Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ЕЛИСЕЕВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА
ДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ YB-1 И PABP НА ТРАНСЛЯЦИЮ ПОЛИA(-) И ПОЛИA(+) мРНК YB-1
03.01.03 - Молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка РАН
Научный консультант:
академик РАН, доктор биологических наук, профессор Овчинников Лев Павлович
Официальные оппоненты:
Озолинь Ольга Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, заведующий лабораторией функциональной геномики и клеточного стресса Фролова Людмила Юрьевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН, заведующий лабораторией структурнофункциональной геномики
Ведущая организация:
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Защита состоится У15Ф ноября 2012 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3.
С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:
142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3.
Автореферат разослан У Ф октября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Смолихина кандидат биологических наук Татьяна Ивановна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Многофункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) позвоночных принимает участие во многих клеточных процессах, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия (Скабкин и др., 2004). Нокаут гена YB-1 приводит к нарушениям эмбрионального развития и пренатальной или ранней постнатальной гибели животных (Lu et al., 2005; Uchiumi et al., 2006). YB-1 участвует в адаптации клеток к росту при пониженной температуре (Matsumoto et al., 2006), увеличивает их устойчивость к ионизирующей радиации и обработке ксенобиотиками (Ohga et al., 1996). В настоящее время в литературе широко обсуждается роль YB-1 в раковой трансформации (Matsumoto et al., 2005) и воспалительных заболеваниях (Frye et al., 2009; Rauen et al., 2009). Количество YB-1 существенно повышено в некоторых опухолях, поэтому в ряде случаев он рассматривается в качестве одного из ярких маркеров злокачественных новообразований (Bargou et al. 1997; Matsumoto et al., 2005). Переходя из цитоплазмы в клеточное ядро, YB-1 может вовлекаться в репарацию ДНК и активировать транскрипцию генов ряда защитных белков, в том числе и белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость раковых клеток (Kohno et. at, 2003). Поэтому ядерная локализация белка YB-1 является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости (Bargou et al.
1997, Kuwano et al., 2004). Кроме того, известно, что YB-1 принимает участие в метастазировании опухолей. Повышенная экспрессия YB-1 в раковых клетках может приводить к изменению клеточного фенотипа с эпителиального на мезенхимальный и, как следствие, к увеличению подвижности клеток (Evdokimova et al., 2009). Однако в других случаях повышенное содержание YB-1 может предотвращать онкогенную трансформацию клеток по PI3K/Akt сигнальному пути (Bader et al., 2003).
Участие YB-1 в широком спектре внутри- и внеклеточных процессов объясняется, прежде всего, его уникальной способностью взаимодействовать как с ДНК и РНК, так и с большим количеством разных белков (Kohno et. at, 2003).
Связываясь с определенными нуклеотидными последовательностями в промоторах генов, YB-1 позитивно или негативно регулирует транскрипцию генов, продукты которых участвуют в делении клеток, апоптозе, иммунном ответе, развитии множественной лекарственной устойчивости и др. (Kohno et. at, 2003). Взаимодействуя с поврежденной ДНК, YB-1 вызывает локальное плавление двойных спиралей (Izumi et al., 2001; Gaudreault et al., 2004), а также может стимулировать ферментативную активность ДНК-гликозилаз hNth1, NEIL1 и NEIL2 (Das et al., 2007; Guay et al., 2008; Pestryakov et al., 2012). Все это способствует эффективной репарации. Кроме того, YB-1 ускоряет обмен комплементарных цепей ДНК, и, как предполагается, может участвовать в рекомбинации ДНК (Skabkin et al., 2001).
YB-1 взаимодействует с мРНК на всех этапах ее существования. В ядре он участвует в регуляции альтернативного сплайсинга пре-мРНК (Chansky et al., 2001). В цитоплазме упаковывает мРНК, а также может регулировать ее трансляционную активность, стабильность и локализацию на актиновом и тубулиновом цитоскелетах (Davydova et al., 1997; Evdokimova et al., 2001;
Ruzanov et al., 1999; Chernov et al., 2008). Считается, что YB-1 может регулировать функциональную активность мРНК как напрямую, связываясь со специфическими нуклеотидными последовательностями (Skabkina et al., 2005;
Giorgini et al., 2001), так и опосредованно. Во втором случае YB-1 за счет своей РНК-шаперонной активности помогает мРНК образовать правильную вторичную структуру, необходимую для узнавания регуляторными белками (Skabkin et al., 2001).
Характер воздействия YB-1 на внутриклеточные процессы зависит от его содержания и локализации. Как правило, основная доля YB-1 находится в цитоплазме, однако в некоторых случаях YB-1 переходит в ядро. Такой переход наблюдается на границе G1/S фаз (Jurchott et al., 2003), при окислительном стрессе, под действием ДНК-повреждающих агентов или при облучении УФ (Stein et al., 2005; Das et al., 2007; Koike at al., 1997), при аденовирусной инфекции (Holm et al., 2002) и в результате взаимодействия YB-1 с некоторыми белками (Raffetseder et al., 2003; Zhang et al., 2003). YB-1 может переходить в ядро после отщепления 20S протеасомой С-концевой последовательности с сигналом цитоплазматического удержания (Sorokin at al., 2005).
Принимая во внимание, что YB-1 участвует в регуляции многих клеточных процессов, следует ожидать, что его количество строго регулируется. Такая регуляция осуществляется как на уровне транскрипции (Shiota et al., 2008;
Yokoyama et al., 2003) и трансляции (Fukuda et al., 2004; Hsieh et al., 2012; Kato et al., 2010; Skabkina et al., 2003, 2005; Thoreen et al., 2012), так и за счет изменения стабильности белка (Lutz et al., 2006; Chibi et al., 2008; Sorokin at al., 2005).
Ранее в нашей лаборатории было показано, что специфическая регуляция синтеза YB-1 может происходить под действием двух мажорных белков мРНП:
YB-1 и поли(А)-связывающего белка PABP. YB-1 избирательно ингибирует трансляцию неполиаденилированной (А(-)) мРНК YB-1 (авторегуляция) при сравнительно низких концентрациях этого белка, оптимальных для трансляции большинства других клеточных мРНК. РАВР, наоборот, стимулирует трансляцию этой мРНК. Как ингибирование под действием YB-1, так и стимуляция под действием РАВР наблюдаются на стадии инициации трансляции, на этапе присоединения к мРНК YB-1 43S-преинициаторного комплекса или на предыдущем этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции (Skabkina et al., 2005; Skabkina et al., 2003). С другой стороны, в 3Т нетранслируемой области (НТО) мРНК YB-1 была обнаружена нуклеотидная последовательность с повышенным сродством к YB-1 и РАВР.
