Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ИВАНЫЧЕВА ЮЛИЯ НИКОЛАЕВНА

Эколого-биологические эффекты

нанопорошков  кобальта, меди и оксида меди в системе растения Ц животные

Специальность 03.02.08 - экология

Автореферат на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

БАЛАШИХА - 2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:                доктор биологических наук

Чурилов Геннадий Иванович

Официальные оппоненты:                Соловьев Андрей Васильевич

доктор сельскохозяйственных наук,

ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет, заведующий кафедрой агрохимии, ботаники

и физиологии растений РГАЗУ

Фомичев Юрий Павлович

доктор биологических наук, профессор

ВНИИживотноводства РАСХН, заведующий лабораторией химико-аналитических исследований

Ведущая организация:                ФГОУ ВПО Рязанский государственный агротехнологический университет

им. П.А. Костычева

Защита диссертации состоится 14 июня 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.056.01 при ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный заочный университет по адресу: 143900, Московская область, город Балашиха, ул. Юлиуса Фучика, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный заочный университет.

Автореферат разослан л____________________ 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета  О.Л. Сойнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современные нанотехнологии обладают огромным потенциалом и играют важную роль в развитии общества. Однако, применение наноматериалов ставит ряд задач, которые относятся, прежде всего, к проблеме воздействия их на окружающую среду, животный и растительный мир, качество сельскохозяйственной продукции. Наноматериалы, обладая малыми размерами, легче вступают в химические превращения и способны образовывать новые соединения с неизвестными ранее свойствами.

Абсорбирующие свойства наночастиц значительно выше, чем у других структур и появление таких наноматериалов в окружающей среде может способствовать активному поглощению загрязнителей и их широкому распространению. Актуальны исследования фитотоксичности наночастиц, где растения, как важнейшие продуценты, находятся в основании множества пищевых цепей. Появление в тканях растений наночастиц может привести к бионакоплению их в организме, расположенном на верхних ступенях пищевых пирамид, включая человека, что способно привести к самым негативным последствиям.

Проведенные в последние годы исследования Л.В. Коваленко (1994-2006гг.), Г.Э. Фолманиса (1999-2011гг.), Н.Н. Глущенко (2002), А.П. Райковой (2001-2006 гг.), С.Д. Полищук(2000-2011гг.), Г.И. Чурилова (2000-2011 гг.) показали эффективность применения нанопорошков металлов в растениеводстве, кормопроизводстве и животноводстве. Положительные результаты были получены в Подмосковье, Рязанской, Тульской, Белгородской области, Ставропольском и Краснодарском крае, в Белоруссии, Башкоркостане. Их использование позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур в среднем на 25%, а в результате усиления естественной резистентности животных снизить потери молодняка на 25-35%. При этом актуально изучение биологической совместимости и токсичности применяемых наноматериалов.

Цель и задачи исследований. Цель исследования: определить воздействие в зависимости от размеров и концентрации наночастиц кобальта, меди и оксида меди  на биохимические показатели растительных объектов  кормового назначения и  влияние кормов на физиологическое состояние животных.

Для реализации поставленной цели предстояло определить:

- воздействие нанопорошков меди различной концентрации на растительные объекты по витальным и морфофизиологическим показателям;

- влияние размеров наночастиц меди на растительные объекты;

- воздействие наночастиц оксида меди в зависимости от концентрации на растительные объекты по витальным и морфофизиологическим показателям;

-степень воздействия наночастиц меди и оксида меди на растительные объекты по биохимическим показателям;

-влияние кормовых растений, семена которых перед посадкой обработаны нанопорошками на физиологические показатели кроликов;

- токсичность нанопорошков на животных.

А также показать эколого - биологическую безопасность растений, обработанных нанопорошками кобальта, меди и оксида меди в зависимости от их химического состава; разработать практические рекомендации.

Научная новизна. Впервые установлено, что неблагоприятные воздействия окружающей среды на растительные объекты снижаются при обработке их семян нанопорошками кобальта, меди и оксида меди. По отклонению показателей биохимического статуса растений определены оптимальные дозы нанопорошков. Показана возможность прогнозирования отдаленных токсических эффектов наночастиц на основе анализа методов световой и аналитической электронной микроскопии. Проведена оценка безопасности введения наночастиц кобальта, меди и оксида меди в организм животных, и показано, что токсичность и биологическая активность наночастиц характеризуется их различными физико-химическими свойствами. Определена  максимальная доза нанопорошка, не оказывающая отрицательного воздействия на организм кроликов.

Практическая значимость работы. Впервые предложена методика оценки фитотоксичности нанопорошков по интегральным морфо - физиологическим и биохимическим параметрам, для чего не требуется дорогостоящего оборудования. Определены размеры и концентрации нанопорошков меди, которые рекомендуется использовать в качестве микроудобрений, способствующих повышению кормовой ценности растений. Доказано, что предельная концентрациия безопасного применения нанопорошка меди для вики и пшеницы составляет 100 г/га, оксида меди - 10,0 г/га, а оптимальная - 0,05 г/га.

Рекомендовано использовать урожай растений, семена которых обрабатывались нанопорошками кобальта и меди, для скармливания кроликам, что способствует ускорению их развития.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на: научных конференциях Рязанского государственного медицинского университета им. академика И.П.Павлова (2008-2012), научной конференции Рязанской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора П.А. Костычева (2008), Международной научно-практической конференции Молодость, талант, знания - ветеринарной медицине и животноводству (Троицк, 2010), международной научно-практической конференции молодых ученых Россельхозакадемии (Омск,2010), Четвертом Международном форуме по нанотехнологиям RusNanoTech - 2011 (Москва, 2011), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых  аспирантов и студентов Молодежная наука 2012: технологии, инновации (Пермь,2012).

Научные положения, выносимые на защиту:

- действие нанопорошков меди различной концентрации на пшеницу и вику по витальным и морфофизиологическим показателям и влияние размеров нанометаллов на данные показатели;

- действие нанопорошков оксида меди в зависимости от концентрации на пшеницу и вику по витальным и морфофизиологическим показателям;

-возможность прогнозирования отдаленных токсических эффектов наночастиц на основе анализа методов световой и аналитической электронной микроскопии;

- определение степени воздействия наночастиц меди и оксида меди на растительные объекты по биохимическим показателям: активностям антиоксидантных ферментов и фитогормонов;

- результаты полевых испытаний: воздействие нанопорошков кобальта, меди и оксида меди на витальные, морфофизиологические показатели, урожайность, накопление биологически активных соединений в опытных растениях;

- результаты влияния растений, выращенных с использованием нанопорошков, на физиологическое состояние кроликов (живую массу, плодовитость и сохранность потомства);

- токсичность наночастиц на животных;

- рекомендации по применению нанопорошков в зависимости от размеров и предельно допустимых концентраций для безопасного воздействия на биологические объекты.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и предложений. Содержит 48 рисунков, 49 таблиц. Список литературы включает 161 источник, в том числе 47 на иностранных языках.

ичный вклад и участие автора. Автору принадлежит разработка, постановка и выполнение научной работы. Отдельные элементы научных исследований выполнены совместно с соавторами, что нашло отражение в опубликованном в автореферате списке работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, научная новизна и её практическая значимость.

1. Состояние проблемы и задачи исследований

Во всем мире уделяется большое внимание перспективам развития нанотехнологий - технологий, направленных на получение и использование веществ и материалов в диапазоне размеров до 100 нанометров. Особенностью таких материалов является существенное изменение механических, магнитных, оптических, электрических, химических и биологических свойств, что открывает широкие области их применения в различных областях промышленности и сельскохозяйственного производства. При этом возникает проблема изучения воздействия наноматериалов на человека и живые организмы в целом. Накоплен значительный экспериментальный материал относительно токсичности и безопасности некоторых наноматериалов для живых организмов. Однако этих результатов по изучению биологических эффектов наночастиц и наноматериалов недостаточно.

2. Материал и методика исследований

Экспериментальная работа проводилась с 2006 по 2011 гг.

Исследование выполнено на растениях: пшеница яровая, вика, лапчатка гусиная и горец птичий. Семена культур одного года урожая принадлежали к одному виду и сорту, соответствовали 1 классу, не были обработаны протравителями и имели соответствующие документы.

Семена обрабатывали водной суспензией нанопорошков оксида меди размер 25-30 нм, меди размером 25-30 нм и 200нм и кобальта 28 нм, которые были произведены в Московском институте стали и сплавов. Препараты имели произвольную форму частиц, высокую удельную поверхность (до 25 м2/г). Суспензию готовили согласно ТУ 931800-4270760-96 в ультразвуковой ванне (модель ПСБ-5735-5). Экспериментально установлена их высокая реакционная способность и каталитическая активность в клетках и тканях растений и животных. Изучалось действие нанопорошков в интервале концентраций 0,001 - 1000г порошка на гектарную норму высева семян.

абораторные исследования проводились на кафедре химии Рязанского государственного агротехнологического университете имени П.А. Костычева (РГАТУ), кафедрах общей химии с курсом биоорганической и органической химии, микробиологии и биохимии Рязанского бюджетного государственного медицинского университета имени И.П. Павлова (РязГМУ) и областной ветлаборатории.

Полевые испытания проводились в учебно-опытном хозяйстве Стенькино Рязанского государственного агротехнологического университета имени П.А. Костычева (РГАТУ). Полевые опыты закладывались согласно Методике полевого опыта Б.А. Доспехова. Обеспеченность в учебно-опытном хозяйстве Стенькино элементами питания: подвижным фосфором 120 мг/кг и калием 150 мг/кг ; медью - 17,3 мг; кобальтом - 1,2 г на кг почвы. Посевная площадь делянки 75 м2, учетная - 50 м2, повторность четырехкратная. Была выбрана методика обработки семян вики за сутки перед посевом рабочими растворами нанопорошков меди и оксида меди, при концентрации нанопорошков 0,05г на гектарную норму высева семян.

Исследования на животных (живая масса, воспроизводство, морфо-биохимические показатели крови) - в виварии, биохимической лаборатории при кафедре химии РГАТУ и клинической лаборатории больницы №11 г.Рязань.

Для анализа воздействия наноматериалов на растительные объекты в лабораторных условиях в качестве субстрата использовали гелеобразные (на основе полисахаридов) культивационные среды. Гелеобразующим компонентом для получения агаризованных сред выбран полисахарид, полученный из морских водорослей (агар Difco или микробиологический агар отечественного производства). Некоторые химические параметры микробиологического агара: сульфаты 1 %; кальций 0,4 %; магний 0,2 %; общий азот 0,25 %; температура застывания 36С; температура плавления 1,2 % геля 5С; pH (1,2 % геля) меняется от 6,1 до 5,7 после автоклавирования. Семена проращивали в условиях, предусмотренных ГОСТ 12038-84 с помощью термостата обогреваемого ТСО-1М с диапазоном температур от 0 С до 60 С; допустимые колебания температуры 1 С.

Исследования клеток растений и определение в них наноматериалов в агрегированном состоянии проводили при помощи оптического светового микроскопа Nikon ECLIPSE LV100-POL. Аналитическую электронную микроскопию проводили на просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEMа1400 с ускоряющим напряжением до 120 кВ в STEM (сканирующая просвечивающая электронная микроскопия). Подготовку образцов выполнял автор, фотографии выполнены в Московском институте стали и сплавов.

Определение цитокининов и абсцизовой кислоты проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) фирмы Biotronic. Условия хроматографирования: детектор ультрафиолетовый (модель BT 3030), длина волны 268 nm, колонка Lichrosorb RP-18, 6 mkm, 4x150. Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-уксусная кислота (V/V - 55:44:1), скорость потока 0,8 мл/мин, время удерживания - 10 мин.

Биологическую активность гиббереллинов определяли по методу Франкленда и Уоринга. Условия хроматографирования: детектор флуоресцентный RF-350 (Shimadzu), Em-350 nm, Ex-280 nm, колонка Lichrosorb RP-18, 6 mkm, 4x250. Подвижная фаза - 40% -ный водный раствор метанола, скорость потока 0,5 мл/мин, время удерживания - 12 мин. Минимальная регистрируемая концентрация во всех случаях составила 2,0 нг в аликвоте пробы (20 мкл).

Для определения активности пероксидазы и супероксиддисмутазы в растительных тканях использовали метод: фотометрический кинетический тест с помощью фотоэлектроколориметра КФК-3-01-ЗОМЗ.

Аскорбиновая кислота, каротин, биохимическое исследование травы и сена вики определялись по стандартным методикам. Выделение белков из семян вики проводилось по стандартной методике (Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севостьянова Т.А., 1975; Скоупе Р., 1985), с использованием модифицированного метода O.H. Loury и N.S. Rosenbrough (1951) с раствором ТХУ (трихлоруксусной кислоты).

Выделение лектинов проводилось по отработанной нами методике с использованием афинной хроматографии (Безвременко И.А.,1979; Туркова Я.И.,1980).

Моносахариды идентифицировали методом и газожидкостной (ГЖХ) хроматографии на приборе Цвет 4-67 с пламенно-ионизационным детектором.

Действие травы вики, выращенной с использованием нанопорошков кобальта, меди и оксида меди, изучалось на кроликах породы Советская шиншилла на самках и самцах в возрасте 1,5 месяцев. Все животные содержались в стандартных условиях вивария. В рационе использовались комбикорм, корнеплоды, трава и сено.

Токсичность нанопрепаратов исследовали на крысах. Морфологические и биохимические показатели крови определялись по унифицированным методикам клинической диагностики (Делекторская Л.Н., Добрянская Л.Д., 1974). Продолжительность опыта 45 дней.

Все количественные изменения были статистически обработаны с использованием коэффициента Стьюдента t=2,015 для надёжности a=0,9.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Воздействие наноматериалов на витальные и морфологические показатели растений. Одним из механизмов токсического действия наночастиц, по современным представлениям, может служить механическое разрушение наноструктурами органов и тканей, развитие мембранных нарушений и развитие комплекса реакций оксидативного стресса. Для диагностики фитотоксичности наноматериалов искусственного происхождения больше подходят не требующие дорогостоящей материальной базы методы молекулярно-клеточного анализа, а более доступные методики по интегральным морфо - физиологическим и биохимическим параметрам.

Если, по сравнению с контрольными, семена в исследуемых образцах не проросли, или же длина корней и стеблей, а также их масса в процентах от контрольного значения менее 70%, то образец наноматериала считается токсичным.

  Заранее подготовленные чашки Петри заполнялись питательной средой на 20% их объема. Семена на ложе раскладывались вручную на расстоянии не менее 0,5Ч1,5 см друг от друга. Повторность опыта четырёхкратная для каждого варианта обработки (контроль, наноматериал, традиционный аналог). Подготовленные таким образом чашки Петри помещали в термостат на проращивание.

Таблица 1

Условия проращивания семян

Культура	оже	Температура	Освещенность	Срок определения, сутки
Вика	Углеводный гель	202	темнота	Энергия прорастания	Всхо- жесть
				3	7
Пшеница	Углеводный гель	202	темнота	3	7

В случае пшеницы к числу нормально проросших относили семена, имеющие не менее двух нормально развитых корешков размером более длины семени и росток размером не менее половины его длины с просматривающимися первичными листочками, занимающими не менее половины длины колеоптиля. Для вики к числу нормально проросших семян относили - имеющие развитый главный зародышенвый корешок размером более длины семени и сформировавшийся росток.

Присутствие нанопорошка меди в питательной среде для семян пшеницы и вики до концентрации 10г на гектарную норму высева способствовало достоверному повышению энергии прорастания семян. При этом в опытных вариантах энергия прорастания превышала контроль на 9-10 %. При более высоких концентрациях нанопорошка меди энергия прорастания семян несколько уменьшалась, оставаясь выше 90%, следовательно, нанопорошок меди в данных концентрациях не обладает токсическим действием.

Нанопорошок оксида меди повышает энергии прорастания семян пшеницы и вики до 10 % при концентрациях не выше 1,0г на гектарную норму высева. И если для пшеницы энергии прорастания остается выше 90% и при более высоких концентрациях, то для вики она составляет 86% (100г/га) и 81% при (1000г/га).

Таким образом, высокореакционные оксид и медь активно включаются в ферментативные процессы по расщеплению запасных питательных веществ, обеспечивая их энергичное прорастание. Следует отметить, что более высокий уровень обменных процессов у проростков опытных вариантов способствовал достоверному повышению всхожести по сравнению с контролем.

Воздействие наноматериалов на морфологические показатели растений.

Метрические показатели проростков семян культур вики и пшеницы при взаимодействии с различными концентрациями нанопорошков меди и оксида меди (25-30 нм) на гелеобразной культивационной среде представлены в таблице 2.

Таблица 2

Длина надземной и подземной части проростков пшеницы и вики при  взаимодействии с нанопорошками меди на гелеобразной культивационной среде

Варианты	Вика (3-х дневные)		Яровая пшеница (3-х дневные)
	Длина  надз. части проростка, мм	Длина  подз. части проростка, мм	Длина  надз. части проростка, мм	Длина  подз. части проростка, мм
контроль	20,60,05*	22,10,14*	21,70,38	18,60,04
Сu  0,01	23,00,40	28,80,37*	21,90,34	18,80,23
Сu 0,10	24,10,32	27,10,07	22,00,26	19,90,32*
Сu 1,00	26,90,12	28,80,21*	22,70,33	21,90,31
Сu 10,00	21,30,41	22,70.24*	23,50,36	21,80,19
Сu 100	21,00,14	22,40,32	23,60,41*	24,80,22
Сu 1000	21,90,25*	27,00,34	25,60,44*	29,80,18
СuО 0,01	20,20,21	23,00,19	21,20,38*	18,80,36
СuО 0,10	18,90,19	22,70,08	22,80,32	18,80,25*
СuО 1,00	23,30,22*	25,30,01*	20,00,18	18,60,26
СuО 10,00	22,30,27	25,50,24	21,90,24*	20,90,28
СuО 100	19,60,32	22,00,23*	22,40,30	20,00,18

Продолжение таблицы 2

СuО 1000

20,30,41

20,20,31

23,30,29

21,50,23

Примечание: *- Р ≤ 0,05

Под действием нанопорошков меди длина надземных и подземных частей вики и пшеницы возрастает в интервале концентраций 0,01 г/га - 1000 г/га. Для вики длина надземных частей максимально увеличивается на 31% (Cu 1,0 г/га) и для и подземных частей на 40% (Cu 1,0 г/га). Для пшеницы длина надземных и подземных частей остается выше контроля во всём интервале концентраций, достигая максимальных значений 60% при Cu 1000 г/га.

Нанопорошок оксида меди также способствует росту надземных и подземных частей пшеницы, но в случае вики при концентрациях CuO больше 10 г/га длина надземных и подземных частей незначительно уменьшаются.

Для установления зависимости активности нанопорошков от размера наночастиц изучалось действие нанопорошка меди размером 200 нм. Такие частицы в меньшей степени влияют на рост растений. Возможно, из-за больших размеров они проникают внутрь семян ограниченно и не взаимодействуют с органеллами клеток. Однако с увеличением их концентрации рост надземных частей пшеницы возрастает на 12 % по отношению к контролю, и подземных на 30 %. Для вики влияние проявляется в меньшей степени, но сохраняется закономерность - подземные части растут быстрее на 16%, чем надземные. По результатам эксперимента можно сделать вывод, что нанопорошки меди (размером 25-200 нм) и её оксида (размер частиц 25- 30нм) не угнетают рост растений. Линейный рост растений является важным показателем, косвенно характеризующим интенсивность деления или растяжения клеток. С этим показателем тесно коррелирует масса и объем органов растения. 

По результатам наших исследований нанопорошки меди размером 200 нм практически не влияют на массу ростков вики и пшеницы, хотя семена пшеницы в большей степени подвержены их воздействию. Нанопорошки меди размером 25-30 нм значительно увеличивают массу ростков вики и пшеницы, вес корней на 51%, вес надземной части на 15%. При действии нанопорошков оксида меди вес ростков хотя и возрастает при низких концентрациях для вики на 2%, для пшеницы на 11%, но это меньше, чем при действии нанопорошка меди. При более высоком содержании нанопорошков оксида меди в питательных средах вес надземных и подземных частей ростков растений уменьшается, оставаясь на уровне контроля и, следовательно, угнетения растений не происходит.

Воздействие наноматериалов на растительные объекты по биохимии-ческим показателям. Одним из важнейших критериев адаптивной устойчивости растения является его биохимический статус. Колебания концентрации важнейших антиоксидантных ферментов, а также фитогормонов, способны отразить негативный эффект, оказываемый факторами среды на гомеостаз растительного организма, т.е. отклонение показателей биохимического статуса  от нормы может служить сигналом о наличие токсического эффекта. В качестве одного из таких факторов могут рассматриваться наночастицы искусственного происхождения, способные попасть в среду обитания растений.

Влияние нанопорошков меди и оксида меди на активность ферментов.

В растительных образцах были определены ферменты пероксидаза и супероксид-дисмутаза. Активность пероксидазы коррелирует с развитием устойчивости растений к стрессам. Неблагоприятные факторы внешней среды отрицательно влияют на рост и развитие растений, что проявляется в значительных изменениях пероксидазы, активность, и спектр которой меняются под действием биологических и небиологических агентов. Результаты опыта показали, что активность пероксидазы различна в зависимос- ти от вида наночастиц: медь и оксид меди.

  Рис.1. Образцы пророщенной пшеницы

Различается активность пероксидазы и по месту нахождения: корни, ростки при одинаковой концентрации наночастиц. Однако, изменения активности пероксидазы на присутствие нанопорошка меди относительно контроля в общем не превышают отклонения более 30%. И только при высоких концентрациях нанопорошков меди отклонения составляют чуть более 30%. Однако для нанопорошков оксида меди при высоких концентрациях отклонения составляют более 30 - 45%, следовательно, данные концентрации 100 г/га и 1000г/га могут быть опасны.

Супероксиддисмутаза (СОД) относится к группе антиоксидантных ферментов. При действии неблагоприятных факторов увеличивается образование активных форм кислорода, в том числе и радикалов. Активность СОД при этом изменяется разнонаправлено; в одних случаях отмечено ее увеличение, в других снижение, что зависит от напряженности действия стрессового фактора (интенсивности и длительности воздействия), а также от восприимчивости организма, стадии развития растений и др.

Таблица 3

Активность пероксидазы (в ед.опт.пл / г сырой ткани Х сек) и супероксиддисмутазы (в усл.ед.акт. / г сырой ткани) корнях и ростках вики под воздействием нанопорошков

Вариант	ПЕРОКСИДАЗА				СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА
	Корни		Ростки		Корни		Ростки
	абс. знач.	%.	абс. знач.	%	абс. знач.	%	абс. знач.	%
Контроль	7,870,010		3,980,032*		47,310,016	-	109,060,034	-
Cu  0,01	8,080,015*	+2,6	4,410,062*	+10,8	48, 870,042*	+3,3	100,650,071*	-7,7
Cu  0,10	8,400,009*	+6,7	4,100,071*	+10,3	49,240,078*	+4,1	98,230,069*	-9,9

Продолжение таблицы 3

Cu  1,00	9,000,064	+14,4	4,300,012	+8,5	51,200,089*	+8,2	106,080,027*	-2,7
Cu 10,0	9,290,053	+18,0	3,850,03*	-3,2	52,130,056*	+10,2	108,290,100*	-0,7
Cu 100	7,380,088	-6,2	3,660,036*	-8,0	53,360,079*	+12,8	110,470,094*	+1,3
Cu 1000	6,040,031*	-23,2	3,420,023*	-14,0	58,820,048*	+24,3	122,230,078*	+12,1
CuO0.01	8,500,043*	+10,8	4,500,042	+13,1	46,400,037	-1,9	108,100,087	-0,9
CuO 0,10	9,100,074	+15,6	4,200,038	+10,6	49,600,076	+4,8	112.200,069*	+2,9
CuO1,00	10,00,012*	+27,0	4,800,051*	+20,6	53,360,087*	+12,8	118,500,083	+8,7
CuO 10,0	11,170,043	+41,9	4,140,043*	-4,0	62,670,029*	+32,5	122,920,079*	+12,7
CuO  100	9,950,051*	+26,4	3,070,029	-22,9	66,900,064	+41,4	141,040,058	+29,3
CuO 1000	7,450,081*	-5,3	2,990,034*	-24,9	84,510,086	+78,6	47,180,011	-56,7

Примечание: *- Р 0,05

Отклонения активности супероксиддисмутазы для нанопорошка меди разных размеров составляют менее 30% и он безопасен для роста и развития растений. Нанопорошок оксида меди вызывает отклонения активности супероксиддисмутазы более 30%, при концентрациях 100 г/га и 1000г/га. Поэтому необходимо строго контролировать содержание и накопление нанопорошка оксида меди в окружающей среде.

При обработке вики и пшеницы суспензией нанопорошка меди с размером частиц 200нм изменения активности ферментов практически не отличается от контроля.

Определение токсических эффектов наночастиц методами световой и аналитической электронной микроскопии по способности наночастиц накапливаться в высших растениях. На рис. 2 представлены фотографии контрольного образца сравнения и клеточной структуры пшеницы, пророщенной в среде с добавлением оксида меди.

 

  а б  в

Рис. 2. Клеточная структура: а- образца сравнения пшеницы, б-надземная часть, в - подземная часть. Увеличение: х1000

  В образцах пророщенных в среде с добавлением нанопорошка оксида меди 1000г/га наблюдаются его присутствие, как в клеточной структуре вершков, так и в клеточной структуре корешков.

Фотографии микроструктуры частиц меди в чистом виде не были обнаружены и с помощью лазерного анализатора. На рис. 3 изображены фотографии микроструктур тест-объектов с искусственно нанесенными наночастицами оксида меди и фотографии  корешков пшеницы, проращенных на питательной среде с оксидом меди.

а б в

Рис. 3. Фотографии: а - тест-объекта с искусственно нанесенными частицами CuO; б - подземных, в- надземных частей пророщенной пшеницы с видимыми включениями наночастиц оксида меди при концентрации 1000г/га на просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEMа1400

Все фотографии сделаны с ускоряющим напряжением 80 кВ, так как при большем напряжении происходит тепловое разрушение образцов. Изображения наночастиц в ростках пророщенной в питательной среде, содержащей наноматериалы, пшеницы в целом совпадает с изображениями аналогичных наночастиц, искусственно нанесенных на корешки пшеницы и, следовательно, нанопорошки оксида меди накапливаются и влияют на экологическую безопасность и развитие растений.

Влияние нанопорошков меди и оксида меди на активность фитогормонов. На разных этапах онтогенеза под влиянием различных условий внешней среды соотношение фитогормонов меняется, и именно это изменяет скорость и направление роста и морфогенеза растительных организмов. Нельзя также не учитывать, что одни гормоны могут оказывать влияние на ферменты, катализирующие синтез или разрушение других гормонов, и тем самым изменять их содержание.

Было изучено действие нанапорошков меди и оксида меди на активность фитогормонов цитокинина (ЦК), гиббереллина (ГК), абсцизовой кислоты (АБК) и индолилуксусных кислот (ИУК) вики и пшеницы, выращенных в песочном субстрате в течение месяца.

Изменения содержания гормонов в вике при обработке нанопорошком меди значительно отличаются от результатов обработки нанопорошком оксида меди (табл. 4).

Таблица 4

Содержание фитогормонов в опытных образцах вики

Вариант	ф и т о г о р м о н ы
	ИУК нг/г сыр.мас	% к контр	ЦК нг/г сыр.мас	% к контр.	ГК нг/г сыр.мас	% к контр.	АБК нг/г  сыр.мас	% к контр.

Продолжение таблицы 4

Контроль	7,690,47	_	589,153,60*	_	25,020.06*	_	72,350,57*	_
Cu - 0,10	8,920,58	15,99	600,624,55*	1,95	27,790,17*	11,07	65,690,73*	-9,21
CuЦ100,0	7,890,37	2,60	531,653,37*	-9,76	22,040,26*	-11,91	70,780,69*	-2,17
Cu0Ц0,10	8,560,83	11,31	433,005,38*	-26,50	26,120,47*	4,40	80,050,72*	10,64
Cu0-100,0	9,410,62	22,37	901,066,90*	35,97	38,320,09*	53,16	110,650,9*	52,94

Примечание: *- Р 0,05

При концентрации нанопорошка меди 1,00 г/га увеличивается содержание ЦК, ГК и ИУК. Количество АБК уменьшается 9,1 % . Для 100 г/га значения ЦК, ГК и АБК ниже контроля примерно на 10%, а ИУК выше на 2,6%.

Если учесть, что накопление АБК тормозит процессы роста индуцированные ИУК, цитокинином и гиббереллином и приводит к снижению фотосинтетического фосфорилирования и интенсивности фотосинтеза, то нанопорошки меди должны стимулировать развитие растения. Возрастание активности гиббереллина, который считают гормоном роста, усиливает вытягивание стебля, увеличивается и накопление углеводов, что было подтверждено в дальнейшем полевыми испытаниями. Нанопорошки меди во всём интервале изменения концентраций увеличивают содержание ИУК в меньшей степени при 100 г/га, а известно, что под влиянием ИУК возрастает сопряженность окисления, фосфорилирования (коэффициент Р/О) и содержание в клетках АТФ. Это дает основание считать, что ИУК увеличивает энергетическую эффективность дыхания растений. Если учесть, что даже небольшие сдвиги в энергетическом потенциале клетки приводят, к заметным изменениям в скорости различных ферментативных реакций то нанопорошки меди должны усиливать передвижения питательных веществ и воды, что является одной из причин усиления роста растений. Значительно более высокая концентрация нанопорошка меди 100 г/га незначительно в пределах 5-10% уменьшает эти показатели, следовательно, использовать такие концентрации нецелесообразно.

При контакте семян вики с нанопорошком оксида меди количество АБК значительно возрастает относительно контроля. При 1,00 г/га на 29,9%, а при 100 г/га на 52,9%. Остальные показатели при 100 г/га изменяют свои значения от 22 до 53%. Таким образом, применять оксид меди в концентрациях выше при 100 г/га опасно.

Результаты измерения активности фитогормонов для пшеницы яровой приведены на рис. 4.

Рис.4. Содержание фитогормонов в опытных образцах пшеницы яровой

Действие нанопорошков меди в концентрации 1 г/га, и 100 г/га вызывают повышение в сравнении с контролем уровня активности ИУК, цитокининов и гибберелловой кислоты, причем значения этих фитогормонов при разных концентрациях наночастиц меди отличаются незначительно. Уровень АБК при обеих концентрациях практически не превышает контроль. Увеличение концентрации нанопорошка меди в 100 раз, не вызывает снижения активности физиологических процессов развития пшеницы. 

При контакте семян пшеницы с нанопорошком оксида меди количество АБК значительно выше контроля при 100 г/га на 35,5%, а при 1,0 г/га на 10,1%. Содержание других фитогормонов при концентрации 100 г/га, как и в случае вики повышается от 22% до 53%. Следовательно, оксид меди при концентрации выше 100 г/га является токсичным, и за его концентрацией необходим контроль.

Действие нанопорошков на урожайность и качество зеленой массы и содержание биологически активных соединений в полевых опытах. Для определения влияния химического состава нанопорошков изучалось действие нанопорошков кобальта, меди и оксида меди при предпосевной обработке семян. Результаты полевых испытаний показали, что с увеличением концентрации наночастиц оксида меди от 10,0 г/га, для пшеницы и вики,  происходит  снижение, как энергии прорастания, так и всхожести проростков семян вики до 27% при 100 г/га. Результаты полевых испытаний подтвердили выводы лабораторных опытов, что концентрации нанопорошков оксида меди  выше 100 г/га могут быть токсичны для растений. Для нанопорошков меди установлено положительное влияние предпосевной обработки семян вики на полевую всхожесть, энергию прорастания и активизацию линейного роста и вики и пшеницы растений. Оптимальными были выбраны концентрации 0,05 г порошка на гектарную норму высева семян.

Определение динамики накопления зеленой массы вики (2009 - 2010 гг.) в фазу цветения выявило, что урожайность зеленой массы вики увеличилась при обработке нанопорошками 0,05 г/га кобальта и меди на 20,5% и 18,4% соответственно. Нанопорошки способствовали изменению химического состава растений в частности увеличению протеина на 40-47,9 % в зависимости от вида наноматериала. Максимальное содержание протеина было при обработке семян вики нанопорошками кобальта 0,03 - 0,05 г/га. Следовательно, химический состав имеет значение для использования наноматериалов в качестве микроудобрений.  Оксид меди не угнетает рост растений при концентрациях 0,05 г/га: в фазу цветения накопления зеленой массы увеличилась  на 10,1% , а количество протеина на 35%.

Увеличилось  содержание белка и в семенах вики. При условии, что добавка нанопорошков меди и кобальта улучшила внешние данные семян вики (размер, контуры, цвет и т.д), содержание белка по сравнению с контролем возросло на 38 - 41%  соответственно. Количество лектина при этом уменьшилось на 24% - 59%, что повысило кормовую ценность вики. Уменьшение лектиновой фракции улучшает кормовые свойства вики, т.к. лектины неблагоприятно действуют на рост животных, усвояемость питательных веществ, вызывая даже иногда токсическое действие. 

При  обработке нанопорошками меди и оксида меди  и кобальта возросло содержание полисахаридов в семенах вики по сравнению с контролем на 36% и 25% и 33% соответственно. Выделенные из семян вики водорастворимые полисахариды, имели величину удельного вращения +1200Е.+1290 и количество уроновых кислот до 40%, что позволяет отнести их к гликуроногликанам. В состав выделенных полисахаридов входят Д-галактуроновая кислота, галактоза, глюкоза, манноза, арабиноза и рамноза, ксилоза и их количество зависит от обработки нанопорошками. Если при обработке вики нанопорошком кобальта увеличилось содержания галактозы  на 20,7%, а рамнозы и арабинозы уменьшилось соответственно на 10,9% и 4,3%, то для меди  и оксида содержание рамнозы снизилось на 8%, арабинозы - на 6%, ксилозы - на 4%, при повышении содержания маннозы, глюкозы и галактозы.

При этом содержание в растениях тех микроэлементов, которые использовались для обработки семян, практически не изменилось. Так, абсолютное содержание меди в опыте и контроле не выходило за пределы 7,4 - 8,0 мг/кг (в контроле 7,9 мг/кг сухого вещества) при обработке нанопорошками меди и оксида меди в дозе 0,05 г, содержание кобальта оставалось в пределах 0.12 - 0.19 мг/кг сухого вещества.

Влияние зеленой массы растений, выращенных с использованием нанопорошков различного состава (кобальта, меди и оксида меди), на физиологическое состояние кроликов. При изучении влияния растений, семена которых перед посадкой были обработаны нанопорошками кобальта, меди и оксида меди 0,05 г (на 120 кг семян) были сформированы четыре группы по 8 особей в каждой, в возрасте 1,5 месяца породы Шиншила. Все животные были здоровы. Продолжительность эксперимента 90 дней. Взвешивание проводили 1 раз в 10 дней. Первая группа крольчих - контрольная - не получала добавок травы вики (20г на 1кг массы кролика), вторая группа крольчих получала добавку к основному рациону травы вики, выращенной с использованием нанопорошка  меди, третья - оксид меди и четвертая - кобальта. Прирост живой массы крольчих опытных групп заметно повысился, начиная с 24 дня эксперимента, к концу исследований прирост составил 18,3% во второй опытной группе, 9,3% в третьей и в четвертой 20,9% по сравнению с контролем. Это связано с улучшением качества корма, за счёт повышенного содержания белка в зеленой массе, а также увеличения содержания в семенах водорастворимых полисахаридов, которые являются энергетическим материалом и способствуют интенсивному росту. Значительное уменьшение количества лектинов повышает процент усвояемости белков, что также стимулирует прирост живой массы. Кобальт в большей степени повышает содержание биополимеров и, как следствие, трава вики  становится более питательной, поэтому кролики интенсивно набирали массу.

Опыт был продолжен  и при введении в рацион кроликов лапчатки гусиной, семена которой перед посадкой были обработаны нанопорошками меди. Причем, чтобы подтвердить действие нанопорошков,  дополнительно была введена еще одна опытная группа, в которой кроликов кормили лапчаткой без обработки нанопорошками.  Динамика роста животных доказала, что нанопорошки  способствует повышению жизнеспособности и продуктивности животных,  активизации их развития и роста.

Таким образом, нанопорошки металлов кобальта и меди обладают более высокой биологической активностью, повышая накопление питательных веществ в растениях. Введение таких растений в рацион животным улучшает динамику их роста и физиологическое состояние.

Определение показателей токсичности нанопорошков. Объектом исследований служили беспородные крысы-самцы массой тела 180-210 г. Были созданы  опытные группы по 10 животных и с учетом особенностей подобраны дозы для нанопорошков кобальта, меди и оксида меди  для однократного перорального введения. Для кобальта эти дозировки составили 10; 50; 100; 150; 200; 300; 400 мг/кг. Для меди 10; 50; 100; 200; 400; 450; 500. Для оксида меди 10; 20; 50; 80; 100; 250; 350. На основании результатов опыта были рассчитаны средне-смертельные дозы для каждого соединения: D50 кобальта 345+5 мг/кг, D50 меди 420 мг/кг, D50оксида меди 300 мг/кг.

В группах, получавших максимальную концентрацию изучаемого препарата, наблюдалось значительное увеличение уровня лейкоцитов в крови животных (до 30% выше контроля). Это связано с защитной реакцией организма крыс на введение препарата, показывает ответ иммунитета на вещества токсического действия. Также в процессе опыта значительно увеличилось содержание билирубина и его фракций (до 30%), что связано с поражением клеток печени от токсического действия максимальных доз изучаемого препарата. Увеличение содержания общего белка (до 24%) и продуктов белкового обмена (мочевая кислота, креатинин) свидетельствуют о возможном поражении выделительной системы, в частности почек. Вскрытие опытных животных подтвердило биохимические результаты опыта. При вскрытии погибших животных наблюдали полнокровие печени, асфиксическое сердце.

  Для определения оптимальных доз нанопорошков меди, оказывающих положительное действие на биологические объекты  было создано 10 опытных групп, в каждую из которых входило по 6 крыс массой 150,0-200,0г. Опыт продолжался 30 дней.  Каждые 10 дней опыта проводилось взвешивание. Первая группа (контроль) не получала добавки; вторая группа (опытная) - получала  нанопорошок меди 0,02 мг/кг; третья группаЦ0,04 мг/кг; четвертая -0,08 мг/кг; пятая - 0,16 мг/кг живого веса в сутки. Введение нанопорошков в рацион лабораторных крыс положительно отразилось на живой массе животных. Оптимальной  для нанопорошка меди является доза 0,04 мг/кг живого веса в сутки, позволившей повысить живую массу крыс  на 9,2% относительно контроля. Повышение дозы нанопорошка меди до 0,16 мг/кг не увеличивает прирост живой массы, и животные отличались меньшей активностью. Аналогичные исследования были проведены и для нанопрошка кобальта. Были проведены морфологические и биохимические показатели крови опытных животных, что позволило определить оптимальные дозировки  для нанопорошков - 0,04 мг/кг живого веса в сутки.

Кровь крыс, участвующих в эксперименте по определению оптимальных концентраций нанопорошков, по морфологическим показателям практически не различалась в  опытных и контрольной группах. Средние результаты содержания эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, цветового показателя и лейкоформула соответствовали норме. Исследованиями основных биохимических показателей также  не выявлено негативных последствий применения нанопорошков. Наблюдался положительный сдвиг  в динамике концентрации глюкозы, а уровень холестерина  и общего билирубина мочевины и креатинина уменьшался (табл.5)

Таблица 5

Биохимические показатели крови белых крыс при многократном (20 дней) применении суспензий нанопорошков

Показатели		Контроль	Дозы нанопорошков, 0,04 мг/кг
			СuО	Сu	Cо
Общий белок, г/л		50,74,31	60,61,47	63,71,92	65,62,16
Альбумины, г/л		33,21,39	39,20,41	42,51,53	40,31,91
Глобулины, г/л	-	5,090,20*	3,980,54	4,550,41	4,830,52
	-	12,30,70	14,21,24	13,70,49	13,10,59
	-	10,10,40	13,31,80	13,01,45	12,31,55
Мочевина, моль/л		4,710,24	4,220,40	4,210,25	4,240,30*
Глюкоза, моль/л		8,141,43	8,350,80*	8,321,00	8,401,15*
Холестерин, моль/л		1,920,21	1,720,09	1,840,20	1,890,02
АсАТ, Ед/л		47,94,24	54,98,15	58,923,8	59,110,8*
ААТ, Ед/л		26,92,77	35,21,20	38,02,79	37,17,85

Продолжение таблицы 5

Креатинин, мкмоль/л	60,75,00	47,84,36	51,97,19	52,33,95*
ЩФ, Ед/л	202,323,9	220,725,4	232,37,54	242,56,53*
Билирубин, мкмоль/л	4,420,36	4,190,73	3,320,16	3,830,57

Примечание: * - Р 0,05

Следовательно, состояние обмена веществ опытных животных при скармливании нанопорошков в концентрациях 0,04г/кг улучшается. Физическая активность опытных животных максимально увеличивается на 12-е сутки эксперимента.

ВЫВОДЫ

1. Присутствие нанопорошка меди размером 25-30 нм  в питательной среде при проращивании семян пшеницы и вики в интервале концентраций 0,01г- 1000г на гектарную норму высева способствовало достоверному повышению энергии прорастания и всхожести. Нанопорошки оксида увеличивают всхожесть при концентрациях меньше 10 г/га. При более высоком содержании оксида меди для вики  всхожесть составляет 88% (1000г/га) и энергия прорастания 81% (1000г/га), следовательно, нанопорошок оксида меди при высоких концентрациях угнетает всхожесть семян.

2. Активность ферментов пероксидазы и супероксиддисмутазы изменяется в присутствие нанопорошка меди и оксида меди, различается активность и по месту определения: корни, ростки  при одинаковой концентрации наночастиц.  Изменения активности ферментов на присутствие  нанопорошка меди в пшенице и вике  относительно контроля, не превышают отклонения более 30%. Для нанопорошков оксида меди при концентрациях 100 г/га и 1000г/га отклонения составляют более 40 - 45%, что указывает на опасность таких концентраций.

3. Изменение активности фитогормонов зависит от концентрации нанопорошков. При концентрации нанопорошка меди до 100 г/га в вике и пшенице увеличивается содержание цитокининов, гибберелловой кислоты и индолилуксусной кислоты. Количество абсцизовой кислоты уменьшается на 9,1%.

4. Методом световой микроскопии установлено, что нанопорошки оксида меди, извлекаемые семенами растений из питательной среды, агрегируются в тканях корешков проростков. Это может влиять на развитие растений.

5. От размеров частиц нанопорошков зависит их биологическая активность. Максимальный размер нанопорошка меди 200 нм не изменяет их морфофизиологические показатели и активность ферментов.

6. Биологическая активность нанопорошков зависит от концентрации в водном растворе. Оптимальная концентрация нанопорошков кобальта, меди и оксида меди 0,05 г на гектарную норму высева семян вики обеспечивает увеличение зеленой массы на 20,5, 18,4 и 10,1% соответственно.

7. При обработке семян вики нанопорошком кобальта и меди содержание белка увеличилось на 38-41%, а лектина уменьшалось на 24% - 59%. Возросло также содержание водорастворимых полисахаридов, что повышало кормовую ценность вики. При одинаковом качественном состав выделенных полисахаридов изменялось количественное соотношение моносахаридов в пределах 25%.

8. Добавка в рацион кроликов растительной массы вики, семена которой обрабатывали нанопорошками кобальта, меди и оксида меди в концентрации 0,05 г на гектарную норму высева, повышало прирост живой массы в среднем на 18%, 21% и 9% соответственно по сравнению с контролем.

9. Включение нанопорошков кобальта, меди и оксида в рацион крыс ежедневно в течение 30 дней в дозе 0,04мг/кг не повлияло на содержание эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, цветового показателя и изменение лейкоцитарной формулы, но происходил положительный сдвиг  в динамике концентрации глюкозы при уменьшении уровня холестерина  и общего билирубина, что свидетельствует об улучшении обменных процессов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. По итогам исследования за порог токсичности порошкообразных на-номатериалов целесообразно принять 30%-ое изменение активности основных ферментов  и гормонов растений.

2. Доза нанопорошка оксида меди превышающая 10 г/га угнетает рост и развитие растений.

3. Для повышения использования продуктивного потенциала кормов целесообразно включать в рационы животным растения, выращенные с применением нанопорошков кобальта и меди, что способствует приросту живой массы до 18 -20%, сохранности и воспроизводству потомства.

4. Эффективно также опрыскивание кормов суспензией нанопорошков меди и кобальта, размером частиц 25-30 нм.

Публикации в рецензируемых научных журналах,

рекомендованных ВАК:

1. Иванычева Ю.Н., Назарова А.А., Чурилов Г.И., Жеглова Т.В., Полищук С.Д., Фолманис Г.Э., Коваленко Л.В. Действие на кроликов железа и меди в ультрадисперсной форме при их введении в организм животных с кормом //Кролиководство и звероводство.- 2008.- № 6.- С. 8-10.
2. Иванычева Ю.Н., Чурилов Г.И., Амплеева Л.Е., Назарова А.А., Жеглова Т.В., Полищук С.Д. Введение в рацион кроликов вики, выращенной с использованием ультрадисперсных порошков кобальта // Кролико-водство и звероводство.- 2009.- № 1.- С. 16-17.
3. Иванычева Ю.Н., Полищук С.Д., Чурилов Г.И. Влияние ультра-дисперсного порошка кобальта на биологическую активность полисахаридов  Poligonum  aviculare (горца птичьего) // Рос. Медико-биологический вестник.- 2009.-№1.- С.26-32.

Статьи в других изданиях

4. Иванычева Ю.Н., Чурилов Г.И., Амплеева Л.Е., Сушилина М.М., Жеглова Т.В. Действие ультрадисперсных железа и кобальта на накопление белка в бобовых культурах // Экологическое состояние природной среды и научно-практические аспекты современных мелиоративных технологий: сб. науч. тр.- Рязань, 2008.- Вып. 3.- С.306-309.
5. Иванычева Ю.Н., Чурилов Г.И., Полищук С.Д., Назарова А.А.,  Жеглова Т.В. Физиологическое действие ультрадисперсной меди при скармливании кроликам и обработке семян растений // Вестник РГАТУ.- 2009.- №2.- С.30-33.
6. Иванычева Ю.Н., Чурилов Г.И., Еськов Е.К., Назарова А.А. Экологическая безопасность горца птичьего при обработке семян растения нанопорошками меди //Разработка, исследование и маркетинг нвой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009.- Вып.64.- С. 809-810.
7. Иванычева Ю.Н.,  Жеглова Т.В., Полищук С.Д. Влияние нанопо-рошков меди и оксида меди на активность фитогормонов в проростках вики и яровой пшеницы //Вестник РГАТУ. - 2012. - №1(13).- С. 12-14.
8. Иванычева Ю.Н. Определение токсичности нанопорошков кобальта меди и оксида меди //Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. Молодых ученых, аспирантов и студентов. - Пермь.-2012.- C.52-58.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии