Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ГЛИНКИНА ЖАННА ИВАНОВНА
ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ВРОЖДЕННЫХ И НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРИ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ
03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор Бахарев Владимир Анатольевич доктор медицинских наук, профессор Кузьмичев Леонид Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, Академик РАЕН Лильин Евгений Теодорович доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич доктор медицинских наук, профессор Щипков Валерий Петрович
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Московский государственный медико- стоматологический университет Росздрава
Защита состоится л18 декабря 2008 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.203.05 при ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.
Автореферат разослан л.........ЕЕЕЕЕЕЕЕ2008г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 212.203.кандидат биологических наук, доцент Гигани О.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Основная цель вспомогательных репродуктивных технологий - наступление беременности и рождение здоровых детей. В настоящее время произошел значительный прогресс в лечении ранее неизлечимых форм бесплодия. Это стало возможным благодаря развитию микроманипуляционной техники и внедрению новых методов ВРТ, таких как ИКСИ, суррогатное материнство и др. Применение новых технологий позволяет получить потомство даже у супружеских пар с генетическими изменениями и высоким риском рождения ребенка с врожденной и наследственной патологией. Единственной в настоящее время возможностью снизить медицинский груз у этой группы пациентов является оптимизация программы ЭКО/ИКСИ с разработкой и применением новых профилактических мероприятий, которые должны стать неотъемлемой частью ВРТ.
Научно-практическая деятельность отделений ВРТ разных стран показала, что изменения в генотипе среди пациентов с нарушением репродуктивной функции отмечаются значительно чаще, чем в популяции [Курило Л.Ф., 1995; Сausio F., 1999].
Нарушение репродуктивной функции обычно обусловлены хромосомными и генными мутациями, наличием наследственной предрасположенности к заболеванию.
Мутации у родителей, приводящие к нарушению репродукции и невозможности зачатия ребенка естественным путем, могут передаваться будущему потомству через гаметы при применении программ ВРТ. Все эти данные указывают на необходимость проявлять настороженность при использовании методов ВРТ у пациентов с генетической патологией.
Следует отметить, что прогресс в развитии микроманипуляционной техники и методов лечения НРФ в настоящее время опережает разработку и внедрение методов профилактики рождения здорового потомства.
Несмотря на значительное усовершенствование существующих на сегодняшний день скрининговых программ по выявлению женщин групп высокого риска рождения генетически больного ребенка, они не могут быть в достаточной мере использованы для выявления аномалий у плодов, полученных в программах ВРТ. При разработке этих программ не учитывались особенности методов получения (стимуляция суперовуляции) беременности и ее течения (мощная гормональная поддержка, часто многоплодие) при использовании репродуктивных технологий. Новые условия требуют создания новых подходов к разработке профилактики врожденной и наследственной патологии и рождения здорового потомства у пациентов, включенных в программу ВРТ.
Новым и исключительно перспективным направлением в клинической практике в плане исключения рождения генетически больного ребенка должна стать преимплантационная диагностика, большим преимуществом которой является исследование эмбриона до момента переноса его в организм матери [Harper J., 2005;
Munne S., 2005].
Однако, несмотря на наличие технических возможностей проведения ПД, до сих пор неизвестно, как влияет сама эта манипуляция на дальнейшее развитие эмбрионов, какова эффективность данного метода; не разработан алгоритм проведения этой процедуры, до конца не сформулированы возможности ПД, показания к ее проведению.
Преимплантационная диагностика может стать альтернативой пренатальной диагностике для тех имеющих высокий риск рождения ребенка с наследственной или врожденной патологией фертильных супружеских пар, которые в случае обнаружения у плода генетической патологии выступают против медицинского аборта по моральным, религиозным или другим мотивам.
Несмотря на наличие многочисленных публикаций по данному вопросу, содержающаяся в них информация носит фрагментарный характер. До настоящего времени в литературе нет обобщенных данных о лечении и исходах беременностей у пациентов с генетическими мутациями. Все вышесказанное указывает на необходимость разработки алгоритма медико-генетического обследования и проведения профилактических мероприятий с помощью медико-генетического консультирования пациентов программы ВРТ.
Цель исследования Изучить особенности генотипа супружеских пар, включенных в программу ВРТ, и разработать алгоритм профилактических мероприятий врожденных и наследственных заболеваний у потомства.
Задачи исследования 1) Оценить частоту хромосомных и некоторых моногенных мутаций при различных формах бесплодия;
2) провести исследование генотипов супружеских пар программы ВРТ: цитогенетическое обследование; исследование гена CYP 21B; гена трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR - cystic fibrosis transmembrane conductase regulator); анализ микроделеций в локусе AZF хромосомы Y, антигенов системы HLA (Human Leucocyte Antigens);
3) выявить уровень хромосомных аберраций в сперматозоидах у мужчин, в кариотипе которых отмечаются хромосомные изменения;
4) определить частоту и характер хромосомных аберраций у эмбрионов in vitro, у неразвивающихся плодов, полученных в программе ВРТ;
5) провести анализ результатов программы ВРТ с проведением ПД у супружеских пар с изменениями в генотипе и без таковых; оптимизировать метод FISH;
6) разработать рекомендации генетического обследования доноров половых клеток;
7) на основании полученных данных разработать алгоритм генетического обследования пациентов и профилактических мероприятий для конкретной супружеской пары с высоким риском рождения ребенка с генетическим заболеванием в программе ВРТ.
Научная новизна В последнее время значительно возрос интерес как к самим новым методам ВРТ, так и к здоровью зачатых с помощью ВРТ детей. Это связано с тем, что в связи с достижениями в области микроманипуляционной техники, биологии, медицины даже у пациентов с генетическими мутациями появилась возможность иметь здоровых детей. В данном исследовании впервые проведено комплексное медико-генетическое обследование страдающих бесплодием и включенных в программу ВРТ супружеских пар, определены особенности генотипа, выявлены удельный вес и тип генетических мутаций у этой группы пациентов. В диссертации впервые предложен алгоритм комплексного медикогенетического обследования пациентов программы ЭКО и ИКСИ. Важным и новым являются разработанные в работе положения, доказывающие необходимость проведения преимплантационной диагностики у супружеских пар с генетическими нарушениями, оптимизирован протокол проведения гибридизации in situ и оценена эффективность преимплантационной диагностики FISH методом. Определена частота анеуплоидии в ядрах бластомеров у пациентов с генетическими изменениями (хромосомными и генными). Впервые выявлена положительная ассоциация антигенов системы HLA I класса у мужчин славянской популяции с нарушением сперматогенеза. Выявлено соотношение клонов с нормальным и аберрантным хромосомным набором в сперматозоидах у мужчин с робертсоновской транслокацией хромосом 13 и 14 в кариотипе. Таким образом, данное исследование направлено на повышение эффективности программы ВРТ и профилактику рождения ребенка с генетическими нарушениями у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции, а также у фертильных супружеских пар с высоким риском рождения потомства с мутациями.
Практическая значимость В данной работе на основе проведенных научных исследований решен ряд важных практических вопросов, направленных на повышение эффективности программы ВРТ и рождения здорового потомства у пациентов этой программы. Полученные данные указывают на необходимость комплексного проведения медико-генетического обследования обоих супругов, нуждающихся в лечении бесплодия до их включения в программу ВРТ.
Выявленный высокий уровень различных генетических изменений у супружеских пар с бесплодием позволяет разработать рекомендации по формированию группы риска пациентов, у которых в потомстве могут возникать мутации. В связи с этим предложена и показана важность оптимизации программы ВРТ для конкретной супружеской пары с генетическими нарушениями (хромосомными и/или генными) с разработкой индивидуального алгоритма лечения бесплодия методами ЭКО, ИКСИ.
Оптимизирован метод флуоресцентной гибридизации in situ, благодаря чему удалось повысить эффективность проведения ПД методом FISH.
Результаты исследования позволяют сделать заключение о высокой эффективности ПД в ряду профилактических мероприятий по рождению здорового потомства в рамках программы ВРТ.
Положения, выносимые на защиту 1. Высокая частота хромосомных и генных изменений в генотипе пациентов программы ВРТ обуславливает необходимость проведения медико-генетического консультирования, цитогенетического обследования обоим супругам и по показаниям молекулярно - генетическое обследования до включения их в программу ЭКО/ИКСИ.
2. У мужчин с робертсоновской транслокацией хромосом 13, 14 в кариотипе выявляется положительная корреляция между показателями спермограммы и частотой нерасхождения в сперматозоидах вовлеченных в транслокацию хромосом и гоносом. При наличии хромосомной аберрации в кариотипе и отклонений в показателях спермограммы в мейозе отмечается высокий уровень нерасхождения хромосом 13, 14, а также гоносом.
3. Антигены системы HLA I класса могут служить надежными маркерами в прогнозе наличия у мужчин нарушений сперматогенеза. Исследование фенотипов HLA I класса мужчин программы ВРТ с отклонениями в показателях спермограммы обнаружило положительные ассоциации между олигоастенотератозооспермией и антигенами HLA В18, В35, Cw4.
4. Преимплантационная диагностика является одним из основных этапов в профилактических мероприятиях у пациентов программы ВРТ. ПД с помощью FISH анализа является эффективным методом определения различных типов анеуплоидии в ядрах бластомеров и может быть рекомендована для применения в клиниках ВРТ как у пациентов с бесплодием, так и у фертильных супружеских пар, имеющих высокий риск рождения ребенка с генетической патологией.
Апробация работы Материалы работы доложены на Международном конгрессе с курсом эндоскопии Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний (Москва, 2004); на VII Российском Форуме Мать и Дитя (Москва, 2005); на V международном конгрессе Актуальные вопросы репродукции человека (проблемы и решения, 2008); межклиническом заседании при ФГУ НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий (23.06.2008 г). По материалам диссертации опубликовано 40 работ.
Структура и объем диссертации Работа изложена на 246 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 45 таблицами и рисунками. Библиографический указатель включает 244 литературных источника, из которых 43 работы отечественных и 201 - зарубежных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика обследованных супружеских пар В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ НЦ АГ и П им.
В.И. Кулакова Росмедтехнологий было обследовано 1898 человек, т. е. 949 супружеских пар, страдающих бесплодием и включенных в программу ВРТ. Все супружеские пары прошли медико-генетическое консультирование. Данные о супружеской паре были внесены в специально разработанную карту генетического обследования.
Супружеские пары были разделены на 2 группы: первая группа состояла из 3супружеской пары, у мужей которых отмечали нормозооспермию и планировали проведение программы ЭКО и ПЭ; вторая группа - из 558 супружеских пар, у мужей которых отмечали различные отклонения в показателях спермограммы и они нуждались в проведении процедуры ИКСИ (внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита).
Средний возраст женщин в группе ЭКО составил 34,2 года (от 20 до 51 г.), мужчин - 38 лет (от 24 до 66 лет). Процент женщин старше 35 лет в этой группе составил 50.4%. Возраст женщин в группе ИКСИ варьировал от 17 до 49 лет (средний возраст 33.г.), мужчин от 24 до 65 лет (средний возраст 39 лет). Женщины старше 35 лет в этой группе составили 34.9 %.
Изучение семейного анамнеза супружеских пар программы ЭКО и ПЭ позволило обнаружить у 23% супружеских пар (женщин и мужчин) НРФ у родственников I и II степени родства; в программе ИКСИ - 15.8%; выявленные ПР, хромосомные и моногенные заболевания у родственников пациентов программы ЭКО составили 1%, в программе ИКСИ - 3.6%.