Было показано, что сайты связывания двух белков на этой последовательности перекрываются, а белки YB-1 и РАВР конкурируют за связывание с ней. Кроме того, было обнаружено, что фрагмент мРНК YB-1 с этой последовательностью ингибирует трансляцию мРНК YB-1, а также других мРНК на стадии инициации.
Эта нуклеотидная последовательность была названа регуляторным элементом.
Несмотря на перечисленные данные, механизмы регуляции трансляции мРНК YB-1 изучены недостаточно. Принимая во внимание важную роль YB-1 в клетке, исследование механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1 является актуальной задачей для молекулярной и клеточной биологии.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение молекулярного механизма регуляции трансляции мРНК YB-1. Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: выяснить (1) действительно ли регуляторный элемент (1127-1204 нт) в 3Т НТО А(-) мРНК YB-1 строго необходим для регуляции трансляции под действием YB-1 и PABP;
(2) оказывает ли YB-1 прямое негативное действие на трансляцию А(-) мРНК YB-1; (3) оказывает ли PABP прямое позитивное действие на трансляцию А(-) мРНК YB-1; (4) изучить как влияют YB-1 и PABP на трансляцию полиаденилированной (А(+)) мРНК YB-1; (5) проверить, взаимодействует ли регуляторный элемент в 3ТНТО мРНК YB-1 с поли(А)-фрагментом; (6) выяснить, как зависит влияние PABP на трансляцию А(+) мРНК YB-1 от длины и нуклеотидной последовательности участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом (1329-1503 нт).
Научная новизна работы и практическая значимость работы. Данными исследованиями на А(-) мРНК YB-1 установлено, что регуляторный элемент (1127-1204 нт) в 3Т НТО строго необходим для специфической регуляции трансляции под действием YB-1 и PABP. Показано, что YB-1 обладает прямым негативным действием на трансляцию мРНК YB-1. Выяснено, что позитивное действие PABP обусловлено вытеснением YB-1 с регуляторного элемента.
Установлено, что PABP не стимулирует трансляцию А(+) мРНК YB-1. Однако трансляция А(+) мРНК YB-1 с удаленным фрагментом (1329-1503 нт) из 3Т НТО между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом стимулируется PABP, в то время как мРНК с заменой этого участка на неспецифическую последовательность ведет себя как исходная мРНК, т.е. не стимулируется PABP в бесклеточной системе трансляции. Обнаружено, что регуляторный элемент 3Т НТО мРНК YB-1 взаимодействует с поли(А)-фрагментом в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика. Предложена модель регуляции трансляции А(+) мРНК YB-1 за счет образования 3Т концевой циклической структуры, препятствующей позитивному действию PABP на трансляцию этой мРНК. Обнаруженные молекулярные механизмы регуляции трансляции мРНК YB-1 могут помочь в поиске подходов к лечению онкологических, вирусных и воспалительных заболеваний.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: Translational Control Meeting (Cold Spring Harbor, New York, USA, 2010), III International meeting Early events in Human Pathologies (Barbizon, France, 2010), Protein Synthesis and Translational Control (EMBL Heidelberg, Germany, 2009), Protein Synthesis and Translational Control (EMBL Heidelberg, Germany, 2007), Translational Control Meeting (Cold Spring Harbor, New York, USA, 2006), 8th International Engelhardt Conference on RNA - Protein Interactions (Sergiev Pasad, Russia, 2006); на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2009), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 2007, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах и 1 статья в периодическом сборнике из списка ВАК.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов:
Введение, Список сокращений, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Выводы и Список литературы. Работа содержит 147 страниц, 32 рисунка и 4 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Исследование механизмов специфического действия YB-1 и РАВР на трансляцию А(-) мРНК YB-На основе данных, ранее полученных в нашей лаборатории, было предположено, что специфическое ингибирование трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и специфическая активация трансляции этой мРНК под действием РАВР достигаются в результате конкурентного взаимодействия этих белков с регуляторным элементом (RE) в 3Т НТО мРНК YB-1. (Skabkina et al., 2005; Skabkina et al., 2003). Однако до последнего времени не было ясно, является ли присутствие регуляторного элемента причиной наблюдаемой регуляции, и оба ли белка оказывают прямое действие на трансляцию, или действие одного из них заключается лишь в вытеснении белка-конкурента.
Первая часть данного исследования посвящена ответу на эти вопросы.
1.1. Регуляторный элемент необходим для специфической регуляции трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и РАВР Регуляторный элемент мРНК YB-1 (рис. 1) - это последовательность из нуклеотидных остатков, локализованная в 3Т НТО (1127-1204 нт). Она содержит два специфических сайта связывания YB-1, представляющих из себя консенсусную последовательность UCCAA/GCA (1137-1143 и 1164-1170 нт), и сайт специфического связывания двух молекул РАВР - А-богатую нуклеотидную последовательность (1149-1204 нт). Видно, что сайты связывания этих белков перекрываются. Ранее было показано, что YB-1 и PABP могут конкурировать за связывание с регуляторным элементом (Skabkina et al., 2005).
Рис. 1. Схема мРНК YB-1 и детальная схема регуляторного элемента (1127-1204 нт) в 3Т НТО мРНК YB-1. Темными и светлыми прямоугольниками обозначены сайты специфического связывания YB-1 и PABP, соответственно.
Для ответа на вопрос, необходим ли регуляторный элемент для специфической регуляции трансляции мРНК YB-1 под действием двух мажорных белков мРНП, была получена конструкция для синтеза мРНК YB-1, в которой регуляторный элемент (1127-1204 нт) был заменен на неспецифическую последовательность той же длины (рис. 2А). Такая мРНК была названа мРНК YB-1 RE.
Рис. 2. (А) Схема исходной мРНК YB-1 (WT) и мРНК YB-1 c удаленным регуляторным элементом (RE). (Б, В) Определение констант диссоциации методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Радиоактивно-меченные фрагменты мРНК YB-1 инкубировали с увеличивающимися количествами YB-1 (Б) или PABP (В) для образования РНК-белковых комплексов. Полученные комплексы фильтровали последовательно через нитроцеллюлозную (НЦ) и нейлоновую (НЛ) мембраны. Относительные количества радиоактивности определяли с использованием Packard Cyclone Storage Phosphor System. Процент связавшейся РНК определяли как (светимость НЦ/(светимость НЦ+светимость НЛ)).
Для проверки специфического связывания YB-1 и PABP были получены фрагменты мРНК YB-1 (1070-1240 нт), содержащие исходный регуляторный элемент (WT) или неспецифическую последовательность той же длины (RE) (рис. 2А). Константы диссоциации комплексов YB-1 (рис. 2Б) и PABP (рис. 2В) с этими фрагментами определяли методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Исходный фрагмент (WT) образует комплексы с YB-1 и PABP с кажущимися константами диссоциации 3,890,15 нМ и 3,850,15 нМ, соответственно. Фрагмент, не содержащий регуляторного элемента (RE), как и ожидалось, связывает YB-1 и PABP значительно хуже (кажущиеся константы диссоциации 9,940,99 нМ и 45,30,3 нМ, соответственно).
Таким образом, замена регуляторного элемента в 3Т НТО мРНК YB-1 на неспецифическую последовательность действительно привела к снижению сродства YB-1 и PABP.
Рис. 3. K(+)A(-) мРНК YB-1 WT, мРНК YB-1 RE и мРНК Luc транслировали в БСТ объемом 10 мкл в присутствии увеличивающихся количеств PABP (А, Б) или YB-1 (В, Г). [14С]-Tyrмеченные продукты трансляции разделяли SDS-гель электрофорезом и детектировали радиоавтографией. (Б, Г) Относительные количества радиоактивности определяли с использованием Packard Cyclone Storage Phosphor System. Уровень трансляции каждой мРНК без добавления PABP (Б) или YB-1 (Г) принимали за 100%. Значения определяли по крайней мере из трех независимых экспериментов. Тест Стьюдента использовали для определения статистической значимости различий между значениями уровня трансляции (Б) мРНК Luc и остальными мРНК:
мРНК YB-1 WT и мРНК YB-1 RE; (Г) мРНК YB-1 WT и остальными мРНК: мРНК YB-1 RE и мРНК Luc. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, # и N.S. - незначимые различия.
Для ответа на вопрос, зависит ли регуляция трансляции мРНК YB-1 от присутствия регуляторного элемента, кэпированные и неполиаденилированные (К(+)А(-)) мРНК YB-1, мРНК YB-1 RE и контрольную мРНК люциферазы (Luc) транслировали в бесклеточной системе трансляции (БСТ) в присутствии увеличивающихся количеств PABP (рис. 3А,Б) и YB-1 (рис. 3В,Г). Как и ожидалось, PABP стимулирует трансляцию исходной мРНК YB-1 (рис. 3А, дорожки 1-4), в то время как мРНК YB-1 RE (дорожки 5-8) стимулируется PABP на уровне контрольной мРНК Luc. Влияние YB-1 на трансляцию представлено на рисунке 3В,Г. Видно, что YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК (рис. 3В, дорожки 1-5) сильнее, чем трансляцию контрольной мРНК Luc. Трансляция мРНК YB-1 RE (дорожки 6-10) ингибируется YB-1 слабее, чем трансляция исходной мРНК YB-1, хотя несколько сильнее, чем контрольной. Таким образом, отсутствие регуляторного элемента приводит к снижению стимулирующего действия PABP и ингибирующего действия YB-1 на трансляцию мРНК YB-1. Полученные данные свидетельствуют о том, что регуляторный элемент необходим для специфической регуляции трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и PABP.
1.2. YB-1 ингибирует, а PABP не влияет на трансляцию мРНК YB-1 с удаленным сайтом связывания PABP Для ответа на вопрос, оказывает ли YB-1 прямое негативное действие на трансляцию мРНК YB-1, была получена конструкция для синтеза мРНК YB-1, в которой сайт специфического связывания PABP был заменен на неспецифическую последовательность той же длины. Сайты специфического связывания YB-1 оставались при этом интактными и располагались на том же расстоянии друг от друга, что и в природной мРНК (рис. 4А). Такая мРНК была названа мРНК YB-1 PABP.
Прежде всего, необходимо было убедиться, что внесенная мутация действительно уменьшила сродство PABP к регуляторному элементу, но не изменила сродства YB-1. Для этого были получены фрагменты мРНК YB-1, содержащие исходный регуляторный элемент (WT) и регуляторный элемент с удаленным сайтом связывания PABP (PABP). Методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах были определены кажущиеся константы диссоциации YB-1 и PABP с этими последовательностями. Кривые связывания и полученные константы представлены на рисунке 4. Видно, что в случае связывания YB-1 (рис. 4Б) кривые практически совпадают и значения констант практически не отличаются: 3,890,15 нМ (WT) и 3,870,05 нМ (PABP). На рисунке 4B видно, что связывание PABP с мутантным регуляторным элементом наступает при более высоких концентрациях белка. Константа диссоциации PABP с регуляторным элементом, содержащим мутацию, значительно выше:
3,850,15 нМ (WT) и 17,670,57 нМ (PABP). Таким образом, как и ожидалось, регуляторный элемент с удаленным сайтом специфического связывания PABP связывает YB-1 c той же эффективностью, а PABP - в пять раз хуже, чем исходный регуляторный элемент.
Рис. 4. (А) Схема исходной мРНК YB-1 (WT) и мРНК YB-1 c удаленным сайтом связывания PABP (PABP). (Б, В) Определение констант диссоциации YB-1 (Б) или PABP (В) методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Более подробное описание см. на рис. 2.
Для проверки возможности прямого действия YB-1 на трансляцию мРНК YB-1 предварительно необходимо удостовериться, что мутация в PABPсвязывающем сайте привела к исчезновению позитивного действия PABP на трансляцию такой мРНК. Для этого К(+)А(-) мРНК YB-1, мРНК YB-1 PABP и контрольную мРНК Luc транслировали в БСТ в присутствии увеличивающихся количеств PABP (рис. 5А,Б). Как и ожидалось, PABP стимулирует трансляцию исходной мРНК YB-1 (дорожки 1-4), в то время как мРНК YB-1 PABP (дорожки 5-8) стимулируется PABP на уровне контрольной мРНК Luc. Таким образом, делеция PABP-связывающего участка действительно привела к снижению стимулирующего действия PABP на трансляцию мРНК YB-1 до уровня, который наблюдается на контрольной мРНК.
Рис. 5. K(+)A(-) мРНК YB-1 WT, мРНК YB-1 PABP и мРНК Luc транслировали в БСТ объемом 10 мкл в присутствии увеличивающихся количеств PABP (А, Б) или YB-1 (В, Г). [14С]-Tyrмеченные продукты трансляции разделяли SDS-гель электрофорезом и детектировали радиоавтографией. (Б, Г) Относительные количества радиоактивности определяли с использованием Packard Cyclone Storage Phosphor System. Уровень трансляции каждой мРНК без добавления PABP (Б) или YB-1 (Г) принимали за 100%. Значения определяли как минимум из трех независимых экспериментов. Тест Стьюдента использовали для определения статистической значимости различий между значениями уровня трансляции (Б) мРНК Luc и остальными мРНК:
мРНК YB-1 WT и мРНК YB-1 PABP; (Г) мРНК YB-1 WT и остальными мРНК: мРНК YB-1 PABP и мРНК Luc. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, # и N.S. - незначимые различия.
