Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Мария Георгиевна Самсонова
ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СЕГМЕНТАЦИИ У ДРОЗОФИЛЫ
03.00.28 - биоинформатика
Автореферат диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2008
Работа выполнена в отделе компьютерной биологии Центра перспективных исследований СанктПетербургского государственного политехнического университета.
Научный консультант: Сергей Георгиевич Инге-Вечтомов доктор биологических наук, профессор, академик РАН
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Л.В.Омельянчук доктор биологических наук, профессор А.А.Миронов доктор биологических наук, профессор А.П.Перевозчиков
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН
Защита диссертации состоится У____Ф __________ 2008 г. на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учной степени доктора биологических наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.
тел. (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан У____Ф __________ 2008 г.
Учный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев 1
Общая характеристика работы
Работа посвящена исследованию механизмов детерминации сегментов в морфогенетическом поле сегментации у плодовой мушки дрозофилы.
Морфогенетическое поле является основным элементом онтогении, и, как физически обособленная область, формируется в результате сложных координированных взаимодействий составляющих его компонент - генов, транскриптов и белков. Эти взаимодействия приводят к тому, что каждая клетка поля становится детерминированной, выбирая один из многих возможных путей развития (Белоусов, 2005). Детерминация сегментов происходит в морфогенетическом поле, представляющем собою ту часть эмбриона, из которой в будущем разовьется зародышевая полоска (Корочкин, 2002; Gilbert, 2003), и приводит к определению положения границ парасегментов (Martinez-Arias and Lawrence, 1985). Физическими компонентами морфогенетического поля сегментации являются гены сегментации и их продукты (см. раздел 2.1).
Выполненный комплекс исследований был ориентирован на создание оригинальных методов получения количественных данных из изображений картин экспрессии генов, изучение особенностей динамики экспрессии генов сегментации, математическое моделирование экспрессии генов gap в циклах 13 и 14А, а также создание атласа пространственно-временной экспрессии генов.
1.1
Актуальность темы Несмотря на большой объем информации о регуляторных взаимодействиях генов сегментации (Akam, 1987; Ingham, 1988; Корочкин, 2002), знания о механизмах регуляции этих генов, и в особенности, о механизмах экспрессии генов gap, являются далеко не полными. Это, с одной стороны объясняется неполнотой экспериментальных данных о регуляторных взаимодействиях, с другой - методологическими трудностями, которые возникают, когда вывод о регуляторном взаимодействии у многоклеточного организма делается на основе качественного анализа экспрессии гена у мутантов. Кратко эти трудности можно обозначить как проблемы непротиворечивости, уникальности и полноты предполагаемого регуляторного механизма.
Для доказательства непротиворечивости гипотетического регуляторного механизма требуется учет вклада всех регуляторов исследуемого гена. Современные экспериментальные методы, однако, имеют ограниченную возможность одновременного анализа влияния всех регуляторов на данный ген, поскольку они основаны на анализе картин экспрессии у мутантов, а получение организмов с мутациями более чем в трех регуляторах часто является непростой задачей. Более того, генная сеть у мутантов по определению состоит из неполного, или дефектного набора регуляторных взаимодействий генов. Таким образом, выводы о структуре генной сети дикого типа приходится делать на основании данных многих экспериментов с мутантами. Непротиворечивость же выявленных взаимодействий может быть продемонстрирована только при проверке их в интактном развивающимся организме, содержащем полный набор регуляторов.
Другая проблема, возникающая при интерпретации картин экспрессии у мутантов, состоит в доказательстве уникальности механизма взаимодействия, т.е. доказательстве того, что данное регуляторное взаимодействие является прямым, а не опосредованным. Такие доказательства требуют проведения дополнительных экспериментов.
И наконец, существует фундаментальная проблема демонстрации полноты выявленных регуляторных взаимодействий. Действительно, необходимость материнских генов и генов gap - физических компонент морфогенетического поля сегментации - для правильной экспрессии генов gap не означает достаточности этого набора генов. В принципе доказательство достаСегменты - последовательно чередующиеся морфологические структуры тела дрозофилы точности выявленного регуляторного механизма невозможно без реконструкции системы ab initio из отдельных, хорошо контролируемых компонентов. Очевидно, что современные экспериментальные методы не позволяют провести такую реконструкцию, и, следовательно, она должна быть проведена in silico с помощью математического моделирования и численных расчетов (Ратушный et al., 2005).
Другой вопрос, один из самых важных в эмбриологии, состоит в выяснении механизма детерминации клеток и частей зародыша. В основе этого механизма лежит активация тех или иных генов в разных клетках, что приводит к возникновению пространственно неоднородной картины экспрессии генов ("узора"или так называемого паттерна). У дрозофилы детерминация сегментов определяет положение парасегментных, а не сегментных границ. Образование парасегментов предшествует формированию сегментов на более поздних стадиях развития.
В морфогенетическом поле сегментации сегментный препаттерн образуют полосы экспрессии генов segment polarity (Lawrence and Johnston, 1989; Martinez-Arias and Lawrence, 1985; Ingham and Martinez-Arias, 1992; Жимулев, 2003).
Классическое объяснение механизмов детерминации было предложено в 1969 году Л.Волпертом, сформулировавшим теорию позиционной информации (Wolpert, 1969; Wolpert, 1989).
Согласно этой теории судьба клетки определяется ее положением в определенном пространственном поле зародыша, в котором существует градиент концентрации некой сигнальной молекулы, называемой морфогеном. Считывание информации о градиенте морфогена и ее интерпретация приводят к дифференциации клеток в том или ином направлении в зависимости от уровня концентрации морфогена.
У дрозофилы продукт материнского координатного гена bcd является классическим примером морфогена (Driever and Nsslein-Volhard, 1988b; Driever and Nsslein-Volhard, 1988a;
Ephrussi and St Johnston, 2004). Проведенные в последнее время генетические и теоретические исследования указывают на то, что действие одного лишь морфогена Bcd недостаточно для возникновения прострвнственно неооднородной картины экспрессии генов в бластодерме дрозофилы. В нашей работе исследована динамика позиционирования областей экспрессии генов сегментации, и на основе полученных данных обсуждается адекватность концептуальной модели Л.Волперта для объяснения механизмов формирования сегментного препаттерна в бластодерме дрозофилы.
Понимание принципов организации и функционирования морфогенетического поля сегментации требует детального количественного описания динамики каждой из его компонент.
Несмотря на высокую разрешающую способность, метод ДНК чипов так же, как и многие другие методы количественной оценки экспрессии генов (количественный PCR, CAT assays), имеет ограниченное применение для решения этой задачи. Дело в том, что все эти методы используют гомогенаты клеток и, таким образом, теряют информацию об экспрессии генов в пространстве. Перспективным является использование иммунофлуоресцентного маркирования биологических макромолекул в сочетании с лазерной конфокальной микроскопией, которая позволяет получать качественные цифровые изображения картин экспрессии генов, готовые для извлечения количественных данных об экспрессии путем компьютерной обработки.
Очевидно, что качество математического моделирования зависит от качества экспериментальных данных. Как было отмечено Х.Китано (Kitano, 2002) идеальный набор данных должен быть исчерпывающим по полноте оцениваемых компонент, измеряемых параметров и по охвату временной динамики, точным в количественном отношении, а также систематическим.
Последнее означает, что способ получения данных разных типов должен допускать их согласованную интеграцию. Хотя эти требования очевидны, в настоящее время лишь немногие наборы данных им удовлетворяют и, поэтому, получение такого набора данных по экспрессии генов сегментации имеет важное значение.
Эффективное использование количественных данных по экспрессии генов сегментации требует организации набора данных в виде базы данных, что обеспечит эффективное хранение и выборку информации, а также облегчит анализ данных, нацеленный на выявление новых биологических закономерностей изучаемого процесса и формулировку новых гипотез для их направленной проверки в экспериментах. Отметим, что по своей сути такая база данных будет пространственно-временным атласом экспрессии генов, поскольку она хранит количественную информацию об экспрессии в разных точках морфогенетического поля и в разные моменты времени.
1.2 Цели работы Цели диссертационной работы состояли в том, чтобы:
1. Разработать новый конвейерный метод количественной оценки уровня экспрессии главных компонент морфогенетического поля сегментации у дрозофилы - генов сегментации - на основе изображений, полученных с помощью конфокальных микроскопов. Этот метод должен включать сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных.
2. Получить исчерпывающий по полноте, точный в количественном отношении и систематический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого индивидуального эмбриона, а также эталонные, интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации в каждой области эмбриона в разные моменты времени;
3. Изучить динамику формирования областей экспрессии генов в морфогенетическом поле сегментации путем оценки положения каждой области в разные моменты времени;
4. Создать математическую модель механизмов регуляции экспрессии генов gap в цикле деления ядер 14А. Примененить эту модель для in silico реконструкции сети генов gaр и выявления механизмов, обеспечивающих сдвиги границ областей экспрессии этих генов;
5. Для облегчения работы теоретиков и биологов с данными создать пространственновременной атлас экспрессии генов сегментации в виде реляционной базы данных, доступной в сети Интернет.
1.3 Объекты и методы исследования Основным объектом исследования являлись 1580 эмбрионов мух дикого типа (Oregon-R), окрашенные методом непрямого иммунофлуоресцентного маркирования для выявления белковых продуктов материнских координатных генов bicoid (bcd) и caudal (cad), генов gap Krppel (Kr), knirps (kni), giant (gt), hunchback (hb), tailless (tll) и генов pair-rule even-skipped (eve), fushitarazu (ftz), hairy (h), runt (run), odd-skipped (odd), sloppy-paired (slp) и paired (prd). Примерно половина из этих эмбрионов была также прокрашена на гистоновые белки для подсвечивания областей изображения, относящихся к ядрам. 4490 изображений картин экспрессии выше перечисленных генов сегментации у эмбрионов были получены в лаборатории проф. Райница (Университет Стони Брук, США) с помощью конфокальных микроскопов Leica TCS4D и Leica TS-SP2. Эти изображения имеют размер 1024 x 1024 пикселей; для записи сигнала используется восьмибитовый формат и настройки микроскопа, уменьшающие уровень шума в регистрируемом сигнале, а также процедура сканирования, позволяющая получить согласованные данные по экспрессии одного гена в индивидуальных эмбрионах, сканированных в разных экспериментах (Kosman et al., 1997; Kosman et al., 1998). Для сканирования выбирались эмбрионы разного возраста, начиная с 10 цикла дробления ядер и кончая гаструляцией.
Для извлечения количественных данных из изображений наряду с оригинальными методами, разработанными в данной работе, использовали стандартные методы обработки изображений (Gonzalez and Woods, 2002).
Поскольку экспрессия генов сегментации, главным образом, является функцией положения ядра вдоль передне-задней (A-P) оси, ее распределение по телу эмбриона достаточно хорошо может быть представлено в одном измерении. Ввиду этого, достаточным представляется анализ количественных данных из центральной 10% (по оси y) полоски, вырезанной в направлении A-P, т.е. вдоль оси x. Таким образом, каждому ядру сопоставляется лишь его x-координата, и картины экспрессии имеют вид графиков, отражающих изменение экспрессии генов вдоль оси x. Для описания областей одномерной картины экспрессии генов использовали аппроксимацию квадратичными сплайнами или быстрое избыточное двоичное вейвлет-преобразование с автоматическим определением требуемого уровня декомпозиции картины экспрессии и визуальным контролем качества автоматического выделения признаков. Для уменьшения размерности вектора признаков применяли факторный анализ.
Сдвиги областей экспрессии генов оценивали с помощью дисперсионного анализа. Для выяснения механизмов взаимодействия генов в сети генов gap, а также для объяснения механизмов сдвигов областей экспрессии этих генов проводили математическое моделирование; предсказанные регуляторные взаимодействия и гипотезы сопоставляли с литературными данными и данными эксперимента. Для создания пространственно-временного атласа экспрессии генов использовали реляционную СУБД IBM DB2, для реализации вэб-интерфейса пользователя применяли такие технологии, как HTML, JSP, Java-сервлеты, Java-апплеты и Java-скрипты.
1.4 Научная новизна работы В настоящей работе впервые Х разработан конвейерный метод получения количественных данных по экспрессии генов сегментации из конфокальных изображений картин экспрессии этих генов. Метод включает 5 процедур, а именно, сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных, которые можно применять последовательно и по отдельности;
Х получен полный, точный и систематический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1580 индивидуальных эмбрионов, а также интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации;
Х показано, что области экспрессии генов сегментации, локализованные в будущей зародышевой полоске, по мере своего формирования в цикле 14А смещаются к переднему полюсу эмбриона;
Х предложена математическая модель для предсказания механизмов регуляции экспрессии генов gap в цикле 14А, правильно воспроизводящая временную динамику экспрессии этих генов, степень перекрывания соседних областей экспрессии, а также воспроизводящая сдвиги границ областей экспрессии генов gap в ходе цикла 14А;
Х исследованы механизмы сдвигов центральной области экспрессии Kr, а также задних областей экспрессии kni и gt по направлению к переднему концу эмбриона;
Х создан пространственно-временной атлас экспрессии генов сегментации в виде реляционной базы данных FlyEx, доступной по сети Интернет.