Первичное бесплодие у пациентов I группы было отмечено у 162 супружеских пар;
у II группы - 309 пар.
Первичное МГК выявило у 80 пациентов из 1898 (4.2%) программы ВРТ врожденные пороки развития (ВПР), моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов. Дальнейшее генетическое исследование выявило различные генные мутации еще у 97 человек. Таким образом, общий уровень данных изменений составил 9.3% (у 177 из 1898 пациентов).
Характеристика сперматогенеза у включенных в обследование мужчин Исследование эякулята было проведено у всех мужчин, включенных в программу ВРТ. У 294 мужчин из супружеских пар I группы показатели спермограммы находились в пределах нормы, у 97 - на границе нормы. У всех мужчин из супружеских пар II группы наблюдали различные отклонения в показателях спермограммы.
Методы исследования С учетом задач исследования были применены следующие методы и исследования:
Цитогенетический метод Данный раздел исследования был выполнен сотрудниками лаборатории клинической генетики ФГУ НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий, которым автор выражает признательность.
Цитогенетическое исследование было проведено на препаратах метафазных хромосом лимфоцитов периферической крови в соответствии со стандартной процедурой.
Для получения препаратов хромосом из ворсин хориона применяли ускоренный прямой метод.
Молекулярно-цитогенетический метод (FISH) Для молекулярно-цитогенетических исследований препараты клеток эякулята готовили по методу, предложенному в 1997 г. Guttenbach M.
Преимплантационная диагностика эмбрионов состояла из 2 этапов - биопсии бластомера и молекулярно-цитогенетического исследования ядра бластомера. Биопсию бластомеров проводили на 3 день развития эмбриона in vitro. Для диагностики и последующего переноса выбирали эмбрионы хорошего качества, т.е., имеющие 6-бластомеров и фрагментацию не более 50%.
Биопсию эмбрионов проводили на микроманипуляторе NARISHIGA с применением лазерной пушки фирмы FERTILASE. В качестве основы подготовки ядра и гибридизации in situ служил протокол, рекомендуемый фирмой-производителем. В ходе исследования данный протокол нами был оптимизирован.
Для флуоресцентной гибридизаци in situ использовали зонды и набор фильтров фирмы ABBOT (Vysis). Микроскопический анализ проводили при увеличении 100Х10 с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss и системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой Metasystems.
Молекулярно-генетический метод Все молекулярно-генетические исследования проводили сотрудники лаборатории ДНКдиагностики ГУ МГНЦ РАМН, которым автор выражает большую признательность.
Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью набора реактивов для выделения DNA Prep100 (DIAtomтм) (Россия) по протоколу производителя.
Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы ДНК-технология (Россия).
Результаты амплификации, ПДРФ-анализа и аллель-специфичной лигазной реакции оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Разделение амплификационных фрагментов специфичных ДНК-маркеров проводили на 8% ПААГ.
Анализ и запись изображений полученных гелей проводили с использованием имеджин станции GEL DOC 2000 и пакета программ QUANTITY ONE о фирмы BIORAD (Италия). Анализ результатов исследования проводили по электрофореграмме.
Спермиологический анализ Спермиологический анализ эякулята выполняли дважды для большинства пациентов по методу, рекомендованному ВОЗ (WHO, 1999).
Исследование HLA I класса Фенотип HLA I класса у мужчин определяли по трем локусам, А, В и С.
Использовали гистотипирующую панель фирмы Гисанс (Санкт-Петербург).
Фенотип HLA определяли с помощью стандартного лимфоцитотоксического Теста Tarasaki в модификации Daussett.
Полученные результаты обрабатывали с помощью статистического определения Х, достоверная значимость которого равнялась 3,77 в программе Statgraphics. Критерий относительного риска, свидетельствующий о силе ассоциаций антигена и изучаемой патологии, рассчитывали по формуле (Woolf B. 1955) fn (I-fk) R = fk (I-fn), где fn - фракция носителей антигена среди обследованных; fk - фракция носителей антигена в контрольной группе. Показатели R более двух считали значимыми.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты цитогенетического обследования супружеских пар, эмбрионов и плодов программы ВРТ Хромосомные нарушения у супружеских пар с НРФ и профилактика рождения больных детей Исследование кариотипа у пациентов ВРТ выявило у 7% супружеских пар хромосомные аберрации: у пациентов I группы - у 24 женщин и 5 мужчин (7.4% в пересчете на супружескую пару); у пациентов II группы - у 7 женщин и 30 мужчин (6.6% в пересчете на супружескую пару).
Анализ полученных результатов показал, что и у мужчин и у женщин обеих групп нарушения в комплексе половых хромосом занимают первое место, хромосомные транслокации - второе, причем робертсоновская транслокация с вовлечением хромосом 13 и 14 встретилась в 50% наблюдений.
Проведенные многочисленные исследования кариотипа пациентов с НРФ показали высокий уровень хромосомных аберраций как у женщин, так и у мужчин.
Уровень хромосомных аберраций у пациентов с НРФ может варьировать от 1.8% до 8% [Курило Л.Ф., 1995; Сausio F., 1999]. При этом хромосомные изменения в общей популяции сравнительно редки и встречаются с частотой от 0.1% до 0.5% [Jacobs P.A., 1974; Nielsen J., 1991].
Следует обратить внимание на тот факт, что и в I и во II группах хромосомные аберрации были выявлены как у мужчин, так и у женщин. Это указывает на необходимость проведения цитогенетического исследования лимфоцитов периферической крови обоим супругам программы ВРТ. Данная группа супружеских пар составляет основную группу пациентов с высоким риском невынашивания беременности и рождения детей с наследственной патологией в рамках программы ВРТ. Это связано с тем, что у такой группы пациентов в процессе мейоза формируются половые клетки с несбалансированным хромосомным набором, которые при оплодотворении вносят свой вклад в аномальное развитие плода.
В связи с этим мужчинам с изменениями в кариотипе в ряде случаев мы рекомендовали исследование ядер сперматозоидов для выявления уровня анеуплоидии, проведение преимплантационной и/или пренатальной диагностики, а также, в зависимости от ряда обстоятельств (невозможность провести преимплантационую или пренатальную диагностику, отягощенный акушерский анамнез (ОАА), большое количество неудачных попыток и т.д.), использование в программе ВРТ донорских половых клеток.
Изучение процесса сегрецации хромосом в половых клетках у мужчин, имеющих изменения в кариотипе Нами были исследованы 5 образцов эякулята от мужчин с аналогичной робертсоновской транслокацией хромосом 13 и 14. Из 5 обследуемых пациентов только у одного показатели спермограммы были в норме, у остальных наблюдали олигоастенотератозооспермию (ОАТ). В качестве группы контроля служили 5 мужчин с нормальным кариотипом и нормозооспермией. В группе контроля сперматозоиды с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 встречались не чаще 1 на 1000 (0.1%) анализируемых клеток. У пациента с нормозооспермией и транслокацией в кариотипе анализ показал самый высокий процент сперматозоидов с нормальным набором хромосом 13 и 14 - 83.9%. У пациентов с отклонениями в показателях спермограммы он варьировал от 64 до 73%.
По частоте встречаемости анеуплоидия хромосомы 14 у мужчин с ОАТ заняла первое место - 17% (сперматозоиды с набором хромосом 14,0 встречались в 11% (среднее значение), а с набором 13,14,14- 6%). Анеуплоидия хромосомы 13 составила 11.6% (сперматозоиды с набором хромосом 13,13, 14 - 6.5% (среднее значение), а с набором 13,0 -5.1%).
У мужчины с нормозооспермией - уровень анеуплоидии хромосомы 13 составил 4.8%, а хромосомы 14 - 10.6%.
Исследование гоносом в сперматозоидах у пациентов с транслокацией в кариотипе показало у них также высокий уровень клеток с хромосомной патологией - от 0.6% до 1.7%. У пациентов с нормальным кариотипом этот уровень не превышал 0.25%.
Полученные данные свидетельствуют о существовании корреляции между хромосомными изменениями в лимфоцитах периферической крови и в половых клетках.
Исследования некоторых авторов позволили сделать предположение о том, что интерхромосомный эффект может зависеть от конкретной хромосомной аберрации в кариотипе [Blanco J., 2000]. Douet-Guilbert N. с соавт. (2005), используя зонды на 7, 9, 13, 21, Х, Y, 18 хромосомы, исследуя у пациентов с транслокациями различных хромосом в кариотипе мейоз FISH методом, выявили статистически достоверное увеличение частоты дисомии гоносом у пациента с der(13;14)(q10;q10), но не у пациента с der(14;21)(q10;q10).
Повышенный уровень дисомии 21 хромосомы отметили только у одного мужчины из четырех с различными реципрокными транслокациями - с t(9;22)(q21;q11.2).
Несмотря на противоречивые данные, все авторы пришли к выводу о важности индивидуального изучения сегрегации хромосом у пациентов с хромосомными аберрациями в кариотипе. Это даст достаточное количество информации о процентном соотношении половых клеток со сбалансированным и несбалансированным хромосомным набором у конкретного мужчины, что позволит провести адекватную генетическую консультацию супружеской паре и может сыграть решающую роль в выборе последующей тактики лечения.
Результаты ПД у супружеских пар с хромосомными аберрациями в кариотипе Большинство супружеских пар при обнаружении у них хромосомных изменений чаще соглашаются на программу с донацией половых клеток. Пациенты принимают такое решение в связи с тем, что большинство из них уже имели многочисленные неудачные попытки ЭКО/ИКСИ в анамнезе.
Во всех случаях биопсию эмбрионов мы проводили на третий день от зачатия, оплодотворение проводили с помощью метода ИКСИ. Перенос генетически пригодных эмбрионов осуществляли на 4 сутки после оплодотворения.
Всего было проведено 7 циклов ВРТ у пациентов с хромосомными аберрациями: у 2-х супружеских пар, где у мужей в кариотипе наблюдали сбалансированные транслокации 13 и 14 хромосом, было проведено 4 цикла; у одной, где у мужа кариотип был представлен дисомией хромосомы Y (47,ХYY) - 2 цикла; у одной, где у женщины в кариотипе был выявлен мозаицизм (46, ХХ [49] / 47,ХХХ [2]).
ПД у пациентов с робертсоновскими транслокациями в кариотипе ПД у супружеских пар, где в обоих случаях носителями транслокации хромосом 13 и 14 являлись мужчины была проведена в 4 циклах ВРТ. Возраст мужчин в обеих супружеских парах был - 32 года, возраст жен - 32 и 33 года, соответственно. В одном наблюдении у мужчины отмечали нормозооспермию, в другом - ОАТ. Для ПД и в первом и во втором случаях были пригодны около 70% эмбрионов, остальные эмбрионы отставали в развитии или имели фрагментацию более 50%. Для FISH исследования ядер эмбрионов использовали зонды на хромосомы 13 и 14.
У первой супружеской пары в двух циклах стимуляции из 23 полученных ооцитов развилось 16 пригодных для биопсии эмбрионов (69.6%). Из 16 полученных бластомеров - три оказались без ядер. Цитогенетическое исследование в первом наблюдении в 2-х циклах позволило выявить 62% эмбрионов, пригодных для переноса по генетическим критериям; в 38% - трисомию по изучаемым хромосомам. После биопсии на 4 день культивирования у первой супружеской пары в 1-м и 2-м цикле стимуляции в развитии остановились по одному эмбриону.
Одноплодная беременность наступила во втором цикле ВРТ при переносе эмбрионов (в первом цикле было перенесено также 2 эмбриона) и закончилась рождением здоровой девочки. Во время беременности женщине было предложено проведение пренатальной диагностики, от которой она отказалась.
У второй супружеской пары в двух программах ВРТ не было ни одного эмбриона, пригодного для переноса. В двух циклах стимуляции из 14 полученных ооцитов развилось 10 (71.4%), пригодных для биопсии эмбриона. Два эмбриона из 10 пригодных для биопсии не удалось проанализировать из-за отсутствия ядер в полученных бластомерах.
Хромосомные анеуплодии были представлены следующей патологией: 37.5% - моносомией хромосом 13 или 14; 62.5%- трисомиями хромосом 13 или 14Анализ результатов исследования показал, что трисомия хромосомы 13 среди представленной анеуплоидии встретилась в 6 наблюдениях из 13 (46.2%). Интересен тот факт, что, несмотря на то, что у мужчины из первой супружеской пары сперматозоиды с набором хромосом 13,14,14 встречались в 6.8%, а 13,13,14 всего в 2.1% наблюдений, трисомия хромосомы 13 в эмбрионах встречалась чаще, чем хромосомы 14. Можно предположить, что эмбрионы с трисомией хромосомы 13 обладают большим потенциалом развития, чем с трисомией 14.
Основываясь на полученных данных, можно сделать заключение о том, что в тех случаях, когда у мужчин с изменениями в кариотипе отмечается нормозооспермия, шансы на наступление беременности здоровым плодом в таких супружеских парах после ПД в рамках программы ВРТ значительно выше, чем у пар, где у мужей имеется ОАТ.
ПД у пациентки с кариотипом 46, ХХ/ 47,ХХХ[49][2] ПД пациентке с кариотипом 46, ХХ/ 47,ХХХ[49][2] была проведена в 3 цикле стимуляции суперовуляции, после того, как у нее был обнаружен мозаичный кариотип.
Две предыдущие попытки ВРТ не дали положительного результата, после чего было решено провести кариологическое исследование лимфоцитов крови, которое позволило выявить у нее изменения в кариотипе.
Возраст женщины был 31 год, мужа - 30 лет. Для FISH исследования ядер полученных эмбрионов использовали зонды на хромосомы Х и Y. Только 9 эмбрионов были пригодны для биопсии. Из них 2 содержали по 2 ядра. Нормальный кариотип был определен в 6 ядрах из 9 (66.7%) (4 эмбриона - женского пола, 2 - мужского).
Хромосомная патология была представлена трисомией хромосомы Х. На 4 день культивирования 2 эмбриона из 6 остановились в развитии (33.3%).
Таким образом, у данной пациентки из 15 полученных эмбрионов только 4 были с нормальным кариотипом и пригодны для переноса (26.7%). В результате переноса эмбрионов (1- женского и 1- мужского) родилась здоровая девочка.
ПД у пациента с дисомией хромосомы Y в кариотипе (47,ХYY) ПД у супружеской пары, где у мужа наблюдали дисомию хромосомы Y в кариотипе и отмечалась ОАТ, была проведена в 2 циклах ВРТ. Возраст мужчины был года, жены 31 год. Для FISH исследования ядер эмбрионов использовали зонды на хромосомы Х и Y.
В ходе стимуляции суперовуляции в 2 циклах ВРТ было получено 29 яйцеклеток (в 1 цикле - 14, во 2-15), из которых получили 22 эмбриона (в 1 цикле - 10, во 2 - 12).
Пригодных для диагностики эмбрионов оказалось 17 (в 1 цикле - 6, во 2 - 11; 77.3%). Из 17 полученных в 2 циклах бластомеров в двух оказалось по 2 и 4 ядра, в одном ядре в ходе диагностики не было получено сигналов. Таким образом, из 17 биопсируемых бластомеров результат был получен в 14 (82%).
В первом цикле стимуляции из 6 пригодных для биопсии эмбрионов нормальный набор по исследуемым хромосомам был выявлен в 2 эмбрионах (33.3%), во 2 цикле - в из 11 (54.5%). Нормальный набор в 1 цикле был представлен в одном наблюдении женским полом и в одном мужским, во 2 цикле - в 3 наблюдениях женским и в 3- мужским.
Хромосомная патология эмбрионов в 1 цикле была представлена в одном наблюдении набором ХХY, в другом - моносомией X; во втором цикле - в 3 наблюдениях ХХY и в одном - ХХХХ.
К сожалению, перенос в двух циклах ВРТ по 2 эмбриона в каждом не дал положительного результата. Пациентка планирует последующее проведение программы ВРТ. Несмотря на отрицательный результат, данная супружеская пара имеет хороший прогноз для проведения последующих попыток ЭКО, т.к. пригодных для переноса эмбрионов у них образуется от 20% (в 1 цикле ЭКО) до 60% (во 2 цикле ЭКО) от общего количества полученных и 33.3% и 54.5% от пригодных для биопсии.
Таким образом, у пациентов с изменениями в кариотипе уровень пригодных для переноса эмбрионов в программе ВРТ может колебаться от 0% до 62% при робертсоновских транслокациях и от 33.3% до 66.7% при нарушениях в комплексе половых хромосом.
Несомненно, в случаях неудачных попыток ВРТ при выборе тактики последующего лечения необходимо учитывать и количество предыдущих циклов стимуляции суперовуляции, а также качество и количество получаемых эмбрионов в предыдущих циклах, и, где возможно, результаты предварительного исследования частоты хромосомных аберраций в половых клетках. Однако, несмотря на вышесказанное, основным критерием для проведения ПД в программе ВРТ все-таки является пожелание самих пациентов участвовать в проведении последующих программ ВРТ.
ПД является одним из главных звеньев в алгоритме профилактических мероприятий по предотвращению не только рождения больного ребенка у супружеских пар с изменениями в кариотипе, но и исключения у них возникновения беременности больным плодом. В литературе уже имеется достаточное количество публикаций о рождении здоровых детей у таких пациентов в рамках программы ВРТ с применением ПД. Кроме того, исследования различных авторов показали, что ПД у пациентов с транслокациями в кариотипе позволяет значительно снизить у них уровень спонтанных абортов с 81% до 13% [Munne S., 2005] и со 100% до 5.3% [Otani T., 2006]. Исследователи обнаружили низкий уровень пригодных для переноса эмбрионов - 18.3% [Otani T., 2006] и высокий уровень несбалансированных хромосомных нарушений в эмбрионах: 72% - у пациентов с робертсоновскими и 82% - с реципрокными транслокациями [Munne S., 2005].
Результаты ПД у супружеских пар с нормальным кариотипом Частота анеуплоидии хромосом 13 и 21 у эмбрионов Профилактика анеуплоидии хромосом 13, 21, а также гоносом имеет большое значение в связи с тем, что данные нарушения занимают превалирующее место среди хромосомной патологии. Причем с возрастом пациентов риск рождения у них ребенка с хромосомной аномалией возрастает. По нашим данным процент женщин старше 35 лет в I группе пациентов составил 50.4%; во II группе -34.9%.
Преимплантационная диагностика эмбрионов на анеуплоидию хромосом 13, была проведена в 19 циклах ВРТ у 15 супружеских пар с бесплодием. Показаниями к проведению диагностики были возраст и в ряде случаев желание самих пациенток. У одной супружеской пары было проведено 3 цикла ВРТ, еще у одной - 2. Средний возраст пациенток в этой группе составил 36 лет (от 28 до 41 года).
Перенос эмбрионов был осуществлен в 18 циклах стимуляции суперовуляции.
Среднее количество пригодных для переноса эмбрионов было 2. У 7 женщин беременность наступила с первой попытки, что составило 36% на цикл или 38% на перенос. У одной пациентки при переносе 3-х эмбрионов была получена беременность тройней. Однако в 1 триместре беременности один плод саморедуцировался.
ИзЦза отсутствия генетически нормальных эмбрионов у одной пациентки перенос был отменен. К настоящему времени 5 беременностей закончились родами детьми без генетических отклонений.
Несмотря на проведение диагностики, в одном наблюдении беременность в I триместре была прервана в связи с обнаружением анэмбрионии плода (кариотип абортуса 46,ХХ) во время ультразвукового исследования. В другом наблюдении у плода во втором триместре также во время ультразвукового исследования была обнаружена гипоплазия почек. На медицинском консилиуме пациентке было предложено прерывание беременности, от которого она отказалась по моральным мотивам. Исход данной беременности неизвестен.
В 19 циклах стимуляции суперовуляции при исследовании 74 одноядерных бластомеров результат был получен в 68 (91.9%). При этом нормальный набор по изучаемым хромосомам, был определен в 42 ядрах из 68, что составило 61.8%, а в отмечали различную форму анеуплоидии (38.2%).
Нарушение числа хромосомы 21 наблюдали в 11 ядрах из 26 (42.3%), при этом трисомия хромосомы 21 отмечалась в 6 наблюдениях (54.5%).
Анеуплоидия хромосомы 13 была обнаружена в 10 наблюдениях из 26 (38.5%), из них трисомия была представлена в 2 наблюдениях (20%). Одновременное присутствие анеуплоидии хромосом 13 и 21 было выявлено в 5 наблюдениях из 26 (19.2%).
Среди эмбрионов с нормальным набором по изучаемым хромосомам 7 из 42 были плохого качества (16.6%); среди эмбрионов с патологией - 3 из 26 (11.5%). При анализе качества эмбрионов, содержащих более 1 ядра, было выявлено, что только в одном наблюдении из 7 (14.3%) эмбрион был плохого качества. Среди эмбрионов со смешанной патологией процент эмбрионов плохого качества составил - 40% (у 2 из 5). Самый высокий уровень эмбрионов плохого качества был отмечен среди эмбрионов, где в бластомерах не было получено ядер - 47.4% (9 из 19).
Возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, был: 28, 30, 31, 31, 41 г. (средний 32.2 г.). У одной женщины 31 года было выявлено 2 эмбриона с данной трисомией. Обеим пациенткам, у которых была выявлена трисомия хромосомы 13, было по 35 лет. Следует отметить, что 5 из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21 только один эмбрион был плохого качества (16.7%). Оба эмбриона с трисомией хромосомы 13 были хорошего качества.
После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для переноса эмбрионов наблюдали в 83% случаев.
Частота анеуплоидии хромосом Х, Y, 21 у эмбрионов Исследование эмбрионов на анеуплоидии хромосом Х, Y и 21 было проведено в 22 циклах ВРТ у супружеских пар с бесплодием. Средний возраст пациенток в этой группе составил 34.7 лет (от 22 до 45 лет). Основным показанием к проведению диагностики было желание пациенток определить пол эмбриона. Учитывая полученную возможность одновременно исследовать гоносомы и хромосому 21, было решено провести данное исследование.
Перенос эмбрионов был осуществлен в 20 циклах, в 2 переноса не было по причине отсутствия генетически нормальных эмбрионов. Среднее количество пригодных для переноса эмбрионов было 2, беременность наступила у 6 женщин (27.3% на цикл, 30% на перенос). У 3 пациенток были получены беременности двойней. У одной из этих женщин в 1 триместре произошла саморедукция одного плода.
При исследовании 107 одноядерных бластомеров результат был получен в 1(95.3%). Из проанализируемых ядер 71 из 102 содержали нормальный набор по изучаемым хромосомам, что составило 69.6%, а в 31 отмечены различные типы анеуплоидии (30.4%).
Из выявленной патологии, изменения в комплексе гоносом наблюдали в 11 ядрах из 31 (35.5%), при этом трисомия половых хромосом была отмечена в 6 наблюдениях (в случаях- XXY, в 2- ХХХ); тетрасомию и моносомию хромосомы Х наблюдали в 2-х случаях, и в одном наблюдении была обнаружена моносомия хромосомы Y.
Анеуплоидия хромосомы 21 была обнаружена в 12 наблюдениях из (38.7%), из них трисомия и моносомия были представлены в равных долях по наблюдений (50%).
Одновременное присутствие анеуплоидии гоносом и хромосомы 21 было выявлено в 8 наблюдениях из 31 (25.8%).
Среди эмбрионов с нормальным набором по изучаемым хромосомам 11 из 71 были плохого качества (15.5%); среди эмбрионов с патологией - 9 из 31 (29%). При анализе качества эмбрионов, содержащих более 1 ядра в бластомере, плохое качество было отмечено в 2 эмбрионах из 8 (25%). Процент эмбрионов плохого качества среди эмбрионов, где не было получено ядер, равнялся 21.7% (5 из 23).
Возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, был: 36, 43, 42, 42, 38 л. (средний 40.2 г.). У одной женщины 38 лет было выявлено эмбриона с трисомией.
Из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21, два эмбриона были плохого качества (33%), и один эмбрион был плохого качества с моносомией. Среди эмбрионов с анеуплоидией гоносом плохое качество эмбрионов было отмечено у 3 из 11(27.3%).
Среди эмбрионов со смешанной патологией отмечался самый высокий процент эмбрионов плохого качества - 37.5% (у 3 из 8).
После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 84% случаев.
Таким образом, анализ результатов ПД с применением зондов к 13, 21 и Х,Y, хромосомам показал, что данная диагностика может являться хорошим профилактическим мероприятием в рамках программы ВРТ. Получение результата в 95% наблюдений указывает на то, что примененный нами молекулярно-цитогенетический FISH метод может быть успешно использован с целью диагностики анеуплоидии по различным хромосомам в ПД. Наше исследование показало, что бластомеры, не содержащие ядер, встречаются значительно чаще, чем бластомеры, содержащие одновременно несколько ядер: 17.2% и 6.7%, соответственно (в 2.8 раза). При этом эмбрионы, от которых были получены многоядерные и безъядерные бластомеры, являлись непригодными для переноса как по генетическим, так и по морфологическим критериям отбора. Так, среди эмбрионов, где полученные бластомеры не содержали ядер, плохое качество было отмечено в 21.7% и 47.4%, а в ядрах, полученных из одного бластомера, отмечали различные анеуплоидии. Таким образом, данные эмбрионы не рекомендуется использовать в программе ВРТ для их дальнейшего переноса в полость матки женщины. Наряду с этим имеющие в хромосомном наборе анеуплоидию эмбрионы могут быть хорошего качества (от 71% до 88.5%), т. е. морфологически нормального строения и в случаях, если бы не было проведено их генетическое исследование, они могли бы быть в дальнейшем использованы в программе ВРТ. Так, эмбрионы с трисомией хромосомы 21 имели плохое качество только в 16.7% и 33% наблюдений, в остальном проценте они вполне соответствовали критериям визуального отбора для переноса в полость матки. Таким образом, визуальное исследование морфологических параметров эмбриона не всегда может отражать его генетический статус. Среди эмбрионов с нормальным набором исследуемых хромосом плохое качество отмечалось у 15.5% и 16.7% эмбрионов соответственно. Среди эмбрионов с одновременной анеуплоидией по различным хромосом плохое качество отмечается чаще, чем при анеуплоидии одной из исследуемых: от 37.5% (Х,Y, 21 хромосом) до 40% (13, 21 хромосом). Полученные данные указывают на то, что одновременное нарушение в наборе нескольких хромосом может оказывать большее негативное влияние на развитие эмбрионов, чем нарушения только по одной хромосоме. Наши данные о том, что морфологические параметры эмбриона не всегда могут отражать его генетический статус подтверждаются и работами других авторов [Baltaci V., 2006].
У женщин старше 39 лет при проведении ПД перенос эмбрионов может не производиться в 11.4% случаях по причине отсутствия нормальных эмбрионов по генетическим критериям. К такому заключению авторы пришли после анализа результатов 3597 циклов ВРТ с ПД. В 410 циклах все эмбрионы содержали различные формы анеуплоидии [Chatzimeletiou K., 2005].
По мнению многих авторов, селекция и перенос эмбрионов с нормальным хромосомным набором увеличивают частоту имплантации, снижают риск спонтанных абортов, и предупреждают рождение детей с генетической патологией у пациентов программы ВРТ [Harper J., 2006; Munne S., 2006; Rossignol, S., 2006].
Результаты ПД у супружеской пары с частым пузырным заносом в анамнезе Известно, что пузырный занос в ряде случаев возникает из-за аномального оплодотворения яйцеклетки и нарушений в хромосомном наборе зиготы, эмбриона. В таких случаях ПД может решить проблему повторных пузырных заносов [Reubinoff B., 1997].
ПД была проведена у фертильной женщины с двумя пузырными заносами в анамнезе, пожелавшей пройти ПД в рамках программы ВРТ. Пузырный занос у пациентки выявлялся по ультразвуковому исследованию в сроки 7 и 9 недель беременности. В одном наблюдении у нее был обнаружен полный пузырный занос, в другом частичный. Перед проведением программы ВРТ пациентка была проконсультирована врачами-онкологами.
Для FISH исследования ядер эмбрионов использовали зонды на хромосомы Х, Y и 21. Из 12 полученных эмбрионов только 10 были пригодны для диагностики (83%).
Нормальный набор по исследуемым хромосомам был определен в 3 эмбрионах из 10, подвергнувшихся диагностике (30%): в одном наблюдении был представлен женским полом, в двух - мужским. Патология хромосом была представлена как в комплексе гоносом, так и по хромосоме 21. Уровень анеуплоидии хромосомы 21 составил всего 16.7% (одно наблюдение из 6) от общего числа выявленной патологии. Все формы хромосомной патологии были представлены по одному наблюдению: XX,21; XXX,2121;
XXXX,2121; Y,2121; XXY,2121; X,2121.
В результате переноса 2 эмбрионов (одного женского и одного мужского пола) наступила одноплодная беременность, которая развивалась нормально. Ультразвуковое исследование на разных сроках беременности пороков развития и отклонений в протекании беременности не показало. В сроке 18 недель беременности пациентка отказалась от проведения пренатальной диагностики. На 40 неделе беременность закончилась рождением здоровой девочки.
Таким образом, программа ВРТ с проведением ПД у женщин с повторными пузырными заносами в ряде случаев может являться хорошим профилактическим мероприятием. Наше исследование показало, что в данном наблюдении у эмбрионов отмечается высокий уровень генетических аномалий (70%), что могло являться причиной предыдущих пузырных заносов. Учитывая тот факт, что почти вся выявленная патология была представлена анеуплоидией гоносом, можно предположить, что данная патология может вносить значительный вклад в развитие данного заболевания. Можно предположить, что подобная тактика ведения пациенток с пузырными заносами с использованием ПД найдет свое применяться в медицинской практике.
Результаты ПД у супружеских пар с определением пола у эмбрионов по желанию пациентов Преимплантационное определения пола эмбриона в программе ВРТ по желанию пациентов занимает большую долю от всех случаев проведенной диагностики.
С просьбой определения пола эмбриона обратились 42 супружеские пары. У них было проведено 60 циклов ВРТ с ПД. Следует отметить, что только 4 пары к моменту обращения были фертильными, у остальных наблюдали либо первичное, либо вторичное бесплодие.
Средний возраст пациенток в этой группе, не считая женщин, включенных в программу донации ооцитов, составил 32 года (от 23 до 43 лет).
У 40 пациенток была проведена стимуляции суперовуляции. У одной женщины лет было проведена программа донации ооцитов. Другая пациентка 49 лет помимо программы донации ооцитов была включена еще в программу суррогатного материнства.
У обеих было проведено по 4 попытки исследования пола эмбриона.
Из 60 случаев проведенной диагностики отмена переноса в связи с отсутствием нужного пола была в 10 случаях. Всего беременность наступила в 17 проведенных циклах, что составило 28% на цикл и 34% на перенос эмбрионов. В 4 наблюдениях беременность была отмечена только как биохимическая, т.е. результаты исследования -субъеденицы хорионического гонадотропина через 14 дней после переноса эмбриона указывали на наличие беременности, однако последующее ультразвуковое исследование через неделю не подтвердило ее наличие. Из 13 клинически распознанных беременностей остановились в развитии в 1 триместре беременности, и 1 прервалась во 2. Таким образом, в результате 8 беременностей, родилось 10 здоровых детей нужного пола (в 2 случаях - двумя плодами).
При исследовании 281 ядра, принадлежащего одноядерным бластомерам, нормальный набор по изучаемым хромосомам был определен в 217 ядрах из 281, что составило 77.2%, а в 64 отмечали различные типы анеуплоидии (22.8%). Женский набор хромосом был определен в 104 наблюдениях; мужской - в 113.
Среди выявленной патологии по изучаемым хромосомам наибольшая частота относилась к моносомии хромосомы Х - 29.7% (в 19 наблюдениях из 64). Моносомия хромосомы Y была отмечена в 8 случаях. Таким образом, общий уровень моносомии составил- 42.2% (в 27 случаях из 64). Трисомия гоносом среди случаев выявленной анеуплоидии была отмечена в 28 наблюдениях, что составило 43.8%. Полисомия гоносом составила 12.5% (в 8 наблюдениях из 64). После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие среди пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 79% случаев.
Сводные данные по ПД с применением зондов к различным хромосомам Результаты ПД с применением зондов к различным хромосомам представлены в таблицах 1 и 2.
Результаты анализа показали, что анеуплоидия по хромосоме 21 занимает в среднем 40.5% от общего уровня выявленной патологии, а по хромосоме 13 - 38.5%.
Средний уровень анеуплоидии гоносом составил наименьший процент - 29.2. Этим объяснятся, что уровень генетически нормальных эмбрионов при исследовании только гоносом оказался самым высоким, а самым низким - при исследовании хромосом 13 и 21.
Следует отметить, что уровень анеуплоидии гоносом (35.5%), где исследовали еще и хромосому 21, оказался выше, чем в тех случаях, где исследовали только гоносомы (22.8%). Мы считаем, что это может быть связано с тем, что возраст пациентов в этих группах был различным. Подобная ситуация наблюдается и при анализе частоты анеуплоидии хромосомы 21. В группе, где средний возраст пациенток составил 36 лет, этот уровень составил 42.3%, а в группе, где возраст был 34.7 года - 38.7%.
Таблица Уровень анеуплоидии по различным хромосомам в ядрах бластомеров Исследуемые Ср.возраст Пригодных для Уровень генетически нормальных хромосомы пациенток биопсии эмбрионов эмбрионов лет % % 13, (при транслокации в (средний 70%) кариотипе) 1 наблюд. 32 69.6 2 наблюд. 33 71.4 Х, Y 1) у женщины с мозаицизмом в кариотипе 31 60 66.2) у мужчины с кариотипом 47,XYY 31 77 33.3(1 попытка)-54.5(2 попытка) (ср. 43.9) 13, 21 36 71.4 61.X,Y, 21 34.7 76 69.Х, Y 32 66.8 77. Таблица Характер анеуплоидии по различным хромосомам в ядрах бластомеров Иссл-мые хромосомы: Иссл-мые хромосомы: Иссл-мые хромосомы:
13, 21 Х, Y, 21 Х, Y Анеупл. 21 хром. от Анеупл. 21 хром. от общего % общего % выявленной выявленной патологии патологии 38.7 Уровень анеуплоидии 42.3 Из них трисомии -50 гоносом Из них трисомии -54.5 22.Анеупл. 13 хром. от Анеупл. гоносом от общего % общего % выявленной выявленной патологии Моносомия гоносом от патологии 35.5 общего % выявленной 38.5 Из них трисомии - 54.5 патологии 42.2% Из них трисомии -20 Трисомия гоносом от общего % выявленной Анеупл. одноврем. 21 и 13 Анеупл. одноврем. патологии 43.8%.
