt) в опыте определялась исходя из экспрессии гена в контроле, которая принималась за единицу: Сt=2Сt(контроля) - Сt(опыта)

Различия достоверны (p<0,05) в парах: 1-3, 1-5, 2-4 (на рис. а и б); 1-2, 3-4, 5-6 (на рис. б)

Таким образом, в клетках К562, резистентных к 2-DQO и 4-NQO, наблюдается более выраженная индукция дифференцировки и сниженная чувствительность к индукции апоптоза по сравнению с родительской линией. Подобные изменения в сублиниях связаны с развитием устойчивости к 4-NQO, 2-DQO и другим соединениям (агентам группы МЛУ).

3. Биологическая активность структурно-различных химических реагентов на клетки К562/ts-p53

Клетки К562 дефектны по гену р53, который является важнейшим элементом ответа на стрессорные воздействия, в том числе на воздействие химиотерапевтических препаратов. Изменения в гене приводят к нарушению способности клеток вступать в апоптоз, останавливаться в контрольных точках клеточного цикла в ответ на повреждение и к развитию МЛУ (Ставровская, 2000). Чаще всего в гене обнаруживаются миссенс-мутации, приводящие к замене одного из аминокислотных остатков в ДНК-связывающем домене белка, что отражается на особенностях влияния мутантных форм р53 на фенотип опухолевых клеток. Нами было изучено влияние мышиного р53 белка, мутантного по Val 135, на дифференцировку и апоптоз клеток К562/ts-p53 после их обработки N-оксидированными производными хинолина в комбинации с эритроидными индукторами. При 37оС этот белок имеет типичные характеристики мутантного белка, а при 32оС приобретает конформацию и свойства белка дикого типа. В качестве контроля были использованы клетки с введенным пустым ретровирусным вектором pPS/neo (К562/neo).

Из результатов следует (табл. 12), что в клетках К562/ts-р53 процессы  эритроидной  дифференцировки и апоптоза протекали более интенсивно по сравнению с клетками К562/neo и клетками родительской линии. Тимидин, бутират натрия и ДМСО повышали синтез гемоглобина в клетках K562/ts-p53. Полученные данные подтверждают ранее обнаруженную способность опухолевого супрессора усиливать эритроидную дифференцировку клеток (Chylicki et al., 2000a; Chylicki et al., 2000b; Yao et al., 2004). Ингибирование синтеза гемоглобина и индукция апоптоза наблюдались при обработке QO. Установлено, что в индукции эритроидной дифференцировки клеток участвует каспаза-3, поскольку добавление ингибитора фермента приводило к снижению синтеза гемоглобина. QO не активировал каспазу-3. Обработка клеток тимидином или бутиратом приводила к повышению активности каспазы-9 и индукции апоптоза. При добавлении в культуры QO наблюдалось резкое возрастание активности фермента и выраженный апоптоз. Эффект отсутствовал при обработке ДМСО или ДМСО+QO. Вероятно, ДМСО способствует инактивации р53, что отражается на развитии апоптоза, индуцированного QO.

Особенности клеток K562/ts-p53 объясняются способностью мутантного р53 белка  в определенных условиях сохранять некоторые активности белка дикого типа: связываться с р53-респонсивными элементами и увеличивать транскрипцию репортерных генов, участвующих в процессах дифференцировки или апоптоза.

Таблица 12

Биологическое действие индукторов эритроидной дифференцировки и их комбинаций с QO  на клетки K562/ts-p53

иния клеток	Реагенты	Концентрация	Индукция эритроидной дифференцировки	Повышение активности каспаз		Усиление флуоресценции		Снижение [NAD++NADH]i
				Каспаза-9	Каспаза-3	ДАФИ	БЭ
K562/ts-p53	ТИМИДИН	2 мМ	++	+	+	+
	ТИМИДИН + QO	2 мМ+ 10 мкМ	+	+	+	+	+	++
	БУТИРАТ НАТРИЯ	2 мМ	++	+	+	+		+
	БУТИРАТ  НАТРИЯ + QО	2 мМ+ 10 мкМ	+	+	+	+	+	++
	ДМСО	0,1 %	++		+	+
	ДМСО + QO	0,1%+ 10 мкМ				+
	QO	10 мкМ		+		+	+