Если YB-1 обладает прямым негативным действием на трансляцию мРНК YB-1, то удаление PABP-связывающего участка не должно повлиять на оказываемый им эффект. Если же негативное действие YB-1 заключается лишь в вытеснении позитивного регулятора - PABP, то удаление PABP-связывающего участка должно приводить к исчезновению ингибирующего действия YB-1. На рисунках 5В,Г представлены результаты трансляции в БСТ К(+)А(-) мРНК YB-1, мРНК YB-1 PABP и контрольной мРНК Luc в присутствии увеличивающихся количеств YB-1. Как и ожидалось, YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК (дорожки 1-5) сильнее, чем контрольной мРНК Luc. мРНК YB-1, содержащая удаленный PABP-связывающий сайт (PABP), ингибируется YB-1 с той же эффективностью, что и исходная мРНК YB-1 WT. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о прямом негативном действии YB-1 на трансляцию мРНК YB-1.
1.3. YB-1 и PABP не влияют на трансляцию мРНК YB-1 с удаленным сайтом связывания YB-Для ответа на вопрос, оказывает ли PABP прямое позитивное действие на трансляцию мРНК YB-1, была получена конструкция для синтеза мРНК YB-1, в которой в сайты специфического связывания YB-1 были внесены точечные нуклеотидные замены (UUUAUUA - выделены жирным и подчеркнуты), снижающие сродство YB-1 к этим последовательностям. Сайты специфического связывания PABP оставались при этом интактными (рис. 6А). Такая мРНК была названа мРНК YB-1 YB-1.
Рис. 6. (А) Схема исходной мРНК YB-1 (WT) и мРНК YB-1 c измененными сайтами связывания YB-1 (YB-1). (Б, В) Определение констант диссоциации YB-1 (Б) или PABP (В) методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Более подробное описание см. на рис. 2.
Внесенные точечные мутации должны приводить к снижению сродства YB-1 к регуляторному элементу, но не изменять сродства PABP. Для проверки этого предположения были получены фрагменты мРНК YB-1, содержащие исходный регуляторный элемент (WT) и регуляторный элемент с измененными сайтами связывания YB-1 (YB-1). Методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах были определены кажущиеся константы диссоциации YB-1 и PABP с этими последовательностями. Кривые связывания и полученные константы представлены на рисунке 6. Как и ожидалось, точечные мутации в сайте специфического связывания YB-1 не влияют на связывание PABP с регуляторным элементом (рис. 6B). Графики связывания PABP и константы диссоциации практически совпадают для WT и YB-1 регуляторного элемента:
3,850,15 нМ (WT) и 3,880,39 нМ (YB-1). В случае же YB-1 (рис. 6Б) связывание с мутантным регуляторным элементом наступает при более высоких концентрациях YB-1. Константа диссоциации в этом случае составляет 121,9 нМ, что в три раза больше, чем константа диссоциации для исходного регуляторного элемента 3,890,15 нМ). Таким образом, регуляторный элемент с измененным сайтом специфического связывания YB-1 связывает PABP c той же эффективностью, а YB-1 значительно хуже, чем исходный регуляторный элемент.
Для проверки возможности прямого действия PABP на трансляцию мРНК YB-1 предварительно необходимо убедиться, что мутации в YB-1-связывающих сайтах привели к снижению негативного действия YB-1 на трансляцию такой мРНК. Для этого К(+)А(-) мРНК YB-1, мРНК YB-1 YB-1 и контрольную мРНК Luc транслировали в БСТ в присутствии увеличивающихся количеств YB-(рис. 7В,Г). Как и ожидалось, YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК (дорожки 1-5) сильнее, чем контрольной мРНК Luc. В случае же мРНК YB-YB-1 (дорожки 6-10) негативное действие YB-1 гораздо слабее. Таким образом, мутации в YB-1-связывающих сайтах действительно привели к снижению ингибирующего действия YB-1 на трансляцию мРНК YB-1.
Если PABP обладает прямым негативным действием на трансляцию мРНК YB-1, то мутации в YB-1-связывающих участках не должны повлиять на оказываемый им эффект. Если же позитивное действие PABP заключается лишь в вытеснении негативного регулятора - YB-1, то мутации в YB-1-связывающих участках должны приводить к исчезновению позитивного действия PABP. На рисунках 7А,Б представлены результаты трансляции в БСТ К(+)А(-) мРНК YB-1, мРНК YB-1 YB-1 и контрольной мРНК Luc в присутствии увеличивающихся количеств PABP. Как и ожидалось, в отличие от контрольной мРНК Luc PABP стимулирует трансляцию исходной мРНК YB-1 (дорожки 1-4). Однако стимулирующего действия PABP не наблюдается на мРНК YB-1 c мутациями в YB-1-связывающих участках - YB-1 (дорожки 5-8). Таким образом, PABP не обладает прямым действием на трансляцию мРНК YB-1.
Рис. 7. K(+)A(-) мРНК YB-1 WT, мРНК YB-1 YB-1 и мРНК Luc транслировали в БСТ объемом 10 мкл в присутствии увеличивающихся количеств PABP (А, Б) или YB-1 (В, Г). [14С]-Tyrмеченные продукты трансляции разделяли SDS-гель электрофорезом и детектировали радиоавтографией. (Б, Г) Относительные количества радиоактивности определяли с использованием Packard Cyclone Storage Phosphor System. Уровень трансляции каждой мРНК без добавления PABP (Б) или YB-1 (Г) принимали за 100%. Значения определяли как минимум из трех независимых экспериментов. Тест Стьюдента использовали для определения статистической значимости различий между значениями уровня трансляции (Б) мРНК Luc и остальными мРНК:
мРНК YB-1 WT и мРНК YB-1 YB-1; (Г) мРНК YB-1 WT и остальными мРНК: мРНК YB-1 YB-1 и мРНК Luc. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, # и N.S. - незначимые различия.
Все полученные данные свидетельствуют в пользу того, что ключевым регулятором трансляции мРНК YB-1 является белок YB-1. Связываясь с регуляторным элементом в 3Т НТО мРНК YB-1, он напрямую ингибирует ее трансляцию. Поли(А)-связывающий белок, вытесняющий YB-1 с регуляторного элемента, не обладает прямым действием на трансляцию мРНК YB-1. Его позитивное действие обусловлено лишь вытеснением негативного регулятора - YB-1.