хром. от общего % хромосомы и гоносом от общего выявленной патологии % выявленной патологии 19.2 25.При исследовании частоты анеуплоидии выявили, что трисомия хромосомы и гоносом составила 52.3% и 49.2%, соответственно, а по хромосоме 13 трисомия занимает только 20%.
Из полученных данных видно, что патология одновременно нескольких хромосом занимает меньшую долю, чем анеуплоидия по отдельным хромосомам.
Наши исследования показали, что ПД с биопсией одного бластомера не влияет на дальнейшее развитие эмбриона. После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 82% случаев (среднее значение). Результаты с применением FISH метода были получены в 95% наблюдений.
Анализ полученных после проведения ПД беременностей и рожденных детей показал, что данная технология с использованием FISH метода является высокоэффективным методом и может быть рекомендована для широкого применения в рамках программы ВРТ. К такому же выводы пришли и другие авторы [Munne S., 2005;
Harper J., 2006].
Анализ кариотипа неразвивающихся плодов пациентов программы ВРТ Исследование кариотипа эмбрионов при неразвивающихся беременностях, полученных в программе ВРТ, имеет значение, так это может помочь в последующем выборе алгоритма лечения для конкретной супружеской пары.
Было проанализировано 57 образцов хориона неразвивающихся плодов, полученных в программе ВРТ. Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил 33.4 г (от 24 до 44 лет).
Статистической значимой разницы по полу эмбрионов, методу зачатия, возраста женщин и сроку прерывания беременности не наблюдали, хотя имеется незначительное повышение возраста женщин, имевших эмбрионы с трисомией по 21 хромосоме и хромосомам группы D. Следует отметить, что оба кариотипа с трисомией гоносом - 47,XXY принадлежали плодам, зачатых из тестикулярных сперматозоидов.
Хромосомные нарушения у эмбриона были выявлены в 31 наблюдении, что составило 54.4%. На первом месте по частоте встречаемости хромосомной патологии в спонтанных абортусах была моносомия хромосомы Х (22.6%). Трисомии различных хромосом (в том числе 2 наблюдения трисомии гоносом) от общего уровня выявленной патологии составили 58.1% (табл.3).
Наши данные совпадают с результатами других исследователей. Ряд авторов показали, что анеуплоидии гоносом занимают первое место в структуре хромосомной патологии у абортусов, полученных в программе ВРТ. Моносомия хромосомы Х занимает превалирующие место и может доходить до 11.2% и выше от общей доли хромосомной патологии [Байбарина Г.В., 2004; Causio F., 2002; Philipp T., 2004; Plachot M. 1989].
Таблица Цитогенетическое исследование клеток хориона неразвивающихся беременностей, полученных в программе ВРТ Сроки прерывания Средний возраст Кариотип абортусов Число беременности пациенток наблюдений (n=57) 7-8 31.9 Норма 5 34 Трисомия хромосомы 1 5-8 37.2 Трисомия хромосом группы D 5-10 33.7 Трисомия хромосомы 16 7-8 38 Трисомия хромосомы 20 8-12 36.7 Трисомия хромосомы 21 6-7 29 Трисомия гоносом (ХХY) 5-9 34.3 Моносомия хромосомы Х 6-7 32 Тетраплоидный набор хромосом 8 33 Триплоидный набор хромосом 6-7 35 Иверсия хромосомы 2 5-8 37 Мозаицизм хромосом 7-8 31 Наличие маркерной хромосомы в кариотипе Анализ полученных результатов показал высокий уровень хромосомных нарушений в клетках неразвивающихся беременностей, полученных в программе ВРТ.
Это указывает на необходимость разработки профилактических мероприятий у данной группы пациентов с оптимизацией программы ВРТ, которая может заключаться в применении ПД. Мы считаем, что в тех наблюдениях, где в хромосомном наборе абортуса выявлены изменения, а у пациентов перед программой ВРТ предварительно не был исследован кариотип, супружеским парам в обязательном порядке рекомендуется провести цитогенетическое исследование перед следующей попыткой.
Особенности проведения ПД с помощью метода FISH с оптимизацией метода в современных условиях Любая из существующих на сегодняшний день лабораторных диагностик имеет определенные сложности при ее проведении.
Отсутствие или наличие нескольких ядер в бластомерах, неполное отхождение цитоплазмы бластомера от ядра, потеря ядер были главными проблемами, с которыми нам пришлось столкнуться в ходе проведения ПД.
По нашим данным до 17% бластомеров не содержали ядер и 6% бластомеров были многоядерные. Зачастую в разных ядрах, полученных из одного бластомера, либо отсутствовали сигналы, либо в них был отмечен разный состав по изучаемым хромосомам. В одном наблюдении в двух ядрах из одного бластомера были получены наборы хромосом, которые соответствовали женскому и мужскому набору.
Потеря ядер бластомеров в ходе диагностики в основном была связана с неполным отхождением цитоплазмы от ядра и при обработке образца пепсином ядро лотклеивалось вместе с цитоплазмой. Изначально в основе проведения ПД был использован протокол, рекомендуемый фирмой производителем. Время экспозиции препарата в пепсине по протоколу - 20 минут. При четком соблюдении этой рекомендации потеря ядер на данном этапе диагностики составляла 6.2%, при этом в 62.5% наблюдений ядро освобождалось от цитоплазмы. Изменение времени пребывания ядра в пепсине с 20 минут до 3 позволило сократить потерю ядер с 6.2 % до 2.4%.
Отсутствие сигналов в ядрах при использовании зондов к различным хромосомам мы наблюдали в от 18.7% до 5.5% случаев. В основном сигналы отсутствовали в тех ядрах, которые были получены из одного бластомера (многоядерные бластомеры), и где имелась цитоплазма вокруг ядра.
К следующим проблемам, которые представляли трудности для точной постановки диагноза, можно отнести: неправильные формы ядер, с размытыми не четкими контурами; наложение сигналов; сдвоенные сигналы (split signals). Наложение сигналов и сдвоенные сигналы затрудняет точную интерпретацию полученных результатов. Наложение может возникать как из-за одновременного исследования нескольких хромосом, так и из-за расположения хромосом в исследуемом ядре.
Моногенные нарушения у супружеских пар с НРФ и профилактика рождения больных детей Исследование моногенных мутаций проводили не у всех пациентов программы ВРТ. Показаниями к выявлению нарушений в гене CYP21В являлись в одних случаях высокие значения 17-ОП, в других либо клинические проявления синдрома (гирсутизм, позднее менархе, нерегулярный менструальный цикл, невынашивание беременности и т.д.), либо обнаруженные в системе HLA- I класса генетические маркеры данного заболевания - антигены В35, В14.
Исследование мутации гена CYP21В молекулярно-генетическим методом было проведено у 108 человек: 70 женщин (34 пациентки - I группы, 36 ЦII группы) и мужчин (18 человек- I группы, 20 ЦII группы).
Гетерозиготное носительство мутации гена CYP21В было выявлено у женщин (14- в I группе, 20 ЦII группы) и 19 мужчин (5- в I группе, 14 ЦII группе). В наблюдениях (1- в I группе, 5 ЦII) исследование выявило наличие мутации в гене CYP21В у обоих супругов. Данная ситуация требует медико-генетического консультирования супружеской пары во время беременности для решения вопроса о проведении пренатальной диагностики.
Анализ результатов нагрузочной пробы с АКТГ обнаружил высокую эффективность выявления (85.7%) гетерозиготного носительства у обследуемых пациентов (у 12 из 14).
Из всех выявленных мутаций, среди мужчин и женщин обеих групп, делеция гена CYP21B составила 70.7%; дупликация - 24.4%.
При делециях гена CYP21В маркер HLA В14 был выявлен в 11 наблюдениях из 16, что составило 68.8%, при дупликациях этого гена маркер HLA В35 был выявлен в наблюдениях из 9, что составило 66.7%.
У 164 мужчин с различными отклонениями в показателях спермограммы проводили исследования локуса AZF хромосомы Y и гена CFTR.
Результаты исследования показали, что 42 мужчины имели мутации в исследуемых генах: в 21 наблюдении (12.8%) - мутации в локусе AZF хромосомы Y; в 21 (12.8%) - мутации гена муковисцидоза (табл. 4 и 5).
Таблица Выявленные мутации гена CFTR и результаты спермограмм у мужчин программы ИКСИ Выявленные мутации в Результаты спермограммы Число наблюдений гене CFTR (n=21) F508del ОАТ W1282X ОАТ 2143delT ОАТ 1677delTA астенотератозооспермия 2184insA обструктивная азооспермия F508del и 5Т олигозооспермия 5Т ОАТ Необструктивная азооспермия Астенотератозооспермия тератозооспермия 5Т/5Т Обструктивная азооспермия Необструктивная азооспермия Таблица Микроделеции AZF локуса хромосомы Y, выявленные у пациентов программы ИКСИ Выявленные микроделеции AZF локуса Результаты спермограммы Число хромосомы Y наблюдений (n=21) Del sY 1192 (n=7) ОАТ Тератозооспермия Олигоастенозооспермия Олиготератозооспермия Del sY 1291 (n=5) астенотератозооспермия азооспермия Олигоастенозооспермия Олиготератозооспермия Del sY 242 (n=1) ОАТ Del sY 1125 (n=1) ОАТ Del sY 254, sY255 (n=3) Азооспермия ОАТ Del sY 1291, Del sY 1197 (n=1) ОАТ Del sY 242, Del sY 254, Del sY 157 (n=1) ОАТ Del sY 1192, Del sY 254, Del sY 255, азооспермия Del sY 1206 (n=1) Del sY 1192, Del sY 254, Del sY 255, Del sY ОАТ 1291, Del sY 1206 (n=1) Анализ результатов исследования гена CFTR показал, что аллель 5Т был выявлен в 14 наблюдениях из 21, в том числе у 3 пациентов в гомозиготном состоянии, и у одного пациента в сочетании с F508del. Общая частота аллеля 5Т от выявленных изменений в гене CFTR составила - 40.5%. На втором месте по частоте встречаемости оказалась мутация F508del, которая была выявлена в 4 наблюдениях, что составило 9.5%.
Женщинам из супружеских пар, где у мужей были выявлены мутации гена муковисцидоза, было рекомендовано исследование данного гена, которое выявило у пациенток также мутации в исследуемом гене.
Наши данные совпадают с результатами исследования других авторов.
Многочисленные исследования пациентов с патологией семявыводящих протоков показали у них высокий уровень мутаций в гене CFTR около 70% [Escudero J., 1997].
Одновременное присутствие двух различных мутаций в гене CFTR у данной группы пациентов по данным разных авторов отмечается в 14.5-40% случаев [Bienvenu T, 1996;
Braekeleer M, 1996; Durieu I., 1997]. Исследователи показали, что частота мутации F508del составляет самый высокий процент среди других мутаций - до 62% [Robert F., 1999; Suzuki Y., 2002], Аллель 5Т, по мнению некоторых авторов, может являться причиной нарушения сперматогенеза различной степени тяжести, а также причиной идиопатического бесплодия у женщин, особенно в тех случаях, когда аллель находится в гомозиготном состоянии [Chillon M., 1995; Claustres M., 2005].