Примечание Ц  В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение 2-х суток при 320С; сравнение результатов действия реагентов проводили в парах К562/neo Ч K562/ts-p53; достоверных различий между клетками К562/neo и родительскими К562 не обнаружено; пролиферация клеток в представленных вариантах была блокирована; У+Ф  изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,05); У++Ф изменение  исследуемого  показателя  достоверно (р<0,01); УЦФ изменение  исследуемого  показателя  отсутствует

Таким образом, в настоящей работе нами показано, что клетки эритромиелолейкозной линии человека К562 в зависимости от условий способны подвергаться химически индуцированным дифференцировке и апоптозу, продемонстрированы основные различия в индукции этих процессов в клетках родительской линии К562, резистентных сублиний (К562/4-NQO, К562/2-DQO)  и клетках-трансфектантах (K562/ts-p53). Несмотря на структурное различие используемых реагентов, итоговый биохимический эффект их действия на клетки может быть совершенно одинаков. В частности, нуклеозиды, натриевые соли жирных кислот с укороченной углеводородной цепью, ДМСО, некоторые N-оксиды (2-NSQO, 4-NSQO и DPyO), циклофосфан, третбутиламиновое производное тиазофосфола стимулируют эритроидную дифференцировку и/или апоптоз в опухолевых клетках. Напротив, системные кортикостероиды, ФМА, QO, 4-NQO подавляют индуцированную эритроидную дифференцировку и стимулируют созревание клеток моноцито-макрофагального или мегакариоцитарного ряда. При этом ФМА и ДМСО способны блокировать апоптоз клеток. В связи с этим, в реализации конкретной клеточной функции принимают участие различные сигнальные пути, воздействуя на которые можно определенным образом регулировать протекание клеточного процесса в том или ином направлении. Одни и те же участники сигнальных путей клетки могут выполнять роль ключевых звеньев модуляции различных клеточных функций, например, дифференцировки и апоптоза. Нами показано, что одними из таких ключевых участников процессов являются клеточные каспазы. Функциональная активность каспаз и других протеиназ во многом определяет чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК и цитотоксических Т-лимфоцитов организма.

ВЫВОДЫ

1. Исследованные химические соединения обладают различным цитотоксическим и антипролиферативным действием на клетки эритромиелолейкозной линии человека К562, что объясняется их структурными особенностями и механизмом внутриклеточного действия. Жизнеспособность клеток в зависимости от условий обработки варьирует от 25% до 95%, пролиферативная активность частично или полностью подавляется.
2. Эритроидная дифференцировка опухолевых клеток К562 индуцируется нуклеозидами, солями жирных кислот с укороченной углеводородной цепью, ДМСО, 2-NSQO, 4-NSQO, DPyO, циклофосфаном и 2-третбутиламино-4-тиоксо-4-хлорметил-1,3,4-тиазофосфол-2-ином. В клетках увеличивается активность -аминолевулинатсинтазы, каспазы-3, повышается синтез гемоглобина. Сочетанное действие двух различных индукторов эритроидной дифференцировки вызывает либо синергический, либо антагонистический эффекты.
3. Миелоцитарная дифференцировка опухолевых клеток сопровождается экспрессией на их поверхности моноцито-макрофагальных  - CD11b, CD14, и мегакариоцитарного - CD41, маркеров, а также активацией гемоксигеназы и индуцируется преднизолоном, дексаметазоном, ФМА, QO, 2-MeQO, 4-NQO, 2-Me-4-NQO, 2-DQO, 4-DQO, 2-анилино-4-тиоксо-4-хлорметил-1,3,4-тиазофосфол-2-ином.

4. Переключение процессов клеточной дифференцировки с эритроидного на моноцито-макрофагальный или мегакариоцитарный влечет за собой переключение функциональной активности каспаз и модуляцию процессов апоптоза. Апоптоз, индуцированный в клетках эритроидными индукторами, реализуется с участием каспазы-9. ФМА подавляет эритроидную, индуцирует моноцито-макрофагальную дифференцировку, блокирует активность каспазы-9 и апоптоз клеток К562, при этом активируется каспаза-6. Каспаза-3 в зависимости от условий участвует как в процессах дифференцировки, так и апоптоза опухолевых клеток.