1.5 Основные положения, выносимые на защиту 1. Компьютерная обработка цифровых изображений картин экспрессии генов, полученных с помощью конфокального микроскопа и иммунофлуоресцентного маркирования биологических макромолекул, может быть использована для получения количественных данных по экспрессии генов in situ.
2. Количественное описание пространственно-временной динамики компонент морфогенетического поля сегментации необходимо для понимания механизмов его функционирования.
3. Сдвиги областей экспрессии генов сегментации важны для позиционирования областей экспрессии генов-мишеней и играют важную роль в формировании сегментного препаттерна.
4. Материнские гены bcd,cad и гены gap Kr, kni, gt, hb, tll не только необходимы, но и достаточны для правильной экспрессии генов gap в будущей зародышевой полоске.
5. Позиционная информация в бластодерме дрозофилы задается динамически меняющейся во времени комбинацией концентраций продуктов материнских и зиготических генов. В каждый момент времени эта комбинация определяется не только материнскими морфогенами, но и сдвигами границ областей экспрессии генов сегментации из-за регуляторных взаимодействий. Это толкование подразумевает активный, а не пассивный способ интерпретации градиента морфогена и размывает границу между формированием и интерпретацией позиционной информации.
1.6 Практическое значение работы Научно-практическая значимость работы состоит в том, что в ней впервые разработан и успешно применен метод конвейерной обработки картин экспрессии генов сегментации с целью получения количественных данных по экспрессии генов. Метод был успешно адаптирован для обработки данных по экспрессии генов сегментации на уровне мРНК (Janssens et al., 2006), для обработки оптических срезов изображений картин экспрессии генов в ядрах эмбриона дрозофилы, а также для маскирования экспрессирующих областей и получения количественных данных по экспрессии генов в раннем развитии коралла Acropora millepora и морского анемона Nematostella vectensis (Kozlov et al., 2007). Все это позволяет считать разработанный метод важным инструментом извлечения количественной информации из изображений картин экспрессии генов. Отметим также, что в силу универсальности большинства процедур разработанный метод может с небольшими модификациями применяться для обработки широкого спектра биологических изображений и, таким образом, представляет интерес для широкого круга ученых в области молекулярной биологии.
В качестве одной из процедур конвейерного метода предложен новый метод определения возраста эмбриона в цикле развития 14А, основанный на анализе динамичных картин экспрессии гена eve, окрашенного у всех эмбрионов, и стандартизации этих картин экспрессии относительно возраста эмбриона, определенного в эксперименте. Этот метод позволяет автоматизировать процедуру предсказания возраста, делает ненужным трудоемкое определение возраста экспериментальным путем и, таким образом, является важным усовершенствованием метода определения возраста эмбриона дрозофилы в раннем эмбриогенезе.
Количественные данные по экспрессии генов сегментации, полученные в данной работе, уникальны по охвату временной динамики, точны, имеют клеточное разрешение и получены в результате систематических и масштабных экспериментов, проводимых в одной лаборатории и с использованием одних и тех же стандартизованных методов. Эта особенность сделала полученные данные исключительно востребованными мировым сообществом, использующим их как в теоретических исследованиях, так и для изучения механизмов сегментации, см. например, Holloway et al., 2003; Pereanu and Hartenstein, 2004; Diambra and da Costa, 2005;
Aegerter-Wilmsen et al., 2005; Isalan et al., 2005; Ludwig et al., 2005; Holloway et al., 2006; Krishna et al., 2005; Ochoa-Espinosa et al., 2005; Perkins et al., 2006; Yucel and Small, 2006; Zinzen and Papatsenko, 2007; Bergmann et al., 2007.
Созданный пространственно-временной атлас экспрессии генов сегментации FlyEx является открытым ресурсом, широко используемым мировым сообществом биологов и биоинформатиков. Так например, в 2006 году общее количество обращений к FlyEx составило более 260000.
В работе исследуется центральный вопрос эмбриологии - механизмы детерминации клеток и частей зародыша в морфогенетических полях. Помимо этого, выполненные исследования имеют важное значение для лучшего понимания медицинских аспектов развития, а совокупность разработанных методов и моделей формирует, в конечном итоге, методологическую базу для реконструкции генной сети организма при отсутствии или ограниченном использовании мутагенеза.
1.7 Апробация работы Результаты диссертационной работы были доложены на конференциях: Computational Cell Biology Workshop [CSHL 2007] (Cold Spring Harbor, USA, 2007); Санкт-Петербургской международной конференции по нанобиотехнологии, пленарный доклад, (Санкт-Петербург, 2006);
3 Workshop on Data Integration for the Life Sciences [DILS2006] (Hinxton, UK); 1, 3, 4 и International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure [BGRSТ1998, 2002, 2004, 2006], в 2006 г. - приглашенный доклад (Новосибирск, 1998, 2002, 2004 и 2006); 3 и 4 TICSP Workshop on Computational Systems Biology, приглашенные доклады (Tampere, Finland, 2005 и 2006); 2, 3 и 4 International Symposium on Networks in Bioinformatics, в 2005 и 2006 г.г. - приглашенные доклады, [ISNB 2005, 2006, 2007] (Amsterdam, the Netherlands, 2005, 2006 и 2007); NETTAB 2005 workshop, Workflows management: new abilities for the biological information overflow (Naples, Italy, 2005); 2d Integrative Bioinformatics Workshop, приглашенный доклад, (Bielefeld, Germany, 2005); 42, 44, 45 и 46 Annual Drosophila Research Conferences, (Washington DC, San Diego, Washington DC и Chicago, USA, 2001, 2003, 2004 и 2005); Intl. Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow, Russia, 2003); 7, и 11 Int. Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology [ISMB99, ISMB02, ISMB03], в 1999 г. - премия SGI за лучший доклад на конференции, (Heidelberg, Germany, 1999;
Edmonton, Canada, 2002; Brisbane, Australia, 2003); Computation in Cells: EPSRC Emerging Computing Paradigms Workshop, приглашенный доклад, (Hertfordshire, UK, 2000) и т.д.
С использованием материалов диссертации автором сделано 2 приглашенных доклада в Lawrence Berkeley National Laboratory, USA (2002 и 2006 гг.), доклад на Московском семинаре по биоинформатике (2006), приглашенные доклады в 2003 г. в Genetics Department, Cambridge University (UK) и в Bioinformatics Research Centre, University of Glasgow (UK), приглашенные доклады в 2005 г. на Вioinformatiсs Сolloquium, Georg-August-Universitat Gottingen (Germany) и на Waterman Seminars, the Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK, Germany), приглашенный доклад в Laurence H. Baker Center for Bioinformatics and Biological Statistics Seminar Series, Iowa University, USA (2001), а также 2 приглашенных лекции на the Les Houches Summer School "Multiple Aspects of DNA and RNA: from biophysics to bioinformatics"(2004). Также сделаны 3 приглашенных доклада на семинарах Dagstuhl: 3d Dagstuhl Seminar for Information and Simulation Systems for the Analysis of Gene Regulation and Metabolic Pathways (2001); Dagstuhl Seminar 04281 "Integrative Bioinformatics - Aspects of the Virtual Cell (2004), Dagstuhl Seminar 03051, "Information and Process Integration: A Life Science Perspective"(2003) и многих других семинарах. Сделан также доклад на семинаре, организованном фирмой Leica, "Современные конфокальные микроскопы фирмы Leica и их применение в биологии"(Санкт-Петербург, 2006).
Кроме того результаты работы обсуждались на Санкт-Петербургском семинаре по компьютерной биологии, на семинарах кафедр эмбриологии и генетики Санкт-Петербургского государственного университета и были включены в лекцию на Международной школе-семинаре BGRS "Эволюция, системная биология и суперкомпьютерные вычисления в биоинформатике"в 2005 г. (Новосибирск, Россия).
1.8 Публикации По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ (все в соавторстве), в том числе 23 статьи в реферируемых научных журналах.
2 Структура диссертационной работы Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и библиографии (229 наименования). Ее полный объем составляет 165 страниц, количество рисунков 44.
2.1 Содержание работы Во Введении объясняются актуальность и цели работы, ее научная новизна, практическая значимость. Сформулированы положения, выносимые на защиту. Приведена информация об апробации работы, количестве публикаций автора, описана структура диссертации.
Первая глава УCовременные представления о детерминации сегментов у дрозофилыФ является обзором литературы.
У дрозофилы морфологически различимые границы сегментов формируются гораздо позднее того времени, когда происходит детерминация сегментов. Формированию границ сегментов предшествует кратковременное появление границ парасегментов, которые возникают во время удлинения зародышевой полоски посередине каждого будущего сегмента (Campos-Ortega and Hartenstein, 1985). Детерминация сегментов приводит к определению положения границ парасегментов (Martinez-Arias and Lawrence, 1985) и происходит в морфогенетическом поле, представляющем собою на стадии синцитиальной бластодермы и в цикле деления ядер 14А ту часть эмбриона, из которой разовьется зародышевая полоска (Gilbert, 2003).
Ранний этап развития дрозофилы включает стадию дробления и синцитиальную бластодерму. Стадия синцитиальной бластодермы продолжается с цикла деления ядер 10 по цикл деления 13. В это время ядра, мигрировавшие на периферию, образуют упорядоченный слой энергид (энергида - ядро, ассоциированное с участком цитоплазмы), прилегающий к поверхности эмбриона. Цикл деления ядер 14 - первый цикл последующей стадии, называемой клеточной бластодермой. Часть цикла 14, предшествующая гаструляции, называется циклом деления 14А. Во время цикла 14А ядра удлиняются вдоль собственной базально-апикальной оси и, вскоре после этого, начинается инвагинация мембран, которая обособляет ядра в отдельные клетки. Важно, что вплоть до полного образования клеточной мембраны каждая формирующаяся клетка сообщается с ниже расположенным желтком посредством цитоплазматических каналов. Это делает возможным обмен белками между соседними энергидами в течение всей стадии синцитиальной бластодермы и цикла деления 14А.
Главные физические компонены морфогенетического поля сегментации суть гены сегментации - идентифицированы, клонированы (Akam, 1987; Ingham, 1988) и подразделены на четыре группы. Материнские координатные гены (Nsslein-Volhard et al., 1987) экспрессируются материнским геномом и влияют на развитие переднего, заднего или терминальных районов эмбриона. Гены других групп gap, pair-rule и segment polarity являются зиготическими, т.е.
экспрессируются геномом эмбриона (Nsslein-Volhard and Wieschaus, 1980).
Большинство материнских координатных и зиготических генов сегментации кодируют транскрипционные факторы, которые регулируют экспрессию зиготических генов сегментации. Таким образом, гены сегментации образуют сеть взаимодействующих друг с другом геноврегуляторов. Анализ фенотипов двойных мутантов выявил иерархию регуляторных взаимодействий в этой генной сети (см. обзоры Akam, 1987; Ingham, 1988), в соответствии с которой гены более высоких уровней (например, материнские координатные гены) регулируют гены более низких уровней (например, гены gap), а не наоборот. Помимо этого выявлены существенные регуляторные взаимодействия между генами, принадлежащими к одному уровню иерархии.
Во второй главе "Материал и методы" приведена информация об объекте и методах исследования.
В третьей главе "Метод получения количественных данных по экспрессии генов сегментации" рассмотрен оригинальный метод, а также лежащие в основе него алгоритмы, разработанные для количественной оценки уровня экспрессии генов сегментации на основе изображений, полученных с помощью конфокального микроскопа. Предложенный метод обработки является конвейерным и включает 5 базовых процедур: сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных. Описана точность каждой из разработанных процедур.
Результаты представлены в статьях A3, A5, A6, A8, A9, A15, A16, A17, A19, A20, A21, A22, A25, A29, A31, A36, A38, A40, A42, A43, А45.
Сегментация изображений включает четыре этапа: (1) приведение экспериментального изображения к стандартной ориентации, так чтобы передний конец эмбриона находился слева, а спинная часть сверху; (2) выделение области, занимаемой объектом на изображении, и отсечение пустой области по краям; (3) построение "ядерной маски"эмбриона, то есть бинарного изображения, в котором только пиксели в границах ядер имеют ненулевую интенсивность; (4) вычисление координат центроидов ядер и средней интенсивности флуоресценции в каждом ядре для каждого канала микроскопа, т.е. для каждого продукта сканированного гена. Среднюю интенсивность флуоресценции считаем пропорциональной уровню экспрессии гена (Kosman et al., 1997).