Вышеперечисленные авторы показали, что среди супружеских пар с репродуктивными нарушениями частота мутаций и полиморфизмов в гене CFTR выше, чем в общей популяции, однако до сих пор остается не решенным вопрос о влиянии данных мутаций и полиморфизма гена CFTR на сперматогенез. Использование репродуктивных технологий у этой группы пациентов позволяет решить проблему деторождения, однако, может способствовать увеличению риска рождения детей с МВ.
Самой распространенной микроделецией в AZF локусе хромосомы Y была Del sY 1192, которая была выявлена в 7 наблюдениях в минорном состоянии и в 2 - в комплексе с другими микроделециями, что составило 42.8% (в 9 наблюдениях из 21).
В двух наблюдениях у пациентов с тератозооспермией и астенотератозооспермией одновременно были выявлены и микроделеция субрегиона AZFc, и гетерозиготное носительство 5Т аллеля.
Высокая частота микроделеции субрегиона AZFc у мужчин с отклонениями в показателях спермограммы была отмечена и другими исследователями.
Многочисленные данные продемонстрировали, что среди мутаций в AZF локусе хромосомы Y микроделеции субрегиона AZFс занимают 1-е место; субрегиона AZFb - 2е; субрегиона AZFа-3-е [Черных В.Б., 2002; Dada, R. 2002; Katagiri Y., 2004; Loginova Iu.A., 2003]. Большинство авторов рекомендуют таким супружеским проведение ПД с выбором пола.
ПД с выбором пола эмбрионов нами была проведена у 4 супружеских пар, где у мужей отмечена олигоастенотератозооспермия и была выявлена делеция субрегиона AZFс хромосомы Y. Было проведено 7 циклов стимуляции суперовуляции, беременность наступила у 2 женщин 3 плодами, родилась одна девочка, беременность близнецами в настоящее время протекает без осложнений.
Выявленные высокие уровни носительства мутаций генов CFTR и СYР21В указывают на необходимость разработки и применения ПД с целью диагностики данных заболеваний у эмбриона до переноса его в полость матки. К большому сожалению, несмотря на своевременное решение проблемы пренатальной диагностики в перспективных и информативных семьях, в России до сих пор не проводится ДНК исследование ядер бластомеров на моногенные нарушения. Внедрение ПД с целью выявления моногенных нарушений у эмбриона будет способствовать так называемой, первичной профилактике МВ и ВДКН, уменьшая число новых больных с этими серьезными заболеваниями.
Исследование антигенов системы HLA у пациентов с НРФ Изучение особенностей антигенов системы HLA у мужчин, включенных в программы ВРТ Полигенность и многофункциональность системы HLA предоставили идеальную возможность для поиска маркеров, обнаружение которых у индивида могло бы сигнализировать о наличии риска возникновения патологии.
Используя эту возможность, а также учитывая разноречивые данные литературы по этому вопросу [Aleksovski D., 1988; Krause W., 1983; Miura H., 1988], были изучены фенотипы HLA у мужчин программы ВРТ с нормозооспермией и различными отклонениями в показателях спермограммы.
Группа мужчин с отклонениями в показателях спермограммы была разделена на две подгруппы. Первую подгруппу составили 109 мужчин с сочетанными формами отклонений в показателях спермограммы (ОАТ), вторая подгруппа состояла из 55 мужчин с астенозооспермией. Контрольная группа была представлена 106 мужчинами.
Анализ полученных результатов позволил установить, что почти по всем выделенным антигенам HLA между собой достоверно различались мужчины с ОАТ и нормозооспермией.
Причем положительные ассоциации у мужчин с ОАТ были обнаружены по антигенам HLA В18, В35 и Cw4, отрицательные - по антигенам HLA А1, В39, В40 и Cw3. По всем выделенным антигенам HLA положительно ассоциирующихся с ОАТ относительный риск больше 2-х.
Мужчины с астенозооспермией и мужчины с нормозооспермией не отличались по частоте всех исследованных антигенов HLA.
Различие по антигенному составу HLA между мужчинами с ОАТ и астенозооспермией было выявлено только по HLA В12, который достоверно был ниже у мужчин с ОАТ (р > 0,001).
Анализ результатов позволил обнаружить, что наличие в фенотипе антигенов HLA В18, и В35 сочетающихся с А24, а также А25 и А26, являющихся аллельными вариантами А10 и образующих гаплотипы, дает высокий риск развития ОАТ.
Полученные результаты обследования мужчин с ОАТ имеют принципиальное значение для медико-генетического консультирования пар программы ЭКО. Обнаружение положительной ассоциации патологии сперматогенеза с антигенами HLA В18 и HLA В35, по-видимому, не случайно. Антиген HLA В18 был типичным маркером фенотипа мужчин из супружеских пар с бесплодием и пар с неразвивающейся беременностью.
Проведенное исследование убеждает не только в необходимости проведения обязательного генетического консультирования мужчин из супружеских пар программы ВРТ, но и требует разработки правил использования этой программы у лиц с высоким генетическим риском. Это необходимо как для профилактики рождения детей с патологией, так и для успешного осуществления программы ВРТ.
Анализ гистосовместимости супругов, включенных в программу ВРТ, по антигенам системы HLA I и II классов Всего HLA исследование было проведено у 853 супружеских пар, у 339 - I группы и у 514 - II группы. Среди пациентов I группы одновременное исследование HLA I и II классов было проведено у 143 супружеских пар, исследование только HLA I или II классов - 182 и 14 пар, соответственно. Таким образом, антигены HLA I класса были изучены у 325 супружеских пар, а HLA II класса - у 314.
В 45 наблюдениях из 143 (31.5%) у пациентов наблюдали идентичные антигены в обоих классах HLA. Подробные данные исследования антигенов системы HLA пациентов I группы представлены в таблице 6.
Таблица Изучение антигенов системы HLA пациентов I группы Класс 2 идентичных 3 идентичных 4 идентичных 5 идентичных HLA антигенов антигенов антигенов антигенов (72 наблюдения) (40 наблюдений) (14 наблюдений) (4 наблюдения) HLA I класса 9 - - - локус А HLA I класса 3 - - - локус В HLA I класса 32 - - - локусы А и В HLA II класса 14 27 - - HLA I и II 14 13 14 классов Изучение антигенов системы HLA II класса показало, что 22 пациента I группы (11 женщин и 11 мужчин) из 314 обследуемых (7%) были гомозиготами по данному классу.
Среди пациентов II группы одновременное исследование HLA I и II классов было проведено у 179 супружеских пар, исследование только HLA I или II классов - 303 и пары, соответственно. Таким образом, антигены HLA I класса были изучены у 4супружеских пар, а HLA II класса - у 211.
В 79 наблюдениях из 179 (44.1%) у пациентов наблюдались идентичные антигены в обоих классах HLA. Подробные данные исследования антигенов системы HLA пациентов II группы представлены в таблице 7.
Таблица Изучение антигенов системы HLA пациентов II группы Класс 2 идентичных 3 идентичных 4 идентичных 5 идентичных HLA антигенов антигенов антигенов антигенов (81 наблюдение) (50 наблюдений) (23 наблюдения) (8 наблюдений) HLA I класса 3 - - - локус А HLA I класса 1 - - - локус В HLA I класса 39 - - - локусы А и В HLA II класса 20 20 - - HLA I и II 18 30 23 классов Изучение антигенов системы HLA II класса показало, что 28 пациентов (женщин и 17 мужчин) из 422 обследуемых (6.6%) были гомозиготами по данному классу.
В двух парах оба супруга оказались гомозиготами по антигенам HLA II класса.
Наши результаты показали, что совпадения по антигенам системы HLA у супружеских пар программы ВРТ могут наблюдаться до 44.1% по 2 классам одновременно. Учитывая тот факт, что идентичность супругов по антигенам HLA создает условия для развития бесплодия, тяжелых осложнений течения беременности - нефропатии, преэклампсии [Дранник Г.Н., 1986; Карпова, Т.В., 1998; Latinen, T., 1993] эти супружеские пары нуждаются в консультации врачей отделения невынашивания беременности до начала программы ВРТ, а так же в случае наступления беременности и должны пройти ряд профилактических мероприятий, направленных на сохранение беременности.
Пути профилактики врожденной и наследственной патологии у пациентов программы ВРТ Результаты МГК с методами генетического обследования пациентов программы ВРТ показали высокий уровень хромосомных и генный изменений в этой группе пациентов. На основании анализа полученных данных нами был разработан алгоритм проведения медико-генетического консультирования с методами генетического обследования супружеских пар I и II групп (рис.1 и 2).
Супружеские пары I группы (у мужей нормозооспермия) Исследование Типирование Типирование кариотипа антигенов системы антигенов системы супругов HLA I класса HLA II класса супругов супругов При выявлении хромосомных При выявлении антигенов При совпадении изменений в кариотипе мужчин В35, В14 - исследование антигенов - - исследование сперматозоидов гена СYP 21 B консультация врача FISH методом по невынашиванию беременности ПД с исследованием При наличии одинаковой хромосом вовлеченных в мутации у обоих супругов - изменения ПД Последующая пренатальная диагностика Рис.1. Алгоритм генетического обследования супружеских пар I группы Разработка генетических подходов к обследованию доноров половых клеток в программе ВРТ В настоящее время требования к кандидатам в доноры половых клеток в России регламентируются Приказом Минздрава РФ от 26 февраля 2003 г. N 67 "О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия", согласно которому донорами половых клеток могут стать любая соматически здоровая женщина в возрасте от 20 до 35 лет и мужчина в возрасте от 20 до 40 лет при наличии собственных здоровых детей и отсутствии выраженных фенотипических проявлений. Учитывая, что наше исследование показало высокий процент гетерозиготного носительства различных мутаций среди пациентов с НРФ, недопустимо использовать в программе ВРТ доноров, не обследованных на наличие носительства таких мутаций. Мы рекомендуем обследовать доноров гамет на носительство мажорных мутаций часто встречающихся заболеваний (муковисцидоз, фенилкетонурия, ВДКН, нейросенсорная тугоухость, спинальная мышечная атрофия). При исследовании доноров необходимо уделять внимание представителям определенных национальностей и этнических групп, так как генетическое обследование необходимо проводить с учетом частоты встречаемости конкретных моногенных заболеваний среди этих групп.
Супружеские пары II группы (у мужей различные отклонения в показателях спермограммы) Типирование Исследование Исследова Исследование Типирование антигенов AZF локусов ние гена кариотипа антигенов системы HLA хромосомы Y CFTR у супругов системы HLA II класса мужчин I класса супругов супругов При наличии делеций -ПД с выбором пола эмбрионов При выявлении При выявлении При совпадении При наличии транслокаций в антигенов В35, антигенов - мутации у кариотипе- В14 - консультация мужа- исследование исследование врача по аналогичное сперматозоидов гена СYP 21 В невынашиванию исследование FISH методом беременности супруге При наличии одинаковой ПД с исследованием При наличии мутации в гене у обоих хромосом вовлеченных мутаций у обоих супругов - ПД в транслокацию супругов - ПД Последующая пренатальная диагностика Рис.2. Алгоритм генетического обследования супружеских пар II группы ЗАКЛЮЧЕНИЕ Медико-генетическое консультирование с генетическими исследованиями 18пациентов программы ВРТ выявило у них высокий уровень генетических изменений.
Выявленные мутации были представлены большим разнообразием как на хромосомном, так и на генном уровне; они затрагивали как гоносомы, так и соматические хромосомы.
Первичное МГК пациентов ВРТ на основании собранного анамнеза и наличие результатов некоторых генетических исследований, проведенных у пациентов ранее, выявило у них в 4.2% (у 80 из 1898) наблюдений различные врожденные пороки развития, моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов.
Дальнейшее генетическое исследование этих пациентов выявило различные генные мутации еще у 97 человек. Таким образом, общий уровень данных изменений составил 9.3% (у 177 из 1898 пациентов)(табл. 8).
Таблица ВПР, хромосомные нарушения, моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов, выявленные у пациентов программы ВРТ Наименование врожденных пороков развития Женщины Мужчины и генетических нарушений число наблюдений число наблюдений I гр.(72) II гр.(47) I гр.(12) II гр.(112) Изменения кариотипа 24 7 5 Гетерозиготное носительство мутации гена 14 20 5 CYP21B Гетерозиготное носительство мутации гена - 2 - CFTR ВПР почек, вызванный наличием в генотипе - - - доминантного мутантного гена Мутации AZF локуса хромосомы Y - - - Носительство рецессивного мутантного гена, 1 2 - - приводящего к ВПР почек у детей Носительство рецессивного мутантного гена, 1 - - - приводящего к ВПР ЦНС у детей Синдром Марфана 1 - - - Нейрофиброматоз 1 - - - Синдром Дель-Кастильо 1 - - Синдром Рокитанского-Кюстера 2 - - - Гетерозиготное носительство мутации гена 1 - - - СМА I Гетерозиготное носительство -талассемии - 1 - - Гетерозиготное носительство мутации гена, - - 1 - приводящего к глухоте Атрофия зрительного нерва, Х-сцепленное - - - заболевание Спинно-бульбарная амиотрофия Кеннеди - - - Синдром Поланда - - - Гипохондроплазия - - - Брахидактилия - - - Синдактилия - - - ВПР сердца 2 1 - Различные ВПР почек 5 4 1 Различные ВПР матки, труб, половых органов 16 8 - Заячья губа, волчья пасть 1 2 - - ВПР желудочно-кишечного тракта 1 - - ВПР щитовидной железы 1 - - ВПР стоп - - - Выявленный уровень хромосомных нарушений у супружеских пар программы ВРТ составил 7%. Эти супружеские пары составляют основную группу пациентов с высоким риском появления у потомства хромосомных аберраций.
Молекулярно-генетическое исследование половых клеток мужчин с измененным кариотипом не только подтвердило это утверждение, но и позволило сделать вывод о том, что у этих мужчин повышен риск рождения детей с мутациями de novo. Различный уровень хромосомных нарушений в сперматозоидах пациентов при одной и той же хромосомной патологии в кариотипе указывает на индивидуальные особенности мейоза у пациентов и может повлиять на дальнейшую тактику лечения этих супружеских пар.
Таким образом, с учетом изменений кариотипа общий уровень генетических нарушений среди пациентов программы ВРТ составил 12.8%.
Выявленный высокий уровень мутаций у нуждающихся в лечении методами ВРТ супружеских пар указывает на необходимость медико-генетического консультирования пациентов с НРФ до включения их в программу ЭКО/ИКСИ. В случае обнаружения у них генетических изменений следует проводить оптимизацию метода ВРТ с применением к ним ПД и последующей пренатальной диагностики.
ВЫВОДЫ 1. Медико-генетическое консультирование с методами генетического обследования пациентов, включенных в программу ВРТ, выявило в 9.3% наблюдений врожденные пороки развития, моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов; в 3.5% - хромосомные изменения. Суммарный уровень генетических изменений у пациентов с нарушением репродуктивной функции составил 12.8%.
2. У пациентов, в системе HLA I класса которых выявлены антигены В35, В14; с высоким значением гормона 17-ОП; с клиническими проявлениями ВДКН синдрома (такими, как гирсутизм, позднее менархе, нерегулярный менструальный цикл, невынашивание беременности и т. д.), уровень гетерозиготного носительства мутации гена CYP21B составил 37.1%. Делеция гена CYP21B составляет 70.7%; дупликация - 24.4%.
3. У пациентов с отклонениями в показателях спермограммы мутации в локусе AZF хромосомы Y и гене CFTR выявляются в 12.8% наблюдений. Del sY 1192 является самой распространенной микроделецией в локусе AZF хромосомы Y - 42.8%. Частота аллеля 5Т составляет 40.5%; мутации F508del - 9.5%.
4. Установлена ассоциация антигенов системы HLA I класса у мужчин славянской популяции с нарушением сперматогенеза: при олигоастенотератозооспермии - HLA В18, В35 и Cw4. Высокий риск возникновения у мужчин олигоастенотератозооспермии (RR=11) связан с наличием в фенотипе одновременного присутствия антигенов HLA В18 и В35.
5. У пациентов с НРФ уровень совпадений антигенов в системе HLA I и II классов может достигать 44.1%.
6. У мужчин с робертсоновской транслокацией хромосом 13, 14 в кариотипе уровень мутаций в их половых клетках по этим хромосомам составляет от 16.1% до 36%, а процент мутаций de novo гоносом - от 0.6% до 1.7%.
7. Уровень хромосомных нарушений, выявленный в клетках хориона полученных в программе ВРТ неразвивающихся беременностей, составляет 54.4%. Моносомия хромосомы Х занимает первое место и составляет 22.6%. Суммарный уровень трисомии различных хромосом от общего процента выявляемой патологии составляет 58.1%.
8. У супружеских пар программы ВРТ, где один из супругов имеет генетические изменения (хромосомные аберрации в кариотипе, микроделеции локуса AZF хромосомы Y), частота наступления беременности после проведенной ПД в пересчете на пункцию составляет 23%, в пересчете на перенос эмбрионов - 30%. В этой группе пациентов в 23% наблюдений отсутствуют эмбрионы, пригодные для переноса по генетическим критериям. У женщин из супружеских пар с нормальным кариотипом при проведении ПД частота наступления беременности составляет 36% на цикл, или 38% на перенос.
9. При проведении ПД бластомеры, не содержащие ядер, встречаются в 17.2% наблюдений; бластомеры, содержащие одновременно несколько ядер - в 6.7%. Эмбрионы, от которых были получены многоядерные и безъядерные бластомеры, являются непригодными для переноса, как по генетическим, так и по морфологическим критериям отбора.
10. Визуальное исследование морфологических параметров эмбриона не всегда отражает его генетический статус. Эмбрионы, имеющие в хромосомном наборе анеуплоидию, могут быть хорошего качества (от 71% до 88.5%); эмбрионы с трисомией хромосомы 21 имеют плохое качество в 16.7% и 33% (при использовании разных наборов зондов, включающих хромосому 21).
11. Одновременное наличие анеуплоидий нескольких хромосом оказывает большее негативное влияние на развитие эмбрионов, чем анеуплоидия по одной хромосоме: от 37.5% до 40% (при использовании разных наборов зондов, включающих хромосому 21) против 16.7% и 33% соответственно. Трисомия хромосомы 21 у эмбрионов составила 52.3%; гоносом - 49.2%.
12. Используемая нами с целью профилактики рождения генетически больного ребенка у пациентов программы ВРТ ПД молекулярно-цитогенетическим FISH методом зарекомендовала себя как высокоэффективный метод профилактики рождения генетически больного потомства и может быть рекомендована для широкого использования в рамках данной программы не только у супружеских пар с бесплодием, но и у фертильных супружеских пар с высоким риском рождения ребенка с генетической патологией.
13. Кандидаты в доноры гамет должны пройти исследование на носительство мажорных мутаций часто встречающихся заболеваний, таких как муковисцидоз и ВДКН.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Пациентам с бесплодием перед включением их в программу ВРТ рекомендуется пройти медико - генетическое консультирование.
2. Исследование кариотипа лимфоцитов периферической крови следует проводить обоим супругам всех супружеских пар программы ВРТ.
3. У мужчин, в кариотипе которых выявлены хромосомные аберрации, необходимо проведение молекулярно-цитогенетического исследования сперматозоидов с применением зондов к соответствующим хромосомам.
4. У пациентов с высоким значением гормона 17-ОП, с клиническими проявлениями ВДКН синдрома, такими как гирсутизм, позднее менархе, нерегулярный менструальный цикл, невынашивание беременности и т. д., либо при обнаружении у них в системе HLA I класса антигенов В35, В14 рекомендуется проведение молекулярногенетического исследования мутаций в гене CYP 21B. При обнаружении у одного из супругов мутации в исследуемом гене второму рекомендуется провести аналогичное исследование.
5. Мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ИКСИ и имеющих отклонения в спермограмме, рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования гена CFTR, Т/Т аллеля, локуса AZF хромосомы Y. При обнаружении у мужа мутации в гене CFTR, 5Т аллеля супруге рекомендуется провести аналогичное исследование.
6. Включенным в программу ВРТ пациентам, у которых имеются хромосомные изменения в кариотипе, необходимо проведение ПД для выявления различных анеуплоидий у эмбрионов.
7. Супружеским парам, где у мужей имеются делеции локуса AZF хромосомы Y, необходимо проведение ПД для выбора эмбрионов женского пола.
8. Женщинам старше 35 лет рекомендуется исследование эмбрионов на самые распространенные анеуплоидии - трисомии хромосом 13, 16, 18, 21 и гоносом.
9. Исследование антигенов системы HLA I и II классов рекомендуется проводить всем супружеским парам перед программой ВРТ. Это позволяет выделить группу риска пациентов, у которых возможно невынашивание беременности и которые должны пройти ряд профилактических мероприятий, направленных на сохранение беременности. Кроме того, антигены системы HLA служат маркерами, которые могут сигнализировать о наличии риска возникновения заболевания как у самого пациента, так и у его потомства.
10. Женщинам, у которых выявлена неразвивающаяся беременность и планируется ее прерывание, показано цитогенетическое исследование клеток полученного хориона.
11. Лицам, планирующим стать донорами половых клеток, необходимо пройти медико-генетическое консультирование и обследование на самые распространенные мутации генов, приводящие к заболеваниям: в первую очередь - муковисцидоз и ВДКН, а при возможности и на др. (фенилкетонурия, нейросенсорная тугоухость, спинальная мышечная атрофия).
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ:
АКТГ - адренокортикотропный гормон Б - I - бесплодие I Б - II - бесплодие II ВДКН - врожденная дисфункция коры надпочечника ВДОСП (CBAVD) - врожденное двустороннее отсутствие семявыводящих протоков (congenital bilateral absence of the vas deferens) ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии ИКСИ (ICSI) - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита (intracytoplasmic sperm injection) МГК - медико-генетическое консультирование МВ - муковисцидоз НРФ - нарушение репродуктивной функции ОАТ - олигоастенотератозооспермия ПД - преимплантационная диагностика ПЦР - полимеразная цепная реакция ЭКО и ПЭ - экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов AZF - Azoospermia Factor (фактор азооспермии) CFTR - cystic fibrosis transmembrane conductase regulator (ген трансмембранного регулятора муковисцидоза) ESHRE - European Society of Human Reproduction and Embryology (Европейское общество репродукции человека и эмбриологии) FISH - Fluorescent In Situ Hybridization (флуоресцентная гибридизация in situ) HLA - Human Leucocyte Antigens - главный комплекс гистосовместимости человека Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Глинкина, Ж.И. Преимплантационная диагностика хромосомных аберраций и пола плода методом FISH- анализа в программе ЭКО и ПЭ (обзор литературы)/ Ж.И. Глинкина, Б.В. Леонов, В.А. Лукин //М., МИА, -2000, Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия. Под ред. Акад. РАМН Кулакова В.И., -603стр.
2. Глинкина, Ж.И. Применение молекулярно-цитогенетического метода гибридизации днк хромосом с днк пробами (FISH) для идентифицирования хромосомных аномалий у эмбрионов в рамках программы ЭКО и ПЭ/ Ж.И. Глинкина, Б.В. Леонов, А.А. Беляева // сборник трудов, Кубанский Конгресс по гинекологии Актуальные вопросы оперативной гинекологии и репродукции человека, -346 стр.
3. Глинкина, Ж.И. Медико-генетическая преимплантационная диагностика в программе ЭКО и ПЭ/ Ж.И. Глинкина // Материалы III Российского форума Мать и дитя тезисы докладов, -2001г., -стр. 328.
4. Глинкина, Ж.И. Исследование кариотипа и антигенов HLA супружеских пар при неразвивающейся беременности/ Ж.И. Глинкина, И.Г. Дзенис, Г.В. Байбарина, Э.Р.
Дуринян, Т.В. Бугай// Материалы III Российского форума Мать и дитя тезисы докладов, -2001г., - стр.- 291, 5. Глинкина, Ж.И. Преимплантационная генетическая диагностика наследственных и врожденных заболеваний в программе ЭКО/ Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев // Практическая гинекология. Под ред. Акад. РАМН Кулакова В.И., Прилепской В.Н., МЕДпресс-информ, М. -2001, -стр. 720-730.
6. Глинкина, Ж.И. Опыт использования FISH- метода в акушерстве и гинекологии/Ж.И.
Глинкина., В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис// Медицинская генетика, Тезисы Всероссийской научно- практической конференции Современные достижения клинической генетики, 2003, -№ 10, -стр. 410.
7. Глинкина, Ж.И. Изучение FISH методом особенностей мейоза у мужчин, включенных в программу ЭКО и ПЭ/Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис, Ю.А. Гаврилов //Проблемы репродукции, Тезисы XII Международной конференции Репродуктивные технологии сегодня и завтра, -2003г., -стр. 38.
8. Glinkina, Zh. Experience of FISH use in IVF and ICSI programme/ Zh.Glinkina, V.A.
Bakharev, L.N. Kuzmichev, I.G. Dzenis // Abstract book PGD in 2003: A Genetic odyssey , Brussels, Belgium, -2003, -p.30.
9. Глинкина, Ж.И. Медико-генетическое консультирование и клинико-генетические методы обследования супружеских пар в программе ЭКО и ПЭ, ИКСИ/ Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев, Б.В. Леонов, И.Г. Дзенис// Поликлиническая гинекология, под. Ред.
Прилепской В.Н., - 2004 г., -стр. 220-241.
10. Глинкина, Ж.И. Исследование ядер сперматозоидов FISH методом у мужчин, включенных в программу ЭКО и ПЭ/ Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис, Ю.А.
Гаврилов// тезисы докладов Международный конгресс с курсом эндоскопии Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний, М,- 2004, -стр.160-161.
11. Глинкина, Ж.И. Опыт медико-генетического консультирования у пациентов программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ/ Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис, Л.Н. Кузьмичев, Л.Б. Киндарова// тезисы докладов, Материалы VI Российского Форума Мать и Дитя, М., -2004, -стр. 606-607.
12. Глинкина, Ж.И. Использование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) для профилактики врожденной патологии в потомстве/В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис, Л.Н.
Кузьмичев, Л.П. Лисова // тезисы докладов, Материалы VI Российского Форума Мать и Дитя, М., -2004, -стр. 607.
13. Глинкина, Ж.И. Преимплантационная диагностика - профилактика появления потомства с врожденной и наследственной патологией/ Ж.И Глинкина // тезисы докладов, III Российский конгресс Современные технологии в педиатрии и детской хирургии, М., -2004, стр. 90-91.
14. Черных, В.Б. Кольцевая Y- хромосома: клинический случай и обзор литературы/ В.Б.
Черных, Ж.И. Глинкина, Л.Ф. Курило, Т.М. Сорокина, Е.М. Гришина и др.// Ж.
Медицинская генетика, -2004, № 10, -стр. 474-479.
15. Glinkina, Zh. FISH Method in IVF-ICSI/ Zh.Glinkina, V.I. Kulakov, L.N. Kuzmichev, V.A. Bakharev, S.A. Diyakonov // Abstract book л12th word congress on human reproduction, -2005, -р. 16. Глинкина, Ж.И. Роль цитогенетического и молекулярно- цитогенетического исследования лимфоцитов крови у супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ/Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев, Л.Н. Кузьмичев, И.Г. Дзенис, Г.И. Мушакова// Журнал Российского общества акушеров-гинекологов, -2004, -№ 3, -стр.35-38.
17. Глинкина, Ж.И. Анализ частоты анеуплоидии гоносом у мужчин программы ЭКО и ЭКО/ ИКСИ/ Ж.И. Глинкина // Ж. Медицинская генетика, -2005, -т. 4, -№2, -стр. 60-64.
18. Кулаков, В.И. Преимплантационное определение пола эмбрионов у пациентов программы ЭКО/ В.И. Кулаков, Ж.И. Глинкина, В.А Бахарев, И.Г. Дзенис, Л.Н.
Кузьмичев, Л.Б. Киндарова //Ж. Акушерство и гинекология, -2005, -№ 2, -стр.43-46.
19. Glinkina, Zh. Chromosomal changes in IVF/ICSI patients/ Zh. Glinkina, V.I. Kulakov, L.N.
Kuzmichev, S.A. Diyakonov, V.A. Bakharev, L.B. Kindarova// Reproductive BioMedicine Online, л6th International Symposium on Preimplantation Genetics, -2005, -Vol.10, Supplement 2, -p.41.
20. Глинкина, Ж.И. Определение пола у преимплантационных эмбрионов пациентов программы ЭКО/ Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис, Л.Н. Кузьмичев, Л.Б.
Киндарова // Ж. Медицинская генетика, -2005, -№ 4, -т.4, -стр. 121. Бахарев, В.А. Исследование кариотипа абортусов программы ЭКО И ПЭ/ В.А.
Бахарев, Ж.И. Глинкина, В.В. Мамонова, Г.В. Байбарина// Ж. Медицинская генетика, 2005, -№ 4, -т.4, -стр. 222. Глинкина, Ж.И. Клинико-генетическое обследование супружеских пар в программе ЭКО и ПЭ, ИКСИ/ Ж.И. Глинкина, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис, Ю.Е. Мосесова// Вспомогательные репродуктивные технологии в лечении женского и мужского бесплодия под ред. Кулакова В.И., Леонова Б.В. М, - 2005, -стр 147-161.
23. Глинкина, Ж.И. Преимплантационная генетическая диагностика врожденных и наследственных заболеваний методом FISH в программе ЭКО и ПЭ/ Ж.И. Глинкина, Б.В.
еонов, В.А. Бахарев, В.А. Лукин// Вспомогательные репродуктивные технологии в лечении женского и мужского бесплодия под ред. Кулакова В.И., Леонова Б.В. М, - 2005, -стр 162-175.
24. Глинкина, Ж.И. Роль медико-генетического консультирования пациентов при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)/ Ж.И. Глинкина, Л.Н Кузьмичев, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис, В.В. Мамонова, Н.А. Туровец// тезисы докладов, Материалы VII Российского Форума Мать и Дитя, М., -2005, -стр. 359.
25. Яворовская, К.А. Перспективы развития вспомогательных репродуктивных технологий/ К.А. Яворовская, Ж.И. Глинкина, С.А. Дьяконов // Ж. Здравоохранение и медицинская техника, -2005, -№ 9(23), -стр. 26. Глинкина, Ж.И. Особенности генотипов пациентов, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения/ Ж.И. Глинкина // Ж. Акушерство и гинекология, 2006, -№ 1, -стр. 27-30.
27. Глинкина, Ж.И. Комплексное генетическое обследование мужчин программы ИКСИ/Ж.И. Глинкина// Ж. Гинекология, -2006, -т.8, -№4, -стр. 60-63.
28. Глинкина, Ж.И. Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов у пациентов с робертсоновскими транслокациями/ Ж.И. Глинкина // тезисы докладов, Материалы VIII Российского Форума Мать и Дитя, М., -2006, -стр. 361-362.
29. Глинкина, Ж.И. Особенности генотипов мужчин, включенных в программу ИКСИ/ Ж.И Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, Н.А. Туровец, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис // Тезисы научно- практической конференции Современные возможности вспомогательных репродуктивных технологий, -2006, -стр. 35.
30. Глинкина, Ж.И. Роль преимплантационной генетической диагностики у пациентов ВРТ с робертсоновскими транслокациями в кариотипе/ Ж.И. Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, В.А. Бахарев, И.Г. Дзенис и др. // Тезисы IV Международного конгресса Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения), -2007, стр.19.
31. Глинкина, Ж.И. Изучение особенности мейоза у пациентов ВРТ с робертсоновскими транслокациями в кариотипе// Тезисы IV Международного конгресса Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения), -2007, стр. 17-18.
32. Глинкина, Ж.И. Значение медико-генетического обследования мужчин, включенных в программу ИКСИ/ Глинкина, Ж.И.// тезисы докладов, Материалы IX Российского Форума Мать и Дитя, М., -2007, -стр. 366.
33. Глинкина, Ж.И. Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов у пациентов с делецией AZF локуса Y хромосомы/ Ж.И. Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, В.А.
Бахарев, И.Г. Дзенис и др. // тезисы докладов, Материалы IX Российского Форума Мать и Дитя, М., -2007, -стр. 367.
34. Глинкина, Ж.И. Особенности мейоза у мужчин с робертсоновскими транслокациями в кариотипе/ Глинкина, Ж.И. // Ж. Акушерство и гинекология, -2008, -№3, -стр. 67-70.
35. Глинкина, Ж.И. Роль преимплантационной диагностики в профилактике рождения потомства с врожденной и наследственной патологией у супружеских пар программы ВРТ/ Ж.И. Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, К.А. Яворовская//Ж. Здравоохранение и медицинская техника, -2008, -№ 2, -стр.38.
36. Глинкина, Ж.И. Исследование гена муковисцидоза у мужчин с нарушением репродуктивной функции программы ВРТ/ Глинкина, Ж.И. //Ж. Медицинская генетика, 2008, -№ 4, -стр.37-39.
37. Глинкина, Ж.И. Профилактика хромосомных нарушений у плодов пациентов программы вспомогательных репродуктивных технологий с робертсоновскими транслокациями в кариотипе/ Ж.И. Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, В.А. Бахарев и др. // Ж.
Акушерство и гинекология, -2008, -№4, -стр. 28-38. Глинкина, Ж.И. Преимплантационная диагностика в профилактике наследования мутаций потомством мужчин с делецииями в AZF локусе хромосомы Y/ Ж.И Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, В.А. Бахарев, А.В. Поляков, И.Г. Дзенис и др. //Ж. Андрология и генитальная хирургия, -2008, -№ 2, -стр. 42-46.
39. Diyakonov, S.A. Association of MHC>
Bakharev, I.G. Dzenis // American J of Reproductive Immunology, -2005, -V.54, -N3, -p.155156.
40. Glinkina, Zh. Genetic Evaluation of Male IVF/ICSI Patient. Serono Symposia International/ Zh. Glinkina, S.A. Diyakonov, L.N. Kuzmichev, V.A. Bakharev et. аl. // Abstract book The First seven days, 2006, -p. 98.