2. Исследование механизмов специфического действия YB-1 и РАВР на трансляцию полиаденилированной мРНК YB-Все предыдущие эксперименты по изучению механизма регуляции трансляции мРНК проводились на неполиаденилированных (А(-)) мРНК. Такой подход позволяет наблюдать только за эффектом PABP, взаимодействующего с 3Т НТО, но не с поли(А)-хвостом. Однако, он не дает ответа на вопрос о том, как влияют белки YB-1 и PABP на трансляцию полиаденилированной (А(+)) мРНК YB-1. Поэтому вторая часть данного исследования посвящена изучению механизма регуляции трансляции А(+) мРНК YB-1.
2.1. PABP не стимулирует трансляцию полиаденилированной мРНК YB-Полиаденилированная мРНК YB-1 содержит два специфических сайта связывания PABP: поли(А)-хвост и А-богатую последовательность в регуляторном элементе 3Т НТО. Стоит отметить, что поли(А)-хвост является более сильным сайтом для связывания PABP. В условиях недостатка PABP, вероятнее всего, поли(А)-связывающий белок в первую очередь будет связываться с поли(А)-хвостом, а лишь потом с регуляторным элементом.
Можно предположить, что появление более сильного сайта для связывания PABP в мРНК YB-1 должно привести к снижению конкуренции между YB-1 и PABP за регуляторный элемент, и, как следствие, А(+) мРНК YB-1 должна ингибироваться при более низких концентрациях YB-1 и стимулироваться при более высоких концентрациях PABP.
Для проверки этого предположения К(+)А(-) и К(+)А50 мРНК YB-(рис. 8А,Г) или, в качестве контроля, мРНК GAPDH (рис. 8Б,Д) транслировали в БСТ в присутствии увеличивающихся количеств YB-1 (рис. 8А-В) или PABP (рис. 8Г-Е).
Рисунки 8А-В демонстрируют эффект YB-1 на трансляцию. Как и ожидалось, мРНК YB-1, как A(-) (рис. 8A, дорожки 1-5), так и A50 (дорожки 210) ингибируются YB-1 сильнее, чем контрольные мРНК GAPDH (рис. 8B).
Степень ингибирования А(+) и А(-) мРНК YB-1 одинакова, что отличается от ожидаемого результата. Отсутствие разницы в степени ингибирования может быть объяснено тем, что количество РАВР в системе трансляции достаточно для связывания как с поли(А)-хвостом, так и с регуляторным элементом в 3Т НТО.
Рисунки 8Г-Е демонстрируют эффект PABP на трансляцию. Как ожидалось, РАВР стимулирует трансляцию А(-) мРНК YB-1 (рис. 8Г, дорожки 1-4), в то время как трансляция контрольных мРНК GAPDH (рис. 8Д) остается практически неизменной.
Рис. 8. K(+)A(-) и K(+)A50 мРНК YB-1 (А, Г) или мРНК GAPDH (Б, Д) транслировали в БСТ объемом 10 мкл в присутствии увеличивающихся количеств YB-1 (А, Б) или PABP (Г, Д). [14С]Tyr-меченные продукты трансляции разделяли SDS-гель электрофорезом и детектировали радиоавтографией. (В, Е) Относительные количества радиоактивности определяли с использованием Packard Cyclone Storage Phosphor System. Уровень трансляции каждой мРНК без добавления YB-1 (В) или PABP (Е) принимали за 100%. Значения определяли как минимум из трех независимых экспериментов. Тест Стьюдента использовали для определения статистической значимости различий между значениями уровня трансляции мРНК YB-1 A50 и остальными мРНК:
мРНК YB-1 A(-), мРНК GAPDH A(-) и A50. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, # и N.S. - незначимые различия.
В зависимости от количества PABP в лизате для A50 мРНК YB-1 можно было бы ожидать стимуляцию трансляции либо при тех же концентрациях PABP, либо при чуть более низких. Однако этого не наблюдается. Трансляция A50 мРНК YB-1 (рис. 8Г, дорожки 5-8) не зависит от добавления PABP, так же как и трансляция контрольных мРНК GAPDH (рис. 8Е). Стоит отметить, что наблюдаемые различия в поведении А(-) и А50 мРНК YB-1 при добавлении PABP не объясняются изменениями в стабильности мРНК.
Известно, что поли(А)-хвост и кэп являются энхансерами трансляции, причем в их действии наблюдается синегризм. Считается, что образование циклической структуры (поли(А)-PABP-eIF4G-кэп) сближает концы мРНК, что облегчает рециклирование рибосом, и повышает сродство eIF4G к мРНК.
Интересно, что в случае увеличения концентрации PABP в лизате для мРНК YB-1 изменяется эффект от поли(А)-хвоста (рис. 8Г, 9А). В исходном лизате А(+) мРНК YB-1 транслируется лучше, чем А(-) мРНК. При добавлении PABP в систему происходит снижение положительного действия поли(А)-хвоста, вплоть до ингибирования (рис. 9А). Таким образом, в некоторых системах с высоким содержанием поли(А)-связывающего белка для мРНК YB-1 поли(А)-хвост будет являться не энхансером трансляции, а ингибитором. В случае контрольной мРНК GAPDH различий в стимулирующем действии поли(А)-хвоста при добавлении PABP не наблюдается (рис. 9Б).
Рис. 9. Обсчет результатов трансляции, представленной на рисунке 8А,Б для начальной (0 нг PABP) и конечной точки (204 нг PABP). Уровень трансляции неполиаденилированной мРНК YB-(А) и мРНК GAPDH (Б) принимали за 100%. Значения определяли как минимум из трех независимых экспериментов. Тест Стьюдента использовали для определения статистической значимости различий между величиной влияния поли(А)-хвоста на трансляцию в присутствии или отсутствие PABP. *p<0.05, N.S. - незначимые различия.
Таким образом, YB-1 ингибирует трансляцию A(-) и A50 мРНК YB-одинаково, в то время как PABP стимулирует трансляцию только А(-) мРНК YB-1, причем в лизатах с высоким содержанием PABP может наблюдаться негативное действие поли(А)-хвоста на трансляцию мРНК YB-1.
2.2. Регуляторный элемент в 3Т НТО мРНК YB-1 взаимодействует с поли(А)-фрагментом в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика На основании полученных данных можно предположить, что в случае A(+) мРНК YB-1 образуется некая структура, которая не препятствует посадке YB-на регуляторный элемент, в то время как PABP не может конкурировать с YB-за этот элемент. Одной из возможных структур может быть 3Т концевая циклическая структура: регуляторный элемент - белки - поли(А)-хвост (рис. 10А). Образование подобной структуры в мРНК c-fos ранее было описано в литературе (Grosset et al., 2000).
