Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ДЕМИДЮК ИЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВИЧ
CТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной генетики Российской академии наук
Научный консультант:
член-корреспондент РАН, Костров Сергей Викторович доктор химических наук, профессор
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАН, доктор химических Кочетков Сергей Николаевич наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ действия физиологически активных соединений Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, профессор кафедры химии природных соединений Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова доктор химических наук, профессор, Ротанова Татьяна Васильевна ведущий научный сотрудник лаборатории химии протеолитических ферментов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН доктор биологических наук, профессор, Машко Сергей Владимирович директор по научной работе ЗАО Научноисследовательский институт АджиномотоГенетика
Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится 29 октября 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на Интернет-сайте ВАК РФ:
Автореферат разослан л____ ___________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник Лютик А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Белки выполняют огромное количество различных функций в каждом живом организме. Вопрос о структурных основах такого функционального многообразия вот уже несколько десятилетий является одним из центральных пунктов науки о белке. Однако, несмотря на достигнутые успехи, мы еще очень далеки от настоящего понимания структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В то же время изучение молекулярных механизмов функционирования имеет не только фундаментальное значение. Белки все шире используются человеком не просто как необходимый компонент рациона, но как способные направленно действовать агенты, прежде всего как промышленные катализаторы и лекарственные средства. В этом контексте знания о структурных основах функционирования - ключ к созданию белковых молекул, обладающих оптимальными для решения прикладных задач свойствами. Кроме того, все более широкое развитие получает направленное конструирование лекарств, для которого информация о структурных детерминантах в молекулах белков-мишеней имеет принципиальное значение.
Среди всего многообразия белков особое место занимают ферменты - белки-катализаторы. С одной стороны, они обеспечивают протекание ключевых биохимических реакций, а, с другой стороны, использование ферментов является одним из основных направлений современной биотехнологии. По имеющимся прогнозам мировой рынок промышленных ферментов достигнет к 2015 году объема в 3,74 миллиарда долларов США.
Основными отраслями, в которых используются ферменты, сегодня являются пищевая и текстильная промышленность, индустрия моющих средств, а также медицина и производство косметических средств. В последние годы наметилось заметное увеличение выпуска ферментов в связи с бурным ростом производства биоэтанола. Промышленное использование ферментов расширяется, в значительной степени, за счет применения инноваций, которые основаны на исследованиях структурно-функциональных взаимосвязей в молекулах белков. Такие исследования дают возможность модифицировать свойства индустриальных ферментов, добиваясь повышения их активности и удешевления целевых продуктов, а также позволяют получать новые рекомбинантные ферменты с заданными свойствами.
Протеазы - белки, катализирующие гидролиз пептидной связи, наряду с большим прикладным значением (они составляют самый крупный сегмент мирового рынка ферментов), играют важную роль в живых системах. Протеазы не просто являются ферментами деградации, вовлеченными в катаболизм белков, но и осуществляют высокоспецифичное расщепление пептидных связей - протеолитический процессинг. Последний определяет активацию или инактивацию различных ферментов, цитокинов, ростовых факторов и гормонов, а также внутри- или внеклеточную локализацию многих белков.
Таким образом, в той или иной степени под управлением протеаз находятся едва ли не все биологические процессы, включая, среди прочих, клеточную пролиферацию и дифференцировку, миграцию клеток, апоптоз и ангиогенез. Неудивительно поэтому, что протеазы вызывают неослабевающий интерес.
Сочетание высокой практической значимости и важной биологической роли протеолитических ферментов стало одним из основных факторов, определивших выбор протеаз в качестве объекта исследования в данной работе, направленной на выяснение новых механизмов функционирования белков.
Цель и задачи работы. Целью работы является изучение молекулярных механизмов, определяющих функционирование протеолитических ферментов.
В ходе выполнения работы решались следующие задачи:
- построение экспериментальных моделей для исследования молекулярных механизмов функционирования белков на основе химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз (ТПП);
- разработка подходов к экспрессии протеаз, синтезируемых клеткой в виде предшественников;
- исследование роли в распознавании субстрата глутамилэндопептидазой Bacillus intermedius консервативных остатков субстратсвязывающего центра;
- исследование функций пропептида и механизма созревания предшественника глутамилэндопептидазы B. intermedius;
- разработка прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья;
- биоинформатический анализ структуры предшественников ТПП;
- изучение функций и механизмов действия пропептидов ТПП;
- определение пространственной структуры предшественника ТПП;
- исследование биологических функций протеализина.
Научная новизна. В рамках данной работы получены оригинальные данные о механизмах функционирования химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз.
Все результаты исследования являются новыми. В том числе:
- охарактеризованы новые протеолитические ферменты;
- впервые изучена функциональная роль консервативных остатков субстратсвязывающего центра глутамилэндопептидазы B. intermedius;
- впервые идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз с короткими N-концевыми пропептидами;
- впервые изучены функции коротких N-концевых пропептидов термолизинподобных протеаз и механизм их удаления;
- впервые для металлопротеаз продемонстрирован эффект белковой памяти;
- установлена пространственная структура предшественника протеализина - первая структура предшественника ТПП и первая структура протеазы с коротким N-концевым пропептидом;
- впервые продемонстрировано, что ТПП с короткими N-концевыми пропептидами могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.
Практическая значимость.
Полученная в ходе работы информация о молекулярных механизмах функционирования протеаз может быть использована для конструирования ферментов с направленно измененными свойствами.
Практическую ценность имеют также реализованные в работе методы получения протеолитических ферментов в гетерологичных экспрессионных системах на основе клеток E. coli и B. subtilis. В частности, оригинальный подход для получения синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью, который основан на создании автопроцессирующихся ферментов путем направленной модификации сайтов их процессинга.
Значительный практический интерес представляют охарактеризованные в работе новые протеолитические ферменты и их штаммы-продуценты. Так, глутамилэндопептидаза B. intermedius может быть использована для ограниченного протеолиза полипептидов при определении первичной структуры, доменной организации и идентификации белков, а также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. Способность протеализина разрушать соединительную ткань животных при низкой положительной температуре позволяет, в перспективе, использовать этот фермент в различных приложениях, например, при получении культур клеток и тканей животных.
Потенциал протеализина в качестве промышленного катализатора демонстрирует созданный в ходе работы на основе рекомбинантного протеализина прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.
Разработанный препарат протестирован в условиях опытного производства. Показано, что его использование способствуют формированию более высоких качественных показателей готовых продуктов мясопереработки.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На основе охарактеризованных в работе новых термолизинподобных и химотрипсинподобных ферментов, их клонированных генов и экспрессионных систем создана экспериментальная модель для исследования молекулярных механизмов функционирования протеаз.
2. Консервативный элемент субстратсвязывающего центра гутамилэндопептидаз - остаток His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата ферментами группы и, по-видимому, для каждой эволюционной ветви Glu-специфичных протеаз характерна своя система компенсации заряда.
3. Идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз с короткими N-концевыми пропептидами. Изучена структурная организация представителей группы. Установлена пространственная структура предшественника протеализина - первая структура предшественника пептидазы семейства M4 и первая структура протеазы с коротким пропептидом. Показано, что протеазы группы протеализина могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.
4. Разработан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.
ичный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работ по исследованию глутамилэндопептидаз и на большинстве этапов исследования пептидаз семейства M4 - от постановки задачи и планирования экспериментов, до анализа, обобщения и представления полученных результатов. Экспериментальный материал преимущественно получен при непосредственном участии автора и под его научным руководством. При разработке ферментного препарата эксперименты по исследованию его действия на мясное сырье осуществлены сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии.
Рентгеновские данные с кристаллов протеализина собраны в Курчатовском центре синхротронного излучения и нанотехнологий, а их обработка осуществлена сотрудниками Института кристаллографии РАН. Эксперименты по изучению вовлеченности протеализина в бактериальную инвазию и действия протеализина на актин проведены сотрудниками Института цитологии РАН.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 37 конгрессе IUPAC (Берлин, 1999), международной конференции Biocatalysis 2000: Fundamentals & Application (Москва, 2000), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), научно-практической конференции Современное состояние российской биотехнологии (Пущино, 2003), международном конгрессе Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development (Москва, 2003), конференции Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии (Казань, 2004), всероссийском симпозиуме Биотехнология микробов (Москва, 2004), XIII Международной конференции Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение (Казань, 2005), II российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 30 конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), IV, V и VI симпозиумах Химия протеолитических ферментов (Москва, 1997, 2002 и 2007), международной конференции Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки (Минск, 2007), I международной научно-практической конференции Микробная биотехнология - новые подходы и решения (Казань, 2007), всероссийской научной конференции Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России (Санкт-Петербург, 2008), международном симпозиуме Biological Motility: Achievements and Perspectives (Пущино, 2008), VI и VII национальных конференциях Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии (Москва, 2007 и 2009), III, IV и V российских симпозиумах Белки и пептиды (Пущино, 2007; Казань, 2009; Петрозаводск, 2011).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 254 страницах, содержит 84 рисунка и 15 таблиц. Работа построена по традиционной схеме и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (544 источника).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 оригинальных научных статей, 5 обзоров, а также свыше 70 тезисов научных докладов. По результатам работы получен патент Российской Федерации.
Работа выполнена при участии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Казанского (Приволжского) федерального университета, Государственного научно-исследовательского институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), Института кристаллографии РАН (Москва), Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), Института биоорганической химии им.
академиков M.M. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва), Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва), Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино), Филиала института химических проблем химической физики (Черноголовка), Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова (Москва), Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий (Москва).
Работа проводилась при поддержке РФФИ (гранты 97-04-50162-а, 00-04-48280-а, 00-04-48281-а, 00-04-48320-а, 01-04-06083-мас, 03-04-48754-а, 03-04-48755-а, 06-0408123-офи, 06-04-48678-а, 09-04-00734-а, 12-04-00961) и программы Президиума РАН Молекулярная и клеточная биология.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Структурные детерминанты строгой субстратной специфичности глутамилэндопептидаз 1.1. Создание модели исследований Наиболее эффективным подходом к исследованию молекулярных механизмов функционирования белков является сегодня использование методов белковой инженерии. Применение этой стратегии для изучения механизмов, лежащих в основе строгой субстратной специфичности глутамилэндопептидаз (ГЭПаз), диктует свойства необходимой экспериментальной модели. Такой моделью может стать охарактеризованный с биохимической точки зрения белок, ген которого клонирован, секвенирован и экспрессирован в удобной для генно-инженерных манипуляций гетерологичной системе. Поскольку анализ литературных данных показал, что наиболее перспективными объектами исследований являются глутамилэндопептидазы грамположительных бактерий, нами были осуществлены работы по характеристике и клонированию генов ГЭПаз из этой группы микроорганизмов.
В качестве модельного объекта для исследований молекулярных механизмов функционирования ГЭПаз нами была выбрана ранее охарактеризованная сотрудниками Московского и Казанского государственных университетов глутамилэндопептидаза из B. intermedius 3-19 (BIGEP). Совместно с сотрудниками МГУ и Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов нами были осуществлены работы по клонированию, секвенированию и экспрессии гена BIGEP, а также разработана схема очистки рекомбинантного белка.
Ген глутамилэндопептидазы был клонирован из геномной библиотеки B. intermedius 3-19 и секвенирован (номер доступа в базе данных GenBank - Y15136).
Анализ выведенной из нуклеотидной последовательности первичной структуры BIGEP показал, что ген кодирует предшественник фермента содержащий, кроме участка соответствующего каталитическому домену, сигнальную последовательность и пропептид. Последовательность зрелой BIGEP оказалась наиболее близкой к первичным структурам бациллярных ферментов, сходство с белками стафилококков, стрептомицетов и вирусов было значительно ниже. На основе сравнения первичных структур ГЭПаз были идентифицированы остатки активного центра BIGEP и высказано предположение, что BIGEP и другие бациллярные ГЭПазы имеют сходную организацию S1 участка и механизм компенсации отрицательного заряда субстрата.
Нами была осуществлена гетерологическая экспрессия гена BIGEP в клетках B. subtilis, а также разработана схема очистки белка из культуральной жидкости рекомбинантного продуцента и получен электрофоретически гомогенный препарат фермента.
Аминоконцевая последовательность рекомбинантного белка была идентична определенной ранее для природной BIGEP, установленная методом электрофореза молекулярная масса (23,5 кДа) хорошо совпадала с расчетной, а удельная активность протеазы соответствовала установленной ранее для природного фермента.
Таким образом, нами был клонирован, секвенирован и экспрессирован в клетках B. subtilis ген BIGEP. Разработана схема очистки рекомбинантного белка и продемонстрировано, что по своей структуре и свойствам он соответствует природному белку.
Полученные результаты были использованы при решении простанственной структуры белка, а также позволили применить BIGEP в качестве модельного объекта для исследования молекулярных механизмов функционирования ГЭПаз.
1.2. Модификация субстратсвязывающего сайта глутамилэндопептидазы B. intermedius Наиболее интересным аспектом функционирования ГЭПаз является их строгая специфичность к гидролизу пептидных связей, образованных -карбоксильными группами отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Кажется очевидным, что для узнавания заряда в молекуле субстрата S1 участок фермента (обозначение по Шехтеру и Бергеру) должен нести компенсаторный заряд, как показано для целого ряда случаев.
Однако у ГЭПаз обнаружить консервативный сильноосновный остаток в S1 кармане не удается.
Таблица 1. Значения KM и k при гидролизе Z-AALE-pNa нативной и cat модифицированной глутамилэндопептидазой B. intermedius* KM, мM kcat, с-1 kcat/ KM, с-1M-Нативная BIGEP 0,67 16,6 247Модифицированная BIGEP-T213 3,3 0,027 8,* Стандартное отклонение представленных значений KM и k не превышает 10 %.
cat В то же время рентгеновские структуры, молекулярное моделирование активных центров этих ферментов, а также эксперименты по их направленной модификации демонстрируют, что His213 (нумерация по химотрипсину) - остаток, существенный для функционирования ГЭПаз. Этот остаток, являющийся общей структурной особенностью всех ферментов данной группы, способен нести положительный заряд, и поэтому His2приписывалась роль наиболее вероятного ключевого элемента в распознавании субстрата ГЭПазами.
Гипотеза требовала экспериментальной проверки, однако получить ГЭПазу с заменой в положении 213 другим исследователям не удавалось. Данные, полученные до начала наших работ, демонстрировали чрезвычайную чувствительность ГЭПаз к природе аминокислотного остатка в положении 213. В связи с этим мы подошли к выбору аминокислотной замены с особым вниманием. Анализ первичных и пространственных структур химотрипсинподобных протеаз (ХПП) показывает структурное сходство регионов 208-214, вовлеченных в формирование S1 участка ГЭПаз, у всех ферментов группы.
Причем среднеквадратичное отклонение C атомов остатка 213 не превышает 0,564 в 13 пространственных структурах ХПП млекопитающих, бактерий и вирусов. Среди этих 13 ферментов, не проявляющих Glu-специфичной активности, шесть имеют Val, пять - Thr и по одному - Leu и Met в 213 положении. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что Thr и Val являются наиболее многообещающими нативоподобными заменами для His213. Из этих двух вариантов нами был выбран Thr, поскольку введение мутации, соответствующей замене His213Val, в ген ГЭПазы Streptomyces griseus не позволило получить мутантный белок в экспрессионной системе, аналогичной примененной нами.
Нами был сконструирован и экспрессирован в клетках лабораторного штамма B. subtilis AJ73 ген BIGEP с двумя нуклеотидными заменами, соответствующими модификации Нis213Тhr. Активный мутантный белок накапливался во внеклеточной среде. Электрофоретически гомогенный мутантный фермент (BIGEP-T213) был выделен из культуральной жидкости. Молекулярная масса BIGEP-T213 (23 кДа) и N-концевая последовательность (VVIGD) были идентичны установленным ранее для нативного белка.
Мутантный фермент гидролизовал азоказеин с удельной активностью 0,6 Ед./мг (для фермента дикого типа 36,8 Ед./мг) и специфический субстрат ГЭПаз Z-AALE-pNA (удельная активность 0,16 Ед./мг), но не специфические субстраты химотрипсина (GlpAAL-pNA) и трипсина (Bz-R-pNA). BIGEP-T213 полностью сохранял активность при инкубации в течение 150 мин при 50C. Потери активности не наблюдалось также при хранении модифицированного фермента при 4C в течение 10 месяцев. Таким образом, нами впервые была получена ГЭПаза с заменой в положении 213 и показано, что модифицированный фермент проявляет каталитическую активность и высокую стабильность.
Субстратная специфичность BIGEP-T213 была оценена по гидролизу окисленной B-цепи инсулина. С помощью масс-спектрометрии и N-концевого секвенирования показано, что в результате действия фермента на субстрат образуется только два фрагмента, соответсвующих гидролизу связи Glu13-Ala14. Каталитические свойства нативной и мутантной BIGEP были изучены по гидролизу Z-AALE-pNa (табл. 1).
Полученные данные демонстрируют, что введение замены His213Thr в молекулу BIGEP не приводит к изменению субстратных предпочтений фермента, что позволяет сделать вывод о том, что His213 не определяет специфичность действия протеазы. В то же время модификация существенно влияет на эффективность катализа. При этом введенная замена относительно мало сказывается на константе Михаэлиса (увеличение KM в 4,9 раза), но сильно влияет на каталитическую константу (уменьшение k в 615 раз).
cat Интересно, что примерно такой же эффект наблюдается в случае гидролиза нативными ГЭПазами субстратов, содержащих остаток Asp в положении P1: KM растет примерно в раз, а падение k имеет тот же порядок (~150 раз).
cat Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют заключить, что консервативный остаток His213 не является ключевым элементом, определяющим распознавание отрицательного заряда боковой цепи остатка в положения P1 субстрата ГЭПзами, но, по-видимому, существенен для точного позиционирования расщепляемой связи относительно нуклеофила - кислорода гидроксильной группы серина каталитического центра. Этот вывод предполагает, что для обеспечения субстратной специфичности ГЭПаз, кроме His213, необходим дополнительный структурный элемент. Анализ пространственных структур ферментов группы показывает, что таким элементом в случае BIGEP и протеазы V8, по-видимому, является -аминогруппа N-концевого остатка фермента, формирующаяся лишь после удаления пропептида.
Для выяснения роли N-концевой аминогруппы в функционировании ГЭПаз может быть предложено два подхода. Первый заключается в получении вариантов зрелых ферментов с модифицированными N-концами. Поскольку удалить N-концевую аминогруппу белка не представляется возможным, то она либо может быть модифицирована химически, либо N-конец фермента может быть удлинен/укорочен на несколько аминокислотных остатков. Второй подход состоит в подробном исследовании механизма созревания ГЭПаз и поиске ответа на вопрос о субстратной специфичности предшественника.
1.3. Получение глутамилэндопептидазы B. intermedius с удаленными N-концевыми остатками Аминоконцевой остаток Val1 в молекуле BIGEP расположен непосредственно в субстратсвязывающем участке, следовательно, введение дополнительных аминокислотных остатков на N-конец молекулы наиболее вероятно приведет к нарушению/перестройке Sсайта и потере ферментом активности. Действительно, все известные в настоящее время варианты протеазы V8 с удлиненным N-концом, получающиеся в результате расщепления предшественника (у этого фермента Val1 также является элементом S1 участка), не обладают протеолитической активностью. Принимая во внимание высказанные соображения, можно полагать, что и химическая модификация аминогруппы Val1 приведет к аналогичным результатам, поскольку вводимые на N-конец фермента заместители будут также локализованы непосредственно в S1 регионе. В то же время, вероятно, оценить влияние аминогруппы Val1 на каталитические свойства белка можно, удалив один или несколько N-концевых остатков, как бы отодвинув аминогруппу от субстратсвязывающего участка.
Для реализации данного подхода нами была использована очищенная рекомбинантная BIGEP, продуцируемая клетками B. subtilis. С целью удаления N-концевых аминокислотных остатков ГЭПаза была обработана аминопептидазами, проявляющими предпочтение к гидрофобным остаткам: лейцин-аминопептидазами из Str. griseus и почек свиньи, а также аминопептидазой Aeromonas proteolytica. После обработки аминопептидазой A. proteolytica BIGEP демонстрировала практически полную потерю протеолитической активности. В то время как при обработке двумя другими аминопептидазами подобного эффекта не наблюдалось. При этом по результатам электрофоретического анализа количество ГЭПазы и ее молекулярная масса оставались неизменными во всех препаратах. Полученные препараты были очищены от аминопептидаз и продуктов гидролиза методом гельпроникающей хроматографии, а затем изучены их структура и ферментативные свойства. Структуру всех полученных вариантов BIGEP анализировали методом MALDI-масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов белков. Было установлено, что под действием ферментов из Str. griseus и почек свиньи структура ГЭПазы не меняется. В то же время, после обработки аминопептидазой A. proteolytica формировался белок (BIGEP-AP), N-концевым остатком которого был Gly4. Детектировать активность очищенной BIGEP-AP по гидролизу азоказеина и специфического субстрата Z-Glu-pNA не удавалось.
Для анализа специфичности BIGEP-AP был использован набор гептапептидных субстратов с внутримолекулярным гашением флуоресценции. Данные пептиды имели общее строение (E(Edans)-AAXAA-K(Dabcyl)-NH2), включая при этом различные аминокислотные остатки в положении 4 (X): Glu, Gln, Leu, Thr, Lys, Val, Ser и Ala. Однако ни в одном случае детектировать активность BIGEP-AP не удалось.
Потеря активности BIGEP при удалении первых трех аминокислот подтверждает важность N-концевых остатков для функционирования фермента. Вероятно, эффект связан с нарушением структуры субстратсвязывающего участка. В то же время, возможно, что модификация аминоконцевой области влияет на пространственное расположение остатков, формирующих каталитический центр. Полученные данные, однако, не дают ответа на вопрос о роли -аминогруппы Val1 в распознавании заряда субстрата, что вызывает необходимость использования другого экспериментального подхода - исследования механизма созревания предшественника.
1.4. Изучение механизма формирования активной глутамилэндопептидазы B. intermedius 1.4.1. Влияние модификации остатка в положении (-1) глутамилэндопептидазы на продукцию активного фермента клетками B. subtilis Все ГЭПазы синтезируются в виде предшественников, созревание которых происходит по разным механизмам. Предшественники эпидермолитических токсинов стафилококков содержат, кроме каталитического домена, только секреторные лидеры, удаляемые сигнальной пептидазой. Вирусные ГЭПазы синтезируются как часть протяженного полибелка, процессинг которого является основной функцией этих ферментов.
Предшественники ГЭПаз стрептомицетов, в дополнение к соответствующей зрелому ферменту области и секреторному лидеру, содержат пропептид, удаляемый автокаталитически. Автокаталитическое удаление пропептида в целом характерно для бактериальных протеаз. Однако автокатализ требует соответствия структуры сайта процессинга специфичности фермента, что в случае ГЭПаз накладывает жесткое ограничение: в положении (-1) в молекуле предшественника должен находиться остаток Glu. Такой остаток характерен для предшественников ГЭПаз вирусов и стрептомицетов, но не консервативен у других бактериальных ферментов. Напротив, у них в позиции (-1) наблюдаются самые разные аминокислотные остатки: Ser, Asn, His, Lys и Arg. Это разнообразие наводит на мысль о непринципиальности свойств остатка в (-1) положении для процессинга ГЭПаз, что может быть объяснено различиями специфичности зрелого фермента и предшественника. Такая трактовка согласуется с гипотезой о ключевой роли остатка 1 зрелоРис. 1. Продукция активной протеазы А Б клетками B. subtilis, несущими интактный и мутантные гены глутамилэндопептидазы B. intermedius в составе соответствующих плазмид. Контроль - клетки B. subtilis BG2036 (рСВ22), не имеющие гена BIGEP. A. 5 мкл ночной культуры нанесено на индикаторную среду молочный агар и выдержано 12 ч при 37C, а затем 24 ч при 22C. Б. Специфическая активность в культуральной среде (через 24 ч) по Z-Glu-pNA. D600 - оптическая плотность культуры при 600 нм.
го белка в определении специфичности фермента и предполагает, что предшественник обладает чрезвычайно широкой специфичностью. Однако существует и другое объяснение - гетероактивация, которая может осуществляться различными протеазами у разных микроорганизмов. В пользу этого варианта на момент начала нашего исследования свидетельствовали только данные, полученные еще в 1978 году для протеазы V8, однако механизм активации бактериальных ГЭПаз в целом оставался невыясненным. Поэтому с использованием модели на основе BIGEP мы предприняли работу по изучению влияния остатка (-1) на формирование зрелого фермента.
Было получено четыре мутантных варианта гена BIGEP, кодирующих ферменты с аминокислотными заменами Lys(-1)Ala/Ser/Asn/Glu (векторы рА-1/рS-1/pN-1/pE-1, соответственно). Кроме того, сконструирован аналогичный вектор (pK-1) с геном, соответствующим BIGEP, не несущей мутаций и сохраняющей Lys(-1). Все гены были экспрессированы в клетках лабораторного штамма B. subtilis. Уровень продукции активной протеазы клетками оценивали по размеру зон гидролиза казеина при культивировании на индикаторной среде молочный агар и по специфической активности в культуральной жидкости (рис. 1). Все клетки, несущие векторы с геном BIGEP, оказались способны, в отличие от контрольного штамма, к гидролизу казеина (рис. 1А). Уровень продукции активной BIGEP клетками был оценен количественно по гидролизу специфического субстрата Z-Glu-pNA. Накопление фермента в культуральной жидкости существенно различалось в зависимости от природы остатка в (-1) положении BIGEP (рис. 1Б). Полученные значения хорошо коррелировали с результатами теста на молочном агаре.
Таким образом, можно констатировать, что ни одна из введенных в положение (-1) мутаций не приводит к полному прекращению продукции активного фермента клетками.
В то же время наши результаты показывают, что природа остатка в данной позиции сайта процессинга BIGEP существенно влияет на уровень продукции активного фермента.
Наиболее вероятным представляется, что изменение уровня продукции активной BIGEP при модификациях в положении (-1) связано с профилем субстратного предпочтения процессирующего фермента или ферментов. В настоящее время опубликованы данные, что в клетках B. subtilis процессинг собственной глутамилэндопептидазы осуществляется субтилизинподобной секреторной протеазой - бациллопептидазой F (bpF).
Можно предположить, что в нашем случае процессинг BIGEP осуществляется тем же ферментом. При этом показано, что bpF гидролизует связи после Ser, Arg и Lys, но, повидимому, не способна расщеплять связи с Ala, Asn и Glu в положении Р1. Следовательно, при введении этих остатков в позицию (-1) BIGEP существует вероятность гидролиза в другом месте полипептидной цепи, что может вызывать наблюдаемый эффект. Однако более правдоподобной представляется активация BIGEP с этими остатками в сайте процессинга другими ферментами, поскольку для ГЭПаз показана возможность процессинга протеазами различных семейств. Так ГЭПаза B. licheniformis in vitro процессировалась при действии субтилизина и трипсина. В случае протеазы V8 из S. aureus и родственных ей ГЭПаз других стафилококков процессинг осуществляется термолизинподобными протеазами: ауреолизином in vivo и термолизином in vitro. Таким образом, весьма вероятно, что, в зависимости от структуры сайта процессинга, ГЭПаза в одном микроорганизме активируется при участии нескольких разных ферментов. В случае B. subtilis, например, на эту роль могут претендовать, кроме bpF, еще семь секреторных протеаз различной специфичности. Кроме того, существует возможность автопроцессинга в случае замены Lys(-1) на Glu, что было показано для ГЭПаз из Str. griseus и B. subtilis, а также нами для самой BIGEP.
Интересно, что, несмотря на введение в положение (-1) BIGEP остатка Ser, находящегося в сайте процессинга ГЭПазы B. subtilis, максимальный уровень протеолитической активности в культуральной среде демонстрируют клетки с геном BIGEP, кодирующим характерный для B. intermedius вариант фермента с Lys(-1). Таким образом, наличие Lys(-1) является предпочтительным для достижения более высокого уровня продукции активного белка. Можно предположить, что модификация остатка (-1) ГЭПаз служит механизмом эволюционной адаптации уровня продукции фермента. В таком случае объяснимо разнообразие свойств остатков в этом положении сайта процессинга очень близких в остальном белков.
Таким образом, полученные нами и опубликованные другими авторами данные позволяют утверждать, что природа остатка в положении (-1) предшественника значительно влияет на созревание ГЭПаз, хотя и не является критической для активации ферментов, поскольку последняя может осуществляться различными путями. Эти результаты должны быть учтены при конструировании эффективных продуцентов не только самой BIGEP, но и других протеаз с узкой субстратной специфичностью.
Исследования влияния остатка (-1) на продукцию BIGEP продемонстрировали, что использованная нами на этом этапе работы экспрессионная система на основе клеток B. subtilis не дает возможности получить предшественник фермента и детально изучить процесс его созревания. Это, в свою очередь, не позволяет сделать вывод о субстратной специфичности ГЭПазы до возникновения свободной аминогруппы N-концевого остатка зрелого белка. Для решения этой задачи нами была создана экспрессионная система на основе клеток E. coli.
1.4.2. Созревание глутамилэндопептидазы B. intermedius in vitro Гетерологическая экспрессия является в настоящее время наиболее эффективным подходом к получению белков, как для исследований, так и в прикладных целях. В то же время, при использовании такого подхода возникает проблема корректного сворачивания. Для белков, синтезируемых в виде предшественников, во многих случаях показано, что фолдинг определяется пропептидами. Однако это не решает проблему полностью, поскольку для формирования активной формы белков пропоследовательности должны быть корректно удалены. Если отщепление пропептида может происходить автокаталитически, то экспрессированная в гетерологической системе протеаза после ренатурации, как правило, созревает самопроизвольно. Но если фермент не способен к автокаталитическому удалению прорегиона, что характерно для многих протеаз с узкой субстратной специфичностью, то необходимо использование другого протеолитического фермента.
Глутамилэндопептидаза B. intermedius синтезируется в виде предшественника, однако, к моменту начала наших работ было не известно, выполняет ли пропептид фермента функцию фолдинг-ассистента. В то же время имеющиеся данные позволяли предполаА Б Рис. 2. Полученные варианты глутамилэндопептидазы B. intermedius и их процессинг. А - частичные последовательности кодируемых генами белков и сайты процессинга. Б - схема получения активной BIGEP. SPM - полноразмерный предшественник; PM и PEM - предшественники без сигнального пептида и без сигнального пептида с мутацией Lys(-1)Glu; M - зрелая часть; IntF - промежуточная форма. Черной стрелкой отмечен сайт процессинга сигнальной пептидазой, белыми стрелками - сайты отщепления пропептидов, серыми - сайты формирования промежуточной формы. Установленные N-концевые последовательности подчеркнуты. Знак л* соответствует положению (-1).
гать, что удаление пропептида BIGEP осуществляется другой протеазой. Действительно, удаление пропептида ГЭПаз может осуществляться автокаталитически лишь при наличии связи GluЦXaa в сайте процессинга, в противном случае, для активации необходимо участие дополнительного фермента. При созревании BIGEP гидролизуется связь LysЦVal, таким образом, in vivo этот фермент, по-видимому, активируется гетерокаталитически.
Следовательно, при экспрессии BIGEP в клетках E. coli, вероятно, понадобится (как в случае ГЭПаз B. licheniformis и S. aureus) активация другой протеазой с соответствующей специфичностью. Этот факт может оказаться благоприятным для получения полноразмерного предшественника BIGEP. Однако использование для процессинга дополнительного фермента нежелательно, если целью исследования является изучение субстратной специфичности, и абсолютно недопустимо с точки зрения получения высокоспецифичной протеазы, которую предполагается применять для ограниченного протеолиза.
Поскольку в описанной ситуации не представлялось возможным выбрать одно оптимальное решение, то нами был сконструирован набор векторов, позволяющих экспрессировать в клетках E. coli разные варианты гена BIGEP (рис. 2). Вектор pM нес ген индивидуальной зрелой части BIGEP (M), предназначенной для проверки фолдазной способности пропептида. Плазмида pSPM кодировала полноразмерный предшественник BIGEP (SPM), содержащий сигнальный пептид, поскольку в ряде случаев при гетерологической экспрессии белков-предшественников в E. coli секреция приводит к их корректному созреванию. Вектора pPM и pPEM, определяющие синтез предшественников без сигнального пептида (PM) и без сигнального пептида с заменой Lys(-1)Glu (PEM), были необходимы для получения негидролизованного предшественника и автоактивирующегося фермента, соответственно.
При экспрессии вариантов генов BIGEP в клетках E. coli BL21 (DE3) все белки (SPM, PM, PEM и M) накапливались в нерастворимой форме. В то же время методом электронной микроскопии было показано, что тела включения имеют различную клеточную локализацию (рис. 3). Полноразмерный предшественник BIGEP (SPM) обнаруживался в периплазматическом пространстве, тогда как остальные белки были локализованы в цитоплазме. Данный факт демонстрирует, что в клетках E. coli наличие собственного сигнального пептида приводит к секреции BIGEP.
Рекомбинантные белки (SPM, PM, PEM и M) были очищены в присутствии 8 М мочевины с использованием катионообменной и гельпроникающей хроматографии до электрофоретически гомогенного состояния.
Для получения данных о первичной структуре SPM, PM, PEM и M были обработаны трипсином и подвергнуты анализу методом MALDI-масс-спектрометрии, котрый показал, что набор фрагментов в случае PM, PEM и M полностью соответствует последовательностям белков, кодируемых модифицированными Рис. 3. Электронные микрофотографии клегенами (рис. 2). В случае SPM фрагмент, соотток E. coli BL21 (DE3), несущих плазмиды pPET23b(+), pSPM, pPM и pM. Стрел- ветствующий кодируемому геном N-концевому ки указывает на положение тел включения.
участку белка, обнаружен не был. N-концевое секвенирование SPM показало, что пять первых аминокислотных остатков этого белка: TSDSV. Эти результаты свидетельствуют об удалении 26 стартовых аминокислотных остатков SPM, соответствующих теоретически предсказанному сигнальному пептиду.
Таким образом, SPM отличался от PM по первичной структуре лишь отсутствием стартового метионина (рис. 2А).
Ренатурацию очищенных SPM, PM, PEM и M проводили в присутствии 25% глицерина и 0,15 M NaCl, снижая концентрацию мочевины в растворе до 0,53 М однократным разбавлением. (Схема созревания представлена на рис. 2Б.) В случае SPM и PM, после 12 ч инкубации при 4C от 50 до 70% белка переходило в промежуточную форму (IntF) (рис. 4А, данные приведены для SPM). Молекулярная масса IntF, по результатам электрофореза, составляла около 26 кДа, что больше массы зрелого белка (22,8 кДа) и меньше массы предшественника (29,5 кДа). По результатам N-концевого секвенирования первые пять остатков IntF - KVKPL (это соответствует участку (-15)-(-11) в последовательности предшественника). Таким образом, промежуточная форма образуется при гидролизе связи Glu(-16)ЦLys в пропептиде BIGEP и имеет расчетную молекулярную массу 24,7 кДа.
IntF была стабильна в растворе при 4C, по крайней мере, в течение 90 суток. Добавление PMSF, ингибитора сериновых протеаз, и о-фенантролина, ингибитора металлопротеаз, не влияло на образование промежуточной формы. Детектировать протеолитическую или специфическую активность IntF не удавалось. При добавлении трипсина или субтилизина, но не термолизина или BIGEP, полученной в клетках B. subtilis (BIGEP-Bs), IntF переходила в активную форму, имеющую, по данным электрофореза, молекулярную массу, совпадающую с массой BIGEP-Bs (около 23 кДа).
В случае PEM детектировать промежуточную форму не удавалось, 50-70% данного белка при инкубации (12 ч, 4C) переходило в активную форму с молекулярной массой около 23 кДа (рис. 4Б). Присутствие в растворе PMSF и о-фенантролина не влияло на этот процесс. Соответствие первичных структур активных форм, полученных из SPM, PM и PEM, структуре зрелой BIGEP дикого типа подтверждено масс-спектрометрическим анализом их трипсиновых гидролизатов.
Определенная по гидролизу Z-Glu-pNA специфическая активность всех полученных вариантов зрелой BIGEP, составляла 1,60,1 Ед./мг, что соответствует значениям, установленным для нативной BIGEP. Протеолитическая активность полученных из SPM, PM и PEM ферментов, определенная по гидролизу азоказеина, также была близка к таковой для природной BIGEP и составляла 313 Ед./мг.
А Б Рис. 4. Электрофоретический анализ препаратов SPM (A) и PEM (Б), полученных в ходе ренатурации. SPM - полноразмерный предшественник BIGEP; IntF - промежуточная форма;
mSPMT и mSPMS - зрелая BIGEP после обработки IntF трипсином и субтилизином, соответственно; M - индивидуальная зрелая часть; PEM - предшественник с мутацией Lys(-1)Glu;
mPEM - зрелая BIGEP, полученная при автокаталитическом созревании PEM; BIGEP-Bs - зрелая BIGEP, выделенная из клеток B. subtilis. MW - маркеры молекулярной массы.
Полученная в клетках E. coli индивидуальная зрелая часть BIGEP (M), очищенная и обработанная аналогично SPM, PM и PEM, при понижении концентрации денатурирующего агента агрегировала с образованием осадка. Детектировать протеолитическую или специфическую активность в осадке или супернатанте не удавалось. Таким образом, отсутствие пропептида в составе рекомбинантной BIGEP приводит к невозможности формирования активного фермента в условиях эксперимента.
Итак, экспрессия нескольких вариантов гена BIGEP в клетках E. coli позволила нам выявить целый ряд фактов, проливающих свет на механизмы функционирования этого фермента. Так, было впервые продемонстрировано, что пропептид ГЭПазы B. intermedius необходим для формирования активного фермента, т.е. является фолдинг-ассистентом.
Нами показано, что для активации in vitro BIGEP нуждается в участии других протеаз, специфичность которых соответствует расщепляемой связи пропептид-зрелая часть (LysЦVal). Необходимость гетероактивации была также показана ранее для ГЭПаз из B. subtilis (in vivo) и из B. licheniformis (in vitro).
В то же время оказалось, что созревание BIGEP осуществляется ступенчато. На первой стадии происходит гидролиз пропептида по единственному остатку глутаминовой кислоты (Glu(-16)) с образованием промежуточной формы (IntF). Образование IntF не требует участия дополнительных протеолитических ферментов и не зависит от присутствия ингибиторов, что соответствует свойствам BIGEP. Эти факты позволяют сделать предположение об автокаталитическом механизме образования IntF. Вероятно, предшественник BIGEP обладает протеолитической активностью, причем природа гидролизуемой в пропептиде связи (GluЦLys) говорит о специфичности, совпадающей с таковой у зрелой ГЭПазы. Тем не менее, обнаружить активность IntF не удавалось. Такое положение может быть связано с низким, не детектируемым используемыми методами, уровнем активности промежуточной формы. Другими объяснениями могут служить внутримолекулярный процессинг предшественника на первой стадии и/или ингибирование активности IntF оставшимися аминокислотами пропептида. Хотя, не исключено, что автопроцессинг BIGEP осуществляется межмолекулярно зрелым ферментом, а инициируется с низкой эффективностью другой, примесной протеазой.
Данные о ступенчатом механизме процессинга были недавно получены in vitro для другой ГЭПазы - фермента из B. licheniformis, а также in vivo и in vitro для протеазы V8. Интересно отметить, что процессинг протеазы V8 происходит in vivo при участии термолизинподобной металлопротеазы ауреолизина, а in vitro при участии термолизина.
Однако обработка промежуточной формы BIGEP термолизином не приводила к образованию зрелого фермента. Вероятно, это связано с различной природой гидролизуемой связи: AsnЦVal у протеазы V8 и LysЦVal у BIGEP. Эти данные хорошо дополняют результаты, полученные нами при мутагенезе (-1) положения BIGEP, и являются еще одним аргументом в пользу сделанных выводов о том, что модификации (-1) остатка ГЭПаз in vivo служат механизмом эволюционной адаптации.
Приняв во внимание способность BIGEP к автокаталитическому гидролизу пропептида по остатку Glu(-16), а также данные об автокаталитическом процессинге in vivo родственных ферментов (глутамилэндопептидазы из B. subtilis и Str. griseus), мы сконструировали ген BIGEP с мутацией, модифицирующей сайт процессинга так, чтобы он соответствовал субстратной специфичности фермента. Полученный мутантный предшественник с заменой Lys(-1)Glu при ренатурации переходил в зрелую форму, не отличающуюся от BIGEP дикого типа по первичной структуре и удельной активности. Процесс созревания такого предшественника осуществлялся автокаталитически, то есть не требовал использования других ферментов.
Этот результат имеет важное прикладное значение. Протеолитические ферменты с узкой субстратной специфичностью, к которым относится BIGEP, позволяют проводить ограниченный гидролиз белков и пептидов, что делает эти протеазы незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. В случае высокоспецифичного фермента, пригодного для ограниченного протеолиза, присутствие примесной активности абсолютно недопустимо. Таким образом, нами предложен новый подход к получению протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологических экспрессионных системах, состоящий в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.
1.5. Глутамилэндопептидазы: пропептиды и структурные детерминанты субстратной специфичности Подведем итог осуществленным в рамках данной работы исследованиям глутамилэндопептидаз. Ферменты этой группы относятся к структурному семейству химотрипсина и характеризуются способностью гидролизовать пептидные связи, образованные -карбоксильными группами остатка Glu и, в некоторых случаях, других отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Все ГЭПазы имеют в целом сходное строение S1 субстратсвязывающего участка, различаясь, однако, системой компенсации заряда субстрата. При этом различия в механизмах распознавания отрицательного заряда коррелируют с различиями в архитектурах и путях процессинга предшественников соответствующих ферментов. Изложенные факты, в сочетании с филогенетическим анализом, позволяют сделать предположение о том, что белки с такой специфичностью возникли на эволюционном древе ХПП, по крайней мере, дважды. Все это делает ГЭПазы привлекательными объектами исследований, которые, с одной стороны, позволяют получить информацию о механизмах распознавания заряженных субстратов, а, с другой стороны, могут служить основой для создания протеаз с измененной субстратной специфичностью.
Нами создана экспериментальная модель для исследования механизмов функционирования ГЭПаз на основе протеазы B. intermedius (BIGEP). В рамках этой модели проведен направленный мутагенез субстратсвязывающей области и впервые получена ГЭПаза с аминокислотной заменой по остатку His213 - ключевому элементу S1 участка. Анализ свойств модифицированного фермента показал, что консервативный у всех ГЭПаз His213 не определяет способность BIGEP расщеплять субстраты после остатка Glu, хотя важен для проявления ферментом высокой каталитической эффективности.
Полученный результат позволил сделать вывод, что His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата у ГЭПаз, и стал новым аргументом в пользу предположения, что для каждой эволюционной ветви ГЭПаз характерна своя система компенсации заряда.
Нами впервые изучен механизм созревания BIGEP и получены данные о влиянии модификаций пропептида на формирование активной протеазы. Показано, что пропептид BIGEP необходим для формирования активного фермента и, следовательно, выполняет функцию фолдинг-ассистента. Такие данные для ГЭПаз получены впервые.
Продемонстрировано, что удаление пропептида BIGEP происходит ступенчато. Первая стадия процессинга, по-видимому, происходит автокаталитичеки, приводя к образованию неактивного интермедиата, который переходит в активную форму после гетероактивации. При этом эффективность гетероактивации и процессирующий фермент определяются остатком в положении (-1) пропептида, а введение остатка Glu(-1) приводит к автоактивации. Таким образом, во-первых, может быть сделан вывод о том, что активация BIGEP in vivo контролируется другими протеазами. Причем изменение остатка (-1) в ходе эволюции, определяя процессирующий фермент, вероятно, дает возможность влиять как на эффективность процессинга, так и на выбор механизма регуляции активности ГЭПазы. Во-вторых, полученные данные позволяют думать, что, поскольку автоактивация предшественника BIGEP сопровождается расщеплением связей остатков Glu, -аминогруппа Val1, N-концевого остатка зрелого белка, также как и His213, не является единственной детерминантой субстратной специфичности фермента. Учитывая это, можно предположить, что каждый из рассмотренных элементов S1 участка (-аминогруппа N-концевого остатка и His213) является достаточным, но не является необходимым для обеспечения наблюдаемых субстратных предпочтений бациллярных и родственных им ГЭПаз. Совокупность же этих двух элементов обеспечивает высокую эффективность катализа. Однако для того, чтобы сделать такой вывод полностью обоснованным, необходимо получить доказательства, что запуск процессинга не осуществляется зрелым ферментом, образующимся в результате действия какой-либо примесной протеазы. Кроме того, нельзя исключить, что ключевую роль в распознавании заряда субстрата играет еще один, до настоящего времени не идентифицированный структурный элемент, ведь высокая эффективность катализа вирусными и стрептомицетными ГЭПазами обеспечивается и без -аминогруппы N-концевого остатка в S1 сайте. Эти предположения еще ждут экспериментальной проверки, которая, вероятно, может быть выполнена в рамках предложенной модели.
Важно отметить, что созданная нами в ходе работы экспериментальная система имеет прикладное значение. Полученные результаты о механизме созревания предшественника BIGEP позволили разработать подход к получению синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологичных экспрессионных системах. Этот подход использует концепцию линженерии пропоследовательностей и основан на создании автопроцессирующихся ферментов, что позволяет избежать введения чужеродных процессирующих протеаз в препарат целевого белка.
В рамках данной работы такой метод был успешно применен для создания продуцента ГЭПазы B. intermedius. Полученный с использованием сконструированного продуцента фермент в настоящее время применяется в нашей лаборатории и других лабораториях Института молекулярной генетики РАН для ограниченного протеолиза белков и пептидов. Не подлежит сомнению также, что созданная нами экспериментальная модель является хорошей основой для получения ферментов с измененной субстратной специфичностью, в том числе с применением инженерии пропептидов.
2. Термолизинподобные протеазы - модель для исследования модулирующей способности пропептидов 2.1. Характеристика белков семейства MРеализация потенциала семейства пептидаз M4, более известного как термолизинподобные протеазы (ТПП), в качестве модельной системы для изучения модулирующей способности пропептидов требует наличия в руках исследователя набора охарактеризованных ферментов этой группы. Поскольку, как уже обсуждалось выше, одним из наиболее эффективных подходов для выявления структурно-функциональных соотношений в белковых молекулах является белковая инженерия, необходимо также располагать клонированными генами целевых протеаз и удобными системами для их экспрессии. Для решения этой задачи сотрудниками лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН (ЛБИ ИМГ РАН) на протяжении многих лет проводился поиск бактериальных штаммов-продуцентов протеолитических ферментов и конструирование геномных библиотек таких микроорганизмов, что дало возможность подобрать модельные белки для использования в рамках данного исследования.
2.1.1. Новая нейтральная протеаза Thermoactinomyces species 27a Сотрудниками ЛБИ ИМГ РАН была создана геномная библиотека Thermoн actinomyces sp. 27a, при анализе которой был клонирован ген металлопротеазы. Ген был экспрессирован в клетках лабораторного штамма Bacillus subtilis AJ73 под контролем собственных регуляторных элементов. В данной работе была установлена последовательность гена металлопротеазы (номер доступа в базе данных GenBank - AY280367), очищен и охарактеризован соответствующий фермент.
Сравнение выведенной из структуры гена аминокислотной последовательности металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27a (Mpr-Thr) с известными первичными структурами белков показало, что она наиболее близка к последовательностям термолизинподобных протеаз (ТПП). Биоинформатический анализ позволил сделать вывод, что белок синтезируется в клетке как предшественник, содержащий, кроме высокогомологичного зрелым пептидазам M4 участка, секреторный лидер, N-концевой пропептид, а также карбоксиконцевой домен, который не характерен для большинства ТПП.
Электрофоретически гомогенная металлопротеаза была выделена из культуральной жидкости рекомбинантного продуцента B. subtilis AJ73 (p31) с выходом 23% при очистке примерно в 40 раз. Молекулярная масса белка, установленная методом электрофореза, составляла 34 кДа, что совпадало со значением, полученным при масс-спектрометрическом анализе - (3419070 Да). Нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность фермента (AAATGTGTGV), положение которой в первичной структуре предшественника показало, что при созревании фермента удаляется N-концевой пропептид протяженностью 215 а.о. Кроме того, сопоставление N-концевой последовательности и молекурярной массы зрелого белка с выведенной первичной структурой предшественника дало возможность сделать вывод, что при созревании Mpr-Thr удаляется также С-концевое расширение. Причем процессинг происходит после 317 или 318 остатка. Это позволяет рассматривать С-концевое расширение фермента как пропептид. Следует отметить, что С-концевые пропептиды характерны для примерно 1/3 ТПП.
Сравнение последовательностей зрелой части Mpr-Thr и каталитических доменов бациллярных ТПП показало их существенное сходство. Наибольшая гомология наблюдается в функционально значимых регионах молекулы: активном центре и участках связывания ионов кальция. Таким образом, по первичной структуре каталитического домена Mpr-Thr является типичным представителем семейства пептидаз M4.
Нами были изучены свойства Mpr-Thr. Ингибиторный анализ подтвердил отнесение Mpr-Thr к каталитическому типу металлопротеаз. Подобно другим ТПП, фермент демонстрировал оптимум протеолитической активности при pH 7,0-7,5 и был стабилен при pH 6,5-9,0. Протеаза проявляла оптимум действия при температуре около 55C. Ионы кальция стабилизировали фермент. Фермент гидролизовал стандартный субстрат ТПП 3-(2-фурил)акрилоил-глицил-L-лейцинамид (ФАГЛА), при этом отношение k /KM, хаcat рактеризующее эффективность катализа, составило (2,80,1)103 M-1c-1. Для сравнения, в случае термолизина это значение - (2,00,1)104 M-1c-1.
Таким образом, нами впервые охарактеризована ТПП термоактиномицета. По своей структуре и свойствам зрелый фермент является типичным представителем семейства M4. В то же время предшественник белка содержит C-концевой пропептид, что характерно лишь для части протеаз группы. Это делает Mpr-Thr перспективной в качестве одного из элементов модели для исследования функций пропоследовательностей.
2.1.2. Протеализин - металлопротеаза Serratia proteamaculans 94, представляющая новую группу термолизинподобных ферментов Ранее сотрудниками ЛБИ ИМГ РАН и Лаборатории гигиены производства и микробиологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии (ВНИИМП) из испорченного мясного сырья был выделен психротолерантный штамм Ser. proteamaculans 94 - продуцент протеолитических ферментов. В рамках данной работы мы исследовали металлопротеазу из этого организма: клонировали, секвенировали и экспрессировали ее ген, охарактеризовали соответствующий белок. Этот фермент, получивший название протеализин, был первой выделенной из Ser. proteamaculans протеазой и первой протеазой этого организма, для которой была установлена структура гена.
Ген протеализина (Pln) был клонирован из созданной нами геномной библиотеки Ser. proteamaculans 94 в составе фрагмента ДНК размером около 3,3 тпн и секвенирован (номер доступа в GenBank - AY280367). Сравнение полной выведенной из последовательности гена первичной структуры (341 а.о.), т.е. последовательности предшественника Pln, с первичными структурами известных ТПП показало, что наибольшая гомология наблюдается с внеклеточной протеазой Erwinia carotovora и минорной протеазой Serratia marcescens.
Последовательность, соответствующая зрелому Pln (291 а.о.), имеет выраженную гомологию с последовательностью термолизина (Tln) (37% идентичных и 54% сходных остатков) и других хорошо охарактеризованных белков семейства M4. Наибольшее количество совпадающих аминокислотных остатков наблюдается в функционально существенных участках молекулы. Это позволило идентифицировать остатки, формирующие активный центр фермента (His112, His116, Glu136, Asn135, Asp140, Glu113, His214, Tyr127) и S1' сайт (обозначение по Шехтеру и Бергеру) связывания субстрата (Phe130, Phe133, Val139 и Leu202). Сопоставление первичной структуры Pln с последовательностью Tln в областях, соответствующих сайтам связывания кальция, показало, что эти участки существенно различаются: в Pln изменено большинство остатков, взаимодействующих с Ca2+ боковыми группами.
Находящаяся на N-конце предшественника Pln последовательность (50 а.о.), которая удаляется при созревании белка, полученного нами в клетках E. coli, не имеет гомологии с препропоследовательностью Tln (232 а.о.) и большинства других ТПП, Рис. 5. LOGO-представление консенсусной пооднако обнаруживает заметное сходство c следовательности PPL-мотива.
N-концевыми областями предшественников целого ряда ферментов группы. В этих последовательностях нами обнаружен консервативный гидрофобный кластер, названный PPL-мотивом и включающий семь аминокислотных остатков, три из которых инвариантны: два следующих друг за другом Pro и Leu через два остатка за ними (рис. 5).
Нами сконструирован рекомбинантный продуцент Pln. При работе с продуцентом E. coli BL21 (DE3) (pSIT20) обнаружено, что свежий лизат клеток содержит Pln в виде предшественника с молекулярной массой около 37 кДа. При этом детектируемая протеолитическая активность в лизате была крайне низкой. Инкубация препарата при 4C приводила к созреванию фермента - образованию процессированой формы с массой примерно 32 кДа. Данный процесс сопровождался ростом протеолитической активности, которая достигала максимума через 24-72 часа после лизиса клеток.
Электрофоретически гомогенный активный Pln выделен из клеточного лизата E. coli в количестве 18,5 мг на литр культуральной суспензии с выходом по активности 12% при очистке в 5 раз. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность зрелого белка (AKTSTGGEVI), что позволило идентифицировать точку процессинга предшественника и сделать вывод о том, что при созревании Pln, синтезированного в клетках E. coli, удаляется аминоконцевой регион, состоящий из 50 а.о., и формируется зрелый активный белок, протяженностью 291 а.о.
Молекулярная масса зрелого Pln составила: определенная посредством гельпроникающей хроматографии - около 31,5 кДа и электрофореза в ПААГ в присутствии SDS - около 32 кДа. Экспериментальные значения близки к величине, рассчитанной по последовательности - 31894 Да. Соответствие значений, полученных в денатурированной и активной форме, показывает, что функциональной формой белка является мономер.
Фермент проявляет оптимум активности при гидролизе азоказеина при pH около 7 и температуре 50C. По типу ингибирования Pln является типичной металлопротеазой.
Активность фермента угнетается о-фенантролином и ЭДТА, но не хлоридом ртути (II) и PMSF. Фермент гидролизует ФАГЛА, стандартный субстрат ТПП. При этом отношение k /KM составляет (2,520,02)102 М-1с-1. Таким образом, по своим энзиматическим свойcat ствам Pln является типичным представителем семейства пептидаз M4.
Протеализин стабилен при pH 5,5-9,5 и температуре до 40C. При более высоких температурах фермент заметно инактивируется и при температуре 60C практически полностью теряет активность за 15 мин. Термостабильность Pln зависит от концентрации ионов кальция. Остаточная активность фермента после 20 мин инкубации при 55C снижалась в 2,4 раза при увеличении концентрации Ca2+ до 40 мМ.
Полученные результаты демонстрируют, что Pln не является высокостабильным ферментом. Это может быть связано с неспособностью к акцепции ионов кальция молекулой белка. Известные представители семейства пептидаз M4 существенно отличаются по термостабильности. Причем атрибутом более лабильных белков является отсутствие сайтов связывания кальция Ca3 и Ca4. При этом стабильность большинства ТПП растет с увеличением концентрации ионов кальция в диапазоне 1-100 мМ. В случае Pln наблюдается обратный эффект. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этого явления, не ясны. Однако можно предположить, что оно, как и низкая стабильность, определяется упоминавшимися выше существенными изменениями в регионах молекулы Pln, соответствующих сайтам связывания кальция.
Наиболее интересной особенностью Pln является организация N-концевой области его предшественника. Все известные ТПП синтезируются в виде препробелков, содержащих на N-конце участок, который отсутствует в зрелом активном ферменте. В то же время для большинства белков семейства, в том числе для Tln, характерна иная структура аминоконцевого региона предшественника. Таким образом, внутри семейства M4 могут быть выделены два структурных подсемейства. Это позволяет, учитывая важность N-концевых пропептидов для функционирования пептидаз семейства, рассматривать ТПП как модель для исследования модулирующей способности пропептидов.
Использование данной модели требует более глубокого анализа структурной организации предшественников пептидаз семейства M4. Такой анализ был осуществлен нами в рамках данной работы и будет представлен ниже.
2.2. Создание прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья на основе протеализина Как упоминалось выше, штамм Ser. proteamaculans 94, природный продуцент протеализина, был обнаружен в ходе исследований, проведенных совместно сотрудниками ВНИИМП и ИМГ РАН. Эта работа была направлена на поиск микроорганизмов, продуцирующих коллагенолитические ферменты, активные при низкой положительной температуре. Было показано, что ферменты культуральной жидкости Ser. proteamaculans способны гидролизовать соединительную ткань животных при температуре 4-10C. На их основе был создан ферментный препарат для улучшения качества мясного сырья.
Однако из-за неэффективности продуцента препарат имеет высокую себестоимость и, вследствие этого, не рентабелен при промышленном применении. Описанное выше клонирование гена Pln и создание его рекомбинантного продуцента послужило базой для осуществления нового совместного проекта ВНИИМП и ИМГ РАН. Этот проект был направлен на создание ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья на основе рекомбинантных протеаз Ser. proteamaculans 94.
На первом этапе коллагенолитическая активность Pln при температурах 4 и 20C была оценена по гидролизу нативного коллагена I типа. Было установлено, что рекомбинантный фермент способен гидролизовать коллаген при обеих температурах, что позволило сделать вывод о целесообразности проведения исследований действия Pln на мясное сырье. Для осуществления этой работы нами была получена лабораторная партия препарата рекомбинантного фермента.
Сотрудниками ВНИИМП была проведена оценка действия препарата на мясное сырье. Для этого были изучены физико-химические и микроструктурные изменения ферментированной говядины. Основные физико-химические характеристики, такие как рН, содержание влаги и влагосвязывающая способность изучали при различных концентрациях препарата в сырье. Было показано, что при действии препарата рН мясного сырья меняется незначительно. При введении препарата в мясном сырье возрастала массовая доля растворимого белка с высокогидрофильными свойствами, что приводило к увеличению влагосвязывающей способности в 1,7-2,1 раза (в зависимости от использованной концентрации препарата). Влияние препарата на соединительную ткань определяли, сравнивая содержание оксипролина в сырых и вареных образцах без и после 48 ч инкубации с ферментным препаратом. Исследование показало, что содержание свободного оксипролина в опытных образцах на 24-30 мг% А Б выше по сравнению с контролем. Эти данные соответствуют увеличению развариваемости коллагена в ферментированном мясном сырье на 74-85%. Эффективное действие на соединительную ткань было подтвеждено микроструктурными исследованиями образцов, обработанных препаратом.
Важным условием применимости ферментного препарата в пищевой промышленности является его полная инактивация Рис. 6. Действие ферментного препарата на в готовом продукте. Поскольку технология основе рекомбинантного протеализина на соприготовления мясных изделий стандартно единительную ткань в составе мясного сырья.
Микрофотографии фарша контрольного образвключает температурную обработку, нами ца (А) и фарша, обработанного препаратом (Б).
была исследована термоинактивация Pln.
Оценка остаточной активности фермента в готовой продукции была проведена совместно с сотрудниками ВНИИМП. Для этого была выработана опытная партия колбасных изделий (сосисок) и изучена протеолитическая активность в изделиях, прошедших термическую обработку и полученных как с использованием ферментного препарата, так и без него. Установлено, что активность Pln не детектируется в готовой продукции, и, следовательно, ферментный препарат может быть использован в пищевой промышленности.
Таким образом, совокупность полученных данных позволила сделать вывод о перспективности использования препарата для обработки сырья с высоким содержанием соединительной ткани. Для проведения дальнейших исследований в опытно-промышленных масштабах были необходимы значительно большие количества ферментного препарата.
Совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН) был разработан технологический регламент получения препарата Pln на основе штамма-продуцента E. coli BL21 (DE3) (pSIT20) в ферментерах объемом 100 л. Была выпущена опытная партия сухого ферментного препарата, с использованием которого на ЗАО Микояновский мясокомбинат (совместно с сотрудниками ВНИИМП) была выработана опытная партия варено-копченой колбасы, а затем изучены микроструктурные характеристики ферментированного фарша и готового продукта.
Исследования показали, что ферментный препарат оказывает влияние, в первую очередь, на структуру соединительной ткани. При этом ее характеризует разрыхление компоновки коллагеновых волокон в пучках (рис. 6), что способствует более глубоким изменениям в структуре коллагена при термической обработке. Использование препарата не оказывает негативного влияния на микроструктурные показатели готовых колбасных изделий. Компоновка структурных элементов фарша в готовых изделиях более плотная по сравнению с контрольными образцами. Фрагменты соединительной ткани характеризуются глубокими деструктивными изменениями. Отмеченные морфологические изменения в структуре опытных образцов способствуют формированию более высоких качественных показателей готового продукта.
Таким образом, в результате совместного проекта сотрудниками ВНИИМП, ИБФМ РАН и ИМГ РАН на основе рекомбинантного Pln создан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.
Рис. 7. Дендрограмма аминокислотных последовательностей N-концевых областей предшественников пептидаз семейства M4.
2.3. Структурная организация предшественников термолизинподобных протеаз Термолизинподобные протеазы (ТПП) - группа цинксодержащих металлоэндопептидаз, обнаруженных у десятков видов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а, кроме того, у микроскопических грибов и архей. ТПП, как и многие другие протеолитичекие ферменты, синтезируются в виде предшественников, которые включают дополнительные структурные элементы, отсутствующие в зрелых молекулах. Причем такие дополнительные последовательности могут быть локализованы как в N-, так и в C-концевой области предшественника.
Во многих случаях показано, что аминоконцевые регионы (АКР) предшественников содержат сигнальный пептид, обуславливающий секрецию ферментов из клетки, и пропоследовательность. Последняя, по крайней мере, у некоторых ферментов семейства, играет роль внутримолекулярного шаперона, который определяет сворачивание белка.
Кроме того, продемонстрировано, что прочасти ТПП способны ингибировать соответствующие зрелые белки, а также участвуют в их секреции. Карбоксиконцевые области предшественников ТПП, по-видимому, отвечают за связывание этих ферментов с различными нерастворимыми субстратами, хотя сведения на этот счет весьма ограничены.
Проведенные нами исследования, а также данные, опубликованные другими авторами, свидетельствуют, что пептидазы семейства M4 могут иметь несколько разных типов структурной организации предшественников. В данной работе впервые осуществлен систематический сравнительный анализ первичных структур полноразмерных предшественников ТПП.
2.3.1. Структура и функции N-концевых регионов предшественников Сравнение аминокислотных последовательностей показало, что по структуре АКР предшественников пептидазы семейства M4 делятся на две основные группы (рис. 7).
Первая группа включает 74 фермента, для которых характерны удаляемые в ходе созревания N-концевые регионы протяженностью 183-287 а.о. (далее длинные АКР). Все экспериментально охарактеризованные белки этой группы секретируются во внеклеточную среду и несут на N-конце предшественника типичные сигнальные пептиды, которые могут быть успешно идентифицированы существующими в настоящее время методами предсказания. За сигнальным пептидом у белков с длинными АКР расположена область, называемая пропоследовательностью, пропептидом или прочастью. Размер пропептидов составляет 162-264 а.о.
Для целого ряда термолизинподобных протеаз с длинными АКР показано, что пропоследовательности выступают в качестве так называемых внутримолекулярных шаперонов, без которых, как правило, невозможно формирование активного фермента. Кроме того, такие пропептиды действуют как ингибиторы зрелого белка. Причем, по-видимому, эта функция прочастей существенна in vivo для предотвращения преждевременного высвобождения активного фермента, которое может быть губительно для клетки. Наличие пропептидов, вероятно, также необходимо для секреции ТПП с длинными АКР. Важно отметить, что длинные пропептиды, как показано в ряде случаев, отщепляются автокаталитически и внутримолекулярно.
В структуре пропептидов ТПП с длинными АКР можно выделить две области, отличающиеся наибольшим консерватизмом. Первая область, которую мы обозначили как R-кластер, соответствует остаткам (-144)-(-106) в последовательности термолизина (Tln).
Вторая - D-кластер соответствует остаткам (-47)-(-16). Между R- и D-кластерами нами обнаружен консервативный остаток Ala(-83). Оба выявленных кластера соотносятся с консервативными областями, выделявшимися в пропоследовательностях протеаз семейства M4 ранее. R-кластер близок к FTP-мотиву (PFAM ID - PF07504). D-кластер является частью домена PepSY (PF03413). Необходимо подчеркнуть, что, хотя (по данным базы