Этап приведения изображения в стандартную ориентацию начинается с построения одного изображения на основе усреднения двух оптических срезов для каждого из трех генных продуктов, регистрируемых у одного эмбриона. Для изображений, прокрашенных на гистоновые белки, используемые в качестве ядерных маркеров, на основе этих двух срезов строим пиксельный максимум. Далее для каждого эмбриона создаем грубую маску путем конструирования попиксельного максимального изображения из четырех изображений, полученных в разных каналах микроскопа, и применения к этому изображению порогового и медианных фильтров, а также нескольких циклов эрозии и дилатации (Gonzalez and Woods, 2002). Маска эмбриона используется для вычисления угла, на который надо повернуть эмбрион, и для удаления случайных пикселей на границах.
На втором этапе строится гладкая маска эмбриона, которая в точности повторяет его форму. Для этого создаем новое изображение пиксельного максимума на основе предварительно повернутых и обрезанных изображений и к полученному изображению применяем последовательно выравнивание гистограммы, медианный и пороговый фильтры. К полученному бинарному изображению применяем трансформацию эвклидова расстояния, медианный и пороговый фильтры, что приводит к созданию маски с очертаниями, более соответствующими натуральным контурам эмбриона. С помощью алгоритма Шена-Кастана (Shen and Castan, 1986), заполнения и эрозии получаем новую гладкую маску всего эмбриона и используем ее для обрезания изображений, полученных во всех каналах микроскопа.
На третьем и четвертом этапах строится так называемая ядерная маска на основе изображения, прокрашенного на гистоновые белки, если оно имеется, или же на основе пиксельного максимума экспрессии трех остальных генов. Сначала для усиления контраста и уточнения границ ядер применяем локальное выравнивание гистограммы, удаляем гранулированный шум алгоритмом Кримминса и проводим несколько циклов медианной фильтрации. Далее, после инвертирования значений всех пикселей, создается изображение водораздела. Область водораздела определяется как территория, занятая одним ядром и ограниченная линией шириной в один пиксель. Каждая область водораздела характеризуется уникальным значением градации серого цвета. В результате применения эрозии и порогового фильтра это изображение преобразуется в бинарное, где границы водораздела имеют значение 0. После умножения этого бинарного изображения на изображение пиксельного максимума или изображение гистоновых белков, каждое ядро отделяется от соседних ядер границей из нулевых пикселей.
Эта операция позволяет разделить некоторые ядра, слившиеся на изображении. В завершение эрозия с последующим преобразованием расстояния (Vincent et al., 1997) и пороговым фильтром позволяют удалить из маски посторонние пятна, не являющиеся ядрами эмбриона.
Полученная бинарная маска используется для извлечения количественных данных об экспрессии генов. Координаты центроида каждого ядра вычисляются с помощью инвариантов моментов (Hu, 1962). Наложение маски на изображения, полученные в каждом канале микроскопа, позволяет вычислить средние концентрации продуктов всех сканированных генов в каждом ядре.
Конечный результат представляет собой таблицу, содержащую (x,y) координаты каждого ядра в процентах от длины и ширины эмбриона, а также усредненную интенсивность флуоресценции, или относительный уровень экспрессии для каждого из сканированных у данного эмбриона генов. Разработанная процедура извлечения количественной информации из биологических изображений реализована в оригинальном пакете ProStack (Processing of Stacks) для визуального построения сложных процедур обработки данных и изображений.
Качество построения ядерной маски обычно контролируется визуально путем ее наложения на изображение, полученное при сканировании гистонов, или на пиксельный максимум изображений, полученных в других каналах микроскопа. Для автоматизации нами предложен численный метод контроля качества ядерной маски, основанный на том, что разброс интенсивностей для пикселей внутри ядра должен быть меньше, чем таковой между пикселями внутри ядра и вне его.
Удаление фонового сигнала. Хорошо известно, что наряду со специфическим окрашиванием, методы иммунофлуоресцентного маркирования биологических образцов in situ приводят к появлению неспецифического сигнала, называемого фоном. Возникновение этого сигнала вызвано многими факторами, из которых важная роль принадлежит первичным и вторичным антителам. Неспецифический фон может быть убран вручную для каждого конкретного слайда путем установки значения оффсета. Однако, очевидно, что простой установкой оффсета невозможно добиться удаления фона из всех картин экспрессии всех генов ввиду того, что для каждой картины требуются свои установки для удаления фона.
Очевидно, что даже незначительный уровень фона исказит численное значение уровня экспрессии гена. Более того, уровень фона варьирует от эмбриона к эмбриону и от эксперимента к эксперименту, что не позволяет провести сравнение данных, полученных в разных экспериментах.
Разработанный нами метод удаления фонового сигнала основан на наблюдении, что уровень флуоресценции в нуль-мутантах, окрашенных на отсутствующий белок, хорошо аппроксимируется двумерным параболоидом (или, в более общем случае, выпуклой поверхностью второго порядка). Этот параболоид очень близок к симметричному относительно осей x и y.
Основная идея метода удаления фона состоит в определении неэкпрессирующих областей эмбриона, которые используются для аппроксимации фонового сигнала, чтобы затем удалить его масштабированием картины экспрессии.
Неэкспрессирующие области - участки эмбриона, в которых данный ген не экспрессируется в большинстве ядер - для каждого гена первоначально определяются на основе тщательного визуального изучения картин экспрессии во всех эмбрионах. Затем неэкспрессирующие области уточняются на двумерной картине экспрессии каждого эмбриона. При этом, в силу искривления полос экспрессии вдоль оси y, их необходимо выпрямить.
Фоновый сигнал аппроксимируется квадратичным параболоидом по опорным точкам, выделенным из неэкспрессирующих областей эмбриона с выпрямленными полосами. Процедура применяется последовательно ко всем изображениям картин экспрессии, полученным у одного эмбриона. Большие неэкспрессирующие области следует разбивать на несколько областей с несущественной вариацией фона. Опорными точками считаются точки, в которых уровень интенсивности флуоресценции на превышает заданного порогового значения, примерно равного 2/3 разброса значений экспрессии в области.
Параболоид S(x, y) = 11x2 +22y2 +12xy +1x+2y +0, аппроксимирующий фон, строится при помощи итеративной оптимизационной процедуры. Окончательно фон удаляется из всего эмбриона линейным отображением интенсивности, которое преобразует значения флуоресценции равные или меньше уровня фона в ноль, а максимально возможную флуоресценцию (255) саму в себя. Преобразование имеет вид ai - S(xi, yi) a(n) = max 255, 0, i = 1... N, (1) i 255 - S(xi, yi) В результате получаем нормированную картину экспрессии, в которой каждое ядро характе(n) ризуется вектором vi = {xi, yi, a(n)}, i = 1,... N.
i Важно подчеркнуть, что масштабирование нормализованных интенсивностей в диапазоне [0,255] необходимо в силу зависимости фона от выбора первичных и вторичных антител и отсутствия такой зависимости у уровня экспрессии гена.
Процедура удаления фона из широких картин экспрессии генов hb и cad, а также генов pair-rule на ранних стадиях дает лучший результат при допущении симметричности по оси x начального приближения параболоида. Ген bcd представляет собой специальный случай, поскольку для него задняя граница экспрессии не определена. Хорошо известно, что концентрация белка Bcd распределена по экспоненциальному градиенту с максимумом в антериорном конце и достигает фонового уровня в постериорной трети эмбриона (Driever and NssleinVolhard, 1988b; Driever and Nsslein-Volhard, 1988a). Мы нормируем картину экспрессии bcd, добиваясь экспоненциальности нормированной картины.
Подтверждение обоснованности предложенного метода удаления фонового сигнала можно получить путем визуальной инспекции картин экспрессии. Слабым местом визуальной оценки является неявное предположение о том, что ни один из генов сегментации не имеет равномерно низкого уровня экспрессии в районах, лежащих вне пространственно органиченных областей экспрессии. Однако, при анализе данных, полученных при окрашивании одного и того же белка разными первичными и вторичными антителами, становится очевидно, что группы антисывороток разного качества дают одни и те же пространственно органиченные области экспрессии, но разные уровни фона. Более того, метод удаления фонового сигнала был тщательно тестирован на мутантных эмбрионах, гомозиготных по нуль-мутации в каком-либо из генов eve, gt, kni или Kr и окрашенных для выявления продукта мутантного гена. Картины экспрессии у таких мутантов после удаления фона трансформируются в нулевой уровень экспрессии во всем эмбрионе.
Визуальная оценка картин экспрессии показывает, что метод удаления фона дает хорошие результаты для эмбрионов, относящихся к циклу 14А. Типичные результаты удаления фона Рис. 1: Результаты удаления фона из индивидуальных картин экспрессии ряда генов. За исключением случаев, когда цикл деления ядер указан, все остальные картины экспрессии получены в эмбрионах, принадлежащих циклу 14А. Ненормализованные картины экспрессии изображены белыми кружками; картины экспрессии после удаления фонового сигнала показаны черными кружками; параболоид, аппроксимирующий фон, изображен сплошной линией.
из картин экспрессии bcd, hb, Kr, eve, run и h на этой стадии приведены на рис. 1. Для картин экспрессии генов gap и pair-rule на ранних стадиях точность метода значительно ниже.
В циклах деления 10Ц12 картины экспрессии этих генов характеризуются очень низким уровнем интенсивности флуоресценции, присутствующей практически во всех частях эмбриона.
На рис. 1 приведены типичные картины экспрессии eve и kni в цикле 12 и результат удаления фона. Интерпретация таких картин неоднозначна: возможно, что весь сигнал обусловлен неспецифической флуоресценцией и зиготическая экспрессия генов отсутствует.
Определение возраста эмбриона. Поскольку окрашивание и сканирование эмбрионов осуществлялось без учета их возраста, необходимы специальные методы для определения времени развития. В силу того, что циклы делений с 10 по 13 являются непродолжительными по времени, для определения возраста эмбриона на этом промежутке времени достаточен подсчет количества ядер. Однако, цикл деления 14А занимает около 50 минут и, поэтому простой подсчет количества ядер недостаточен. Предложенный для решения этой задачи экспериментальный метод требует использования одного из каналов микроскопа для получения изображений мембран. Он основан на измерении степени инвагинации мембраны у фиксированных эмбрионов и использовании стандартной кривой, описывающей временную динамику инвагинации мембран in vivo, для определения возраста эмбриона (Merrill et al., 1988).
Мы разработали новый метод определения возраста эмбриона в цикле деления ядер 14А, основанный на анализе высоко динамичных картин экспрессии гена eve, окрашенного у всех эмбрионов, и стандартизации этих картин экспрессии относительно возраста эмбриона, определенного в эксперименте. Этот метод позволяет автоматизировать процедуру предсказания возраста, исключает трудоемкое определение возраста экспериментальным путем и, таким образом, значительно улучшает метод определения возраста эмбриона дрозофилы в раннем эмбриогенезе.
В качестве первого шага в разработке метода все эмбрионы, принадлежащие циклу деления 14А, были распределены путем визуального анализа картин экспрессии eve по восьми временным классам. Поскольку эмбрионы были сканированы без учета их возраста, разумно предположить равномерное распределение возраста в выборке эмбрионов, принадлежащих циклу 14А. Так как все восемь временных классов содержат примерно одинаковое количество эмбрионов и цикл деления 14А занимает около 50 минут развития, можно считать, что каждый класс по длительности соответствует примерно 6.5 минутам. Классификация эмбрионов, основанная на анализе динамики картин экспрессии гена eve, хорошо согласуется со степенью инвагинации мембран.
Для предсказания возраста эмбриона по картине экспрессии использовано обобщение метода SVM (Support Vector machine) на случай регрессионного оценивания (Vapnik, 1995; Smola and Scholkopf, 1998). Метод предсказания возраста включает три этапа: (1) формирование обучающей выборки эмбрионов, каждый элемент которой характеризуется набором характерных признаков, описывающих картину экспрессии, и экспериментально определенным возрастом;
(2) построение регрессионной функции по обучающей выборке; (3) предсказание возраста для эмбрионов, не включенных в обучающую выборку и не имеющих экспериментальных данных о степени инвагинации мембраны.
В качестве обучающей выборки была использована группа из 103 эмбрионов, принадлежащих временным классам 3 - 8. Каждый эмбрион обучающей выборки был охарактеризован многомерным вектором, компонентами которого являются возраст эмбриона и 13 параметров, равных экстремумам экспрессии гена eve. Возраст был определен путем измерения степени инвангинации мембран на дорсальной стороне каждого из эмбрионов и использования стандартной кривой (Merrill et al., 1988).
Малый размер обучающей выборки (103 эмбриона) по сравнению с размером вектора признаков (13) может повлечь недостоверное предсказание и отсутствие устойчивости при изменении параметров алгоритма. Для уменьшения размерности вектора признаков был использован факторный анализ. После применения факторного анализа к выборке из 501 эмбриона, относящихся к циклу 14А, была получена совокупность из 13 новых факторов. Важно, что для 1эмбрионов обучающей выборки, первые два фактора имеют значительную корреляцию с возрастом, 92% и 25% соответственно. Это позволило надежно предсказывать возраст, учитывая в векторе черт только первые три фактора, и увеличило скорость сходимости.
В результате подбора параметров, дающих наилучшее совпадение регрессионной функции с экспериментальными данными, было установлено, что модели со скалярным ядром и полиномиальным ядром второго порядка лучше всего согласуются с данными.
Результаты оценки точности предсказания возраста, осуществленной путем последовательного исключения одного эмбриона из обучающей выборки и использования оставшихся эмбрионов в качестве рабочей выборки для предсказания возраста исключенного эмбриона, показали, что обе модели имеют примерно одинаковую точность в случае использования в векторе черт одного, двух или трех факторов. Ошибка предсказания возраста составляет около двух минут развития. Это хороший результат, если принять во внимание, что возраст эмбрионов в обучающей выборке находится в пределах от 20 до 50 минут с начала цикла деления 14А.
Таким образом, для аккуратного предсказания возраста эмбрионов, не включенных в обучающую выборку, достаточно только трех факторов. Чтобы провести различие между моделями, примем во внимание, что расчеты в задаче со скалярным ядром сходится гораздо быстрее (например, для трех факторов за 59 итерации против 197) и, следовательно, скалярная модель оказывается более предпочтительной.
Модели со скалярным ядром и полиномиальным ядром второго порядка были использованы для предсказания возраста 398 эмбрионов, не принадлежащих обучающей выборке, причем вектор признаков был составлен из трех факторов. Предсказанные возрасты хорошо коррелировали с классификацией эмбрионов по временным классам.
Регистрация картин экспрессии генов сегментации. Использованные для получения данных конфокальные микроскопы позволяют получать у одного эмбриона картины экспрессии только трех генов. Нас же интересует пространственно-временная динамика экспрессии всех генов, контролирующих формирование препаттерна сегментации. В силу индивидуальной вариабельности размеров эмбрионов, информацию об относительном расположении картин экспрессии разных генов в пространстве невозможно получить простым совмещением картин экспрессии у индивидуальных эмбрионов, окрашенных антителами к разным белкам. Чтобы решить эту задачу, данные, полученные для индивидуальных эмбрионов, должны быть приведены к общей системе координат с помощью процедуры регистрации.
В данной работе был разработан метод регистрации, основанный на выделении контрольных точек в изображении и на преобразовании координат для максимально полного совмещения этих точек в разных изображениях (Brown, 1992). В качестве контрольных точек обычно используют какие-либо характерные признаки изображений. Поскольку в нашем исследовании все эмбрионы были сканированы для выявления экспрессии гена eve и картина экспрессии этого гена сильно меняется во времени, в качестве контрольных точек использовали характерные признаки этой картины - экстремумы одномерной картины экспрессии, полученной путем экстракции данных из 10% центральной полосы эмбриона.
Регистрация изображений производится посредством масштабирования двумерных картин экспрессии вдоль оси абсцисс с помощью аффинного преобразования, минимизирующего суммарное расстояние между x-координатами всех экстремумов на разных картинах и средним положением соответствующих экстремумов по всем регистрируемым изображениям. Число экстремумов варьирует в зависимости от класса. В качестве функционала качества использована метрика, основанная на вычислении эвклидова расстояния.
Точность регистрации оценивали по величине стандартных отклонений положений экстремумов от среднего значения локализации соответствующего экстремума у эмбрионов одного и того же временного класса. Точность метода регистрации выше у эмбрионов из поздних временных классов и уменьшается от центра эмбриона к периферии. У эмбрионов временного класса 8 точность регистрации в центральной 10% полосе находится в пределах 0.22Ц0.47%.
В других участках эмбриона эти значения колеблются от 0.29 до 4.42% и во многих случаях бывают меньше 1%. Поскольку диаметр одного ядра в центре эмбриона приблизительно равен 1% длины эмбриона (ДЭ), а на периферии примерно в 1.5 раза больше, полученные значения свидетельствуют о высокой точности регистрации.
Конструирование интегрированных картин экспрессии генов сегментации. Главной целью пространственной регистрации и удаления фона является построение карты взаимного расположения областей экспрессии всех генов сегментации для множества эмбрионов одинакового возраста. Области экспрессии каждого гена на карте будут представлены своей УэталоннойФ или УинтегрированнойФ картиной экспрессии, которая характеризуется средними для всего временного класса значениями интенсивности флуоресценции. Идеальная интегрированная картина экспрессии данного гена могла бы быть построена в гипотетической ситуации, когда все эмбрионы имели бы одинаковую ядерную структуру, т.е. состояли бы из множества ядер с одинаковыми для всех эмбрионов координатами. В таком случае средние интенсивности флуоресценции могли бы быть вычислены независимо в каждом ядре. Однако, на самом деле количество и положение ядер в разных эмбрионах, а также плотность распределения ядер внутри каждого индивидуального эмбриона непостоянны. Поэтому должна быть вычислена усредненная ядерная структура картины экспрессии, учитывающая эти особенности. Эта задача решена путем определения пространственной плотности распределения ядер, что позволило вычислить среднее значение диаметра ядра в каждой точке усредненного эмбриона.
Конструирование двумерных интегрированных картин экспрессии мы выполнили, используя регистрированные данные, и для эмбрионов каждого временного класса. Для этого каждому ядру каждого индивидуального эмбриона ставили в соответствие ядро усредненной ядерной структуры картины экспрессии, имеющее наиболее близкие координаты, после чего вычисляли среднюю интенсивность флуоресценции по всем индивидуальным ядрам, отнесенным к данному среднему ядру.
Интегрированная картина экспрессии а Интегрированная картина экспрессии в gt, Kr, eve Индивидуальный эмбрион б gt, Kr, kni gt, Kr, eve Рис. 2: Атлас экспрессии генов во временном классе 8. а. Интегрированные картины экспрессии gt, Kr и eve; б.картина экспрессии тех же генов у индивидуального эмбриона того же класса;
в. интегрированная картина экспрессии Kr, kni и gt в виртуальном эмбрионе.
Пример интегрированной двумерной картины экспрессии генов gt, Kr и eve у эмбрионов восьмого временного класса представлен на рис. 2а. Сравнение этой картины с картиной экспрессии тех же генов у индивидуального эмбриона класса 8 (рис. 2б) показывает, что интегрированная картина в целом правильно передает основные особенности экспрессии индивидуальных генов, включая форму и размер областей экспрессии. Представленная на этом же рисунке картина экспрессии генов Kr, kni и gt (рис. 2в) интересна тем, что среди использованных в данной работе эмбрионов не было эмбрионов, одновременно окрашенных для выявления экспрессии этих генов. Картируя интегрированные картины экспрессии на усредненную ядерную структуру, теперь можно создавать так называемые "виртуальные эмбрионы"с новыми комбинациями генов для визуализации взаимного расположения их областей экспрессии.
Для конструирования одномерных интегрированных картин экспрессии генов сегментации координаты ядер каждой отрегистрированной одномерной картины экспрессии группировались вдоль оси x по R интервалам. Затем внутри каждого интервала вычислялось среднее значение интенсивности флуоресценции по всем эмбрионам данного временного класса. Число R выбиралось из тех соображений, что в центральной части эмбриона диаметр одного ядра составляет примерно 1% от его длины, и, следовательно, R должно быть равно 100 для того, чтобы правильно смоделировать ядерную структуру картины экспрессии. Одномерные интегрированные картины экспрессии материнских генов во временном классе 3, генов gap и генов pair-rule во временном классе 8 изображены на рис. 3.
Разработанные нами методы были применены для получения количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1580 индивидуальных эмбрионов (рис. 4 и рис. 5), а также эталонных, интергрированных данных об экспрессии каждого из 14 генов сегментации в каждой области эмбриона в разные моменты времени. Полученные данные имеют разрешение по пространству в одно ядро и разрешение по времени около 6.минут развития.
В четвертой главе "Динамическая природа позиционной информации" обсуждаются механизмы формирования сегментного препаттерна в бластодерме дрозофилы в свете новых, полученных нами данных о динамике формирования областей экспрессии генов сегментации. Эти результаты представлены в статьях A1, A2, A10, A30, A33.
2bcd а cad 2110 10 20 30 40 50 60 70 80 90 12Kr hb б kni tll 2gt 110 10 20 30 40 50 60 70 80 90 12h в eve 2run ftz 110 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2slp г prd 2odd 1 1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1Длина эмбриона, % Рис. 3: Одномерные интегрированные картины экспрессии материнских генов во временном классе 3 (а), генов gap (б) и генов pair-rule (в,г) во временном классе Согласно классической теории, предложенной в 1969 году Л.Волпертом (Wolpert, 1969;
Wolpert, 1989), судьба клетки определяется ее положением в определенном пространственном поле зародыша, в котором существует градиент концентрации некой сигнальной молекулы, называемой морфогеном. Считывание информации о градиенте морфогена и ее интерпретация приводят к дифференциации клеток в том или ином направлении в зависимости от уровня концентрации морфогена. В соответствии с новой, уточненной концепцией, для классификации молекулы в качестве морфогена (Wolpert, 1989; Gurdon and Bourillot, 2001) должно выполняться несколько условий: морфоген должен быть распределен по пространству в форме постепенно меняющегося градиента, перемещаться и действовать на больших расстояниях, а также исключительно и непосредственно обуславливать зависящую от порога индукцию по крайней мере двух разных состояний экспрессии генов в клетках-мишенях.
Интенсивность флуоресценции Важно, что уточненная концепция морфогена и понятие позиционной информации основаны на четком разграничении между формированием и интерпретацией позиционной информации. В основу этих концепций заложена статическая система координат, налагаемая на абсолютно пассивную ткань-мишень в каждый момент развития после достижения градиентом стационарного состояния. Результаты анализа динамики формирования областей экспрессии генов сегментации, полученные в данной работе, демонстрируют абсолютную неадекватность такой концептуальной модели для описания механизмов формирования паттерна в бластодерме дрозофилы.
Рис. 4: Картины экспрессии материнских генов и генов gap в начале (временной класс 1 (Т1)) и конце (временные классы 7 или 8 (Т7 или Т8)) цикла 14А. Для каждого гена и временного класса приведены двумерная и одномерная картины экспрессии у типичного индивидуального эмбриона.
Для изучения динамики формирования областей экспрессии генов в морфогенетическом поле сегментации каждая область была охарактеризована небольшим числом характерных признаков (см. раздел 1.3). В качестве таких признаков выбирали положения максимумов экспрессии, а также x-координаты точек, в которых уровень экспрессии достигал некого порогового значения, например 50% от максимального уровня.
Мы установили, что большинство областей экспрессии генов сегментации статистически значимо меняют свое положение по мере формирования. Особенно велики сдвиги центральной области экспрессии Kr, а также задних областей экспрессии gt, kni и hb (рис. 4). Эти области сдвигаются от заднего конца эмбриона к переднему. Так например, задние границы областей экспрессии Kr, gt и kni смещаются примерно на 5, 6 и 15 ядер соответственно (табл. 1).
диаметр ядер, расположенных вдоль центральной переднезадней оси, приблизительно равен 1% ДЭ Рис. 5: Картины экспрессии генов pair-rule в начале (временной класс 1 (Т1)) и конце (временной класс 8 (Т8)) цикла 14А. Для каждого гена и временного класса приведены двумерная и одномерная картины экспрессии у типичного индивидуального эмбриона.
Таблица 1: Сдвиги областей экспрессии генов gap во времени.
Область gt ant hb ant Признак A пик 2 пик 3 P P (141) (61) (145) (144) (173) Интервал 1Ц8 5Ц8 1Ц8 1Ц8 1ЦСдвиг -1.43 * 0.64 * -5.53 0.06 * -0.Область Kr cent kni post gt post hb post Признак A P A P A P A P (261) (261) (134) (134) (137) (137) (136) (136) Интервал 1Ц8 1Ц8 1Ц8 1Ц8 1Ц8 1Ц8 3Ц8 3ЦСдвиг 1.02 5.23 1.6 6.32 6.38 15.21 2.02 4.Для каждой области экспрессии приведены величины сдвигов передней (A) и задней (P) границ. Для передней области экспрессии gt приведены также сдвиги положения пиков области экспрессии 2 (на том интервале, где она существует) и области экспрессии (рис. 4). Сдвиги положительны, если движение областей экспрессии происходит от заднего концу к переднему, сдвиги в обратном направлении имеют отрицательные значения.
Интервалы времени исчисляются во временных классах. Для каждой области экспрессии в скобках указан объем выборки эмбрионов, использованной для вычисления сдвига.
Звездочкой отмечены сдвиги, не являющиеся статистически значимыми. "ant", "cent"и "post"обозначены области экспрессии, расположенные в передней, центральной и задней частях эмбриона соответственно.
Границы передней области экспрессии гена gt (рис. 4) не сдвигаются, и эта область не сужается со временем. Однако, во временном классе 4 у левой границы этой области начинает формироваться новая область (пик 2). Образование новой области сопровождается сдвигом "родительской области"(пик 3) на пять ядер в направлении, противоположном движению остальных областей экспрессии генов gap, т.е. к заднему концу эмбриона (табл. 1). В интервале с первого по восьмой временной классы крутизна задней границы передней области экспрессии hb увеличивается. В указанном интервале времени эта граница сдвигается в направлении к заднему концу эмбриона приблизительно на 0.9 ядер, однако сама передняя область экспрессии hb не меняет своего положения (табл. 1).
Большинство областей экспрессии генов pair-rule тоже изменяют свое положение в ходе цикла 14А и статистически значимо смещаются к переднему полюсу эмбриона (табл. 2). За исключением h и odd полоса 1 генов pair-rule либо не двигается, либо сдвигается очень незначительно. Полоса 1 h сдвигается по направлению к заднему концу, а полоса 1 odd - к переднему, причем последний сдвиг коррелирует с образованием полосы 2. Наиболее значительные сдвиги обнаружены для полос 7 eve, h и run, причем эта полоса у eve смещается примерно на пять ядер.
Таблица 2: Сдвиги областей экспрессии генов pair-rule во времени.
ген / область 1 2 3 4 5 6 eve в.к. 3Ц8 3Ц8 3Ц8 3Ц8 4Ц8 4Ц8 3Ц(N=654) сдвиг 0.47 1.94 1.97 3.44 3.21 2.62 5.ftz в.к. 3Ц8 3Ц8 3Ц8 4Ц8 3Ц8 4Ц8 5Ц(N=158) сдвиг 0.20 * 1.27 1.72 1.86 2.27 3.84 1.01 * h в.к. 3Ц8 3Ц8 3Ц8 4Ц8 4Ц8 4Ц8 4Ц(N=105) сдвиг -2.18 1.54 3.61 1.11 2.61 3.25 3.odd в.к. 3Ц8 4Ц8 3Ц8 5Ц8 3Ц8 3Ц8 - (N=85) сдвиг 2.41 1.13 * 2.98 0.92 3.65 2.66 - run в.к. 3Ц8 4Ц8 3Ц8 5Ц8 3Ц8 3Ц8 5Ц(N=65) сдвиг 0.20 * 1.66 2.81 2.56 1.57 3.41 3.В качестве характерных признаков использовано максимальное значение интенсивности флуоресценции в каждой полосе. Промежутки времени, для которых вычислены сдвиги, начинаются с момента появления полосы и исчисляются во временных классах (в.к.). Объем выборки N приведен для каждого гена. Сдвиги для полосы 7 odd не приводятся, поскольку она формируется в самом конце цикла 14A. Сдвиги положительны, если движение областей происходит от заднего концу к переднему, сдвиги в обратном направлении имеют отрицательные значения. Звездочкой отмечены сдвиги, не являющиеся статистически значимыми.
Анализ сдвигов областей экспрессии гена eve у 120 эмбрионов, у которых точный возраст был определен путем измерения степени инвагинации мембран и использования стандартной кривой (Merrill et al., 1988), показал, что в ходе цикла 14А полосы eve сдвигаются к переднему полюсу эмбриона непрерывно, хотя скорость движения полос 5 и 6 менее равномерна, чем таковая у полосы 7.
Движение не крайних, расположенных внутри картин экспрессии полос генов pair-rule, чаще всего коррелирует с образованием новой области экспрессии. Так например, полоса odd сдвигается очень сильно во временных классах с 3 по 5, когда от е задней границы е отпочковывается полоса 2. Сходным образом, образование полосы 7 odd во временных классах 5 - 7 сопровождается сначала сужением полосы 6 в интервале между временными классами и 7, за которым следует сильный сдвиг пика этой полосы во временных классах 7 - 8.
Поскольку недавно было продемонстрировано движение ядер в бластодерме эмбриона (Keranen et al., 2006), а также вследствие того, что большинство генов сегментации кодируют транскрипционные факторы, представляется важным произвести оценку вклада морфогенетических движений ядер в сдвиги областей экспрессии этих генов. С этой целью у живых эмбрионов оценили на дорсальной и вентральной сторонах сдвиги трех ядер, положение которых примерно совпадает с местом формирования головной бороздки (cf) (ядро 31), с положением максимума полосы 3 h в момент ее образования во временном классе 3 (ядро 51) и с положением задней границы центральной области экспрессии Kr во временном классе 1 (ядро 62).
31 а T6.5 мин.
cf задняя граница Kr 31 51 б T19.5 мин.
полоса 3 h cf 31 47 51 57 в 00110000 0001111 111T52 мин.
полоса 3 h задняя граница Kr cf A-П 250 h во временном классе run во временном классе г 200 h во временном классе run во временном классе 1h максимум полосы 1во временных классах 3 и run минимум между полосами 2 и 3 во временных классах 3 и 20 25 30 35 40 45 50 55 % Длины Эмбриона Рис. 6: Движение ядер in vivo в сравнении со сдвигами областей экспрессии. Панели (а), (б), и (в) - соответствующие указанным моментам времени кадры фильма, демонстрирующего дорсальную сторону живого эмбриона. (г) - одномерные графики картин экспрессии run и h во временных классах 3 и 8. Овалами, нарисованными пунктирной линией, в (в) обозначены положения задней границы Kr и полосы 3 h во временном классе 8. Сходные результаты были получены на дорсальной и вентральной сторонах 15 эмбрионов. (г) показано, что положения максимума полосы 3 h и минимума межполосного промежутка 2/3 run сдвигаются относительно друг друга в интервале между временными классами 3 и 8.
Оказалось (рис.6), что в ходе цикла 14А ядра 51 и 62 сдвигаются к переднему концу эмбриона на расстояние, соответствующее половине диаметра ядра. Дальнейшие доказательства того, что обнаруженные в данной работе сдвиги областей экспрессии не обусловлены движением ядер, можно получить, рассмотрев поведение межполосного промежутка 2/3 гена run и полосы 3 h. В конце цикла 14А, во временном классе 8, картины экспрессии этих генов строго комплементарны и, следовательно максимум экспрессии h и минимум экспрессии run Интенсивность флюоресценции локализуются в одном месте (ядре). Однако, как следует из рисунка 6, на ранних стадиях этого цикла межполосный промежуток 2/3 run и полоса 3 h локализуются в разных местах эмбриона. Таким образом, в ходе цикла 14А межполосный промежуток 2/3 run и полоса 3 h сдвигаются относительно друг друга. Очевидно, что это явление не может быть обусловлено движением ядер.
Эти факты, а также данные об асимметричном расположении областей локализации мРНК генов сегментации относительно областей локализации соответствующих белков (cм. пятую главу), свидетельствуют о том, что сдвиги областей экспрессии в будущей зародышевой полоске являются следствием регуляции активности генов и не обусловлены движением ядер.
Эти сдвиги по порядку величины совпадают с размерами полос экспрессии генов pair-rule (3Ц5 ядер) и, следовательно, очень важны для позиционирования областей экспрессии геновмишеней и для формирования сегментного препаттерна.
Важно, что в противоположность ядрам, расположенным в будущей зародышевой полоске, ядро 31, расположенное в месте формирования головной бороздки, сдвигается к заднему концу эмбриона примерно на расстояние равное 2 ядрам (рис.6). Этот сдвиг совпадает по направлению и сопоставим по величине с размерами сдвигов областей экспрессии генов сегментации, локализованных в головном отделе эмбриона (см. рис. 4 и рис. 5). Таким образом, не исключено, что сдвиги областей экспрессии генов сегментации в головном отделе могут быть обусловлены движением ядер.
Как известно, градиент Bcd был первым морфогенетическим градиентом, который удалось увидеть непосредственно в эксперименте (Driever and Nsslein-Volhard, 1988b; Driever and Nsslein-Volhard, 1988a). Однако, следует отметить, что помимо Bcd в бластодерме дрозофилы существует второй материнский градиент Hb, и что определение положения границ областей экспрессии генов-мишеней происходит в результате синергетического взаимодействия этих двух градиентов (Driever and Nsslein-Volhard, 1988b; Simpson-Brose et al., 1994; Reinitz et al., 1995). Кроме того, в нашей работе показано, что концентрация морфогена Bcd непостоянна и сильно меняется во времени, а области экспрессии генов gap и pair-rule, являющихся мишенями действия материнских градиентов, меняют свое положение по мере развития. Все это означает, что позиционную информацию в бластодерме дрозофилы нельзя рассматривать как некое постоянное, заданное концентрацией морфогена позиционное число. Наоборот, данные о движении областей экспрессии генов-мишеней свидетельствуют о том, что позиционная информация не является статичной, а постоянно и быстро меняется. Как показано в пятой главе диссертации (см. ниже), сдвиги и уточнение границ экспрессии генов gap происходят за счет взаимной регуляции этих генов и не зависят от действия материнских градиентов и диффузии продуктов генов gap между ядрами. Материнские градиенты и гены gap совместно определяют положение границ экспрессии генов pair-rule, которые тоже сдвигаются по мере развития. Разумно предположить, что такие сдвиги влияют на положение полос экспрессии генов segment polarity и, тем самым, на положение парасегментных границ (Ingham and Martinez-Arias, 1992).
В свете всего выше сказанного, позиционную информацию в бластодерме дрозофилы следует рассматривать как динамически меняющуюся во времени комбинацию концентраций продуктов материнских и зиготических генов. В каждый момент времени эта комбинация определяется не только материнскими морфогенами, но и сдвигами границ областей экспрессии генов сегментации в результате регуляторных взаимодействий. Эта трактовка подразумевает активный способ интерпретации градиента морфогена и размывает границу между формированием и интерпретацией позиционной информации.
Пятая глава "Регуляторные взаимодействия в сети генов gap" посвящена результатам математического моделирования механизмов регуляции экспрессии генов gap в цикле 14А. Для доказательства существования в эмбрионе дрозофилы предсказанных регуляторных механизмов использованы известные из литературы данные. Исследован также механизм, обеспечивающий сдвиги границ областей экспрессии генов gap.
Этот материал изложен в работах A4, A10, A11, А18, A24, A28, A34, A37, A41, A44.
Моделируется экспрессия генов в сети, включающей гены bcd, cad, hb, Kr, gt, kni, и tll, для чего используется метод, названный методом генных сетей (gene circuits) и впервые предложенный в (Mjolsness et al., 1991; Reinitz et al., 1995). В модели рассматривается поведение системы в цепочке ядер, расположенной вдоль центральной оси эмбриона в направлении AЦP и заключенной в интервале между координатами, равными 35% и 92% ДЭ. Поведение ядер во времени моделируется с помощью трех последовательных процессов: интерфаза, митоз и деление. Митоз отличается от интерфазы только отсутствием синтеза белка. Деление ядра является дискретным во времени.
a Внутреннее состояние i-го ядра определяется набором концентраций vi транскрипционных факторов, кодируемых генами сегментации с индексами a. Изменение концентраций во a времени dvi /dt зависит от интенсивности трех процессов, происходящих в течении интерфазы синтеза, диффузии и распада белка, представленных суммой слагаемых в правой части следующего нелинейного дискретного уравнения реакции-диффузии:
a dvi N ab b Bcd = Rag T vi + mavi + ha b=dt a a a a (2) +Da(n) (vi-1 - vi ) + (vi+1 - vi ) a -avi, где a = 1,..., N и N число зиготических генов в модели.
ab Величины T в (2) представляют матрицу коэффициентов регуляторных взаимодействий Bcd и характеризуют регуляторное действие продукта гена b на экспрессию гена a. vi описывает концентрацию морфогена Bcd в ядре i. Регуляция белком Bcd активности гена a описывается параметром ma. Параметр ha характеризует регуляторный вклад других материнских факторов транскрипции, равномерно распределенных в бластодерме эмбриона. Относительная интенсивность синтеза описывается с помощью сигмоидной функции регуляцииЦэкспрессии N 1 ab b Bcd g(ua) = ua/ (ua)2 + 1 + 1, где ua = T vi + mavi + ha есть суммарный вклад b=регуляторов в экспрессию гена a. Максимальная интенсивность синтеза продукта гена a обозначена через Ra. Параметр a есть скорость распада продукта гена a и соотносится с пеa a риодом 1/2 полураспада данного белка по формуле 1/2 = ln 2/a. Коэффициент диффузии Da(n) обратно пропорционален квадрату расстояния между соседними ядрами.
Концентрации белков, обусловленные материнской экспрессией генов hb и cad (Уматеринские градиентыФ), используются как начальные условия для уравнений в цикле 13. Значения всех параметров находятся путем подгонки решения модели к экспериментальным данным по экспрессии в 9 последовательных моментах времени - цикле 13 и 8 временных классах цикла 14А, т.е. решается обратная задача математического моделирования. Минимизируется функционал качества, равный сумме квадратов разностей между экспериментальными данными и результатами расчета по модели:
a a E = (vi (t)model - vi (t)data)2 + Epenalty, (3) где Epenalty - штрафная функция. Суммирование проводится по всем имеющимся данным Nd, то есть, по всем измеренным концентрациям белка для всех генов a, всех ядер i и всех временных классов t. Для нахождения параметров модели использовалась параллельная версия стохастического метода оптимизации - метода численного отжига Лама (PLSA). Этот метод подробно описан в Metropolis et al., 1953; Kirkpatrick et al., 1983; Lam and Delosme, 1988a;
Lam and Delosme, 1988b; Reinitz et al., 1995; Chu, 2001. Так как PLSA имеет стохастическую природу, а функционал качества имеет много локальных минимумов, то оптимальные значения параметров, найденные в результате нескольких проходов алгоритма, могут отличаться даже при сходных значениях функционала. В нашей работе каждый численный эксперимент заключался в нахождении 66 параметров для системы из 348 дифференциальных уравнений, а один цикл работы алгоритма занимал на кластере из 10 процессоров Intel XeonЦ2.4GHz от до 160 часов в зависимости от начального приближения.
В результате расчетов было отобрано 10 сетей, картины экспрессии в которых находились в хорошем соответствии с данными. Распределение различных коэффициентов матрицы регуляторных взаимодействий в сетях не одинаково, но для большинства параметров устойчива тенденция к определенному типу регуляторного взаимодействия.
На рис. 7 приведены данные о характере взаимодействия материнских генов и генов gap.
Видно, что гены bcd и cad в основном активируют гены gap, а активность hb, kni, gt, Kr регулируется по принципу автоактивации. Гены gap либо не взаимодействуют, либо репрессируют друг друга. Исключением является действие Gt на hb. Наиболее сильная взаимная репрессия наблюдается между парами генов gt и Kr, а также между hb и kni, причем области активности этих генов не перекрываются. Продукт терминального гена gap tll репрессирует все другие гены gap, кроме hb.
а bcd cad hb Kr gt kni tll hb 0/0/10 0/0/10 0/0/10 0/10/0 0/2/8 10/0/0 1/8/Kr 0/0/10 0/0/10 9/1/0 0/0/10 10/0/0 9/1/0 10/0/gt 0/0/10 0/0/10 9/0/1 10/0/0 0/3/7 1/9/0 10/0/kni 3/0/7 0/0/10 10/0/0 6/4/0 9/1/0 0/0/10 10/0/0.б в 0.0.-0.-0.0.г д 0.0.-0.-0.Рис. 7: Распределение коэффициентов матрицы регуляторных взаимодействий. а. Классификация параметров по типу взаимодействия. Строки - гены-мишени a, столбцы - генырегуляторы b (см. уравнение (2)). Значения параметров T и m -0.005 классифицировались как репрессия регулятором b действия гена-мишени a, значения в интервале от -0.0до 0.005 классифицировались как отсутствие взаимодействия, а значения параметров 0.0классифицировались как активация. Числа соответствуют числу сетей, в которых данное значение параметра означает репрессию/отсутствие взаимодействия/активацию соответственно.
Обычным шрифтом выделены взаимодействия, классифицированные в большинстве сетей как активация, курсив означает отсутствие взаимодействия, жирный шрифтом отмечены взаимодействия, классифицированные как репрессия. б-д. Графики разброса значений параметров m и T при регуляции экспрессии Kr (б), kni (в), gt (г) и hb (д).
Значение параметра Значение параметра m m T T T T T T T T T T T T Kr Kr Kr Kr Kr Kr Kr kni kni kni kni kni kni kni cad hb Kr gt kni tll Kr kni cad hb gt tll m m T T T T T T T T T T T T gt gt gt gt gt gt hb hb hb hb hb hb gt hb kni tll cad hb Kr gt cad hb Kr gt kni tll Помимо анализа матрицы регуляторных взаимодействий, с целью выявления специфических регуляторных взаимодействий, обуславливающих формирование границ областей экспрессии генов-мишеней, был проведен графический анализ комбинированного вклада разных ab b Bcd регуляторов (T vi и mavi ) в регуляцию гена-мишени.
Графический анализ показал, что Bcd вносит весомый вклад в активацию передних областей активности gt и hb, а также центральной области экспрессии Kr. Cad оказывает активирующее действие на экспрессию kni и gt в задней половине эмбриона. Более того, Cad вносит относительно большой вклад в активацию Kr в центральной области эмбриона, а также в активацию экспрессии hb в передней половине эмбриона на ранних стадиях развития.
Взаимно репрессирующие взаимодействия генов gap локализованы в пространстве. Напомним, что Kr и gt имеют непересекающиеся области экспрессии в бластодерме (рис. 3, 8a).
Во всех сетях Gt репрессирует Kr (рис. 7а,б). Это взаимодействие определяет положение как передней, так и задней границ области активности Kr в цикле 14A (рис. 8в). Области активности hb и kni пересекаются с областью активности Kr (рис. 3, рис. 8б). В большинстве сетей Hb и Kni репрессируют Kr, однако эти воздействия являются более слабыми, чем действие Gt (рис. 7а,б). Kni участвует в определении положения задней границы центральной области активности Kr, а Hb - передней.
Рис. 8: Анализ действия репрессоров, определяющих положение границ области экспрессии Kr. (а и б) Решения уравнений модели в позднем цикле 14A. (в и г) Профили репрессии для Kr в позднем цикле 14A. Суммарный вклад регуляторов uKr показан сплошной черной линией как функция положения вдоль продольной оси эмбриона в процентах. Закрашенные области показывают индивидуальный вклад регуляторов. Горизонтальные пунктирные линии ограничивают уровни регуляции, ниже которых экспрессия меньше 10%(нижняя линия) и, выше которого больше 90% (верхняя линия) от максимального уровня. Вертикальные пунктирные линии ограничивают области на продольной оси, где ua ниже 10% уровня активности. Стрелка в в указывает на незначительный уровень дерепрессии Kr в отсутствии Gt. Звездочки в г показывают насколько сдвинется граница области экспрессии Kr в отсутствии Hb и Kni.
Результаты графического анализа комбинированного вклада разных регуляторов в регуляцию остальных генов gap (hb, kni и gt) хорошо согласуются с результатами анализа коэффициентов матрицы регуляторных взаимодействий (рис. 7).
Таким образом, нами обнаружено пять базовых регуляторных механизмов, обеспечивающих взаимное расположение областей экспрессии генов gap в эмбрионе (рис. 9):
Х активация экспрессии генов gap под действием Bcd и Cad, распространяющаяся на широкие области эмбриона;
Х автоактивация генов gap;
Х сильная репрессия по принципу обратной связи между генами gap с неперекрывающимися областями экспрессии;
Х асимметричная репрессия между генами gap, чьи области экспрессии перекрываются Х репрессия по принципу прямой связи экспрессии генов gap в задней части эмбриона под действием терминального гена tll.
Рис. 9: Схематическое представление топографии сети генов gap. Области экспрессии генов hb, kni, gt, Kr и tll показаны в виде прямоугольников. Передняя часть эмбриона слева. Схема основана на данных, представленных на рисунке 7a, причем показаны только те взаимодействия, которые наблюдались в 9 сетях gap из 10. Репрессия между генами показана в виде соединительных линий с усиками. Цвет фона обозначает области, испытывающие активирующее действие белков Bcd (темно-серый) и Cad (светло-серый).
Анализ результатов численного моделирования динамики экспрессии генов gap позволяет выявить регуляторные механизмы, обуславливающие сдвиги границ областей экспрессии этих генов. Отметим, что численное моделирование является в настоящее время единственно доступным способом решения этой проблемы в силу невозможности изучения ее генетическими методами, поскольку мутанты, у которых такие сдвиги отсутствуют, пока не получены.
Решение модельной задачи, соответствующее найденным оптимальным значениям параметров, с высокой точностью воспроизводит сдвиги областей экспрессии генов gap в будущей зародышевой полоске эмбриона. Более того, исследование поведения модели показало, что синтез белка происходит исключительно в передней половине каждой из исследуемых областей (центральной области экспрессии Kr, областей экспрессии kni и gt в задней половине эмбриона), тогда как в задней части областей экспрессии преобладает процесс распада соответствующих белков. Синтез белка в передней части и распад белка в задней части каждой из областей, действуя совместно, сдвигают эти области по направлению к переднему полюсу эмбриона.
Гипотеза об асимметричном расположении зон синтеза белка по отношению к областям экспрессии, сформулированная на основании моделирования, была подтверждена экспериментальными методами. Было показано, что в цикле 14А области распределения концентраций мРНК Kr, kni и gt не симметрично локализованы относительно областей распределения концентраций соответствующих белков и сдвинуты относительно последних по направлению к переднему концу эмбриона. Более того, области распределения концентраций мРНК этих генов так же, как и области распределения концентраций белка, смещаются в ходе цикла 14А к переднему полюсу эмбриона.
Решение уравнений модели без диффузии (c нулевыми значениями параметра Da), соответствующее найденным оптимальным значениям параметров, воспроизводит во времени и пространстве сдвиги областей экспрессии. Таким образом, диффузия не оказывает существенного влияния на сдвиги областей экспрессии генов gap.
Для объяснения механизмов сдвига областей экспрессии Kr, kni и gt был проведен графический анализ регуляции экспрессии этих генов в области сдвига и в прилегающих областях.
Оказалось, что у центральной области экспрессии Kr и задних областей экспрессии gt и kni сдвиг задних границ происходит в результате асимметричных регуляторных взаимодействий между Kr и kni, kni и gt, gt и hb (рис. 9). Передние границы этих областей экспрессии тоже двигаются вследствие смещения задних границ соседних областей экспрессии генов gap, расположенных ближе к переднему полюсу эмбриона, либо в результате того, что границы областей экспрессии gt и hb в передней части эмбриона становятся менее пологими. Таким образом, сдвиги передних границ областей экспрессии можно рассматривать как вторичное явление, происходящее из-за динамического поведения задних границ.
Шестая глава "Создание атласа экспрессии генов сегментации во времени и пространстве" посвящена описанию структуры и функциональных возможностей атласа экспрессии генов сегментации во времени и пространстве, FlyEx ( изложен в наших статьях A7, A12, A13, A14, A23, A26, A27, A32, A35, A39.
FlyEx - реляционная база данных, созданная на основе СУБД IBM DB2, пользовательский интерфейс которой связан с базой данных с помощью WWW-сервера, Apache Tomcat и Javaсерверов приложений. Из последних, наибольший интерес представляет сервер изображений.
Этот сервер разработан для обработки изображений картин экспрессии генов. Он позволяет выполнять такие операции как объединение двух или трех изображений в серой шкале в одно цветное множественное изображение, генерацию разностного изображения между двумя изображениями, маскирование одного изображения другим, обеспечивает кадрирование изображения, фильтрацию интенсивности флуоресценции и усиление контраста.
На середину 2007 г. FlyEx содержит информацию о 1580 эмбрионах и 4490 картинах экспрессии 14 генов сегментации. Для каждого эмбриона хранится ядерная маска, все эмбрионы относятся к циклам деления с 10 по 14А, общее число записей для наборов количественных данных составляет около 9.5 млн., для усредненных данных около 270 тысяч. FlyEx также хранит коэффициенты регистрации и нормализации, используемые для построения Уна летуФ регистрированных данных и данных с удаленным фоновым сигналом. Для каждого метода регистрации и каждого эмбриона, принадлежащего к временным классам 2Ц8 цикла деления ядер 14А, хранятся по 2 коэффициента регистрации. По 6 коэффициентов нормализации хранится для каждого гена в каждом эмбрионе. Интегрированные данные построены для каждого временного класса, но только для тех генов, которые сканированы в более чем 9 эмбрионах.
Наполнение базы данных FlyEx продолжается.
Основная цель базы данных FlyEx состоит в ответах на запросы пользователей о динамике формирования областей экспрессии генов сегментации. Формы запросов раздела "Анализ данных"обеспечивают доступ к различным операциям над изображениями и количественными данными по экcпрессии генов. Эти операции позволяют пользователю получать информацию о взаимном расположении областей экспрессии генов сегментации в различные временные моменты, качестве данных по экспрессии генов, динамике формирования областей экспрессии, о степени вариабельности экспрессии гена в разных участках тела эмбриона и в разные моменты времени.
FlyEx - открытый ресурс, широко используемый мировым сообществом биологов (см. раздел "Практическое значение работы"). Для облегчения работы с данными, хранимыми во FlyEx, предусмотрена возможность выгрузки любых объемов данных по запросу пользователя.
В седьмой главе "Заключение. Анализ ранее разработанных и новых методов и моделей" проведен сравнительный анализ ранее использованных и разработанных в данной работе методов получения данных по экспрессии генов сегментации и математических моделей детерминации сегментов и процесса сегментации, а также количественных данных по экспрессии генов сегментации с данными, полученными другими коллективами исследователей. Подведены итоги диссертационной работы.
Работу завершают Выводы.
3 Выводы 1. Разработан оригинальный конвейерный метод количественной оценки уровня экспрессии генов сегментации на основе изображений, полученных с помощью конфокального микроскопа. Этот метод включает такие процедуры как сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных.
2. Показано, что возраст эмбриона в цикле деления ядер 14А может быть предсказан с точностью до 2 минут развития на основании анализа высоко динамичной картины экспрессии гена even-skipped.
3. Получен полный, точный и систематический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1580 индивидуальных эмбрионов, а также интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации. Интегрированные данные имеют пространственное разрешение в одно ядро и разрешение по времени в 15 минут развития для цикла 13 и около 6.5 минут развития для цикла 14А.
4. Показано, что области экспрессии генов сегментации, локализованные в будущей зародышевой полоске, по мере своего формирования в цикле 14А смещаются к переднему полюсу эмбриона. Сдвиги областей экспрессии по порядку величины совпадают с размерами полос экспрессии генов pair-rule. Смещения ядер в этом районе эмбриона значительно меньше, чем сдвиги областей экспрессии.
5. Разработана математическая модель, которая правильно воспроизводит временн динаую мику экспрессии генов сегментации, размер перекрывания областей экспрессии соседних генов, а также сдвиги границ областей экспрессии генов gap в цикле 14А.
6. Реконструированная в рамках модели топография сети генов gap включает в себя пять базовых регуляторных механизмов: (1) активацию генов gap под действием Bcd и Cad;
(2) автоактивацию генов gap; (3) сильную репрессию по принципу обратной связи между генами gap с неперекрывающимися областями экспрессии; (4) асимметричную репрессию между генами gap, чьи области экспрессии перекрываются; (5) репрессию по принципу прямой связи генов gap в задней части эмбриона под действием терминального гена tll. Эта топография является внутренне непротиворечивой, достаточной для объяснения наблюдаемых картин экспрессии генов gap и, в целом, согласуется с литературными данными.
7. Подтверждена гипотеза о том, что в будущей зародышевой полоске области распределения концентраций мРНК Kr, kni и gt локализуются асимметрично относительно областей распределения концентраций соответствующих белков и сдвинуты относительно последних в направлении к переднему полюсу эмбриона.
8. Показано, что численное моделирование позволяет сопоставить группу генных взаимодействий со специфичным регуляторным процессом: предсказано, что сдвиги границ экспрессии генов gap происходят из-за асимметричности регуляторных взаимодействий между этими генами, при которых ген, область экспрессии которого расположена ближе к заднему концу эмбриона, репрессирует ген с перекрывающейся областью экспрессии, но расположенной ближе к переднему концу. Эти сдвиги не зависят от действия материнских градиентов и диффузии продуктов генов gap между ядрами.
9. Создана база данных FlyEx ( являющаяся пространственно-временным атласом экспрессии генов сегментации. База предоставляет пользователю информацию о динамике формирования областей экспрессии генов сегментации и позволяет произвести получение любых объемов данных по запросу.
4 Список публикаций по теме диссертации (тезисы 42 докладов на конференциях в список не включены) 4.1 Реферируемые журналы [A1] Surkova,S., Kosman,D., Kozlov,K., Manu, Myasnikova,E., Samsonova,A., Spirov,A., VanarioAlonso,C.-E., Samsonova,M., Reinitz,J. 2008. Characterization of the Drosophila segment determination morphome. Dev. Biol., 313(2), 844-862.
[A2] Суркова,C., Мясникова,Е., Райниц, Дж., Самсонова, М. Динамическая фильтрация вариабельности картин экспрессии зиготических генов сегментации у дрозофилы. Биофизика, в печати.
[А3] Суркова,C., Мясникова,Е., Козлов,К., Самсонова,А., Рaйниц, Дж., Самсонова,М.
Метод получения количественных данных из конфокальных изображений картин экспрессии генов in situ. Цитология, 50, 3, 170-185.
[A4] Самсонова,М., Гурский,В., Козлов,К., Самсонов,А. (2006) Системный подход к исследованию развития организмов. Научно-технические ведомости СПбГТУ, 2, 222-234.
[A5] Samsonova,M., Pisarev,A., Kozlov,K., Poustelnikova,E., Tkachenko,A. (2006). An information management system for collaboration within distributed working environment. LNBI, 4075, U. Leser, F. Naumann, and B. Eckman, eds, Berlin Heidelberg, Springer-Verlag, 204-215.
[A6] Sorzano,C.O.S., Blagov,M., Thevenaz,P., Myasnikova,E., Samsonova,M., and Unser,M.
(2006). Algorithm for spline-based elastic registration in application to confocal images of gene expression. Pattern Recognition and Image Analysis, 16, 1, 93-96.
[A7] Pisarev,A., Blagov,M., Pustelnikova,E., Myasnikova,E., Samsonova,M. (2005). A system for on-line processing and analysis of images of gene expression patterns. Pattern Recognition and Image Analysis, 15, 2, 428-431.
[A8] Janssens,H., Kosman,D., Vanario-Alonso,C-E., Jaeger,J., Samsonova,M., Reinitz,J. (2005).
A high-throughput method for quantifying gene expression data from early Drosophila embryo. Dev., Genes Evol., 225(7), 374-381.
[A9] Myasnikova,E., Samsonova,M., Kosman,D., Reinitz,J. (2005). Removal of background signal from in situ data on the expression of segmentation genes in Drosophila. Dev., Genes Evol., 215(6), 320-326.
[A10] Jaeger, J., Surkova, S., Blagov, M., Janssens, H., Kosman, D., Kozlov, K.N., Manu, Myasnikova, E., Vanario-Alonso, C.-E., Samsonova, M., Sharp, D.H., Reinitz, J. (2004). Dynamic control of positional information in the early Drosophila embryo. Nature, 430, 368-371.
[A11] Jaeger,J., Blagov, M., Kosman, D., Kozlov, K.N., Manu, Myasnikova, E., Surkova, S., Vanario-Alonso, C.-E., Samsonova, M., Sharp,D.H., Reinitz, J. (2004). Dynamical analysis of regulatory interactions in the gap gene system of Drosophila melanogaster. Genetics, 167, 17211737.
[A12] Poustelnikova, E., Pisarev, A., Blagov, M., Samsonova, M., Reinitz,J. (2004). A database for management of gene expression data in situ. Bioinformatics, 20, 14, 2212-2221.
[A13] Samsonova, M., Pisarev, A., Blagov,M. (2003) Processing of natural language queries to a relational database. Bioinformatics, 19, Suppl. 1, i241-i249.
[A14] Pisarev, A., Pustelnikova, E., Samsonova, M., Baumann,P. (2003) Mooshka: a system for management of multidimensional gene expression data in situ. Information Systems, 28, 269-285.
[A15]. Myasnikova, E., Samsonova, A., Samsonova, M., Reinitz, J. (2002) Support vector regression applied to the determination of the developmental age of a Drosophila embryo from its segmentation gene expression patterns. Bioinformatics, 18, S87-S95.
[A16]. Aizenberg, I., Myasnikova, E., Samsonova, M., Reinitz, J. (2002) Temporal>
Mathematical Biosciences, 176, 145-159.
[A17]. Kozlov, K., Myasnikova, E., Pisarev, A., Samsonova, M., Reinitz, J. (2002) A method for two-dimensional registration and construction of the two-dimensional atlas of gene expression patterns in situ. In Silico Biology, 2, 125-141, Козлов,К.Н., Петухов,Л.В., Самсонов,А.М., Самсонова,М.Г. (2002) Градиентный метод первого порядка для поиска феноменологических параметров в модели генных сетей.
Тр. СПбГТУ. Прикладная математика, 485, 73-83.
[A19] Aizenberg, I., Myasnikova, E., Samsonova, M., Reinitz, J. (2001) Application of the Neural Networks Based on Multi-Valued Neurons to>
[A20] Мясникова, E.М., Самсонова, A.А., Самсонова, M.Г.,, Рейнитц, Дж. (2001) Пространственная регистрация данных об экспрессии генов in situ. Молекулярная биология, 35, 6, 1-6.
[A21] Myasnikova, E., Samsonova, A., Kozlov, K., Samsonova, M., Reinitz, J. (2001) Registration of the expression patterns of Drosophila segmentation genes by two independent methods.
Bioinformatics, 17, 3-[A22] Kozlov, K., Myasnikova, E., Samsonova, M., Reinitz, J., Kosman, D. (2000). Method for spatial registration of the expression patterns of Drosophila segmentation genes using wavelets.
Вычислительные технологии, 5, 7, 112-119.
[A23] Serov, V.N., Spirov, A.V., Samsonova, M.G. (1998) Graphical interface to the genetic network database GeNet. Bioinformatics, 14, 6, 546-547.
4.2 Главы в книгах [A24] Samsonova,M.G., Samsonov,A.M., Gursky,V.V., Vanario-Alonso,C.-E. (2005). A survey of gene circuit approach applied to modelling of segment determination in fruit fly. In: Multiple aspects of DNA and RNA: from Biophysics to Bioinformatics, Session LXXXII (Eds. D. Chatenay, S. Cocco, R. Monasson, D. Thieffry and J. Dalibard). Elsevier, 2005, 305-323.
[A25] Myasnikova,E., Samsonova,A., Surkova,S., Samsonova,M., Reinitz,J. (2005). Determination of the developmental age of a Drosophila embryo from confocal images of its segmentation gene expression patterns. In: Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II. (Eds. N.Kolchanov and R. Hofestaedt) Springer Science+Business Media, Inc. 2005, 467-478.
[A26] Pisarev,A., Poustelnikova,E., Kozlov,K., Myasnikova,E., Samsonova,M., Reinitz,J. (2005).
ImageServer, a Tool for On-line Processing and Analysis of Biological Images. In: Yearbook Bioinformatics 2004, R. Hofestaedt (ed.), Magdeburg: IMBio, Informationsmanagement in der Biotechnologie e.V., 15-24.
[A27] Spirov, A.V., Samsonova, M.G. (1998) GeNet database as a tool for analysis of regulatory genetic networks. In: Information Processing in Cells and Tissues, M.Holcombe and R.Paton (Eds), Plenum Press, 285-294.
[A28]. Serov, V.N., Kirillova, O.V., Samsonova,M.G. (1999) NetWork: a tool for visualization of genetic network structure and dynamics. In: Visual Representations and Interpretations, R.Paton and I.Neilson eds., Springer Verlag, 156-160.
4.3 Труды конференций [A29] Matveeva,A.Д Kozlov,K., Samsonova,M. (2006). Methodology for building of complex workflows with ProStack package and iSIMBioS. In: Proceedings of the 5th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRSТ2006), July 16-22, 2006, Novosibirsk, Russia, v.2, 204-208.
[A30] Surkova,S.Yu., Samsonova,M.G. (2006) Dynamic filtration of variability within expression patterns of zygotic segmentation genes in Drosophila. In: Proceedings of the 5th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRSТ2006), 16-22 July 2006, Novosibirsk, Russia, v. 2, 178-182.
[A31] Samsonova,M., Poustelnikova,E., Pisarev,A., Myasnikova,E., Kozlov,K., Reinitz,J. (2005).
A LIMS to support quantitative data acquisition and numerical simulations of dynamics of segment determination in Drosophila early embryo. In: Proceedings of NETTAB 2005 workshop, Workflows management: new abilities for the biological information overflow, Second University of Naples, Naples, Italy, 5-7 October, 2005, [A32] Blagov M., Poustelnikova, E.,. Pisarev, A., Myasnikova, E., Samsonova, M. (2004) A system for on-line processing of images of gene expression patterns. In: Proceedings of the 4d International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRSТ2004), 25-30 July 2004, Novosibirsk, Russia,. v. 2, 161-164.
[A33] Surkova, S. Yu., Samsonova, M.G. (2004) Temporal and spatial precision in formation of segmentation gene expression domains in Drosophila. In: Proceedings of the 4d International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRSТ2004), 25-30 July 2004, Novosibirsk, Russia, v. 2, 142-145.
[A34] Samsonova, M., Surkova, S., Jaeger, J. and Reinitz, J. (2004). Quantitative approach to the functional genomics of development. In: Proceedings of the 4th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRSТ2004), 25-30 July 2004, Novosibirsk, Russia. v. 2, 135-137.
[A35] Pisarev A., Blagov M., Samsonova M. (2004). Method for integration of databases with common subject domains. In: Proceedings of the 4d International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRSТ2004), 25-30 July 2004, Novosibirsk, Russia. v. 2, 131-134.
[A36] Aizenberg, I., Butakoff, C., Myasnikova, E., Samsonova, M., Reinitz, J. (2002)>
Katsaggelos eds, 4668, 10-19.
[A37] Surkova, S. Yu., Samsonova, M.G., Myasnikova, E.M. (2002). Temporal changes in position of segmentation gene expression domains in Drosophila early embryo. In: Proceedings of the 3d International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRSТ2002), 14-20 July 2002, Novosibirsk, Russia, v. 3, 122-125.
[A38] Aizenberg,I., Myasnikova,E., Samsonova,M. (2001)>
Conf. on Artificial and Natural Neural Networks, IWANN 2001, Granada, Spain, June 2001, Springer, Part 2, 219-226.
[A39] Samsonova, M., Pustelnikova, E., Pisarev, A., Reinitz, J. (2000). Design of the integrated atlas of segmentation gene expression in situ. In: Proceedings of the German Conference on Bioinformatics, 5 - 7 Oct. 2000, Heidelberg, 125-132.
[A40] Myasnikova, E., Samsonova, A., Samsonova, M., Reinitz, J. (2000) Spatial registration of in situ gene expression data. In: Computation in Cells: Proceedings of an EPSRC Emerging Computing Paradigms Workshop, Univ. of Hertfordshire, UK: Dept. of Computer Science, Technical report No: 345, 21-26.
[A41] Samsonova,M., Serov,V., Trushkina, A. (2000) Tools for visualization of genetic network structure and dynamics. In: Computation in Cells: Proceedings of an EPSRC Emerging Computing Paradigms Workshop, Univ. of Hertfordshire, UK: Dept. of Computer Science, Technical report No:
345, 61-66.
[A42] Kozlov, K., Myasnikova, E., Samsonova, M., Reinitz, J., Kosman, D. (2000). Fast redundant dyadic wavelet transform in application to spatial registration of the expression patterns of Drosophila segmentation genes. In: Proceedings of the 15th International Conference on Pattern Recognition, Barcelona, Sept. 2000, v.3, 463-466.
[A43] Myasnikova, E.M., Kosman, D., Reinitz, J., Samsonova, M.G. (1999) Spatio-temporal registration of the expression patterns of Drosophila segmentation genes. In: Proceedings of the 7th Int. Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, T.Lengauer, R. Schneider, P.Bork, D.Brutlag, J.Glasgow, H.-W.Mewes and R.Zimmer eds., AAAI press, 195-201.
[A44] Samsonova, M., Serov, V.N (1999) NetWork: an interactive interface to the tools for the analysis of genetic network structure and dynamics. In: Proceedings of Pacific Symposium on Biocomputing, 4, 102-111.
[A45] Myasnikova, E., Kosman, D., Reinitz, J., Samsonova, M. (1999) A method for the spatiotemporal registration of the expression patterns of Drosophila segmentation genes. In: Proceedings of the 1st Conference on Modelling and Simulation In Biology, Medicine and Biomedical Engineering, Noisy-le-Grand, France. ESIEE, 63-67.
Список литературы Белоусов, Л. В. (2005). Основы общей эмбриологии. "Наука", Изд-во Московского университета, Москва, Россия.
Жимулев, И. Ф. (2003). Общая и молекулярная генетика. Сибирское университетское издательство, Новосибирск, Россия.
Корочкин, Л. И. (2002). Биология индивидуального развития. Изд-во Московского университета, Москва, Россия.
Ратушный, А. В., Лихошвай, В. А., Ананько, Е. А., Владимиров, Н. В., Гунбин, К. В., Лашин, С. А., Недосекина, Е. А., Николаев, С. В., Омельянчук, Л. В., Матушкин, Ю. Г. и Колчанов, Н. А. (2005). Новосибирская школа системной компьютерной биологии: исторический экскурс и перспективы развития. Информационный Вестник ВОГиС, 9(2):232Ц261.
Aegerter-Wilmsen, T., Aegerter, C. M., and Bisseling, T. (2005). Model for the robust establishment of precise proportions in the early drosophila embryo. J Theor Biol, 234(1):13 - 9.
Akam, M. (1987). The molecular basis for metameric pattern in the drosophila embryo.
Development, 101:1Ц22.
Bergmann, S., Sandler, O., Sberro, H., Shnider, S., Schejter, E., Shilo, B. Z., and Barkai, N. (2007).
Pre-steady-state decoding of the bicoid morphogen gradient. PLoS Biol, 5(2):e46.
Brown, L. G. (1992). A survey of image registration techniques. ACM Computing Surveys, 24(4):325Ц376.
Campos-Ortega, J. A. and Hartenstein, V. (1985). The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. Springer, Heidelberg, Germany.
Chu, K. W. (2001). Efficient parallel simulated annealing: The existence and estimation of an optimal mixing regime. PhD thesis, State University of New York at Stony Brook, Stony Brook, NY.
Diambra, L. and da Costa, F. (2005). Complex networks approach to gene expression driven phenotype imaging. Bioinformatics, 21:3846Ц3851.
Driever, W. and Nsslein-Volhard, C. (1988a). The Bicoid protein determines position in the drosophila embryo in a concentration-dependent manner. Cell, 54:95Ц104.
Driever, W. and Nsslein-Volhard, C. (1988b). A gradient of Bicoid protein in drosophila embryos.
Cell, 54:83Ц93.
Ephrussi, A. and St Johnston, D. (2004). Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell, 116(2):143Ц52.
Gilbert, S. F. (2003). Developmental Biology, Seventh Edition. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts 01373.
Gonzalez, R. C. and Woods, R. E. (2002). Digital image processing. Prentice Hall, Upper Saddle River, N.J., 2nd edition.
Gurdon, J. B. and Bourillot, P.-Y. (2001). Morphogen gradient interpretation. Nature, 413:797 - 803.
Holloway, D. M., Harrison, L. G., Kosman, D., Vanario-Alonso, C. E., and Spirov, A. V.
(2006). Analysis of pattern precision shows that drosophila segmentation develops substantial independence from gradients of maternal gene products. Dev Dyn, 235(11):2949Ц60.
Holloway, D. M., Harrison, L. G., and Spirov, A. V. (2003). Noise in the segmentation gene network of drosophila with implications for mechanisms of body axis specification. In Bezrukov, S. M., F.
H. M. F., editor, Fuctuations and Noise in Biological, Biophysical, and Biomedical Systems, volume 5110 of Proceedings of the SPIE, pages 180Ц191.
Hu, M.-K. (1962). Visual pattern recognition by moment invariants. IRE transactions of information theory, IT-8:179Ц187.
Ingham, P. W. (1988). The molecular genetics of embryonic pattern formation in drosophila.
Nature, 335:25Ц34.
Ingham, P. W. and Martinez-Arias, A. (1992). Boundaries and fields in early embryos. Cell, 68:221Ц235.
Isalan, M., Lemerle, C., and Serrano, L. (2005). Engineering gene networks to emulate drosophila embryonic pattern formation. PLoS Biol, 3(3):e64.
Janssens, H., Hou, S., Jaeger, J., Kim, A. R., Myasnikova, E., Sharp, D., and Reinitz, J. (2006).
Quantitative and predictive model of transcriptional control of the drosophila melanogaster even skipped gene. Nat Genet, 38(10):1159Ц65.
Keranen, S. V., Fowlkes, C. C., Luengo Hendriks, C. L., Sudar, D., Knowles, D. W., Malik, J., and Biggin, M. D. (2006). Three-dimensional morphology and gene expression in the drosophila blastoderm at cellular resolution ii: dynamics. Genome Biol, 7(12):R124.
Kirkpatrick, S., Gelatt, C. D., and Vecchi, M. P. (1983). Optimization by simulated annealing.
Science, 220:671Ц680.
Kitano, H. (2002). Systems biology: a brief overview. Science, 295(5560):1662Ц4.
Kosman, D., Reinitz, J., and Sharp, D. H. (1997). Automated assay of gene expression at cellular resolution. In Altman, R., Dunker, K., Hunter, L., and Klein, T., editors, Proceedings of the 1998 Pacific Symposium on Biocomputing, pages 6Ц17, Singapore. World Scientific Press.
D., Small, S., and Reinitz, J. (1998). Rapid preparation of a panel of polyclonal antibodies to drosophila segmentation proteins. Development, Genes and Evolution, 208:290Ц294.
Kozlov, K., Pisarev, A., Matveeva, A., Kaandorp, J., and Samsonova, M. (2007). Image processing package for quantification of biological images. In Proceedings of the 4th Int. Symposium on Networks in Bioinformatics (ISNB 2007), page 204, Amsterdam, the Netherlands.
Krishna, S., Banerjee, B., Ramakrishnan, T. V., and Shivashankar, G. V. (2005). Stochastic simulations of the origins and implications of long-tailed distributions in gene expression. PNAS, 102:4771П4776.
Lam, J. and Delosme, J.-M. (1988a). An efficient simulated annealing schedule: Derivation.
Technical Report 8816, Yale Electrical Engineering Department, New Haven, CT.
Lam, J. and Delosme, J.-M. (1988b). An efficient simulated annealing schedule: Implementation and evaluation. Technical Report 8817, Yale Electrical Engineering Department, New Haven, CT.
Lawrence, P. A. and Johnston, P. (1989). Pattern formation in the drosophila embryo: allocation of cells to parasegments by even-skipped and fushi-tarazu. Development, 105:761Ц767.
Ludwig, M. Z., Palsson, A., Alekseeva, E., Bergman, C. E., Nathan, J., and Kreitman, M. (2005).
Functional evolution of a cis-regulatory module. PLoS Biology, 3:0588Ц0598.
Martinez-Arias, A. and Lawrence, P. (1985). Parasegments and compartments in the drosophila embryo. Nature, 313:639Ц642.
Merrill, P. T., Sweeton, D., and Wieschaus, E. (1988). Requirements for autosomal gene activity during precellular stages of drosophila melanogaster. Development, 104:495Ц509.
Metropolis, N., Rosenbluth, A., Rosenbluth, M. N., Teller, A., and Teller, E. (1953). Equation of state calculations by fast computing machines. The Journal of Chemical Physics, 21:1087Ц1092.
Mjolsness, E., Sharp, D. H., and Reinitz, J. (1991). A connectionist model of development. The Journal of Theoretical Biology, 152:429Ц453.
Nsslein-Volhard, C., Frohnhofer, H. G., and Lehmann, R. (1987). Determination of anteroposterior polarity in drosophila. Science, 238:1675Ц1687.
Nsslein-Volhard, C. and Wieschaus, E. (1980). Mutations affecting segment number and polarity in drosophila. Nature, 287:795Ц801.
Ochoa-Espinosa, A., Yucel, G., Kaplan, L., Pare, A., Pura, N., Oberstein, A., Papatsenko, D., and Small, S. (2005). The role of binding site cluster strength in bicoid-dependent patterning in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A, 102(14):4960Ц5.
Pereanu, W. and Hartenstein, V. (2004). Digital three-dimensional models of drosophila development. Curr Opin Genet Dev, 14(4):382Ц91.
Perkins, T. J., Jaeger, J., Reinitz, J., and Glass, L. (2006). Reverse engineering the gap gene network of drosophila melanogaster. PLoS Comput Biol, 2(5):e51.
Reinitz, J., Mjolsness, E., and Sharp, D. H. (1995). Cooperative control of positional information in drosophila by bicoid and maternal hunchback. The Journal of Experimental Zoology, 271:47Ц56.
Shen, J. and Castan, S. (1986). An optimal linear operator for edge detection. In Proceedings CVPR Т86, Miami.
Simpson-Brose, M., Treisman, J., and Desplan, C. (1994). Synergy between the Hunchback and Bicoid morphogens is required for anterior patterning in drosophila. Cell, 78:855Ц865.
Smola, A. and Scholkopf, B. (1998). A tutorial on support vector regression.
Vapnik, V. (1995). The Nature of Statistical Learning Theory. Springer, N.Y.
Vincent, S., Ruberte, E., Grieder, N. C., Chen, C. K., Haerry, T., Schuh, R., and Affolter, M.
(1997). Dpp controls tracheal cell migration along the dorsoventral body axis of the drosophila embryo. Development, 124:2741Ц2750.
Wolpert, L. (1969). Positional information and the spatial pattern of cellular differentiation. The Journal of Theoretical Biology, 25:1Ц47.
Wolpert, L. (1989). Positional information revisited. Development (Supplement), 107:3Ц12.
Yucel, G. and Small, S. (2006). Morphogens: precise outputs from a variable gradient. Curr Biol, 16(1):R29Ц31.
Zinzen, R. P. and Papatsenko, D. (2007). Enhancer responses to similarly distributed antagonistic gradients in development. PLoS Comput Biol, 3(5):e84.