Одним из доводов в пользу предложенной гипотезы может служить образование комплекса регуляторный элемент - белки - поли(А)-фрагмент (рис. 10Б). Для его обнаружения использовали метод замедления подвижности РНК в геле (Gel-shift). Схема эксперимента представлена на рисунке 10В. [32P]меченный поли(А)-фрагмент инкубировали с лизатом ретикулоцитов кролика для образования поли(А)-белковых комплексов в отсутствии или в присутствии немеченных РНК (регуляторного элемента (RE), контрольной РНК или полноразмерной 3Т НТО мРНК YB-1 (рис. 10Г, дорожки 4-5, 6-7, и 8-9, соответственно)). Полученные комплексы разделяли электрофорезом в неденатурирующем ПААГ и детектировали радиоавтографией. Об образовании поли(А)-белкового комплекса можно судить по изменению подвижности в геле радиоактивного поли(А)-фрагмента (рис. 10Г, дорожки 1 и 2). Появление дополнительного сдвига при добавлении немеченой РНК может свидетельствовать об образовании тройного комплекса РНК - белки - фрагмент поли(А). На рисунке 10Г виден сдвиг полосы поли(А)-белкового комплекса (дорожка 2) при добавлении немеченого регуляторного фрагмента (дорожка 4) и 3Т НТО (дорожка 8), в то время как в контроле такого сдвига не наблюдается (дорожка 6).
Чтобы убедиться в наличии фрагментов мРНК YB-1 в полученных комплексах, реакционную смесь (после предварительной инкубации при 30С) обрабатывали смесью рибонуклеаз А и Т1 (рис. 10Г, дорожки 3, 5, 7 и 9), которые расщепляют гетерогенные полинуклеотидные последовательности (в нашем случае немеченую РНК), но не гидролизуют поли(А).
Рис. 10. (А) Схема предполагаемой 3Т концевой циклической структуры. (Б) Схема предполагаемого комплекса РНК - белки - поли(А)-фрагмент. (В) Схема эксперимента. На модели неденатурирующего ПААГ показаны предполагаемые подвижности радиоактивномеченного поли(А)-фрагмента, комплекса белки - поли(А)-фрагмент и комплекса РНК - белки - поли(А)-фрагмент. Кроме того, изображен переход комплекса РНК - белки - поли(А)фрагмент в комплекс белки - поли(А)-фрагмент под действием рибонуклеаз А и T1. (Г) [32P]меченный поли(А)-фрагмент длиной около 100 нт инкубировали в необработанном микрококковой нуклеазой ретикулоцитном лизате (1,5 мкл) 15 мин при 30 С в отсутствие (дорожки 2, 3) или в присутствии 400 нг немеченых фрагментов РНК (RE - дорожки 4, 5; РНК длиной 100 нт - дорожки 6, 7 или 3Т НТО мРНК YB-1 - дорожки 8, 9). Затем комплексы разделяли электрофорезом в 3,6% ПААГ. Детекцию проводили радиоавтографией. Экспериментальные точки 3, 5, 7, 9 перед электрофоретическим разделением обрабатывали смесью рибонуклеаз (РНКаза А - 4 нг, РНКаза Т1 - 0,01 ед.) в течение 20 мин при 30 С. (Д) [32P]-меченный поли(А)фрагмент длиной около 100 нт инкубировали с 240 нг РАВР 15 мин при 30 С в отсутствие (дорожка 2) или в присутствии 90 и 450 нг немеченых фрагментов РНК (3ТНТО - дорожки 3, 4 и RE - дорожки 5, 6), затем комплексы разделяли электрофорезом в 5% ПААГ. Детекцию проводили радиоавтографией. RE - регуляторный элемент 3ТНТО мРНК YB-1.
После такой обработки подвижность комплексов (дорожки 5, 7, 9) совпадает с подвижностью поли(А)-белкового комплекса (дорожка 3). Это говорит о том, что наблюдаемый нами сдвиг полосы поли(А)-белкового комплекса при добавлении немеченых фрагментов мРНК YB-1 действительно обусловлен образованием комплексов РНК - белки - фрагмент поли(А).
Таким образом, в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика регуляторный элемент в 3ТНТО мРНК YB-1 взаимодействует с экзогенным поли(А).
Из литературных данных известно, что PABP может формировать димеры и мультимеры, которые, как предполагается, обеспечивают кооперативное связывание белка с поли(А)-хвостом (Kuhn and Pieler, 1996). Можно предположить, что для образования 3Т концевой циклической структуры будет достаточно только РАВР (3ТНТО-РАВР-РАВР-поли(А)).
Для проверки этого предположения также был использован метод Gel-shift (рис. 10Д). Реакционную смесь, содержащую [32P]-меченный поли(А)-фрагмент, РАВР и возрастающие количества одного из немеченых фрагментов РНК (регуляторный элемент или 3ТНТО мРНК YB-1) инкубировали 15 мин при 30 С для образования РНК-белковых комплексов, которые разделяли электрофорезом в ПААГ и детектировали радиоавтографией (рис. 10Д). Появление дополнительного сдвига при добавлении немеченой РНК может свидетельствовать об образовании комплекса РНК - PABP - PABP - поли(А)фрагмент. Однако, при добавлении как регуляторного элемента (рис. 10Д, дорожки 5-6), так и полноразмерной 3ТНТО мРНК YB-1 (дорожки 3-4) не происходит образование такого комплекса, а наблюдается лишь конкуренция за связывание с РАВР (полоса, соответствующая полосе исходного комплекса, исчезает, и появляются полосы, соответствующие более подвижным и менее насыщенным комплексам поли(А) с РАВР).
Таким образом, в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика регуляторный элемент в 3Т НТО мРНК YB-1 взаимодействует с экзогенным поли(А), однако одного PABP для такого взаимодействия недостаточно.
2.3. Влияние PABP на трансляцию полиаденилированной мРНК YB-зависит от длины участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом Можно предположить, что образование 3Т концевой циклической структуры на А(+) мРНК YB-1 препятствует посадке PABP на регуляторный элемент, и, как следствие, PABP не будет стимулировать трансляцию такой мРНК. Если данное предположение верно, то укорочение участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом должно приводить к невозможности образования циклической структуры. В этом случае можно ожидать облегчения посадки PABP на регуляторный элемент и, как следствие, стимуляцию трансляции как полиаденилированной, так и неполиаденилированной мРНК под действием PABP.
Для проверки предложенной гипотезы были получены K(+)A(-) и K(+)AмРНК YB-1 с различной длиной 3ТНТО: (1) с полноразмерной 3Т НТО (WT); (2) с укороченной 3Т НТО (1329); (3) с 3Т НТО, в которой удаленная последовательность была заменена на неспецифическую последовательность примерно той же длины (1329+250). Схемы полученных мРНК представлены на рисунке 11А. Эти мРНК транслировали в БСТ из ретикулоцитов кролика в присутствии увеличивающихся количеств PABP (рис. 11Б-Ж).
В случае исходной мРНК YB-1 WT (рис. 11Б,В) стимуляция под действием PABP наблюдается только для А(-) мРНК (ср. дорожки 1-4 с дорожками 5-8). В случае мРНК YB-1 1329 с укороченным 3Т НТО (рис. 11Г,Д), как и ожидалось, PABP стимулирует трансляцию как А(-) (дорожки 1-4), так и А(+) мРНК (дорожки 5-8). Влияние PABP на трансляцию мРНК YB-1 1329+2(рис. 11Е,Ж) такое же, как и в случае исходной мРНК: А(-) мРНК (дорожки 1-4) стимулируется PABP, а А(+) мРНК не стимулируется (дорожки 5-8).
Таким образом, влияние PABP на трансляцию полиаденилированной мРНК YB-1 зависит от длины участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом, что свидетельствует в пользу гипотезы об образовании 3Т концевой циклической структуры на мРНК YB-1.
Рис. 11. (A) Схема исходной мРНК YB-1 (WT) и мРНК YB-1 c измененными 3Т НТО. (Б-Ж) K(+)A(-) и K(+)A50 мРНК YB-1 WT (Б, В), мРНК YB-1 1329 (Г, Д) или мРНК YB-1 1329+250 (Е, Ж) транслировали в БСТ объемом 10мкл в присутствии увеличивающихся количеств PABP. [14С]Tyr-меченные продукты трансляции разделяли SDS-гель электрофорезом и детектировали радиоавтографией. (В, Д, Ж) Относительные количества радиоактивности определяли с использованием Packard Cyclone Storage Phosphor System. Уровень трансляции каждой мРНК без добавления PABP принимали за 100%. Значения определяли как минимум из трех независимых экспериментов. Тест Стьюдента использовали для определения статистической значимости различий между значениями уровня трансляции неполиаденилированной и полиаденилированной мРНК (для каждой пары отдельно) ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, N.S.- незначимые изменения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Данная работа посвящена изучению молекулярного механизма регуляции трансляции мРНК YB-1. Ранее в 3Т нетранслируемой области этой мРНК была обнаружена последовательность, названная регуляторным элементом. С этой последовательностью конкурентно связываются два мажорных белка мРНП:
YB-1 и PABP. Эти белки обладают противоположным действием на трансляцию А(-) мРНК YB-1. В данной работе было показано, что найденный ранее регуляторный элемент в 3Т НТО мРНК YB-1 действительно строго необходим для регуляции трансляции А(-) мРНК YB-1 под действием YB-1 и PABP.
Установлено, что только один из двух белков - YB-1 - оказывает прямое негативное действие на трансляцию мРНК YB-1. Позитивное действие РАВР на трансляцию А(-) мРНК YB-1 обусловлено вытеснением негативного регулятора - YB-1 - из комплекса с регуляторным элементом мРНК YB-1.
Специфическое негативное действие YB-1 наблюдается и на А(+) мРНК YB-1, в то время как влияние PABP на трансляцию полиаденилированной и неполиаденилированной мРНК YB-1 различается. В отличие от А(-), А(+) мРНК YB-1 не стимулируется PABP. Стоит отметить, что при высоком содержании PABP для мРНК YB-1 может наблюдаться негативный эффект от поли(А)хвоста. Одним из возможных объяснений этого необычного явления может быть образование на 3Т конце минициклической структуры (поли (А) - белки - регуляторный элемент), препятствующей дополнительной посадке PABP на регуляторный элемент. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что экзогенный поли(А)-фрагмент может взаимодействовать с 3Т НТО мРНК YB-1 в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика. Белки, участвующие в этом взаимодействии, еще предстоит идентифицировать. Кроме того, было показано, что влияние PABP на трансляцию А(+) мРНК YB-1 зависит от длины участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом, что также может свидетельствовать в пользу предложенной гипотезы. Можно предположить, что в зависимости от набора и количества белков может наблюдаться ситуация, когда А(-) мРНК YB-1 будет транслироваться гораздо лучше, чем А(+) мРНК.
PABP-зависимая активация трансляции А(-) мРНК YB-1 может быть очень важна в условиях тотального деаденилирования мРНК, которое наблюдается в раннем эмбриональном развитии, при формировании долговременной памяти, а также в условиях ДНК-повреждающего стресса (Zhang et al., 2010). При деаденилировании трансляционная активность большинства мРНК падает. Они выходят из полисом и сохраняются в форме свободных нетранслируемых мРНП, в которых мРНК защищена от действия экзорибонуклеаз. Такие мРНК могут снова использоваться после их цитоплазматического полиаденилирования. Для формирования этих частиц требуется доупаковка мРНК белком YB-1. Это обуславливает необходимость продолжения более активного синтеза YB-1 в условиях деаденилирования мРНК (Evdokimova et al., 2001).
В последнее время в литературе широко обсуждается альтернативное 3Т концевое обрезание и полиаденилирование мРНК-предшественника, в ходе которого образуются мРНК с более короткой 3Т НТО, и роль этого явления в раковой трансформации, дифференцировке и пролиферации клеток (Giammartino et al., 2011; Proudfoot, 2011). Биоинформатическими методами было показано, что предпочтение в использовании проксимальных и дистальных сигналов обрезания предшественников мРНК и их последующего полиаденилирования зависит от ткани. Так например, в плаценте, сетчатке глаза и крови чаще используются проксимальные сигналы (синтезируются мРНК с более короткой 3Т НТО), а в мозге (где находятся практически не пролиферирующие клетки), наоборот, дистальные (Wang et al., 2008; Zhang et al., 2005). Программа PolyApred ( предсказывает в 3Т НТО мРНК YB-1 два альтернативных сигнала обрезания и полиаденилирования (1313-1318 и 1335-1341нт). Можно предположить, что использование альтернативного сигнала полиаденилирования для мРНК YB-приведет к невозможности образования 3Т концевой циклической структуры и, как следствие, к стимуляции трансляции данной мРНК поли(А)-связывающим белком, что может отразиться на количестве YB-1 в клетке.
Известно, что негативная авторегуляция трансляции PABP осуществляется за счет специфического связывания PABP с 5Т НТО собственной мРНК (de Melo Neto et al., 1995). В совокупности данная регуляторная система - авторегуляции YB-1 и РАВР и позитивная регуляция трансляции мРНК YB-1 под действием РАВР - может поддерживать концентрацию YB-1 и PABP и их соотношение в клетке на уровне, оптимальном для трансляции большинства клеточных мРНК, и быстро реагировать на изменения в количестве вновь синтезируемой мРНК.
Это особенно актуально для активно делящихся клеток, в которых интенсивно протекают процессы как транскрипции, так и трансляции. Можно предположить, что для таких клеток использование альтернативного сигнала обрезания/полиаденилирования в мРНК YB-1 предпочтительнее. В случае же медленно делящихся клеток транскрипция идет в них не столь активно и, возможно, тонкая регуляция оптимального соотношения YB-1 и PABP в этих условиях не так важна. На данный момент есть очень мало экспериментально проверенных примеров альтернативного обрезания/полиаденилирования.
Однако изучение данного способа регуляции может помочь в понимании механизмов регуляции дифференцировки, пролиферации клеток и раковой трансформации.
ВЫВОДЫ В бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика показано, что 1. Регуляторный элемент в 3Т НТО неполиаденилированной мРНК YB-строго необходим для негативной регуляции трансляции этой мРНК под действием YB-1 и позитивной под действием PABP.
2. YB-1 обладает прямым негативным действием на трансляцию мРНК YB-1, в то время как позитивный эффект РАВР обусловлен вытеснением YB-1 с регуляторного элемента.
3. Фрагмент мРНК YB-1 с регуляторным элементом образует комплекс с поли(А)-фрагментом в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика.
4. Влияние PABP на трансляцию полиаденилированной мРНК YB-зависит от длины участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)хвостом. Трансляция полиаденилированной мРНК YB-1 с укороченным спейсером стимулируется PABP, в то время, как трансляция полноразмерной мРНК или мРНК с заменой удаленного участка на неспецифическую последовательность не стимулируется поли(А)-связывающим белком.
5. На основании полученных данных предложена модель регуляции трансляции полиаденилированной мРНК YB-1 за счет образования 3Т концевой циклической структуры, препятствующей позитивному действию PABP на трансляцию этой мРНК.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи в реферируемых журналах и периодических сборниках:
1 Eliseeva, I.A., Kim, E.R., Guryanov, S.G., Ovchinnikov, L.P., and Lyabin, D. N.
(2011). Y-box-binding Protein 1 (YB-1) and Its Functions. Biochemistry (Moscow) 76, 13, 1402-1433.
2 Елисеева И.А., Ким Е.Р., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П.. Лябин Д.Н.
(2011) Y-бокс-связывающий белок (YB-1) и его функции. Успехи биол.
химии т. 51, 65-132.
3 Lyabin, D.N., Eliseeva I.A., Skabkina, O.V. and Ovchinnikov L.P. (2011).
Interplay between Y-box-binding protein 1 (YB-1) and poly(A) binding protein (PABP) interplay in specific regulation of YB-1 mRNA translation. RNA Biology 8, 5, 883-892.
4 Pestryakov P., Zharkov D.O., Grin I., Fomina E.E., Kim E.R., Hamon L., Eliseeva I. A., Petruseva I.O., Curmi P.A., Ovchinnikov L.P. and Lavrik O.I. (2012). Effect of the multifunctional proteins RPA, YB-1, and XPC repair factor on AP site cleavage by DNA glycosylase NEIL1. J Mol Recognition 25, 4, 224-233.
5 Моисеева Н.И., Стромская Т.П., Рыбалкина Е.Ю., Вайман А.В., Малышкина М.А., Ким Е.Р., Елисеева И.А., Кулаковский И.В., Овчинников Л.П., Ставровская А.А. (2012). Влияние внеклеточного белка YB-1 на культивируемые клетки опухолей молочной железы. Биологические мембраны 29, 5, 340-348.
Тезисы научных конференций:
6 Lyabin, D.N., Eliseeva, I.A., Skabkina, O.V., and Ovchinnikov, L.P. (2010). YB- - PABP interplay in specific regulation of YB-1 mRNA translation. In:
Transational Control, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, p. 79.
7 Lyabin, D.N., Eliseeva, I.A., Skabkina, O.V. and Ovchinnikov, L.P. (2010).
YB-1-PABP interplay in specific regulation of YB-1 mRNA translation. In:
Biopolymers and cell, Vol.26, N3, p.244. (III International meeting Early events in Human Pathologies, Barbizon, France).
8 Елисеева И.А., Лябин Д.Н., Овчинников Л.П. (2009). Исследование механизма ингибирования трансляции мРНК YB-1 при ее полиаденилировании. В сборнике тезисов: Биология наука XXI века, Пущино, Россия, стр. 14.
9 Eliseeva, I., Lyabin, D., Ovchinnikov, L. (2009). On the Mechanism of YB-mRNA translation by polyadenilation. In: Protein Synthesis and Translational Control, EMBL Heidelberg, Germany, p.120.
10 Елисеева И.А., Лябин Д.Н., Скабкина О.В., Овчинников Л.П. (2008).
Молекулярный механизм избирательного ингибирования трансляции мРНК YB-1 при ее полиаденилировании. В книге: IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 11-15 мая 2008 г. Новосибирск, стр.
79 (№ 111).
11 Лябин Д.Н., Скабкина О.В., Скабкин М.А., Елисеева И.А., Овчинников Л.П.
(2008). Регуляция трансляции мРНК YB-1. В книге: IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 11-15 мая 2008 г.
Новосибирск, стр. 96 (№ 146).
12 Lyabin, D.N., Eliseeva, I.A., Skabkina, O.V. and Ovchinnikov, L.P. (2007). A mechanism of negative regulation of YB-1 mRNA translation by poly(A) tail. In:
Protein Synthesis and Translational Control, EMBL Heidelberg, Germany, p.186.
13 Lyabin, D.N., Eliseeva, I.A., Skabkina, O.V. and Ovchinnikov, L.P. (2007).
Regulation of YB-1 mRNA Translation. In: Protein Biosynthesis, Structure and Function, Pushchino, Russia, p. 16.
14 Lyabin, D.N., Eliseyeva, I.A., Skabkina, O.V., and Ovchinnikov, L.P. (2006). The Negative Effect of Poly(A) Tail on YB-1 mRNA Translation. In: Translational Control, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, p.199.
15 Lyabin, D.N., Skabkina, O.V., Eliseyeva, I.A., and Ovchinnikov, L.P. (2006). The Specific regulation of YB-1 mRNA translation by 3ТUTR and the poly(A) tail. In:
RNA - Protein Interactions. Program and Abstracts, Moscow Region, Russia, p.
35.
16 Lyabin, D.N., Eliseyeva, I.A., Skabkina, O.V., and Ovchinnikov, L.P. (2006). The Negative Effect of Poly(A) Tail on YB-1 mRNA Translation. In: RNA - Protein Interactions. Program and Abstracts, Moscow Region, Russia, p. 72.