5. Апоптоз опухолевых клеток К562, индуцированный стирильными производными N-оксидов хинолина и пиридина, а также производными тиазофосфола, осуществляется при участии митохондриального цитохрома С, каспаз-3, -8 и -9. Реагенты оказывают влияние на процессы окисленияЦвосстановления цитохрома С, модулируют набуханиеЦсжатие митохондрий и способствуют выходу данного белка в цитоплазму. Преобладание в цитоплазме клеток окисленной или восстановленной форм цитохрома С отражается на реализации программы апоптоза.

6.        Изменение чувствительности клеток К562 к лизису естественными клетками-киллерами лейкоцитов периферической крови человека зависит от типа химического соединения, концентрации, времени воздействия, исходного состояния клеток, способных подвергаться дифференцировке и/или апоптозу. Обработка клеток индукторами эритроидной дифференцировки повышает их чувствительность к лизису. Влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки и/или апоптоза зависит от процесса, первично индуцируемого в опухолевых клетках. Чувствительность клеток к лизису снижается, если первично индуцируется дифференцировка и повышается, если индуцируются апоптоз и дифференцировка.

7.  Эритроидная дифференцировка в клетках резистентных сублиний К562/4-NQO, и особенно К562/2-DQO, протекает более интенсивно по сравнению с родительскими К562, при этом регистрируется резкое повышение экспрессии генов -глобина и каспазы-3. Экспрессия гена каспазы-9 не изменяется. Сублинии являются устойчивыми к апоптоз-индуциру-ющему действию исследуемых ксенобиотиков.

8.        Процессы эритроидной дифференцировки и апоптоза в клетках  К562/ts-р53, обработанных индукторами при 320С, протекают более интенсивно по сравнению с родительской линией К562. В индукции эритроидной дифференцировки клеток участвует каспаза-3.

9. Стирильные производные N-оксидов хинолина, пиридина и производные тиазофосфола являются наиболее перспективными реагентами для создания на их основе препаратов нового типа, использование которых может повысить эффективность лечения онкологических заболеваний.

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов Фонда Президента Российской Федерации Поддержка ведущих научных школ РФ (НШ-894.2003.4, НШ-4310.2006.4), РФФИ (гранты 99-04-49442, 01-04-06530, 02-04-49999, 02-04-06427), С.-Петербургского КЦФЕ (МО1-2.6П-783, диплом АСП № 301106) и Целевой программы РАН Поддержка молодых ученых.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Монография:

1. Волкова Т.О., Немова Н.Н.  Молекулярные механизмы апоптоза лейкозной клетки: Отв. ред. д.м.н., проф. А.И. Шевченко. - М.: Наука, 2006. - 208 с.

Статьи:

2. Анисимов А.Г.,  Болотников И.А.,  Волкова Т.О. Влияние  тимидина  и  форбол-12-миристат-13-ацетата на эритроидную дифференцировку клеток  К562  и  чувствительность их к неспецифическому  лизису  спленоцитами  крыс // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 1999. Ц  Т. 128. Ц  № 11. Ц  С. 521-524.
3. Анисимов А.Г.,  Болотников И.А.,  Волкова Т.О. Изменение  чувствительности  клеток К562  к неспецифическому лизису лейкоцитами человека и крысы  под влиянием бутирата натрия, диметилсульфоксида и форбол-12-миристат-13-ацетата // Онтогенез, 2000. Ц  Т. 31. Ц  № 1. Ц  С. 47-52.
4. Анисимов А.Г.,  Болотников И.А.,  Чекмасова А.А., Волкова Т.О. Взаимосвязь  индуцированной  in  vitro дифференцировки клеток  опухолевых линий и  чувствительности их к  неспецифическому лизису ЕКК. Возможные механизмы // Цитология, 2000. Ц  Т. 42. Ц  № 10. - С. 923-936.
5. Анисимов А.Г., Чекмасова А.А., Волкова Т.О., Немова Н.Н.  Обработка  клеток К562  тимидином  на фоне  дексаметазона повышает чувствительность опухолевых  клеток  к  литическому действию  лейкоцитами человека // Цитология,  2001. - T. 43. Ц  № 1. - C. 76-81.
6. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Биологические эффекты in vitro стирильных производных ряда хинолина и пиридина на примере клеток опухолевых линий: В книге Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений/ Под ред. д.х.н. В.Г. Карцева и акад. Г.Н. Толстикова. - М.: ИРИДИУМ-ПРЕСС, 2001. - С. 254-257.
7. Анисимов А. Г., Волкова Т. О., Чекмасова А. А, Немова Н. Н. Форбол-12-миристат-13-ацетат отменяет ингибирующее действие А23187 на эритроидную дифференцировку клеток К562, индуцированную диметилсульфоксидом // Известия РАН. Серия биол., 2002. - № 2. - С. 142-148.
8. Анисимов А.Г., Волкова Т.О., Чекмасова А.А., Немова Н.Н. Химически-индуцированная дифференцировка клеток опухолевых линий // Онтогенез, 2002. Ц  Т. 33. Ц  № 5. - С. 325-341.
9. Волкова Т.О., Малышева И.Е. Модуляция процессов дифференцировки и апоптоза клеток промиелоцитарной линии человека К562 стирильными производными ряда хинолина и пиридина // Вестник молодых ученых. Серия Науки о жизни, 2002. - вып. 4. - С. 58-63.
10. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Сравнительный анализ дифференцирующего и апоптогенного действий цитидина, тимидина и гуанозина на клетки эритромиелолейкозной линии человека К562 // Вопросы мед. химии, 2002. - Т. 48. Ц  № 6. - С. 586-593. 
11. Анисимов А. Г., Чекмасова А. А.,. Волкова Т. О, Немова Н. Н. Эритроидная дифференцировка сублиний клеток К562, резистентных к 2-(4Т-диметил-аминостирил)хинолин-1-оксиду или 4-нитрохинолин-1-оксиду, значительно усиливается при обработке тимидином // Известия РАН. Серия биол., 2003. Ц  № 1. Ц  С. 37-46.
12. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Зыкина Н.С. Модуляция активности каспаз в клетках К562 в условиях обработки бутиратом, изобутиратом и изовалератом натрия // Вестник молодых ученых. Серия Науки о жизни,2004 - вып.1.ЦС.72-76.
13. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Форбол-12-миристат-13-ацетат ингибирует апоптоз в эритролейкемических клетках К562, индуцированный рядом нуклеозидов // Онтогенез, 2005. - Т. 36, № 1. - С. 18-25.
14. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Рябков В.А., Волкова Т.О., Кручек М.М. Активность программированной клеточной гибели лимфоцитов при ревматоидном артрите // Терапевтический архив, 2006. Ц  № 6. - С. 14-19.
15. Волкова Т.О., Зыкина Н.С., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Клеточные механизмы индукции апоптоза в эритромиелолейкозной линии человека К562 при обработке производными хинолин-N-оксида // Биомедицинская химия, 2006. - Т. 52, № 2. - С. 180-187.
16. Volkova T.O., Zykina N.C., Malycheva I.E., Nemova N.N. Cell mechanisms for apoptosis induction in K562 human erythroleukemia cell line treated with quinoline-N-oxides derivatives // Biochemistry (Supplement Series B: Biomedical chemistry), 2007. - Vol. 1 (1). - P. 82-86 (англ. вар. 15).
17. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Функциональное перераспределение активностей каспаз в клетках К562, индуцированных к дифференцировке и апоптозу производными тиазофосфола  //  Биомедицинская химия,  2008. Ц  Т. 54.,  № 6. Ц  С.643-648.

Тезисы конференций:

18. Болотников И.А., Волкова Т.О.,  Анисимов А.Г. Модуляция  эритроидной дифференцировки и чувствительности к неспецифическому лизису клеток  человеческой эритромиелолейкозной линии  К562 в условиях обработки  рядом метаболических ингибиторов / Международная конф. Рецепция и внутриклеточная  сигнализация. Ц  Пущино, 1998. Ц  С. 68-71.
19. Volkova T.O., Anisimov A.G. Change of number and viability of cells K562 in conditions of treatment by a number of chemical reagents / Proceeding of the International young research school. - Petrozavodsk, 1998. - Vol. 1. - P. 59-68.
20. Болотников И.А.,  Волкова Т.О.,  Анисимов А.Г. Влияние  индукторов  дифференцировки клеток К562 на чувствительность их к лизирующему действию  ЕКК-содержащих  лейкоцитов  человека и крыс // Цитология, 1999. - Т. 41. Ц  № 3/4. Ц  С. 262.
21. Волкова Т.О.,  Чекмасова А.А.,  Анисимов А.Г.  Биологическая активность  некоторых производных хинолина на клетки К562 / II Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Ц  С.-Петербург, 2000. Ц  Т.  2. Ц  С. 151.
22. Анисимов А.Г.,  Волкова Т.О.,  Чекмасова А.А.,  Андреев В.П.  Взаимосвязь между  апоптогенной  активностью  ряда  производных  хинолина  и пиридина и их способностью ингибировать  эритроидную дифференцировку клеток  линии К562 // Цитология, 2000. - Т. 42. Ц  № 3. Ц  С. 258.
23. Волкова Т.О., Чекмасова А.А., Анисимов А.Г. Форбол-12-миристат-13-ацетат восстанавливает дифференцирующее действие диметилсульфоксида на клетки К562, подавленное предобработкой клеток кальциевым ионофором А23187 // Цитология, 2001. - Т. 43. Ц  №  4. - С. 328.
24. Volkova T.O., Nemova N.N. Styryl derivatives of  quinolines and pyridine: biological action on the cells of tumor lines in vitro / International conference УThe Chemistry and Biological Activity of Nitrogen-Containing Heterocycles and Alkaloids. - Moskow, 2001. - Vol. 1. - P. 553-556.
25. Волкова Т.О., Черномордая Ю.П., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Модулирующее действие N-оксидированных производных хинолина на индуцированную эритроидную дифференцировку клеток К562 зависит от типа эритроидного индуктора и последовательности обработки опухолевых клеток реагентами // Цитология, 2001. - Т. 43. Ц  № 9. - С. 846.
26. Волкова Т.О. Цитотоксическое и апоптогенное действие индукторов дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий / 6ая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов.  - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2001. - С. 41.
27. Волкова Т.О. Индукция программированной гибели в клетках миелоидных опухолевых линий человека. Особенности. Механизмы / XII Международная конф. молодых ученых Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы. - С.-Петербург,  2001. - С. 619-623.
28. Малышева И.Е., Волкова Т.О., Немова Н.Н. Клетки крови эритроидного ряда человека: особенности дифференцировки в условиях холодового стресса / Международная конф. Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере. - Сургут, 2002. - С. 60-62.
29. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Участие каспаз в проведении сигнала апоптоза в опухолевых клетках человека / V Международный симпозиум Химия протеолитических ферментов. - Москва, 2002 - C. 35.
30. Волкова Т.О., Малышева И.Е. Модуляция биологической активности цитохрома С в условиях обработки рядом метаболических ингибиторов / 6ая Пущинская школа-конф. молодых ученых Биология - наука 21го века. Секция Молекулярная биология и биохимия - Пущино, 2002. - Т. 1. - С. 229.
31. Волкова Т.О., Сак Н.С., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Поиск новых модуляторов электронтранспортной функции белков системы цитохромов в эритролейкемических клетках человека К562 / III съезд Биохимического Общества. - С.-Петербург, 2002. Ц  С. 65-66.
32. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Индукция апоптоза в клетках миелоидных опухолевых линий человека. Возможные участники и модуляция их биологической активности / Всероссийская конф. Проблемы медицинской энзимологии, Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия. - Москва, 2002. Ц  С. 55.
33. Волкова Т.О. Экспериментальное моделирование процессов индуцированной дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий in vitro и модуляции их чувствительности к неспецифическому лизису лейкоцитами человека и крыс / Научная  конф. Карелия и РФФИ. - Петрозаводск, 2002. Ц  С. 20.
34. Волкова Т.О., Малышева И.Е. Эффекторное влияние индуцированной дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий на модуляцию активности внутриклеточных цистеиновых протеиназ и чувствительность клеток к неспецифическому лизису лейкоцитами человека / Научная конф. Карелия и РФФИ. - Петрозаводск, 2002. - С. 21.
35. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Диметилсульфоксид ингибирует апоптоз в эритролейкемических клетках К562, индуцированный кальциевым ионофором А23187 // Цитология, 2002. - Т. 44. - № 9. Ц  С. 866-867.
36. Волкова Т.О., Малышева И.Е. Модуляция чувствительности эритролейкемических клеток К562 к неспецифическому лизису лейкоцитами человека в условиях обработки антиопухолевыми агентами / 5ый Конгресс РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. - Москва, 2002. - Т.2. Ц  С. 37.
37. Волкова Т.О., Сак Н.С., Малышева И.Е. Взаимосвязь цитохромов С и Р-450 в реакциях метаболизма N-содержащих гетероциклических соединений / 7ая Пущинская школа-конф. молодых ученых Биология - наука 21го века. Секция Молекулярная биология и биохимия - Пущино, 2003. - С. 41.
38. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Везикова Н.Н., Марусенко И.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при раннем ревматоидном артрите // Научно-практическая ревматология (приложение к журналу), 2003. Ц  № 2. - С. 21.
39. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Влияние форбол-12-миристат-13-ацетата на модуляцию апоптоза в эритролейкемических клетках человека К562 при обработке рядом химических реагентов // Цитология, 2003. - Т. 45. Ц  № 9. - С. 858-859.
40. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Процессы индукции эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток К562 в условиях обработки 2-(4Т-нитростирил)хинолин-1-оксидом и 4-(4Т-нитростирил)хинолин-1-оксидом // Цитология, 2003. - Т. 45. Ц  № 9. - С. 859.
41. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Зыкина Н.С., Кожевникова М.Н. Влияние N-оксидированных производных хинолина на активность микросомальных NADPH-оксидоредуктаз и концентрацию никотинамидных коферментов в клетках линии К562 / 8ая Пущинская школа-конф. молодых ученых Биология - наука 21го века. Секция Общая и функциональная биохимия - Пущино, 2004. - С. 72.
42. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при системной красной волчанке // Научно-практическая ревматология (приложение к журналу), 2004. Ц  № 4. - С. 7.
43. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов как критерий активности и эффективности терапии при системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите / III Международная научно-практическая конф.  УБолезнь ХоджкинаФ Ц  Петрозаводск, 2004. Ц  С. 132-134.
44. Варга О.Ю., Игнатьев В.К.,  Хейфец Л.М., Везикова Н.Н., Марусенко И.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите / Материалы IV конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа. Ц  Великий Новгород, 2004. Ц  С. 36-38.
45. Волкова Т.О. Индукция апоптоза в эритролейкемических клетках человека К562 при обработке системными кортикостероидами // Вестник молодых ученых. Серия Науки о жизни (приложение к журналу), 2005. - С. 45. 
46. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Участие каспаз в индукции дифференцировки и апоптоза клеток миелоидных опухолевых линий человека / VI Международный симпозиум Химия протеолитических ферментов. - Москва, 2007.
47. Волкова Т.О., Зыкина Н.С., Немова Н.Н. Участие опухолевого супрессора р53 в индукции эритроидной дифференцировки клеток линии К562 // Цитология, 2007. - Т. 49, № 9. - С. 727-728.
48. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Влияние нитростирильных производных хинолин-1-оксида на чувствительность эритролейкемических клеток К562 к неспецифическому лизису лейкоцитами человека // Цитология,2007. - Т. 49, № 9. - С. 728.
49. Волкова Т.О. Опухолевый супрессор р53 индуцирует эритроидную дифференцировку клеток линии К562 / Всероссийская медико-биологическая научная конф.  молодых  учёных "Фундаментальная  наука и клиническая медицина"  (XI  Всероссийская конф.  Человек и его здоровье).  - С.-Петербург, 2008. - С. 71-72.
50. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Апоптоз-индуцирующее действие комбинаций системных кортикостероидов и солей жирных кислот с укороченной цепью на эритролейкемические клетки К562 / IV Съезд российских биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск: Изд-во Арта, 2008. - С. 223.
51. Волкова Т.О., Гуров Э.В. Новые ингибиторы электронтранспортной функции цитохрома С в опухолевых клетках / 12ая Пущинская школа-конф. молодых ученых Биология - наука 21го века. Секция Общая и функциональная биохимия - Пущино, 2008. - С. 77.

Другие работы:

52. Волкова Т.О. Эффекторное влияние индуцированной дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий на модуляцию активности внутриклеточных цистеиновых протеиназ и чувствительность клеток к неспецифическому лизису лейкоцитами человека: ВНТИЦентр; № ГР 01. 200.210712; Инв. №  0220.0 502160. - М., 2005. - 56 с.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии