Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Тикунова Нина Викторовна
ДИЗАЙН РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
03.00.03 - молекулярная биология 03.00.06 - вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Кольцово - 2007
Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.
Научный консультант д.б.н., профессор Ильичёв Александр Алексеевич Официальные оппоненты член-корреспондент РАН, д.х.н., профессор Габибов Александр Габибович д.б.н., профессор Гуляева Людмила Федоровна д.м.н., профессор Игнатьев Георгий Михайлович Ведущая организация Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
Защита состоится л 09 ноября 2007 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии Вектор по адресу: ФГУН ГН - ВБ Вектор Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел.(383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГН - ВБ Вектор.
Автореферат разослан л ____ августа 2007 года.
Ученый секретарь диссертационного совета Э.Г. Малыгин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Антитела относительно давно стали применять в терапии ряда заболеваний, в том числе и вирусных инфекций, благодаря исключительным свойствам этих природных биомолекул - высокой специфичности, наличию эффекторных функций, способности проникать в ткани и выводиться из организма с помощью естественных механизмов. Однако, применение поликлональных антител, выделенных из донорской крови, имеет ряд недостатков (Maynard and Georgiou, 2000), наиболее серьезным из которых является биологический риск, связанный с возможностью инфицирования неидентифицированными патогенами. Кроме того, сырьевая база для получения специфических поликлональных антител всегда ограничена, и стандартизовать эти препараты очень трудно из-за различающихся от партии к партии соотношений белок/специфические антитела. Серьезной проблемой является и то, что не все антигены можно использовать для иммунизации добровольцев, например, получить человеческие сыворотки против высокопатогенных инфекционных агентов или токсических агентов практически невозможно. Использование в терапии моноклональных антител (МКА) также имеет серьезные ограничения. Большинство имеющихся МКА производятся гибридомными клетками животных, и введение их в организм человека вызывает развитие нежелательной иммунной реакции, особенно при повторном введении. Кроме того, эффекторные функции МКА животных недостаточно активируются в организме человека, у них слишком короткий период полувыведения из организма. Получение высокоаффинных МКА человека, стабильно продуцируемых гибридомными клетками, к настоящему времени затруднено из-за отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы (Karpas et al., 2001;
Traggiai et al., 2004). Cпектр антител, получаемых с помощью гибридомных клеток человека, ограничен: так, получить антитела против патогенных и токсичных агентов, а также против собственных белков человека не представляется возможным (Laffly and Sodoyer, 2005). Наконец, не стоит забывать, что гибридомные клетки трансформированы, и, вследствие этого, препараты на их основе потенциально опасны как онкогены.
Новые перспективы в этой области открывают ДНК-технологии. Одним из направлений в получении МКА человека является создание трансгенных животных, у которых собственные гены, кодирующие иммуноглобулины, заменены на человеческие (Kellermann and Green, 2002; Laffly and Sodoyer, 2005). Однако, не все желаемые антитела можно получать таким образом из-за токсичности ряда антигенов для организма животного.
Еще одно активно развивающееся направление в разработке рекомбинантных антител основано на направленном дизайне генов, кодирующих иммуноглобулины, методами генетической инженерии. Так, к настоящему времени разработаны и используются в медицинской практике так называемые химерные антитела, состоящие из вариабельных доменов мышиных антител, обладающих целевыми свойствами, и константных доменов иммуноглобулинов человека. Создаются также и гуманизированные антитела, в которых только гипервариабельные участки человеческих антител заменены на мышиные.
Вместе с тем очевидно, что полностью человеческие рекомбинантные антитела (fully human antibodies) являются наиболее предпочтительными. Для их создания объединяют вариабельные домены антител человека, обладающих целевой активностью, с константными доменами иммуноглобулинов человека нужного изотипа. Такие антитела синтезируют в эукариотических клетках, обеспечивающих правильную конформацию и гликозилирование молекул иммуноглобулинов.
Ключевой стадией в создании полноразмерных антител человека является получение вариабельных доменов, отвечающих за специфичность антитела, его аффинность и биологические свойства. Одним из способов их получения является отбор вариабельных доменов из комбинаторных фаговых библиотек мини-антител.
Каждый бактериофаг в такой библиотеке экспонирует на своей поверхности только одно антитело уникальной специфичности (фаговое антитело). Репертуар антител в таких библиотеках может достигать 1012 различных мини-антител. В ходе процедуры аффинной селекции (biopanning) можно существенно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать мини-антитела с нужными свойствами. Для получения рекомбинантных антител с заданными свойствами в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и Fab-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli.
Сами мини-антитела находят применение в терапии некоторых заболеваний.
Обладая меньшими размерами, они легче проникают в ткани, преодолевают гематоэнцефалический барьер, вызывают меньший неспецифический иммунный ответ (Ewert et al., 2003). На их основе конструируют полифункциональные миниантитела, иммунотоксины, средства адресной доставки лекарственных средств в организме больного.
В настоящее время мини-антитела и рекомбинантные полноразмерные антитела применяют в фундаментальных исследованиях, в биотехнологии, в терапии различных заболеваний, включая вирусные. Разработка противовирусных рекомбинантных антител ведется очень широко, однако лишь ограниченное количество работ, посвящено получению рекомбинантных антител, направленных к особо опасным для человека вирусным патогенам.
В число основных направлений деятельности ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор входят фундаментальные исследования вирусов, включая особо опасные, и разработка средств лечения заболеваний, вызываемых вирусными инфекциями. Именно поэтому целью настоящей работы являлась разработка и оптимизация методов получения рекомбинантных антител, направленных к вирусным патогенам и, прежде всего, особо опасным вирусам, патогенным для человека.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
- создать экспрессионную систему, обеспечивающую высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках E.coli, и на примере одноцепочечных антител, направленных к вирусу клещевого энцефалита, исследовать особенности экспрессии целевых генов с использованием созданной конструкции, изучить иммунохимические свойства продуцируемых антител;
- отобрать из имеющейся синтетической фаговой библиотеки одноцепочечные антитела человека, направленные к вирусу Эбола и ортопоксвирусам, включая жизнеспособный вирус натуральной оспы (штаммы variola major и variola minor alastrim); исследовать иммунохимические и биологические свойства отобранных антител;
- сконструировать натуральную наивную библиотеку одноцепочечных антител человека и охарактеризовать ее, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела к различным антигенам, включая вирусные;
- сконструировать натуральную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе генетического материала периферических лимфоцитов доноров, вакцинированных вирусом осповакцины, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела человека, направленные к различным ортопоксвирусам, исследовать их иммунохимические свойства;
- выявить одноцепочечные антитела человека, способные ингибировать инфекционность ортопоксвирусов, определить белки-мишени для этих антител;
- на основе одноцепочечных антител человека, направленных к вирусу Эбола и к ортопоксвирусам, сконструировать полноразмерные антитела человека и исследовать их иммунохимические свойства.
Научная новизна результатов исследования.
Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека из периферических лимфоцитов доноров, иммунизированных вирусом осповакцины.
Впервые из сконструированной иммунной библиотеки и из имеющейся синтетической библиотеки отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к жизнеспособным ортопоксвирусам - вирусу натуральной оспы, штаммы variola major и variola minor alastrim, вирусам осповакцины, оспы коров, эктромелии, а также к рекомбинантному белку prA30L вируса натуральной оспы.
Впервые обнаружены рекомбинантные антитела человека, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы.
Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные нейтрализовать инфекционность вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии.
Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела человека sb9, s1F4, s1I6, и s2I19, подтверждена их способность связывать ортопоксвирусы.
Впервые из имеющейся синтетической и сконструированной нами наивной библиотеки одноцепочечных антител отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к белкам вируса Эбола; созданы штаммы Escherichia coli HB2151/pHEN-4D1 и Escherichia coli HB2151/pHEN-2E3, продуцирующие антитела s4D1 и s2E3 в растворимой форме.
Сконструированы полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам и к вирусу Эбола. Показано, что полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам, обладают вируснейтрализующей активностью.
Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli.
Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного вируснейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (НВs), содержащего два остатка цистеина, что обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью МКА, направленных к основной антигенной детерминанте НВs-антигена.
На основе сконструированных векторов созданы штаммы E.coli, продуцирующие мономерные и димерные одноцепочечные антитела к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита с уровнем продукции около 20% суммарного клеточного белка.
Практическая значимость работы.
В результате работы созданы оригинальные генетические конструкции, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных мономерных и димерных антител в клетках E.coli. Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано для масштабирования наработки одноцепочечных антител к различным антигенам.
Сконструирована и охарактеризована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами к ортопоксвирусам.
Данная библиотека является источником вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, направленных к ортопоксвирусам, и предназначена для поиска специфических антител и создания на их основе терапевтических препаратов для лечения ортопоксвирусных инфекций и профилактики поствакцинальных осложнений, а также для разработки диагностических тест-систем.
Сконструирована и охарактеризована наивная библиотека одноцепочечных антител человека, которая является источником вариабельных доменов антител человека к широкому спектру антигенов.
Получено одноцепочечное антитело человека к фактору некроза опухоли, обладающее константой аффинности около 4108М-1. Это дает основание рассматривать данное антитело перспективным для терапии вирусных геморрагических лихорадок и ряда аутоиммунных заболеваний.
Сконструированы полноразмерные антитела человека к ортопоксвирусам, обладающие вируснейтрализующей активностью. Эти антитела являются перспективными для разработки на их основе препаратов нового поколения для профилактики и терапии поствакцинальных осложнений.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: VI Всероссийская конференция Новые направления биотехнологии, 1994, Пущино; Bayev memorial conference, 1996, Москва; Международная конференция Tick-borne viral, rickettsial and bacterial infections, 1996, Иркутск; Международный симпозиум "Protein Structure, Stability, and Folding. Fundamental and Medical Aspects", 1998, Москва; Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 1998, 2002, 2006, Новосибирск; школы-конференции л5th, 6th, 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, 2000, 2002, 2005, Пущино, Россия;
Human Antibodies and Hybridomas 2001, Prague, Czech Republic, 2002, Berne, Switzerland; XII International Congress of Virology, 2002, Paris, France; Международный семинар УBasic Science in ISTC ActivitiesФ, 2001, Новосибирск, Россия;
Международная научно-практическая школа-конференция УЦитокины. Воспаление.
Иммунитет.Ф 2002, Санкт-Петербург, Россия; 15th, 16th, 17th, 18th International Symposium of Antiviral Research, 2002, Prague, Czech Republic, 2003, Savannah, USA, 2004, Tucson, USA, 2005, Barcelona, Spain; VII International Potsdam Symposium on Tick-Borne Diseases, 2003, Berlin, Germany; Международный междисциплинарный симпозиум От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине, 2005, Судак, Украина; Международная конференция Физикохимическая биология 2006, Новосибирск; International conference УBasic Science for Biotechnology and MedicineФ 2006, Novosibirsk, Russia; VII Межгосударственная научно-практическая конференция. 2006, Оболенск, Россия. Кроме того, результы докладывались на ежегодных встречах Наблюдательного Комитета ВОЗ по контролю за исследованиями вируса натуральной оспы в 2004, 2005 и 2006 годах.
Материалы диссертации изложены в 15 статьях в научных журналах. Часть результатов защищена патентами РФ (6 патентов ) Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из семи разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список литературы. Работа изложена на 2страницах машинописного текста и включает 90 рисунков, 14 таблиц и список литературы, содержащий 338 ссылок.
Работа выполнялась во ФГУН ГН - ВБ Вектор Роспотребнадзора с 1994 по 2006 гг. в рамках научных тем организации, по гранту РФФИ (04-360)-а, по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: Защита от патогенов, контракты 43.035.11.1527 и 43.035.11.1529, по гранту Международного научно-технического центра ISTC#1638p Комбинаторные библиотеки против ортопоксвирусов.
На разных этапах выполнения в работе приняли участие Г.Н. Николенко, Т.А.
Батанова, В.В. Морозова, В.В. Дубровская, Т.Э. Юн, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ; а также И.В. Матяш, Е.В.
Жираковская, Е.И. Бовшик, Е.В. Протопопова, В.Б. Локтев, Е.Ф. Беланов, Н.И.
Бормотов, З.Ф. Киселева, Л.И. Карпенко, Г.В. Кочнева, Е.И. Рябчикова, И.П. Гилева, А.В. Качко, Н.Т. Денисова и другие сотрудники ФГУН ГН - ВБ "Вектор" - автор приносит им искреннюю благодарность.
Особую признательность автор выражает д.б.н. профессору А.А. Ильичеву, который был инициатором исследований, основанных на методологии фагового дисплея, в дальнейшем уделял много внимания развитию этой работы и сыграл важную роль в представлении ее результатов; а также к.х.н. Л.Н. Шингаровой, обеспечившей помощь при конструировании полноразмерных антител, и к.х.н. А.Г.
аману, к.х.н. Ф.А. Бровко, без помощи которых конструирование натуральных библиотек затянулось бы на годы.
Автор также хотел бы выразить признательность академику РАН профессору Л.С. Сандахчиеву, а также А.А. Гуськову и Е.В. Сокуновой, без чьей поддержки и помощи он не смог бы осуществить исследования, связанные с вирусом натуральной оспы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Часть первая Конструирование одноцепочечных антител, направленных к вирусу клещевого энцефалита, и исследование их свойств посвящена разработке оригинальных экспрессионных векторов, обеспечивающих высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli.
Развитие линженерии антител способствовало появлению нового поколения иммунологических препаратов - рекомбинантных антител человека. При создании терапевтических антител методами генетической инженерии одной из ключевых стадий является выбор антиген-связывающих доменов антител, обладающих целевыми свойствами. Для исследования иммунологических и биологических свойств таких антигенсвязывающих доменов их объединяют в искусственную молекулу мини-антитела. Мини-антитела необходимы не только как промежуточный этап при конструировании полноразмерных антител, но и сами по себе они представляют ценность, поскольку из-за своих небольших размеров легче проникают в ткани и вызывают значительно меньший неспецифический иммунный ответ. Кроме того, на их основе возможно конструирование иммунотоксинов. Все это говорит о высоком потенциале мини-антител для разработки на их основе препаратов для практической медицины.
Одним из вариантов мини-антител являются одноцепочечные антитела (scFv).
Молекула scFv представляет собой легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина, объединенные между собой гибким пептидным линкером. Это обеспечивает стабильность молекулы независимо от концентраций и слабых нековалентных взаимодействий отдельных Vh- и Vl-доменов. Одна из задач нашей работы заключалась в создании векторов для эффективной экспрессии генов одноцепочечных антител, поскольку высокий уровень продукции существенно облегчает очистку scFv для последующего изучения их свойств.
Такой вектор создавали на основе одноцепочечных антител, направленных к вирусу клещевого энцефалита (КЭ). Для разработки вектора на первом этапе был сконструирован базовый ген одноцепочечного антитела на основе Vh- и Vl-генов, кодирующих вариабельные домены МКА мыши к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита. МКА Е6В, любезно предоставленное профессором В.Б. Локтевым, ГН - ВБ УВекторФ, распознает группоспецифический эпитоп вирусов комплекса КЭ (Гайдамович с соавт., 1990), способно блокировать гемагглютинирующую активность вируса КЭ, нейтрализует инфекционность штамма 205 вируса КЭ (Протопопова с соавт., 1996). МКА Е6В взаимодействует с доменом Е2 гликопротеина Е по классификации Цехановской с соавторами (Tsehanovskaya et al., 1993), играющим основную роль в формировании вируснейтрализующих и протективных антител. К МКА Е6В были получены поликлональные и моноклональные антиидиотипические антитела. Все это и определило использование МКА Е6В в качестве прототипа для конструирования одноцепочечных антител к вирусу КЭ.
Vh- и Vl-гены, кодирующие вариабельные домены этого антитела, объединили в единую ДНК-последовательность с помощью фрагмента ДНК, кодирующего линкерный пептид (Gly4Ser)3. На основе полученного scFv-гена с использованием промотора РНК-полимеразы фага Т7 и оригинальной последовательности ДНК, кодирующей лидерный пептид пектатлиазы В (pelB) Erwinia carotovora, была сконструирована плазмидная ДНК pTLS (рис. 1). Фрагмент ДНК, кодирующий лидер pelВ, был любезно предоставлен профессором С.М. Деевым, Институт Молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва.
Для экспрессии сконструированного гена использовали штамм E.coli BL21(DE3), содержащий в составе бактериальной хромосомы копию гена РНКполимеразы фага Т7 под индуцибельным lacUV5 промотором. При добавлении в культуральную среду индуктора lac-оперона ИПТГ в этих штаммах синтезируется РНК-полимераза фага Т7, обеспечивающая высоко эффективную транскрипцию со специфического промотора. При трансформации клеток E.coli BL21(DE3) плазмидой pTLS в лизатах индуцированных клеток был обнаружен дополнительный белок с молекулярной массой около 26 кДа, соответствующей расчетной молекулярной массе процессированной, т.е. без лидерного пептида, формы одноцепочечных антител (рис. 2). Практически весь белок находился в растворимой SacI BglII BglII XhoI BstEII XhoI BstEII SacI T7 6xHis TVh Vl pelВ pelВ Vh Vl Hbs р7SHS pTLS ColE1 Apr ColE1 Apr Рис. 1. Схемы структурной организации плазмид pTLS и p7SHS. Обозначены промотор фага Т7, лидер pelB, гены, кодирующие Vh- и Vl-домены МКА Е6В, ген устойчивости к ампициллину, ori репликации. Стрелками указаны некоторые сайты рестрикции.
форме. В контрольном лизате индуцированных клеток, содержащих исходную векторную плазмиду pGEM1, этот белок отсутствовал.
Для специфичного и прочного связывания антитела с антигеном необходимо формирование правильной третичной структуры молекулы, обеспечивающей сближение гипервариабельных районов и формирование антигенсвязывающего сайта.
Сохранение конформации антигенсвязывающего домена сконструированных одноцепочечных антител было подтверждено в экспериментах по их связыванию с поликлональными антиидиотипическими антителами (АИА), которые эффективно распознавали как идиотип исходных МКА Е6В, так и сконструированные одноцепочечные антитела (рис. 3А). Кроме того, специфичность полученных одноцепочечных антител была продемонстрирована методом ИФА и Вестерн-блот анализа. В качестве антигена в этих экспериментах использовался рекомбинантный 1 2 3 4 5 М кДа Рис. 2. Электрофореграмма в 12% ПААГ с SDS субклеточных фракций клеток E.coli BL21(DE3)/pTLS. Окраска Кумасси R-250.
Дорожки: 1 - растворимые цитоплазматические белки (из 30 мкл клеточной культуры), 2 - фракция нерастворимых белков (из 1 мл клеточной культуры), 3 - белки культуральной жидкости, осажденные 65% сульфатом аммония (из 1 мл культуральной жидкости), 4 ратворимые периплазматические белки (из мкл культуры), 5 - суммарный клеточный лизат (из 50 мкл культуры). М - маркер молекулярных масс.
А Б 3.0BL21(DE3)/pTLS 2.500 BL21(DE3)pGEM 2.01.51.00.500 1\10 1\20 1\40 1\80 1\10.0Разведения клеточных лизатов 1\100 1\300 1\900 1\2700 1\8100 1\24300 1\729разведения Рис. 3. Связывание одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов E.coli BL21(DE3)/pTLS с АИА (А) и конкурентное связывание одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов и МКА Е6В с рекомбинантным белком Е вируса КЭ (Б). А: выявление образцов клеточных лизатов АИА сывороткой (1,2) и нормальной кроличьей сывороткой (3,4). 1,3 - разведения клеточного лизата BL21(DE3)/pTLS, 2,4 - разведения клеточного лизата BL21(DE3)/pGEM1. Использовали разведение сывороток 1/200. Б: разведение 1\соответствует 10 мкл клеточной культуры.
белок Е (Нетесова и др., 1999) вируса КЭ, любезно предоставленный Н.А. Нетесовой, ГН - ВБ УВекторФ. Рекомбинантный белок Е содержит домены Е1 и Е2 (1-416 а.к.) гликопротеина Е вируса КЭ, согласно классификации Цехановской, и эффективно связывается исходным МКА Е6В. Способность сконструированных одноцепочечных антител связывать рекомбинантный белок Е в иммуноблоте и ИФА подтвердила сохранение специфичности исходных МКА у сконструированных антител.
Дополнительно для подтверждения идентичности эпитопа белка Е, распознаваемого исходными МКА Е6В и сконструированными одноцепочечными антителами, показали наличие конкуренции между этими антителами за общий сайт связывания. Ингибирование связывания МКА Е6В с антигеном достигало 80%, что подтвердило специфичность связывания рекомбинантных антител с белком Е и продемонстрировало наличие конкуренции между ними за общий сайт связывания (рис. 3Б). Это указывает на идентичность эпитопа белка Е, распознаваемого как МКА Е6В, так и рекомбинантными антителами.
Оригинальной особенностью данной работы было введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного нейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs-эпитопа), против которого в ГН - ВБ Вектор были получены МКА 10F1. Этот эпитоп, содержащий 9 а.о., фланкирован остатками цистеина. Участие этих остатков, находящихся на разных молекулах scFv, в образовании S-S связей должно приводить к формированию димерных молекул одноцепочечных антител. Получение одноцепочечных антител в димерной форме важно в связи с тем, что такие молекулы, как и молекулы IgG, обладают двумя антигенсвязывающими сайтами. Это должно приводить к повышению константы связывания с антигеном и может способствовать проявлению вируснейтрализующих свойств, в зависимости от механизма, по которому осуществляется нейтрализация.
Важным свойством сконструированных одноцепочечных антител, содержащих на С-конце молекулы HBs-эпитоп, была возможность детекции таких антител при помощи специфических анти-HBs МКА 10F1.
Процент ингибирования Оптическая плотность,492 нм Из ДНК плазмиды pKHBс-33 (Карпенко с соавт., 2000), любезно предоставленной Л.И. Карпенко, ГН - ВБ УВекторФ, был выделен Sau3A/XhoI(pol) фрагмент размером 31 п.о., содержащий эпитоп 139-147 HBs-антигена. В плазмиду pGEM7zf(+), гидролизованную рестриктазами EcoRI и SmaI, был встроен полученный фрагмент и EcoRI/BglII фрагмент из плазмиды pTLS, содержащий ген одноцепочечного антитела. С помощью рестрикционного анализа были отобраны клоны, содержащие необходимые вставки. Таким образом была получена плазмида p7SHS (рис. 1), которая должна была обеспечивать экспрессию одноцепочечных антител с С-концевыми цистеинами.
Клетки E.coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой p7SHS, индуцировали ИПТГ в среднелогарифмической стадии роста и культивировали в течение ночи.
изаты клеток готовили двумя способами - при температуре 37С и 95С. При электрофоретическом анализе в лизатах, приготовленных при 37С, было выявлено наличие дополнительных белков с молекулярной массой около 26 кДа и 50 кДа (рис.
4А). В клеточных лизатах, обработанных при 95С, димерная форма антител отсутствовала, при этом доля мономерной формы увеличивалась.
Вестерн-блот анализ клеточных лизатов, приготовленных при различных температурах, с АИА сывороткой против МКА Е6В и с МКА 10F1, специфически взаимодействующим с HBs-эпитопом, показал, что и АИА сыворотка, и МКА 10F1, выявляли белки 26 и 50 кДа (рис. 4Б-В). Эти данные подтверждают то, что белки с молекулярной массой 26 и 50 кДа действительно представляют собой мономерную и димерную формы одноцепочечных антител. Взаимодействие в иммуноблоттинге МКА 10F1 с белком 50 кДа указывает на то, что, несмотря на образование межмолекулярной связи по цистеиновым остаткам, HBs-эпитоп узнается соответствующим МКА. Исследование субклеточной локализации димерных одноцепочечных антител показало, что практически все они находится в растворимой форме.
М 1 2 3 1 2 3 1 2 М 1 2 3 1 2 3 1 2 2211АБ В АБ В Рис. 4. Электорфореграмма лизатов клеток E.coli BL21(DE3)/pGEM7zf(+) (1) и E.coli BL21(DE3)/p7SHS, лизированных при 95С (2) и при 37С (3). А - окраска кумасси R-250; Б - иммуноблоттинг с АИА, В - иммуноблоттинг с МКА 10F1. M-маркер молекулярных масс.
Для обеспечения эффективной очистки одноцепочечных антител в 3Т-конец гена, кодирующего одноцепочечное антитело в составе плазмид pTLS и p7SHS, был встроен фрагмент ДНК, кодирующий 6 а.о. гистидина. Полученными плазмидами pTLSHis и p7SHSHis трансформировали клетки E.coli BL21(DE3) для наработки в них одноцепочечных антител и последующей очистки (рис. 5). Мономерные и димерные одноцепочечные антитела были получены после такой очистки в концентрации мг/мл. Выход одноцепочечных антител составлял около 40 мг на литр культуры.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2 3 4 АБ АБ Рис. 5. Электрофореграмма фракций, полученных при хроматографии на Ni-NTA-агарозе лизатов, содержащих димерные (А) и мономерные (Б) одноцепочечные антитела. Окраска Кумасси R-250. 1 - осветленный клеточный лизат до нанесения на колонку, 2 - несвязавшиеся белки, 3 - промывка, 4 - элюат, 5 - маркер молекулярных масс.
Иммунохимические характеристики очищенных мономерных и димерных одноцепочечных антител свидетельствовали о том, что они близки к исходным МКА по эффективности связывания, и по специфичности. Сконструированные одноцепочечные антитела были способны выявлять в ИФА и иммуноблоте как рекомбинантный белок Е вируса КЭ, так и сам вирус КЭ (рис. 6-7А). Кроме того, была продемонстрирована конкуренция рекомбинантных и исходных МКА за общий сайт связывания на рекомбинантном белке Е, и на поверхностном гликопротеине Е в составе вируса КЭ (рис. 7Б).
Для сравнения аффинности мономерных, димерных антител и исходных МКА Е6В было проведено измерение констант диссоциации этих антител. Использовали метод определения константы диссоциации комплекса антиген-антитело в конкурентном ИФА, описанный в работах (Friguet et al., 1985; Stevens, 1987). В качестве антигена использовали очищенный рекомбинантный белок Е. Для каждого варианта антител строили график зависимости обратного значения относительного изменения оптической плотности раствора при добавлении к антителу различных концентраций антигена от обратного значения концентрации добавленного антигена (рис. 8).
кДа кДа 1 2 3 4 1 2 3 А Б Рис. 6. Вестерн-блот анализ рекомбинантного белка Е (А) и вируса КЭ (Б) с помощью мономерных (1) и димерных (2) одноцепочечных антител, МКА Е6В (3) и нормальной мышиной сыворотки. Указаны размеры маркеров молекулярных масс.
А Б 4 0,3,0,0,2,1 0,0,1,0,0,0,0,1\200 1\400 1\800 1\1600 1\3200 1\6400 1\1281\100 1\200 1\400 1\800 1\1600 1\32Разведения антигена Разведения мини-антител Рис. 7. А: Связывание мономерных, димерных одноцепочечных антител и МКА Е6В с рекомбинантным белком Е вируса КЭ, сорбированным на пластик в разведениях, начальная концентрация - 2 мг\мл. 1 - мономеры одноцепочечных антител, 2.5х10-9М; 2 - димеры одноцепочечных антител, 5х10-9М; 3 - МКА Е6В, 7.5х10-10М; 4 - нормальная мышиная сыворотка в разведении 1\1000. Б: Конкурентное связывание рекомбинантных одноцепочечных антител и МКА Е6В с вирусом КЭ. 1 - разведения димерных одноцепочечных антител, 2 - разведения мономерных одноцепочечных антител, 3 - отрицательный контроль. Исходная концентрация одноцепочечных антител - 2.5 мг\мл, концентрация МКА Е6В - 0.5 мкг\мл.
Значение констант диссоциации вычисляли по формуле A-Ai/А=1+KD/a0, где А - значение оптической плотности в лунке без добавления антигена, Ai - значение оптической плотности, получаемое при добавлении к постоянной концентрации антител концентрации антигена а0, КD- константа диссоциации. Для бивалентных OD, 492 нм OD, 492 nm Рис. 8. График зависимости оптической плотности образцов (А 492 нм) от концентрации конкурирующего антитела. Кривые построены программой MicroMathScientist, версия 3.2 в соответствии с уравнением, описывающим процесс. 1 и 2 - мономерные и димерные одноцепочечные антитела, 3 - МКА Е6В.
молекул вводили поправку для KD=а0 (1-f)/f, где f=A-Ai/А (Stevens, 1987).
Полученные таким образом значения констант диссоциации составили:
- для мономерного одноцепочечного антитела - (9,2 0,2) 10-8 М1;
- для димерного одноцепочечного антитела - (3,2 0,3) 10-8 М1;
- для МКА Е6В - (1,8 0,2) 10-8 М1.
Полученные значения констант диссоциации показали, что по сравнению с исходными МКА аффинность мономерных одноцепочечных антител была примерно в 5 раза ниже, в то время как ковалентные димеры уступали в аффинности исходным МКА лишь в 2 раза.
Таким образом, нами была создана оригинальная генетическая конструкция, обеспечивающая высокий уровень продукции в клетках E.coli одноцепочечных мономерных и димерных антител в растворимой форме. Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано при масштабировании наработки одноцепочечных антител. Интересной особенностью этой конструкции является наличие на 3Т-конце гена, кодирующего одноцепочечное антитело, олигонуклеотида, кодирующего основной поверхностный эпитоп вируса гепатита В. Наличие этого эпитопа на C-конце антитела с одной стороны обеспечивает образование ковалентных димеров одноцепочечных антител, константа аффинности которых превышает таковую для мономерных молекул. С другой стороны, этот эпитоп одновременно служит иммунохимическим маркером для выявления антител. Созданная генетическая конструкция может быть использована для эффективной экспрессии других одноцепочечных антител, в том числе и одноцепочечных антител человека, что было продемонстрировано в дальнейших исследованиях, проводимых во ФГУН ГН - ВБ Вектор.
Часть вторая Конструирование комбинаторных библиотек одноцепочечных антител человека посвящена созданию и характеризации двух натуральных комбинаторных библиотек - наивной и иммунной библиотеки против ортопоксвирусов.
В настоящее время одним из способов эффективного первичного отбора целевых мини-антител является их селекция из комбинаторных библиотек. Большая представительность таких библиотек позволяет рассчитывать на селекцию миниантител с заданными свойствами. Синтетические комбинаторные библиотеки, обладая большими размерами по сравнению с натуральными, не всегда обеспечивают отбор антител, обладающих биологической активностью. Возможно, это объясняется присутствием в их структуре искусственных гипервариабельных районов.
Натуральные библиотеки содержат мини-антитела, полученные при объединении природных вариабельных доменов, конформация которых точнее подогнана к вероятным антигенам в ходе эволюции.
Поскольку в цели данной работы входило получение рекомбинантных антител, обладающих биологической активностью, в частности, противовирусной, мы сконструировали натуральные библиотеки - иммунную и неиммунную (наивную). В качестве источника генетического материала для конструирования иммунной библиотеки была использована мРНК из периферических лимфоцитов четырех доноров, недавно вакцинированных вирусом осповакцины (ВОВ). В сыворотках каждого донора до вакцинации, а также после вакцинации с интервалами в 3-4 дня определяли титр антител против ВОВ. Забор крови проводили при явном проявлении у донора гуморального иммунного ответа. Наивная библиотека была создана на основе РНК периферических лимфоцитов здоровых людей. Эти эксперименты проводились в ходе совместных исследований с сотрудниками Филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и А.Ю. Овчинникова, г. Пущино, Московская обл.
Выбор олигонуклеотидов для амплификации V-генов, кодирующих легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, был обусловлен первичной структурой этих доменов. Ввиду относительно высокой консервативности участка FR1 и J-сегментов соответствующие им олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве праймеров для амплификации кДНК В-лимфоцитов. Вместе с тем, существует несколько различных J-генов, как минимум 7 семейств Vh-генов, а также несколько типов Vl-генов каппа- и лямбда-семейств, причем последовательности FR1 у них несколько различаются. Поэтому, как правило, приходится использовать достаточно широкие наборы праймеров.
В данной работе праймеры были выбраны из набора, представленного в работе (Marks et al., 1991). Этот набор был ограничен в пользу олигонуклеотидов, позволяющих амплифицировать гены вариабельных доменов тех семейств, которые наиболее широко представлены в организме человека (DeWildt et al., 1999; Knappik et al., 2000). Для вариабельных доменов тяжелых цепей это были семейства 1, 3 и 5, для вариабельных доменов легких k или цепей - 1, 2 и 3 семейства. Кроме того, Vh и Vl домены выбранных структурных семейств в составе одноцепочечных антител должны были обладать большей термодинамической стабильностью по сравнению с остальными и способностью эффективно продуцироваться в различных прокариотических и эукариотических системах (Ewert et al., 2003). Этим мы рассчитывали увеличить содержание в конструируемой библиотеке стабильных антител, которые преобладают по сравнению с остальными типами антител у человека.
Объединение ДНК фрагментов вариабельных доменов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов в последовательности, кодирующие одноцепочечные антитела человека, проводили с использованием линкерного олигонуклеотида, содержащего сайт для эндонуклеазы рестрикции ApaLI (рис. 9). Сайт рестрикции был введен в последовательность линкерного праймера для повышения выхода в процессе сборки scFv-генов. При этом, из-за введенного сайта рестрикции соответствующая аминокислотная последовательность линкера, S(G4S)2ARGSG4S, изменилась по сравнению с традиционно используемой (G4S)n. Однако, как было показано ранее (Tang et al., 1996; Turner et al., 1997), незначительные изменения линкерной последовательности существенно не влияют на взаимодействие между Vh и Vl доменами, обеспечивающее формирование антигенсвязывающего сайта.
При конструировании обеих библиотек гены, кодирующие одноцепочечные антитела, были встроены в векторную фагмиду pHEN2 (рис. 10). Эта фагмида может реплицироваться как обычная плазмида, а, благодаря наличию ori фага М13 и в случае ко-трансфекции клеток E.coli фагом-помощником M13K07, может упаковываться в фаговые частицы.
Между последовательностями, кодирующими встраиваемое одноцепочечное антитело и белок рIII бактериофага М13, находится стоп-кодон TAG, который в supE штаммах E.coli транслируется как остаток глутаминовой кислоты. Фагмида pHENобеспечивает в supE штаммах E.coli довольно высокий уровень экспрессии генов одноцепочечных антител в составе слитого белка с оболочечным белком рIII бактериофага М13. При комплементации в отсутствие фага-помощника одна копия рекомбинантного белка будет включаться в состав фаговой частицы, что не сказывается на инфекционности последней. Кроме того, при трансформации несупрессорных штаммов E.coli данная фагмида позволяет получать секретируемые антитела в виде индивидульных молекул, не связанных с оболочечным белком.
LinkApaLI ApaLI линкер линкер ApaLI ApaLI ApaLI LinkApaLI VL VL SfiI ApaLI ApaLI VL VL NotI Х Гидролиз, ApaLI Х Лигирование Х Амплификация SfiI ApaLI NotI VL VL scFv-ген scFv-ген Рис. 9. Схема конструирования генов, кодирующих одноцепочечные антитела человека. На схеме показаны: Vh- и Vl-гены; сайты для эндонуклеаз рестрикции ApaLI, SfiI, и NotI; линкер LinkApaLI.
M13 ori M13 Origine HindIII P lacZ ApaLI RBS SfiI Vh VH ApaLI Vl VL NotI 6 His-tag pHEN2 patent pHEN2-scFv APr Apr Amber 5255 bp TAG ApaLI pIII ApaLI ColEEcoRI Рис. 10. Схема фагмиды pHEN2-scFv, содержащей ген одноцепочечного антитела. Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции HindIII, SfiI, ApaLI, NotI и EcoRI; промотор лактозного оперона P lacZ; место посадки рибосом (RBS); Vh- и Vl-гены, супрессируемый стоп-кодон TAG; фрагмент гена белка pIII; ori репликации ColE1; ori фага M13; Apr- ген устойчивости к ампициллину.
Полученный репертуар фагмид использовали для трансформации клеток супрессорного штамма E. coli TG1. Трансформанты высевали на агаризованную среду. Для определения размера библиотеки высевали десятикратные разведения суспензий трансформированных клеток и подсчитывали количество выросших клонов. Размеры сконструированных иммунной и наивной библиотек составили 3107 и 2108 независимых трансформантов, соответственно.
К настоящему времени созданы комбинаторные библиотеки размером более 10клонов. Однако полагают, что для воссоздания исходного разнообразия антител в комбинаторной библиотеке из неиммуннных В-лимфоцитов, используемых в качестве источника РНК, достаточно содержаться 108 индивидуальных независимых рекомбинантов (Gavilondo, 2000). Размер иммунных библиотек обычно меньше, но они создаются для отбора антител определенной специфичности, и, даже обладая меньшим размером, они достаточно представительны для отбора целевых антител.
Для оценки функционального размера сконструированных библиотек фагмидные ДНК из десятков случайно выбранных клонов из обеих библиотек использовали в качестве матрицы для амплификации scFv-генов. Было показано, что фагмидные ДНК из подавляющего большинства клонов обеих библиотек содержали вставки, по размеру совпадающие с scFv-генами. Разнообразие представленных антител оценивали методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) scFv-генов из этих случайно выбранных клонов. Для каждого из них наблюдали уникальную картину рестрикции.
Для того, чтобы иметь возможность отбирать из библиотеки антитела к антигенам различной природы, необходимо оценить функциональную представительность этой библиотеки. Для этого можно провести аффинное обогащение библиотеки клонами, продуцирующими антитела, направленные к различным антигенам, и по полученным результатам оценить, является ли функциональная представительность сконструированной библиотеки достаточной для проведения дальнейших экспериментов.
Для подтверждения функциональной представительности сконструированной наивной библиотеки была проведена селекция из этой библиотеки фаговых антител, направленных к различным по своей природе антигенам: фактору некроза опухоли человека (ФНО-, любезно предоставлен к.х.н. Л.Н. Шингаровой, Институт Биоорганической химии, Москва), вирусоподобным частицам, образованным коровым белком вируса гепатита В (HBc-антиген, любезно предоставлен к.б.н. Л.И.
Карпенко), и к инфекционному вирусу осповакцины (рис. 11).
А Б В кДа М ВОВ ФНО М кДа 21Рис. 11. А. Электрофореграмма в 12% ПААГ с SDS белков вируса осповакцины, штамм ЛИВП. Б. Электронная микрофотография частиц HBc-антигена. Негативное контрастирование уранил ацетатом, приводится по (Карпенко с соавт., 2000). В.
Электрофореграмма в 12% ПААГ с SDS рекомбинантного белка ФНО-. М - маркер молекулярных масс.
Аффинное обогащение библиотеки (биопэннинг) проводили с использованием стандартных методов с нашими модификациями. Процедура биопэннинга представляла собой инкубацию фаговой библиотеки антител с соответствующим антигеном с последующей отмывкой несвязавшихся и элюцией связавшихся с антигеном бактериофагов, несущих на себе одноцепочечные антитела (рис. 12). В качестве элюентов использовали либо триэтиламин, либо сам антиген.
Элюированные бактериофаги, экспонирующие одноцепочечные антитела, нарабатывали в клетках E.coli и использовали для следующих раундов биопэннинга или для скрининга. Условия проведения аффинного обогащения библиотеки клонами, продуцирующими одноцепочечные антитела к ФНО-, НВс-антигену и ВОВ суммированы в таблице 1.
Таблица 1.
Условия проведения биопэннингов Кол-во Концентрации Способ АГ раундов АГ блокировки Элюент ФНО- 2 25, 12.5 мкг/мл 0,2% Твин-20-ФСБР ФНО-, 25 мкг/мл НВс-антиген 2 20, 20 мкг/мл 0,2% Твин-20-ФСБР НВс-антиген, 20 мкг/мл ВОВ 3 50, 20, 20 мкг/мл 3% БСА 100 мМ триэтиламин Рис. 12. Схема проведения биопэннинга.
Поликлональные фаговые популяции, полученные в результате первого, второго и третьего раундов селекции, а также исходную фаговую библиотеку тестировали с помощью ИФА для оценки изменения связывания с соответствующим антигеном. Проведенное тестирование показало значительное превышение сигнала при связывании соответствующего антигена популяцией после 2-го или 3-го раунда селекции над сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой. Это указывало на то, что во всех случаях произошло обогащение исходной библиотеки клонами, продуцирующими фаговые антитела к соответствующему антигену.
Из обогащенных специфическими антителами к ФНО-, НВс-антигену и ВОВ библиотек независимые клоны были протестированы методом ИФА на наличие фаговых антител, связывающих соответствующий антиген. Чтобы оценить разнообразие отобранных антител, кодирующие их гены были проанализированы с помощью ПДРФ-анализа. Для этого, ПЦР-фрагменты, содержащие scFv-гены, были обработаны эндонуклеазами рестрикции НаеIII. Количество протестированных клонов, процент положительных из них и количество уникальных клонов представлены в таблице 2.
Для проверки специфичности отобранных антител все антитела, связывающие Таблица 2.
Суммарные результаты скрининга клонов Кол-во Кол-во Кол-во клонов, % уникальных протестиро продуцирующих позитивных клонов, АГ, мг/мл ванных клонов специфические клонов продуцирующих антитела специфические антитела ФНО-, 0.5 мг/мл 29 15 51,7 НВс-антиген, 1 мг/мл 24 8 33,3 ВОВ, 3 мг/мл 24 11 45,8 ФНО- человека, ВОВ и вирусоподобные частицы, образованные коровым белком вируса гепатита В, были протестированы в реакциях перекрестного связывания. В результате проведенных экспериментов было показано, что все фаговые антитела, отобранные к ФНО-, взаимодействовали только с ФНО- и не связывались с ВОВ и коровым белком вируса гепатита В (рис. 13). Антитела, отобранные к ВОВ, взаимодействовали только с ВОВ, но не связывались с другими использованными антигенами, и т.д.
А Б OD., 405 нм OD., 405 нм HBc 3.3.ВОВ 3 BOB 2.HBc 2.ФНО- ФНО- 1.1.0.0.0 1B1 1C1 1D1 1F1 M13C 1A1 1B2 1C3 1H4 1A5 1D6 2A2 2D1 2D2 2F2 2G2 M13C В 3,5 ФНО- BOB 2,HBc 1,Рис. 13. Перекрестное связывание фаговых антител, специфичных к ВОВ (А), НВс0,антигену (Б) и ФНО- человека (В), с НВсантигеном в составе вирусоподобных A1 B2 G1 A3 B3 D3 M13C частиц, ВОВ, и ФНО-.
Кроме того, была протестирована способность отобранных антител связывать соответствующие антигены с помощью Вестерн-блот анализа. Все антигены фракционировали электрофоретически в денатурирующих условиях в 14% ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Антигены выявляли с помощью соответствующих отобранных фаговых антител. В качестве контроля неспецифического связывания использовали бактериофаг, экспонирующий на своей поверхности антитело М13С, не связывающее ни один из целевых антигенов.
Было показано, что все фаговые антитела, отобранные по связыванию с вирусоподобными частицами, образованными коровым белком вируса гепатита В, выявляли белок 24 кДа, соответствующий размерам корового белка вируса гепатита В.
Кроме того, 2 фаговых антитела, отобранных по связыванию с ФНО- человека, выявляли белок с молекулярным весом около 17 кДа, соответствующий молекулярному весу рекомбинантного ФНО- человека. Два антитела из шести, отобранных по связыванию с ВОВ, взаимодействовали с белком 27 кДа ВОВ, а одно антитело - с белком размером около 54-56 кДа ВОВ. Остальные фаговые антитела, отобранные по связыванию с ВОВ и ФНО-, белков в иммуноблоте не выявляли.
Вероятно, они направлены к конформационным эпитопам, которые разрушались при проведении электрофореза в денатурирующих условиях.
Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили возможность отбора из сконструированной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека, специфичных к различным по своей природе антигенам. Следовательно, представительность сконструированной библиотеки достаточна для отбора из нее антител, направленных к широкому спектру антигенов, в том числе антигенов, наличие которых в сыворотках доноров не удается обнаружить обычными методами.
Возможность такого отбора предопределена как резервами иммунной системы, на основе которой и сконструирована используемая библиотека, так и дополнительной рекомбинацией вариабельных доменов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, происходящей при конструировании комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител.
Среди отобранных из наивной библиотеки специфичных антител наибольший интерес с нашей точки зрения представляют фаговые антитела против ФНО-. Этот цитокин является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты (Blam et al., 2001;
Mease, 2002; Schroder et al., 2004). При тяжелых инфекциях, в частности, при вирусных геморрагических лихорадках, ФНО-, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления.
Для коррекции подобных состояний можно применять антагонисты некоторых цитокинов, включая антитела человека против ФНО- (Knight et al., 1993; Moreland et al., 1997; Kempeni et al., 1999).
Принимая это во внимание, отобранные из наивной библиотеки антитела против ФНО- были исследованы более детально. С помощью ИФА исследовали связывание их последовательных разведений с ФНО-. В результате было показано достоверное превышение значения оптической плотности над контрольной при разведении фаговых антител до 4109 БОЕ/мл (рис. 14). Фаговое антитело М13С, использованное в качестве контроля неспецифического связывания, не связывало ФНО- человека (рис. 14). Поскольку только 10% бактериофагов несут scFvs на своей поверхности (Griffiths et al., 1998), следовательно, в лунке находилось только 4107 фаговых антител, что соответствует приблизительно 1,710-16 М scFv.
Дополнительно было проведено исследование связывания этих антител еще с тремя различными белками - бычьим сывороточным альбумином (БСА), овальбумином (ОВА) и убиквитином (УБИ). Альбумин - это основная фракция белков крови, а убиквитин - фермент, ответственный за, так называемое, лубиквитин- опосредованное расщепление внутриклеточных белков. Поэтому, исследование 1.4 1.1.2 1.A3 ср.знач 1 A1 ср.знач В3 ср.знач 0.8 0.G1 ср.знач D4 ср.знач В2 ср.знач 0.6 0.M13C ср.знач M13C ср.знач 0.4 0.0.2 0.0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 разведение фаговых антител разведение фаговых антител Рис. 14. Связывание разведений фаговых антител с ФНО- человека в ИФА.
OD., 405 нм OD., 405 нм взаимодействия отобранных одноцепочечных антител с данными белками сразу же позволило бы исключить неперспективные для дальнейших исследований антитела. В результате, одно фаговое антитело из шести продемонстрировало высокий сигнал при связывании овальбумина, что свидетельствовало о его недостаточной специфичности (рис. 15).
1.1.1.БСА 1.ОВА УБИ 0.ФНО Рис. 15. Связывание фаговых 0.антител, отобранных против 0.ФНО-, с БСА, ОВА и УБИ в 0.ИФА.
A1 G1 B2 A3 B3 DДля оценки аффинности отобранных антител два антитела - А1 и В3 были переведены в формат индивидуальных одноцепочечных антител в растворимой форме. Для продукции таких антител был использован несупрессорный штамм Е.coli.
НВ2151, транслирующий кодон TAG, находящийся в структуре антитела перед белком рIII бактериофага как стоп-кодон (рис. 10), что приводит к экспрессии только гена, кодирующего одноцепочечное антитело.
При трансформации клеток Е.coli. НВ2151 фагмидами pHEN-A1 и pHEN-Вбыли получены штаммы E.coli HB2151/pHEN-sA1 и E.coli HB2151/pHEN-sВ3, продуцирующие одноцепочечные антитела sА1 и sВ3 к ФНО- с уровнем продукции около 1% суммарного клеточного белка.
Антитела sА1 и sВ3 очищали из периплазматических фракций с помощью набора Ni-NTA Qiagen. Фракции, полученные при хроматографии, анализировали электрофоретически (рис. 16). Уровень очистки для обоих одноцепочечных антител Рис. 16. Электрофореграмма в 14% А Б SDS-ПААГ (А) и Вестерн-блот анализ с анти c-myc МКА (Б) фракций, полученных при хроматографии на Ni-NTA-агарозе лизатов E.coli, содержащих sA1. 1 - лизат клеток E. coli НВ2151/pHENA1, 2 - периплазма клеток E. coli НВ2151/pHEN-A1 до нанесения на колонку, 3 - несвязавшаяся периплазматическая фракция клеток E. coli НВ2151/pHEN-A1 после нанесения на колонку, 4-5 - фракции промывок, 6-7 - фракции элюата. М - 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 стандарты молекулярных масс.
OD., 405 нм составил приблизительно 50%. Учитывая степень очистки, концентрация sАсоставляла 45 мкг/мл, а концентрация sВ3 - 35 мкг/мл. Выход одноцепочечных антител sА1 и sВ3 составлял 270 и 210 мкг на литр культуры, соответственно.
Способность очищенных антител связывать ФНО- была продемонстрирована с помощью ИФА и Вестерн-блот анализа. Это подтвердило сохранение специфичности очищенных одноцепочечных антител sА1 и sВ3 по сравнению с исходными фаговыми антителами. Гены, кодирующие sА1 и sВ3, были секвенированы.
Определение констант аффинности антител sА1 и sВ3 проводили в экспериментах с использованием параллельного титрования антител с известной начальной концентрацией, составляющей для антител 0,225 мкг/мл, на антигене в непрямом ИФА. Расчет констант ассоциации проводили с использованием программы Origin 7.0. Графики изменения OD приведены на рис. 17. Константа аффинности для антитела sА1 составила Кафф = (4 0,5) 108М-1, для антитела sВ3 - Кафф = (7,3 0,5) 107М-1.
1, kaffsa1=(4,00,5)108 М-1, kaffsb3=(7,30,5)107 М-1,0,0,0,0,Рис. 17. Определение констант 0,аффинности одноцепочечных 0,антител sА1 и sВ3 с использованием 0,непрямого иммуноферментного 0,0,анализа.
10-10 10-9 10-8 10-Концентрация антител, M Как правило, антитела, отобранные из фагмидных библиотек размером 107 - 1рекомбинантных клонов, обладают высокой специфичностью, но низкой аффинностью порядка 106 М-1 (Marks et al., 1991; de Kruif et al., 1995; Ламан с соавт., 2002). Нами были получены антитела с Кафф 108М-1, что может быть объяснено использованием наших модификаций при проведении аффинной селекции.
Следовательно, даже в библиотеке scFvs средней представительности присутствуют среднеаффинные антитела, однако для их отбора необходима оптимизация методов отбора клонов.
Полученные одноцепочечные антитела человека, направленные к ФНО-, с аффинностью около 108 М-1 в дальнейшем могут быть использованы для конструирования полноразмерных антител человека. Такие полноразмерные антитела, в случае наличия у них нейтрализующей ФНО- активности, могли бы представлять большой интерес в терапии ряда заболеваний, в частности, для лечения вирусных гемморрагических лихорадок и аутоиммунных заболеваний.
Таким образом, нами была доказана возможность отбора из сконструированной натуральной библиотеки антител против широкого спектра антигенов.
Часть третья Получение рекомбинантных антител человека, направленных к вирусу Эбола, и исследование их свойств описывает отбор одноцепочечных антител из комбинаторных библиотек и конструирование полноразмерного антитела человека к вирусу Эбола.
4OD Так как была доказана возможность отбора из сконструированной нами натуральной библиотеки антител к широкому спектру антигенов, эта библиотека и переданная нам ранее синтетическая библиотека Griffin 1, MRC, Великобритания (Nissim et al., 1994), были использованы для отбора из них одноцепочечных антител человека, направленных к вирусу Эбола.
Вирус Эбола (ВЭ) является одним из самых опасных для человека вирусов.
Сочетание высокой контагиозности, летальности, отсутствие средств профилактики и лечения однозначно определяют его в четвертую - группу по классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) вирусов. В настоящее время отсутствуют действенные средства борьбы с филовирусными инфекциями: вакцины находятся в стадии разработки, нет эффективных средств терапии. Вместе с тем, получены МКА мыши, способные обеспечивать протекцию модельных животных от летальных доз ВЭ (Wilson et al., 2000). Однако гетерологичность таких иммуноглобулинов не позволяет использовать их для терапии филовирусных лихорадок человека. Именно поэтому получение рекомбинантных полноразмерных антител человека против ВЭ представляет существенный интерес.
В данной работе в качестве антигена использовали лизированный препарат вируса Эбола Заир, штамм Mayinga, любезно предоставленный профессором А.А.
Чепурновым, ГН - ВБ Вектор. Инактивацию проводили кипячением в SDS, следовательно, использованный антиген содержал только линейные эпитопы.
Аффинную селекцию специфичных антител из обеих библиотек проводили по методам, описанным ранее (Nissim et al., 1994) с нашими модификациями. Условия проведения аффинного обогащения библиотек и отбора клонов, продуцирующих одноцепочечные антитела против ВЭ, суммированы в таблице 3. Для всех отобранных одноцепочечных антител были определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов,.
Поскольку селекцию антител проводили с использованием инактивированного ВЭ, отобранные фаговые антитела были проанализированы с помощью ИФА на способность связывать инфекционный вирус Эбола (табл. 4). Было показано, что все антитела, отобранные из наивной библиотеки, и 8 антител, отобранных из синтетической библиотеки, за исключением одного антитела, способны связывать инфекционный ВЭ. Это свидетельствует о том, что выявляемые эпитопы присутствуют в составе белков и нативных, и инактивированных вирионов.
Таблица 3.
Условия селекции фаговых антител против вируса Эбола из синтетической и натуральной библиотек Кол-во Кол-во уникальных Библио- Кол-во Концентра Способ Элюент тестиро клонов, тека раундов ции АГ, блокировки ванных продуцирующих мкг/мл клонов специфические антитела Синтети 3 70; 50; 25 3% БСА 100 мМ 80 ческая триэтиламин Натура- 2 5; 0.8 0,2% Твин- ВЭ, 0.8 мкг/мл 60 льная 20-ФСБР Ранее в ГН - ВБ Вектор были получены МКА мыши, направленные к инактивированному вирусу Эбола, и было показано, что некоторые из них способны связывать и инактивированный вирус Марбурга (ВМ) (Казачинская с соавт., 2000).
Поэтому отобранные нами антитела также были протестированы на способность к перекрестному связыванию с ВМ. Результаты показали, что все антитела, отобранные из наивной библиотеки, и большинство антител, отобранных из синтетической библиотеки, являлись специфично направленными только к ВЭ (табл. 4).
Таблица 4.
Иммунологические свойства фаговых антител против вируса Эбола Титр фаговых Концентрация Связывание Связывание Белки- Клон антител в ИФА вируса Эбола в антител с антител с мишени (БОЕ/мл)* ИФА**, нг\мл живым ВЭ инактивированным ВМ Фаговые антитела, отобранные из синтетической библиотеки 101E2 20 + - VP101G4 60 + - VP2102E3 60 + - NP 2102G2 60 + + VP40, VP14D1 20 + - NP 1.615A2 20 + - NP 1.615D1 50 + - NP 105D3 20 - - NP 3.21 5F4 20 + - NP Фаговые антитела, отобранные из натуральной библиотеки A1 4108 5 + - VPB2 2.51011 80 + - NP, VPC3 4108 5 + - VPH4 21011 80 + - NP, VP21A5 20 + - VP41D6 5 + - VP81F6 5 + - VP41B7 5 + - VP* Минимальная концентрация фаговых антител, при которой положительный сигнал в ИФА выше отрицательного контроля в 3 раза. Количество антигена - 80 нг/лунка. **Наименьшее количество антигена, выявляемое 1010 фаговых частиц.
При определении белков-мишеней для отобранных антител было показано, что антитела связывали нуклеопротеин (NP) и белки оболочки VP40, VP24, причем некоторые антитела выявляли в иммуноблоте более одного вирусного белка (табл. 4).
Следует отметить, что в коллекции полученных ранее в ГН - ВБ Вектор МКА мыши, направленных к инактивированному ВМ, также присутствовали МКА, выявлявшие в иммуноблоте более одного белка ВМ (Разумов с соавт., 1998).
Из шести одноцепочечных антител, отобранных из синтетической библиотеки, специфичных к NP ВЭ, четыре антитела (4D1, 5А2, 5D1, 5F4) имели не только идентичные Vl-домены, но и похожие последовательности Vh-доменов (табл. 7), различающиеся лишь единичными заменами в каркасных или гипервариабельных регионах CDR1 или CDR2. Третий гипервариабельный регион (CDR3) Vh-домена, играющий наиболее важную роль в специфичности и аффинности антитела, являлся у этих четырех антител идентичным. Поэтому можно предположить, что антитела 4D1, 5А2, 5D1, 5F4 связывали один и тот же эпитоп NP ВЭ.
Для того, чтобы определить константы аффинности отобранных антител, два из них были переведены в форму растворимых одноцепочечных антител без последовательности фагового белка р3 на С-конце молекулы. Для этого клетки E.coli НВ2151 независимо трансформировали фагмидными ДНК pHEN-4D1 и pHEN-2E3.
Уровень продукции одноцепочечных антител человека s4D1 и s2E3 в растворимой форме клетками E.coli HB2151/pHEN-4D1 и E.coli HB2151/pHEN-2E3достигал 5% от суммарного клеточного белка.
Очистку каждого антитела проводили из объединенных периплазматической и цитоплазматической фракций с помощью набора Ni-NTA Qiagen. Константы аффинности очищенных одноцепочечных антител s4D1 и s2E3 определяли с использованием титрования антител с известной начальной концентрацией, на антигене в непрямом ИФА. Расчет констант аффинности проводили с использованием программы Origin 7.0. Расчетная величина константы аффинности для антитела s4D1 составила (1,7 0,3) 107 М-1, а для антитела s2E3 - (6,8 0,8) 106 М-1.
На основе вариабельных доменов одноцепочечного антитела 4D1, направленного к NP вируса Эбола, было сконструировано полноразмерное антитело человека. Для этого к генам, кодирующим Vh- и Vl-домены 4D1, были соответственно присоединены гены, кодирующие лидерные пептиды тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (Radko et al., 2002) и константные домены CH1- CH2- CH3- тяжелой цепи IgG1 человека и каппа-домен легкой цепи антитела человека (Aliev et al., 2002).
Эти эксперименты проводили в рамках совместного проекта с сотрудниками лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова.
Сконструированные гены, кодирующие тяжелую цепь IgG1 и легкую каппа-цепь антител человека, были независимо встроены в экспрессионную плазмиду pcDNA3.1(+) (рис. 18). Результирующие плазмиды pCH1 и pCL1 использовали для котрансфекции эукариотических клеток линии HEK293Т.
Транзиентная экспрессия сконструированных генов, кодирующих тяжелую и легкую цепи полноразмерного человеческого антитела, обеспечила биосинтез полипептидов со свойствами легкой и тяжелой цепей антитела человека, которые объединяются в антитело класса IgG1 (рис. 19).
Специфичность очищенного полноразмерного антитела fh4D1 подтверждали методом Вестерн-блот анализа. Было показано, что fh4D1, как и исходное фаговое антитело 4D1, выявляло NP вируса Эбола и не выявляло белки вируса Марбург, связывание с которыми рассматривали в качестве отрицательного контроля (рис. 20).
(12) BglII (12) BglII NheI (895) NheI (895) s s Vl Vh XhoI (1326) pCLpCHXmaJI (1294) ApaI (1344) const XhoI (1665) XhoI (2474) Рис. 18. Физические карты плазмид pCL1 и pCH1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции.
Pcmv - цитомегаловирусный промотор; S - сигнальная последовательность; Vl, k - вариабельный и константный участки гена легкой цепи рекомбинантного антитела; Vh, const.
- вариабельный и константный участки гена тяжелой цепи рекомбинантного антитела;
BGHpA - сайт полиаденилирования бычьего гормона роста.
Рис. 19. Электрофореграмма очищенного целевого белка в денатурирующем 13% ПААГ. Дорожки: 1 - маркер молекулярных масс, 2 - целевой белок, обработанный 2меркаптоэтанолом, 3 - целевой белок, не обработанный 2-меркаптоэтанолом. Очистку рекомбинантных антител из культуральной жидкости проводили методом аффинной хроматографии на колонке с носителем Protein G Sepharose.
А Б 21Рис. 20. Белки ВЭ (1) и ВМ (2), выявленные антителом fh4D1 (А) в иммуноблоте и окрашенные Кумасси R-250 (Б).
1 2 1 2 М P P c c m m v v r r p p m m A A C C o o l l E E S S V V p p A A N N e e o o m m A A y y p c p c i i n H n H G S G S B V B V i r i o r o r i f o o r i f Константу связывания fh4D1 определяли с использованием метода твердофазного ИФА (рис. 21). Величину константы связывания рассчитывали, используя формулу: __________________ x + R + 1/k - ( x + R + 1/k)2 - 4Rx OD405 = A ------------------------------------------------ (Варфоломеев и Гуревич, 1999), где 2R x - концентрация антител в растворе, R - концентрация сорбированного антигена, k - константа аффинности, A - нормировочный множитель. Величина константы аффинности fh4D1составила (7,7 1,5) 107 М-1. Эта величина лежит в пределах, характерных для ряда моноклональных антител.
k=(7,71,4)*107,М-0.0.0.0.Рис. 21. Определение константы аффинности полноразмерного 0.антитела человека fh4D1 с использованием непрямого ИФА.
1E-11 1E-10 1E-9 1E-8 1E-концентрация антитела, M Таким образом, на примере антитела fh4D1 нами был отработан способ создания полноразмерного антитела человека на основе вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, отобранных из комбинаторной библиотеки. В дальнейшем возможно использование сконструированного антитела fh4D1 для специфической детекции ВЭ.
Часть четвертая Конструирование рекомбинантных антител человека, направленных к ортопоксвирусам, и исследование их свойств описывает получение на основе технологии фагового дисплея рекомбинантных вируснейтрализующих антител человека к ортопоксвирусам.
В настоящее время существуют причины, по которым ортопоксвирусы продолжают оставаться источником биологической опасности для людей:
распространяется новое генерализованное заболевание человека, вызываемое вирусом оспы обезьян; возможно использование вируса натуральной оспы из неофициальных коллекций в террористических целях. Однако, в связи с ликвидацией вируса натуральной оспы массовая вакцинация была прекращена во второй половине 70-х годов прошлого века, и в настоящее время большинство населения иммунитета к ортопоксвирусным инфекциям не имеет. Специфические средства лечения ортопоксвирусных инфекций очень ограничены. Прививка осповакцины дает достаточно надежную защиту, но нередко сопровождается серьезными поствакцинальными осложнениями, вероятность возникновения которых особенно велика для лиц со сниженным иммунным статусом. Для профилактики и лечения ОД, 405 нм некоторых осложнений, возникающих после оспопрививания, применяют человеческий вакцинный иммуноглобулин (VIG), но поскольку он обладает всеми недостатками препарата, полученного из донорской крови, предпочтительнее было бы использование специфичных к ортопоксвирусам антител человека, созданных с помощью рекомбинантных технологий.
На первом этапе мы провели отбор одноцепочечных антител человека к ортопоксвирусам из синтетической библиотеки Griffin 1, MRC, Великобритания (Nissim et al., 1994) и иммунной библиотеки, сконструированной в ходе выполнения данной работы.
В качестве антигенов для аффинного обогащения библиотек использовали:
вирус осповакцины (ВОВ), штамм Листер, вариант Л-ИВП, вирус оспы коров (ВОК), штамм Гришак, вирус эктромелии (ВЭМ), штамм К2, а также вирус натуральной оспы (ВНО), штаммы Ind3a и Butler, относящиеся к variola major и variola minor, группа штаммов alastrim, соответственно. Следует отметить, что для максимального сохранения антигенных профилей ортопоксвирусов в работе использовали жизнеспособные вирусы, так как известно, что инактивация, как правило, разрушает конформационные эпитопы вирусных белков. Все эксперименты с жизнеспособными ВНО, то есть аффинное обогащение библиотеки, отбор и исследование отобранных фаговых антител, проводили в лаборатории со степенью защиты BSL 3-4, сертифицированной ВОЗ и Министерством здравоохранения РФ.
Для того чтобы избежать отбора антител к содержащимся в вирусных препаратах белкам тканевого или клеточного происхождения, в ходе аффинной селекции использовали вирусы, наработанные на различных объектах. Например, для первого и второго раунда аффинного обогащения библиотеки антителами, специфичными к ВНО, использовали вирус, выделенный из ХАО РКЭ, а третий раунд обогащения проводился с использованием вируса, наработанного на культуре клеток VeroE6.
Кроме ортопоксвирусов для обогащения иммунной библиотеки использовали рекомбинантный белок prA30L (Разумов и др., 2005), любезно предоставленный к.б.н. И.П. Гилевой, ФГУН ГН - ВБ Вектор Роспотребнадзора. Рекомбинантный белок prA30L является аналогом поверхностного белка слияния ВНО (штамм Ind3а), кодируемым ОРТ A30L. Этот белок гомологичен белку слияния ВОВ массой 14 кДа, который кодируется ОРТ A27L.
В ходе экспериментов было независимо проведено аффинное обогащение синтетической библиотеки клонами, продуцирующими антитела, направленные к двум штаммам ВНО - Ind3A и Butler, и клонами, продуцирующими антитела к ВОВ.
Иммунная библиотека обогащалась клонами, продуцирующими антитела к ВОВ и ВОК. Дополнительно из обеих библиотек отбирали антитела к ВЭМ. Примеры результатов биопэннинга и тестирования вируснейтрализующей активности популяций, обогащенных антителами против ВОК и рекомбинантного белка prA30L приведены на рис. 21 и 22-23.
Всего было протестировано 1062 клона из синтетической библиотеки и 948 - из иммунной. Гены, кодирующие антитела, продуцируемые позитивными клонами, подвергали ПДРФ-анализу и секвенированию. В результате из синтетической библиотеки отобрали 24 уникальных антитела, из иммунной - 42. Результаты селекции антител против ортопоксвирусов суммированы в таблице 5.
Анализ аминокислотных последовательностей отобранных антител показал, что Vh-домены большинства антител, отобранных из обеих библиотек, относятся к Vh1- А Б 1,ВОК 1,1,1, prA30L 0,1,БСА 0,БСА 0,0,0,0,обезжиренное обезжиренное 0,0,0 молоко молоко Рис. 21. Связывание популяций фаговых антител с ВОК (А) и рекомбинантным белком ВНО prA30L (Б) в ИФА.
190 50 10(13) 2,5*10(12) 6*10(11) 1,5*10(11) 10(13) 2,5*10(12) 6*10(11) 1,5*10(11) концентрация фаговых частиц, БОЕ/мл концентрация фаговых частиц, БОЕ/мл Рис. 22. Нейтрализация инфекционности Рис. 23. Нейтрализация инфекционности ВОК популяцией фаговых антител, ВОВ популяцией фаговых антител, обогащенной антителами против ВОК (1), и обогащенной антителами против белка исходной комбинаторной библиотекой (2) в prA30L (1), и исходной комбинаторной культуре клеток Vero E6. 3 - контроль библиотекой (2) в культуре клеток Vero E6. неспецифической нейтрализации ВОК (anti- - контроль неспецифической нейтрализации Thy антитело). Титр ВОК 320 БОЕ/мл. ВОВ (anti-Thy антитело). Титр ВОВ - 2БОЕ/мл.
и Vh3-cемействам. Отбор Vh-доменов, принадлежащих именно к этим двум семействам, из иммунной библиотеки может быть связан с тем, что эти семейства Vhдоменов представлены в человеческом организме в наибольшей степени и максимальном разнообразии по сравнению с остальными семействами (Hoogenboom et al, 1992). Кроме того, Vh1- и Vh3-домены одноцепочечных антител обладают максимальной термодинамической стабильностью по сравнению с остальными и способны принимать правильную конформацию in vivo (Ewert et al, 2003), что может быть причиной отбора таких Vh-доменов из синтетической библиотеки.
Все отобранные уникальные фаговые антитела исследовали в реакциях перекрестного связывания с ВОК, ВОВ и ВЭМ. По результатам проведенных экспериментов антитела разделились на две группы. Большинство вошло в первую группу, и каждое из них выявляло приблизительно равные концентрации разных ортопоксвирусов (табл. 6). Вероятно, эти антитела являются родоспецифическими.
Во вторую группу вошли антитела 2VC3, 2VD10, 2VA8, 9G2, 20A5, 1F4 и 2В2, связывающие разные виды ортопоксвирусов с различной эффективностью (табл. 6).
При этом антитела 2VC3 и 2VD10 связывали ВОВ и ВЭМ эффективнее, чем ВОК, OD 405 нм OD 405 нм уровень нейтрализации, % уровень нейтрализации, % а ек т нд нд а о д и ау ау ек нд нд н л р р у у б от ау и ра ра р л би б ая би н я д а о х дн ис хо ис Таблица 5.
Суммарные результаты отбора клонов Кол-во Кол-во Вирус Кол-во Конц-ции АГ, тестиро- Кол-во (%) уникаль раундов мкg/ml ванных позитивных ных клонов клонов клонов Синтетическая библиотека ВНО,Ind3a 3 100, 100, 20 261 12 (4.6%) ВНО, Butler 3 100, 100, 20 165 10 (6.1%) ВОВ 3 50, 20, 20 458 15 (3.3%) ВЭМ 178 5 (8.9%) Итого: 1062 42 (4%) Иммунная библиотека ВОВ 3 50, 20, 20 368 97 (25%) ВЭМ 3 96 10 (10.4%) ВОК 2 100, 100 92 15 (16%) prA27L 3 25, 20, 10 250* 12 (5%)* 8* + 142 + 45 (31%) + Итого: 948 179 (17.6%) а антитело 2VA8 не связывало ВЭМ. Это антитело является строго группоспецифическим, вероятно, эпитоп, узнаваемый этим антителом, отсутствует на поверхности ВЭМ.
Антигенная структура ортопоксвирусов являлась предметом исследований многих авторов, пытавшихся выяснить причины такого серологического сходства при столь сильно отличающихся биологических свойствах этих вирусов (Ichihashi, 1988;
Czerny, 1990; Demcovicz et al,1992 и др). Считается, что иммунологический профиль отдельных видов ортопоксвирусов складывается из набора видоспецифических эпитопов (Esposito et al., 1977; Gispen et al., 1974) и из композиции эпитопов, складывающихся для каждого вида в определенную мозаику (Ichihashi, 1988), причем эта мозаичная композиция вносит существенный вклад в формирование разнообразия ортопоксвирусов (Ichihashi, 1988; Demcovicz et al., 1992).
В нашей работе были отобраны фаговые антитела, связывающие разные виды ортопоксвирусов с различной эффективностью. Ряд МКА грызунов, полученных ранее (Ichihashi et al, 1988; Разумов и др., 2005), также обладал подобными свойствами. Существование антител, связывающих разные виды ортопоксвирусов с различной эффективностью, свидетельствует о том, что наряду с видоспецифическими эпитопами существуют общие для разных видов эпитопы, конформации которых имеют определенные различия у разных видов ортопоксвирусов. Видимо, эпитопы, узнаваемые антителами 1F4, 9G2, 20A5, 2VC3 и 2VD10, присутствуют на всех исследованных вирусах, но обладают межвидовыми конформационными отличиями. Мы полагаем, что подобные эпитопы также вносят определенный вклад в разнообразие иммунологических профилей различных ортопоксвирусов, наряду с видоспецифическими эпитопами и с мозаичной композицией видоспецифичных эпитопов, уникальной для каждого вида.
В данной работе впервые была сделана попытка обнаружить штаммоспецифические эпитопы ВНО и определить, связаны ли они с вирулентностью этого патогена. Известно, что штаммы ВНО различаются по степени тяжести заболевания, которое они вызывают, и по уровню смертности. К variola Таблица 6.
Свойства отобранных одноцепочечных антител против ортопоксвирусов Концентрация ортопоксвирусов в ИФА Вируснейтрализующая (нг/лунка) активность Белок- мишень АТ Штаммы ВНО ВОВ ВОК ВЭМ ВОВ ВОК ВЭМ ВОО Kuw- Brazil Ind3a Сon2 Butler 5 1Антитела, отобранные из синтетической библиотеки 1I4 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 12,5 - - - н/о 54-1I6 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 12,5 - - - н/о кДа 2I3 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 12,5 - - - н/о 2I19 9,4 37,5 9,4 37,5 37,5 12,5 12,5 0,8 - - - н/о 27 кДа 2I46 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 12,5 12,5 12,5 - - - н/о 3I3 150 150 37,5 150 150 50 50 12,5 - - - н/о 3I5 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 12,5 12,5 3,1 - - - н/о 3I7 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 12,5 12,5 12,5 - - - н/о 2B2 150 37,5 150 0,6 0,6 50 50 3,1 - - - н/о 35 кДа 2B3 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 50 50 50 - - - н/о 2B20 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 50 50 50 - - - н/о 2B25 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 12,5 - - - н/о 2B28 9,4 9,4 9,4 2,3 2,3 12,5 12,5 12,5 - - - н/о 2B34 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 50 - - - н/о 2B36 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 50 50 3,1 - - - н/о 1F4 37,5 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 50 1,0 - - - н/о 27 кДа 8C5 37,5 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 200 50 - - - н/о 8G4 37,5 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 50 50 - - - н/о 9G2 150 150 150 9,4 9,4 12,5 200 3,1 - - - н/о 35 кДа 10E3 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 50 50 50 - - - н/о 10H2 37,5 37,5 37,5 9,4 9,4 200 200 50 + - - н/о 15G1 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 50 50 200 - - - н/о 16H3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 50 50 50 + - - н/о 20A5 37,5 37,5 37,5 9,4 9,4 0,8 200 0,8 - - - н/о Антитела, отобранные из иммунной библиотеки 2VC3 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 200 3,1 + - + н/о 35 кДа 2VD10 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 50 3,1 + - + н/о 35 кДа 3VA10 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 3,1 3,1 + + + + 35 кДа 4VC1 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 3,1 3,1 + + н/о н/о 35 кДа 2VA8 н/о н/о н/о н/о н/о 12,5 3,1 - +/- +/- - - 3VB7 н/о н/о н/о н/о н/о 50 50 50 - - - - 3VG8 н/о н/о н/о н/о н/о 50 50 50 - - - - 3VF11 н/о н/о н/о н/о н/о 50 50 50 - - - - a4 н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + н/о н/о 35 кДа b9 н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + + + 35 кДа f11 н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + н/о н/о 35 кДа c4 н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о н/о 35 кДа d2 н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + +/- + 35 кДа e7 н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о + 35 кДа e8 н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о н/о 35 кДа h1 н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о н/о 35 кДа f6 н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 + + н/о н/о g1 н/о н/о н/о н/о н/о 50 200 50 +/- +/- н/о н/о h6 н/о н/о н/о н/о н/о 50 50 50 - - - н/о g4 н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 + + н/о н/о g11 н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 - - - н/о e10 н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 +/- +/- н/о н/о 4.1 н/о н/о н/о н/о н/о 50 н/о н/о + + н/о н/о 14 кДа d4 н/о н/о н/о н/о н/о 200 н/о н/о + + н/о н/о 14 кДа н/о - не определяли, +/- - ингибирование бляшкообразования < 30%, но < 50% major относят возбудителей, вызывавших классическое заболевание, приводившее к летальному исходу у 10 - 40% невакцинированых пациентов, тогда как смертность при заболевании, вызванном variola minor, составляла менее 1% (Esposito et al., 1977).
Variola minor была эндемична в Африке и Южной Америке наряду со штаммами variola major, причем исследования возбудителей variola minor показали наличие определенных биологических различий у вирусов, выделенных в Африке и в Южной Америке (Fenner, 1989). Для южноамериканских штаммов variola minor предложено использовать термин alastrim (Fenner, 1989).
Поиск штамм-специфических эпитопов проводили с помощью фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки. В работе использовали штаммы ВНО, относящиеся к группам штаммов как variola major (штаммы Ind-3а, Con-9, Kuw-5), так и variola minor alastrim (Butler, Brazil 131) (рис. 24). Результаты экспериментов показали, что большинство фаговых антител отличались между собой по интенсивности сигнала в ИФА при связывании исследуемых штаммов вируса натуральной оспы, но каждое из них выявляло приблизительно равные концентрации разных представителей данного вида (табл. 6). Исключение составили антитела 2В2 и 9G2 (табл. 6). Оба этих фаговых антитела эффективнее связывали штаммы группы alastrim, чем штаммы variola major. Вероятно, эпитоп, узнаваемый фаговыми антителами 2В2 и 9G2, обладает межвидовыми, а в случае вируса натуральной оспы и межштаммовыми конформационными отличиями. Таким образом, в результате проведенных экспериментов нам не удалось выявить строго штаммоспецифические антитела, но были получены два фаговых антитела, которые выявляли низковирулентные (alastrim) штаммы эффективнее, чем остальные штаммы ВНО.
Следовательно, штаммы вируса натуральной оспы также могут иметь различия в иммунологических профилях за счет конформационных отличий в аналогичных эпитопах.
Все отобранные фаговые антитела были протестированы на наличие вируснейтрализующих свойств. Было показано, что 14 антител, отобранных из иммунной библиотеки по связыванию с ортопоксвирусами (рис. 25), и два антитела, 1 2 3 4 М 5 кДа 21Рис. 24. Электрофореграмма белков ортопоксвирусов в 15% SDS-ПААГ.
Окраска кумасси R-250. Дорожки: 1 - ВНО, Brazil 131, 2 - ВНО, штамм Butler, 3 - ВНО, Kuv-5, 4 - ВНО, Con-9, 5 - ВОВ, Листер, 14,вариант Л-ИВП, 6 - ВНО, Ind-3a. М - маркер молекулярных масс.
отобранные из этой же библиотеки по связыванию с рекомбинантным белком ВОВ prA30L (рис. 26), были способны нейтрализовать инфекционность ортопоксвирусов на культуре клеток VeroE6. Часть фаговых антител, отобранных из иммунной библиотеки, продемонстрировала способность нейтрализовать вирус оспы обезьян (ВОО) (рис. 27, табл. 6).
11Рис. 25. Нейтрализация ВОК фаговыми антителами в культуре клеток Vero E6. Титр фаговых антител - 1013 БОЕ/мл, титр ВОК - 320 БОЕ/мл.
14.1 1.2 3.2 5.2 6.2 8.2 10.2 a6 a7 b1 c6 c10 d2 d4 d6 e1 e7 f2 f5 g10 antiThy Рис. 26. Нейтрализация ВОВ фаговыми одноцепочечными анти-prA30L антителами в культуре клеток Vero E6. Титр фаговых антител 1012 БОЕ/мл, титр ВОВ - 250 БОЕ/мл.
Все антитела, отобранные из синтетической библиотеки, были протестированы на способность нейтрализовать инфекционность ВНО, штаммы Ind3a и Butler.
Антител, способных ингибировать инфекционность ВНО, обнаружено не было. Два антитела, отобранные из синтетической библиотеки по связыванию с ВОВ, обладали вируснейтрализующими свойствами в отношении этого вируса.
Определение ортопоксвирусных белков-мишеней для фаговых антител, отобранных из иммунной и синтетической библиотек, осуществляли методом Вестерн-блот анализа. Было показано, что из 24 фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки, только пять антител выявляли белки ортопоксвирусов в Вестерн-блот анализе. Антитела 2I19 и 1I6, отобранные по связыванию с ВНО, Ind3a, выявляли белки с молекулярной массой около 27 кДа и 54-56 кДа, соответственно.
Антитело 1F4, отобранное по связыванию с ВОВ, выявляло белок с молекулярным весом около 27 кДа (табл. 6). Антитела 9G2 (отобрано против ВЭМ) и 2B2 (отобрано против ВНО, Butler) взаимодействовали с белками ВОВ и ВНО, Butler, молекулярный вес которых был около 35 кДа (табл. 6). Из 18 вируснейтрализующих антител выявляли в иммуноблоте белок ортопоксвирусов с молекулярной массой 35 кДа (табл.
6, рис. 28).
Способность антител, отобранных по связыванию с рекомбинантным белком prA30L, также исследовали с помощью Вестерн-блот анализа. Было показано, что АТ н Уровень ейтрализации, % уровень нейтрализации, % hy f ehadb c e g h g CCAT fgeDA V V V y V t 3V an А Б 1180 70 1 60 50 50 40 30 20 5,7*10(13) 1.4*10(13) 3.5*10(12) 8.9*10(11) 5,7*10(13) 1.4*10(13) 3.5*10(12) 8.9*10(11) Phage antibodies, pfu/ml Phage antibodies, pfu/ml В Рис. 27. Нейтрализация ВОК (А), ВОВ (Б) и ВОО (В) фаговыми одноцепочечными антителами b9 (1) и 3VA10 (2) в культуре клеток Vero E6. 3 - контроль неспецифической нейтрализации (anti-Thy 0 антитело). Титр ВОК - 320 БОЕ/мл, титр 5.7*10(13) 1.4*10(13) 3.5*10(12) 8.9*10(11) ВОВ - 250 БОЕ/мл, ВОО - 480 БОЕ/мл.
Phage antibodies, pfu/ml 4.1 и d4, выявляли рекомбинантный белок, перенесенный на нитроцеллюлозную мембрану. Остальные 18 отобранных антител не выявляли prA30L, перенесенный на нитроцеллюлозную мембрану, и, вероятно, направлены к конформационным эпитопам рекомбинантного белка prA30L.
Большинство фаговых антител, отобранных из обеих библиотек, не выявляли какого-либо ортопоксвирусного белка в иммуноблоттинге. Вероятно, эти антитела взаимодействовали с конформационными эпитопами, которые разрушались при проведении электрофореза в восстановительных условиях.
Следует отметить, что 11 вируснейтрализующих антител, специфичных к белку р35, имели в структуре CDR3 Vh-домена, играющего ключевую роль в специфичности антитела, четко выраженный мотив.S..V..HG....
RIAARRHAFD Это позволяет предположить, что эти 11 вируснейтрализующих антител направлены к одному линейному эпитопу, представленному на белке р35.
Кроме того, было показано, что иммунная библиотека после обогащения также способна выявлять ортопоксвирусный белок с молекулярной массой около 35 кДа (рис. 28). Этот же белок выявлялся сыворотками доноров, вакцинированных ВОВ (рис. 28).
Среди структурных белков ортопоксвирусов известны два иммунодоминантных мембранных белка - H3L (р35) и D8L с близкой молекулярной массой, индуцирующих образование вируснейтрализующих антител (Маренникова и Щелкунов, 1998). Мы предположили, что белок, с которым связывается большинство вируснейтрализующих антител, является продуктом ОРТ H3L вируса осповакцины % Plaque reduction % Plaque reduction % Plaque reduction Рис. 28. Вестерн-блот анализ белков ВОВ с популяциями фаговых антител (А), с фаговыми антителами (Б) и с сыворотками доноров (В). М - маркеры молекулярных масс, v - белки ВОВ, перенесенные на мембрану. Проявление - А: 1 - исходная библиотека, 2, 3 - библиотека, обогащенная в результате 1-го и 2-го раунда биопэннинга, соответственно, 4 - анти-Thy антитело; Б - приведены названия фаговых антител; В: 1, 2, 3, 4 - сыворотки доноров, вакцинированных ВОВ, 5 - сыворотка невакцинированного ВОВ донора.
(J3L - вируса оспы коров). Для проверки этого предположения был сконструирован штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка ВОК prJ3L. В качестве экспрессирующего вектора использовали плазмиду pUR291. При использовании этого вектора 5Т-концевая область мРНК прокариотического гена сохраняется нативной, и поэтому оптимальна для инициации трансляции. Кроме того, гибридный белок в меньшей степени, чем чистый, подвергается протеолитической деградации.
Целевой полипептид в составе такого гибридного белка, как правило, продуцируется в виде отдельного домена, сохраняя свою ферментативную активность и антигенные свойства (Петренко и др., 1988; Мазин и др., 1990).
Ген, кодирующий белок J3L ВОК (штамм Гришак), встраивали в полилинкер плазмиды pUR291, находящийся на 3Т-конце гена, кодирующего -галактозидазу.
Результирующей плазмидой pUR-J3L (рис. 29) трансформировали клетки E.coli DH5F', которые выращивали на среде с ампициллином в присутствии X-gal и ИПТГ.
Оценку продукции гибридного белка проводили с помощью электрофоретического анализа клеточного лизата в 10% ПААГ с SDS (рис. 30). Было показано, что после индукции ИПТГ лизат клеток E.coli, трансформированных плазмидой pUR-J3L, содержит белок, масса которого соответствует расчетной молекулярной массе гибридного рекомбинантного белка -галактозидаза-J3L (prJ3L) - около 150 кДа. В лизате клеток E.coli, трансформированных исходной плазмидой pUR291, после индукции ИПТГ присутстовала только -галактозидаза, молекулярная масса которой - около 116 кДа (рис. 30А).
изаты клеток E.coli/pUR-J3L и E.coli/pUR291 анализировали с помощью Вестерн-блот анализа с использованием сыворотки ревакцинированного донора и PLacZ Рис. 29. Схема плазмиды pUR-J3L, содержащей ген J3L, кодирующий рбелок ВОК. Указаны сайты для Ap pUR291-J3L эндонуклеазы рестрикции BamHI;
6195 bp промотор лактозного оперона P lacZ; ген LacZ, кодирующий -галактозидазу E.coli;
Apr- ген устойчивости к ампициллину.
J3L BamHI (3286) контрольной сыворотки от донора, никогда не вакцинированного ВОВ. Было показано, что антитела из сыворотки ревакцинированного человека выявляют рекомбинантный белок, в то время как антитела из сыворотки не вакцинированного человека не взаимодействуют с рекомбинантным белком (рис. 30В). Это подтвердило сохранение у рекомбинантного белка prJ3L эпитопов, присутствующих в его природном аналоге в составе вирионов.
1 2 M М к1 1 М к2 1 205 205 2prJ3L prJ3L 116 116 197 84 55 45 36 29 24 Б В А Рис. 30. А: Электрофореграмма белков клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pURJ3L (1) и плазмидой pUR291 (2) в 10% ПААГ с SDS. М - стандарты молекулярных масс белков. Б-В: Иммуноблотинг белков клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pURJ3L (Б), и плазмидой pUR291 (В) с сывороткой человека, вакинированного ВОВ (1) и сывороткой неиммунного к ВОВ человека (2). к1 и к2 - соответствующие белковые профили. М - стандарты молекулярных масс белков.
Вестерн-блот анализ этих же лизатов с использованием вируснейтрализующих фаговых антител, отобранных из иммунной библиотеки, подтвердил, что белкоммишенью для этих антител действительно является белок J3L, или, в случае ВОВ - продукт ОРТ H3L (рис. 31а). Кроме того, было показано, что иммунная библиотека после обогащения также способна выявлять рекомбинантный белок prJ3L (рис. 31б).
Эта же обогащенная библиотека выявляла ортопоксвирусный белок с молекулярной массой около 35 кДа (рис. 28А). Следовательно, в результате процедуры аффинного обогащения, имитирующей in vitro развитие гуморального ответа в организме, в библиотеке преобладают антитела, связывающие белок, закодированный ОРТ J3L ВОК, и перекрестно реагирующие с белками p35 ВОВ и ВЭ. Можно сделать вывод, что в ходе иммунного ответа на ортопоксвирусы, одним из основных иммунодомина- М к1 a4 b9 f11с4 d2 e7 e8 h1 к2 к3 a4 b9 f11с4 d2 e7 e8 h1 к21А pUR-J3L pUR2 М к1 1 2 3 к2 к3 1 2 3 к21Б pUR-J3L pUR2Рис. 31. Иммуноблотинг белков клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pUR-J3L (к1), и pUR291 (к3), с фаговыми вируснейтрализующими антителами (А); с исходной популяцией фаговых антител (1Б) и популяциями фаговых антител, полученных после первого (2Б) и второго (3Б) раунда аффинного обогащения библиотеки против вируса оспы коров; и anti-Thy антителом (к2). М - маркер молекулярных масс белков.
нтных белков, к которому в основном нарабатываются вируснейтрализующие антитела в организме человека, является белок p35, ОРТ H3L ВОВ.
Этот результат является независимым подтверждением высказанного ранее предположения о важной роли белка р35 в развитии иммунного ответа на ортопоксвирусы в организме человека (Zinoviev et al., 1994; Davies D., et al, 2005).
Для оценки аффинности одноцепочечных антител к ортопоксвирусам, отобранных из обеих библиотек, некоторые антитела были получены в форме отдельных молекул, не слитых с оболочечным белком бактериофага. Были созданы штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела s1F4, s1I6, s2I19, отобранные из синтетической библиотеки, и одноцепочечное антитело sb9, отобранное из иммунной библиотеки.
Одноцепочечные антитела s3I7, sd2 и s3VA10 продуцировались в клетках E.coli в нерастворимой форме. Для растворимых одноцепочечных антител были определены константы аффинности (рис. 32), которые составили:
s1F4 - (1,6 0,3) 107 М-1;
s1I6 - (1,5 0,3) 107 М-1;
s2I19 - (9,1 4,7) 106 М-1;
sb9 - (3,1 0,5) 108 М-1.
Видно, что константа аффинности одноцепочечного антитела, отобранного из иммунной библиотеки (размер библиотеки 3107) на порядок выше констант аффинности одноцепочечных антител, отобранных из синтетической библиотеки (размер библиотеки > 108).
На основе вариабельных доменов одноцепочечных антител s1F4, s1I6, s2I19 и sb9 были сконструированы полноразмерные антитела человека fh1F4, fh1I6, fh2I19 и fhb9. Эти эксперименты проводились в ходе совместных исследований с Институтом биоорганической химии им. М.М. Шемякина и А.Ю. Овчинникова. Схема получения этих антител была такой же, как и для полноразмерного антитела, направленного к вирусу Эбола.
s1I6 kaff=(1.50.3)107, M-2. s1F4 kaff=(1.60.3)107, M-1. s2I19 kaff=(9.13.8)106, M-1. sb9 kaff=(3.140.53)108, M-1.1.1.0.0.0.0.0.1E-10 1E-9 1E-8 1E-7 1E-6 1E-концентрация антитела, M Рис. 32. Определение констант аффинности одноцепочечных антител с использованием непрямого ИФА.
ОД, 405 нм Сконструированные антитела продуцировались в клетках человека HEK293T в результате транзиентной экспрессии соответствующих пар плазмид, несущих гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи этих антител. Очистку рекомбинантных антител из культуральной жидкости проводили методом аффинной хроматографии на колонке с носителем Protein G Sepharose 4 Fast Flow.
Специфичность полноразмерных антител подтверждали с помощью иммуноблот-анализа белков ВОВ, ВОК и ВНО, Braz 131 (рис. 33). Результаты подтвердили сохранение специфичности сконструированных полноразмерных антител по сравнению со специфичностью исходных одноцепочечных антител.
Рис. 33. Вестерн-блот анализ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M белков ортопоксвирусов:
1,2,3 - связывание антитела fh1F4 с ВОВ, ВОК и ВНОBrazil 131, соответственно;
4, 5, 6 - связывание антитела fh1I6 с ВОВ, ВОК и ВНО- Brazil 131, соответственно, 7,8,9 - связывание антитела fh1I6 с ВОВ, ВОК и ВНОBrazil 131, соответственно, 10 - контроль коньюгата, - связывание МКА 2D5 с ВОВ, 12 - ВОВ, М - маркер молекулярных масс.
Для всех сконструированных полноразмерных антител с использованием ИФА были определены константы аффинности (рис. 34).
fh1I6 kaff=(4.41.9)12. fh2I19 kaff=(1.50.2)12. fh1F4 kaff=(9.61.3)11. fhb9 kaff=(1.50.2)11.1.1.1.0.0.0.0.1E-11 1E-10 1E-9 1E-8 1E-7 1E-концентрация антитела, M Рис. 34. Определение констант аффинности сконструированных полноразмерных антител человека с использованием непрямого ИФА.
ОД, 405 нм Константы аффинности этих антител, по нашим оценкам, оказались:
fh1F4 - (3,5 0,4) 109 М-1;
fh 1I6 - (4.4 1.9) 109 М-1;
fh2I19 - (1.5 0.2) 108 М-1;
fhb9 - (1.5 0,3) 109 М-1.
Наличие вируснейтрализующих свойств у полученных полноразмерных рекомбинантных антител человека проверялось в реакции нейтрализации ВОВ в культуре эукариотических клеток Vero E6 (рис. 35). Исследование проводили при постоянном титре ВОВ, 250 БОЕ/мл. В качестве положительного контроля использовали МКА мыши 2D5 (Ichihashi and Oie, 1996). Результаты показали, что только антитело fhb9, сконструированное на основе вариабельных доменов, отобранных из иммунной библиотеки, обладало вируснейтрализующей активностью, как и исходное одноцепочечное антитело b9.
1Рис. 35. Нейтрализация инфекционности ВОВ полноразмерными рекомбинатными антителами человека против ортопоксвирусов в культуре клеток Vero E6.
Концентрация антител fh1F4, fh1I6 и fh2I19 - 40 мкг/мл, fhb9 - 25 мкг/мл, МКА 2D5 - 0.мкг/мл. Титр ВОВ - 250 БОЕ/мл fh1F4 fh1I6 fh2I19 fhb9 2DПолноразмерные антитела человека fh1F4, fh1I6 и fh2I19 выраженными вируснейтрализующими свойствами, не обладали. Однако наблюдалось достоверное ингибирование бляшкообразования в культуре клеток Vero E6, приблизительно на 40% для антител fh1F4 и fh1I6, а для анитела fh2I19 - на 32% (рис. 35). Эти антитела были отобраны из синтетической библиотеки, и исходные одноцепочечные антитела 2I19, 1F4 и 1I6 вируснейтрализующими свойствами не обладали.
Известно, что добавление неинактивированной сыворотки неиммунного человека усиливает вируснейтрализующие свойства антител. Предполагается, что основную роль в этом играют белки комплемента, способствуя нейтрализации вирусов путем разрушения инфицированных клеток или лизиса самих оболочечных вирусов (Weiss, 2002; Zinkernagel, 2002). Поэтому нами была исследована нейтрализация ВОВ при совместной инкубации с антителом fh1F4 и сывороткой невакцинированного против ВОВ донора в разведении 1:100 (рис. 36).
Было показано, что процент ингибирования бляшкообразования в пробе с добавленной сывороткой увеличился до 53%, по сравнению с пробой, содержащей только полноразмерное антитело. Аналогичный эффект был обнаружен в работе (Lustig et al., 2004) на примере поликлональных антител к мембранному белку АВОВ. Эти антитела не обладали вируснейтрализующей активностью (Galmiche et al., 1999), однако, добавление к ним комплемента обеспечило лизис вирусной мембраны (Lustig et al., 2004).
уровень нейтрализации,% 1Рис. 36. Ингибирование инфекционности ВОВ полноразмерным антителом человека fh1F4, использованном в концентрации 0.мг/мл, совместно с сывороткой невакцинированного против ВОВ чдонора в разведении 1:100 на культуре клеток Vero E6.
Титр ВОВ - 250 БОЕ/мл, концентрация контрольного МКА 2D5 - 62 нг/мл.
Изучение механизмов нейтрализации вирусов проводилось рядом исследователей (Dimmock, 1993; Burton, 2001; Klasse and Sattentau, 2002; Reading andDimmock, 2007). В последнее время сложилось представление о существовании различных механизмов вирусной нейтрализации (рис. 37), опосредуемой антителами (Reading and Dimmock, 2007). При этом различные антитела могут нейтрализовать инфекционность одного и того же вируса с помощью различных механизмов (Reading and Dimmock, 2007).
Вируснейтрализующие одноцепочечные антитела, обнаруженные в данной работе, не способны осуществлять нейтрализацию путем аггрегации вирионов, поскольку имеют только один антигенсвязывающий домен. Вместе с тем, мы показали, что большинство из этих вируснейтрализующих антител - 3VA10, b9, d2 и т.д., связывали белок р35 ортопоксвирусов, продукт трансляции ОРТ H3L вируса осповакцины. Известно, что белок H3L обладает способностью связываться с поверхностью клетки через глюкозаминогликаны клеточной поверхности и, таким образом, задействован в процессе проникновения вируса в клетку (Ichihashi et al, 1996; Hsiao et al,1999). Более того, было показано, что рекомбинантный белок H3L конкурирует с вирусом осповакцины в процессе присоединения вируса к клетке (Lin et al, 2000). Делеция по гену H3L вируса осповакцины приводит к уменьшению размера вирусных бляшек в культуре клеток, понижению в 10 раз титра IMV и EEV и уменьшению инфекционности полученных вирионов. Исходя из этих данных, можно Рис. 37. Схема возможных механизмов вирусной нейтрализации посредством антител.
уровень нейтрализации,% а а к к D от fh1Fрот о ор в ыв ы с с 1F4+ h f предположить, что вируснейтрализующие антитела, связывающие белок H3L, ингибируют вирусную инфекционность, блокируя эпитоп H3L, отвечающий за присоединение к специфическим клеточным рецепторам.
Известно, что использованное нами в качестве контрольного МКА 2Dнаправлено к миристилированному мембранному белку, кодируемому ОРТ L1R ВОВ (Ichichashi et al., 1996). Показано, что белок L1R необходим для протеолитического процессинга коровых белков p4b, p4a, VP8 (Ravanello and Hruby, 1994) и для проникновения вируса в клетку (Ichihashi et al, 1996; Wolffe et al, 1995). Вероятно, МКА 2D5 ингибирует вирусную инфекционность, блокируя эпитоп, отвечающий за присоединение к специфическим клеточным рецепторам, экспонированный на белке L1R. Эти факты подтверждают гипотезу о сложном, опосредованном несколькими белками, механизме проникновения ортопоксвирусов в клетку и о наличии нескольких рецепторов к ортопоксвирусам на поверхности клетки.
В целом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что нами отработан весь путь получения полноразмерных антител человека, обладающих вируснейтрализующими свойствами в отношении ортопоксвирусов: от конструирования комбинаторной библиотеки мини-антител человека до создания на основе вариабельных доменов, отобранных из этой библиотеки, полноразмерных антител. Проведение дальнейших исследований, включая доклинические, позволит сделать вывод о применимости сконструированных полноразмерных антител для создания на их основе средств профилактики и лечения поствакцинальных осложнений и ортопоксвирусных инфекций. Кроме того, полученные панели миниантител и полноразмерных антител, направленных к ортопоксвирусам, могут быть использованы в качестве инструмента исследования иммунологического профиля ортопоксвирусов. Картирование с их помощью видоспецифических эпитопов и антигенных детерминант, индуцирующих образование вируснейтрализующих антител, позволит лучше понять молекулярные механизмы вирулентности ортопоксвирусов и предоставит необходимую информацию для разработки вакцин нового поколения.
ВЫВОДЫ 1. Создана экспериментально-методическая база для получения рекомбинантных антител человека методами фагового дисплея, что позволило впервые получить одноцепочечные антитела человека, направленные к вирусным патогенам, включая особо опасные вирусы.
2. Сконструированы две натуральные комбинаторные библиотеки одноцепочечных антител человека: наивная библиотека и иммунная библиотека одноцепочечных антител человека к ортопоксвирусам. Размер библиотек достигал 3107 и 21независимых трансформантов, соответственно. Иммунная библиотека к ортопоксвирусам создана впервые.
3. На основе сконструированных нами иммунной и наивной библиотек и имеющейся синтетической библиотеки Griffin-1 проведен комплекс работ по получению и изучению рекомбинантных антител человека, направленных к различным антигенам.
В рамках исследования:
а) впервые получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека, направленных к инфекционному вирусу натуральной оспы, штаммы Ind3A (variola major) и Butler (variola minor alastrim), и другим ортопоксвирусам; константы аффинности отобранных антител составляли от 106 до 108 М-1;
б) впервые получены одноцепочечные антитела человека, обладающие вируснейтрализующей активностью в отношении вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии;
в) показано, что большая часть вируснейтрализующих одноцепочечных антител связывала продукт открытой рамки считывания ORT H3L, антитела к которому преобладают в сыворотке людей, вакцинированных вирусом осповакцины;
г) впервые выявлены одноцепочечные антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы;
д) на основе одноцепочечных антител человека, направленных к ортопоксвирусов, сконструированы полноразмерные антитела человека fhb9, fh1F4, fh1I6 и fh2I19, константы аффинности которых достигали 108 - 109 М-1; показано, что антитело fhb9 способно ингибировать инфекционность ортопоксвирусов;
е) впервые создана и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека к вирусу Эбола, с константами аффинности от 106 до 107 М-1;
ж) сконструировано полноразмерное антитело человека, специфически взаимодействующее с нуклеопротеином вируса Эбола с константой аффинности (7.71.5) х 107 М-1;
з) получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека к ФНО с константами аффинности от 107 до 108 М-1.
4. Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli.
Введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного линейного эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (НВs), содержащего два остатка цистеина, обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью моноклональных антител, направленных к основной антигенной детерминанте НВs-антигена. С использованием сконструированных векторов получены мономерные и димерные формы одноцепочечных антител, направленные к гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита; продемонстрирована их способность конкурировать с исходными моноклональными антителами за связывание с вирусом клещевого энцефалита; измерены их константы диссоциации, которые составили (9.2 0.2) 10-8 М1 и (3.2 0.3) 10-8 М1, соответственно.
5. Созданы и охарактеризованы бактериальные штаммы-продуценты одноцепочечных антител человека, направленные к вирусу Эбола, к ортопоксвирусам, включая вирус натуральной оспы и оспы обезьян, к ФНО;
мономерные и димерные одноцепочечные антитела, направленные к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита; штаммпродуцент рекомбинантного белка р35 вируса оспы коров. Штаммы депонированы в коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГН - ВБ Вектор Роспотребнадзора.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ, ОПУБЛИКОВАННОЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах 1. Дубровская В. В., Улитин А.Б., Ламан А.Г., Гилева И.П., Бормотов Н.И., Ильичев А.А., Бровка Ф.А., Щелкунов С.Н., Беланов Е.Ф., Тикунова Н.В. Конструирование комбинаторной иммунной клонотеки одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов и селекция из нее антител к рекомбинантному белку prA30L вируса натуральной оспы.// Мол. биол. 2007, т. 41, № 1, с. 173-185.
2. Дубровская В. В., Тикунова Н. В. Получение одноцепочечных антител человека к основному иммунодоминантному белку ортопоксвирусов. //Вестник НГУ.-2007.Том 5.-выпуск 1. c. 100-105.
3. Юн Т.Э., Тикунова Н.В., Шингарова Л.Н., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Морозова В.В., Швалов А.А., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина А.А., Ильичев А.А., Кирпичников М.П., Сандахчиев Л.С. Полноразмерное рекомбинантное антитело человека против вируса осповакцины. //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2007, т. 407: №5, с. 98-101.
4. Батанова Т.А., Улитин А.Б., Морозова В.В., Ламан А.Г., Жираковская Е.В., Воронина В.В., Бровко Ф.А., Тикунова Н.В. Создание и характеризация наивной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека. //Мол. Ген.
Вирусол. И микробиол. 2006, № 3, с. 35-41.
5. Тикунова Н.В., Батанова Т.А., Чепурнов А.А. Рекомбинантные антитела человека против вируса Эбола: селекция и характеризация. //Вопр. Вирусол. 2005, т. 50, № 5, с. 25-29.
6. Тикунова Н.В., Бовшик Е.И., Юн Т.Э., Жираковская Е.В., Морозова В.В., Батанова Т.А., Гуськов А.А., Сокунова Е.Б., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С..
Рекомбинантные антитела человека против вируса натуральной оспы. //Вопр.
Вирусол. 2005, т. 50, № 6, с. 20-25.
7. Морозова В.В., Тикунова Н.В., Батанова Т.А., Юн Т.Э., Бовшик Е.И., Жираковская Е.В., Воронина В.В., Бобко Д.И., Беланов Е.Ф., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Мини-антитела человека против ортопоксвирусов. //Вестник РАМН, 2004, № 8, с. 22-27.
8. Тикунова Н.В., Беланов Е.Ф., Морозова В.В., Батанова Т.А. Бормотов Н.И., Овечкина Л.Г., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Фаговые антитела способны нейтрализовать вирусы. //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2002, т.382, №1, с. 124-126/ 9. Николенко Г.Н., Протопопова Е.В., Ильичев А.А., Коновалова С.Н., Карпенко Л.И., Локтев В.Б., Порываева В.А., Тикунова Н.В. Рекомбинантные антитела к вирусу клещевого энцефалита. //Вопр. Вирусологии, 2002, №5, c. 31-36.
10. Tikunova N.V., Morozova V.V., Batanova T.A., Belanov E.F., Bormotov N.I., Ilyichev A.A. Phage antibodies from combinatorial library neutralize vaccinia virus. //Himan Antibodies, 2001, v.10, p. 95-99.
11. Тикунова Н.В., Колокольцов А.А., Чепурнов А.А. Рекомбинантные моноклональные антитела человека против вируса Эбола. //ДАН, 2001, т. 378, № 4, с. 551-554.
12. Тикунова Н. В., Николенко Г. Н., Протопопова Е. В., Котелкин А. Т., Локтев В. Б., Белавин П. А., Нетесова Н. А., Деев С. М., Ильичев А. А. Получение одноцепочечных антител против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. // Вопр. Вирусологии, 1999, №1, c. 12-15.
13. Ильичев А.А., Меламед Н.В., Тикунова Н.В. Нитевидный бактериофаг М13 в бинарной системе экспрессии, основанной на РНК-полимеразе Т7. // Биотехн., 1997, № 1, с. 12-20.
14. Николенко Г. Н., Головин С. Я., Виноградов С. М., Ильичев А. А., Тикунова Н. В.
Клонирование и секвенирование гена, кодирующего одноцепочечный иммуноглобулин (scFv) на поверхностный гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита.// Жур. Инфекц. Патологии, 1996, т. 3, № 4, с. 47-52.
15. Тикунова Н.В., Головин С.Я., Микрюков Н.Н., Хрипин Ю.Л., Черненко В.Ю., Иванов В.Г., Ильичев А.А., Петренко В.А.Синтез, клонирование и определение первичной структуры кДНК 1-антитрипсина человека. //Биоорг. Химия, 1991, т.
17, № 12, с.1694-1697.
Патенты 1. Николенко Г. Н., Тикунова Н. В., Головин С. Я., Протопопова Е. В., Локтев В. Б., Деев С. М, Ильичев А. А Рекомбинантная плазмидная ДНК pTLS, содержащая ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Патент РФ №-2158309. 2000 г.
2. Николенко Г. Н., Тикунова Н. В., Протопопова Е. В., Локтев В. Б., Карпенко Л.И., Коновалова С.Н., Ильичев А. А Рекомбинантная плазмидная ДНК p7SHSHis для продукции димерных одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент димерной формы одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Патент РФ № 2190017. 2002 г.
3. Шингарова Л.Н., Тикунова Н.В., Юн Т.Э., Батанова Т.А., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина А.А., Кирпичников М.П., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCL1, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса Эбола, рекомбинантная плазмидная ДНК pCH1, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи указанного антитела, и их применение. Патент РФ № 2285043. 2006 г.
4. Батанова Т.А., Тикунова Н.В., и Юн Т.Э. Рекомбинантная фагмидная ДНК pHENTAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека. //Заявка на патент РФ, справка о приоритете № 2005129664 от 22.09.05.
Решение о выдачи патента от 07.03.07.
5. В. В. Дубровская, Н. В. Тикунова, В. В. Морозова, Н. И. Бормотов, А. Г. Ламан, А.
Б. Улитин, Ф. А. Бровко, Е. Ф. Беланов, А. А. Ильичев Комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против вируса осповакцины, рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-3A10, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека, способного нейтрализовать ортопоксвирусы, и искусственное одноцепочечное антитело человека 3A10, способное нейтрализовать ортопоксвирусы.// Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2005125994 от 15.08.05. Решение о выдачи патента от 24.05.07.
6. Тикунова Н.В., Шингарова Л.Н., Юн Т.Э., Морозова В.В., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина А.А., Кирпичников М.П., Ильичев А.А. и Сандахчиев Л.С. Рекомбинантные плазмидные ДНК pCL37 и pCH37, кодирующие полипептиды со свойст-вами легкой и тяжелой цепей антитела человека против вируса осповак-цины, обеспечивающие совместно биосинтез полноразмерных антител человека против вируса осповакцины в клетках млекопитающих, и рекомбинантное полноразмерное антите-ло человека класса IgG1, взаимодействующее с вирусом осповакцины. Заявка на патент РФ.
Справка о приоритете № 2006100694 от 16.01.06. Решение о выдачи патента от 30.07.07.
Опубликовано 38 тезисов и статей в сборниках конференций.