Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
НИКИТИНА
Людмила Валериевна
ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
РАКА ЖЕЛУДКА
И
ПРЕДШЕСТВУЮЩИХ ПОРАЖЕНИЙ
14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва-2012
Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минзравсоцразвития России
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Доктор медицинских наук, профессор Шабалова Ирина Петровна
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Полонская Наталия Юрьевна | Доктор медицинских наук, ГБУЗ Городская поликлиника № 117 Департаментааздравоохранения г.аМосквы,азаведующая Централизованной межрайонной многопрофильной КДЛ |
Шапиро Наум Абрамович | Доктор медицинских наук, профессор, Центральная клиническая больница № 1 ОАО РЖД, руководитель цитологической лаборатории |
Ведущая организация:
ФГБУ НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург
Защита состоится л____________2012 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д 208.071.04 при ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минзравсоцразвития России по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО РМАПО Минзравсоцразвития России по адресу 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д.19.
Автореферат разослан л__________ 2012 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета Луговская Светлана Алексеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
По данным агентства по изучению рака IARC (International Agency for Research on Cancer) рак желудка (РЖ) по заболеваемости среди всей онкологической патологии занимает четвёртое место, а по смертности - второе (GLOBOCAN 2008, Lyon: IARC Press, 2008).
В нашей стране при высоком уровне заболеваемости только 5-10% новообразований желудка диагностируется на ранних стадиях. Удельный вес запущенных форм рака на протяжении многих лет составляет 22-25% без тенденции к снижению (Кашкин С.В, 2002; Тазалов В.А., Коваленко В.Л., 2006; Минздравсоцразвития РФ (Статистические материалы), 2011). Высокий уровень заболеваемости РЖ в России, преобладание случаев заболевания, выявленных в стадии распространенной опухоли, и как следствие неблагоприятные результаты лечения и прогноз определяют важность и необходимость своевременной диагностики РЖ. В связи с этим одним из важнейших направлений онкологической науки и практики является разработка концепции диагностики рака и этапов, предшествующих развитию злокачественных образований. Согласно гистологической классификации опухолей пищеварительной системы ВОЗ (Lyon, 2000) к предшествующим поражениям (precursor lesions) относят хронический атрофический гастрит, кишечную метаплазию, интраэпителиальную неоплазию (дисплазию), аденомы, семейный аденоматозный полипоз, фовеолярную гиперплазию, синдром Пейтц-Егерса.
Гистологическое исследование считают золотым стандартом морфологической диагностики, однако и этот метод может давать ложноотрицательные результаты (Валенкевич Л.Н., Яхонтова О.И, 2006; Черняховская Н.Е., Андреев В.Г., ПоваляеваА.В., 2008).
Цитологическое исследование также является полноценным методом морфологической верификации диагноза, но его не всегда включают в обследования больных с заболеваниями желудка.
Кроме того, существуют определенные ограничения цитологического метода, обусловленные способом получения материала, локализацией патологического очага, особенностями его гистологического строения, а также способностью врача-цитолога интерпретировать клеточный состав цитологического препарата.
Грамотное использование традиционных цитологических методов, разработка и внедрение новых диагностических технологий позволяет улучшить качество морфологической диагностики (ПетроваС.В., Райхлин Н.Т., 2005; Полонская Н.Ю., Егорова О.В., 2005; Шимчук С.Ф., 2005; Шапиро Н.А., Шибанова А.И., Елеубаева Ж.Б., 2011; Волченко Н.Н., Славнова Е.Н., Сухарев С.С., 2011). Большое значение в диагностике рака и предшествующих поражений приобретают молекулярно-биологические исследования, активно изучаются молекулярные маркеры, играющие роль в канцерогенезе (эпидермальный фактор роста, c-met, k-sam, цитокератины, ki-ras, p53, Bcl-2, COX-2, EPO-R, beta-catenin, E-cadherin, c-erbB-2 (HER-2/neu), CEA) и возможности определения их экспрессии в гистологических препаратах (Slesak B., Harlozinska A., 1998; Limaye A. et al., 2003; Sereno M. et al., 2006). Прогностическая значимость экспрессии онкопротеина c-erbB-2 (Her-2/neu) у пациентов с заболеванием желудка неоднозначна, однако есть результаты исследований, которые показали эффективность таргетной терапии при гиперэкспрессии c-erbB-2 (Her-2/neu) (HohlerаT. et al., 2010; Bang Y.J. et al., 2010; Albarello L., Pecciarini L., Doglioni C., 2011). Результаты определения CEA - раково-эмбрионального антигена (РЭА) на биоптатах показали их незначительную диагностическую значимость в диагностике рака желудка (Пасечников В.Д., Чуков С.З., Котелевец С.М., 2003).
Данных литературы по применению онкопротеинов c-erbB-2 (Her-2/neu) и CEA (РЭА) на цитологическом материале из слизистой оболочки желудка (СОЖ) в литературе мы не встретили. Возможно, это связано со сложностями выполнения иммуноцитохимических исследований на традиционных цитологических препаратах.
Перспективной технологией, позволяющей расширить возможности использования иммуноцитохимических реакций, является жидкостная цитология (ЖЦ). Клеточный материал равспределяется на предметном стекле в один слой, что снижает количество неполноценных мазков, а также ложноотрицательных результатов цитологического исследования (Савостикова М.В., 2010; Abulafia O.et al., 2003; Poller D. N., Stelow E. B., Yiangou C., 2008; Beerman H. et al., 2009). Использование тонкослойных микропрепаратов для иммуноцитохимических исследований (ИЦХИ) обладает рядом преимуществ перед традиционными мазками (Савостикова М.В., 2010; Шабалова И.П., 2010; Farnsworth A., 2003) Однако в доступной литературе мы не нашли сведений о ЖЦ на материале гастробиопсий.
Одним из новых направлений в клинической цитологии является метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ позволяет изучить структуру и разнообразные свойства поверхностей с разрешением порядка нескольких нанометров за несколько минут. При использовании АСМ получают трёхмерное изображение клеток и макромолекул на их поверхности. Методом АСМ можно исследовать как рутинные цитологические мазки, так и жидкостные монослойные препараты (Кирпичников М.П., 2006; Яковлева В.А. с соавт., 2007; Chernoff D.A., 2008).
Другое направление, способное оптимизировать цитологическую диагностику - информационные технологии, позволяющие правильно решить диагностические задачи, благодаря использованию опыта и базы знаний в определенной области (Шабалова И.П., 2002; Касоян К.Т., 2005; Джангирова Т.В., 2005; Никитаев В.Г., Бердникович Е.Ю., 2007; Toliva J., et al. 2006). Разработка этих направлений в применении к цитологической диагностике заболеваний желудка представляется весьма актуальной.
Цель исследования. Повышение эффективности цитологической диагностики поражений желудка на основе применения компьютерных программ, жидкостной цитологии, молекулярных технологий и атомно-силовой микроскопии.
Задачи исследования
- Сопоставление результатов цитологического и гистологического исследований биопсийного материала, анализ причин ошибочно поставленных диагнозов.
- Создание базы данных изображений цитологических препаратов при заболеваниях желудка.
- Выделение цитологических признаков рака желудка и предшествующих поражений для создания компьютерной интерактивной программы.
- Разработка технологических заданий и модулей для создания информационной системы поддержки принятия решений в цитологической диагностике поражений слизистой оболочки желудка.
- Оценка диагностической эффективности применения разработанной компьютерной системы с привлечением специалистов с разным опытом работы в цитологической диагностике заболеваний желудка.
- Анализ результатов применения жидкостной цитологии и иммуноцитохимических исследований на материале гастробиопсий.
- Изучение возможностей применения АСМ в дифференциальной диагностике заболеваний желудка.
Научная новизна
- На основе создания базы изображений и информационных модулей разработана компьютерная программа, обладающая свойствами интерактивного учебного пособия и компьютерного атласа по цитологической диагностике заболеваний желудка.
- Определена эффективность использования интерактивных программ в диагностике рака желудка и предшествующих поражений.
- Разработана методика приготовления препаратов методом жидкостной цитологии из материала со слизистой оболочки желудка.
- Выявлена целесообразность использования молекулярных маркеров на цитологическом материале из биоптата слизистой оболочки желудка.
- Установлены морфометрические параметры, позволяющие получить дополнительную информацию за счет применения атомно-силовой микроскопии цитологических отпечатков с биоптатов, полученных при гастроскопии.
Основные положения, выносимые на защиту
- Совместное применение цитологического и гистологического исследований позволяет оптимизировать цитологическую диагностику поражений СОЖ.
- Информационная система поддержки принятия решения способна улучшить цитологическую диагностику заболеваний желудка, может использоваться для обучения и повышения профессиональных навыков врачей-цитологов.
- Применение иммуноцитохимического исследования и АСМ дает дополнительную информацию при доброкачественных и злокачественных поражениях желудка.
Практическая значимость работы
- Цитологическое исследование отпечатков с биоптатов СОЖ позволяет получить дополнительную диагностическую информацию и повысить эффективность морфологического исследования при заболеваниях желудка. Эффективность исследования в выявлении рака желудка двумя морфологическими методами (гистологическим и цитологическим) с учетом повторных биопсий значительно повышается, на нашем материале она составила 97,9%.
- Разработанная интерактивная программа может использоваться как в обучении, так и в самостоятельной работе, диагностике, позволяет повысить эффективность цитологического исследования при заболеваниях желудка.
- Препараты, приготовленные методом жидкостной цитологии из биоптатов СОЖ, можно применять для ИЦХИ. Установлено значение определения c-erbB-2 (Her-2/neu) и CEACAM6 (РЭА) в материале из слизистой оболочки желудка.
- Получена возможность дополнительной дифференциально-диагностической информации при применении метода АСМ.
Реализация результатов исследования
Результаты работы включены в материалы лекций, практических и семинарских занятий по теме Цитологическая диагностика по материалу гастроскопий на кафедре ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России (г. Москва), кафедры клинической лабораторной диагностики КГБОУ ДПО ИПКСЗ МЗ Хабаровского края (г. Хабаровск). Результаты исследований внедрены в практику работы ГБУЗ КДЦ № 2 ДЗМ (г. Москва).
Апробация диссертации
Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития, сотрудников ФГБУ МНИОИ им. П.А. Герцена, ГКБ им. С.П. Боткина, ГУБЗ Консультативно-диагностического центра № 2 ДЗМ, ГУ Онкологического диспансера № 2 города Москвы 02.02.2012 г.
Результаты диссертации доложены на VIII съезде клинических цитологов России (г. Уфа, 2009 г.), 17 Международном конгрессе по цитологии (г. Эдинбург, 16-20 мая 2010 г.), Всероссийской конференции Лабораторные технологии при организации медицинской помощи (г. Москва, 26-27 мая 2010 г.), научно-практической конференции Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине (г.аМосква, 29-30 марта 2011 г.), Евразийском форуме по диагностике злокачественных новообразований (г. Киев, 9-10 июня 2011 г.), IX всероссийском съезде клинических цитологов (г. Казань, 19-21 ноября 2011 г.), 37 Европейском конгрессе по цитологии (г. Дубровник-Цавтат, 2012).
Публикации результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, изданных в отечественной (10) и зарубежной (2) печати, из них 4 работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы, иллюстрирована 82 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиографический указатель содержит 225 источника литературы (89 отечественных и 136 зарубежных публикаций).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали биопсийный материал, полученный при эндоскопическом исследовании от пациентов в КГБУЗ Краевая клиническая больница № 1 им. профессора С.И. Сергеева, г. Хабаровска, (главный врач С.С. Пудовиков); МУЗ Центральная районная больница г. Николаевска-на-Амуре (главный врач Г.С.аАбугов), ДВМОЦ ФМБА России, г. Николаевска-на-Амуре, (главный врач Г.Ю. Верёвкин); ГУБЗ Консультативно-диагностического центра № 2 ДЗМ, г. Москвы, (главный врач Б.М. Прощенский); ГУ Онкологического диспансера № 2, г. Москвы, (главный врач к.м.н. А.Ю. Федотов).
Атомно-силовую микроскопию проводили на базе ФГУ Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена. Работа по данному разделу выполнена в рамках Госконтракта № 16.513.11.3069 Разработка научных основ исследования объёмной ультраструктуры клеток средствами АСМ для уточнения диагноза и выработки плана лечения на различных этапах развития рака и других патологических состояний.
Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России (заведующий, д.м.н., профессор В.В. Долгов) (табл. 1).
Таблица 1
Разделы диссертационной работы
Раздел диссертационной (научной) работы | Число пациентов | Число исследований (изображений) |
Оценка эффективности цитологического исследования материала биопсии в диагностике рака желудка | 574 | 745 |
Создание системы поддержки принятия решений при цитологической диагностике заболеваний желудка | 186 | 1979 |
Метод ЖЦ и ИЦХИ | 75 | 171 |
Метод АСМ в цитологической диагностике поражений желудка | 30 | 900 |
Всего | 865 | 3795 |
Материал биопсии в морфологической диагностике
Для изучения информативности цитологического метода проведен ретроспективный анализ результатов 745 цитологических исследований отпечатков из материала, полученного при биопсии желудка у 574 пациентов с разной степенью поражения СОЖ. Отпечатки готовили из всех фрагментов, полученных с помощью щипцовой биопсии при фиброгастродуоденоскопии (ФГДС); после высушивания на воздухе мазки окрашивали по методу Романовского-Гимза. Цитологические препараты классифицировали как отрицательные, подозрительные, позитивные по наличию рака и неинформативные. Цитологический диагноз сравнивали с результатами гистологического исследования биоптатов.
Материал и методы для создания системы поддержки принятия решений по цитологической диагностике заболеваний желудка
Совместно с кафедрой компьютерные медицинские системы (зав. проф. Никитаев В.Г.) Научно-исследовательского ядерного университета Московского инженерно-физического института мы разработали компьютерную систему поддержки принятия решений (СППР).
В основу создания компьютерной системы поддержки принятия решений (СППР) положены результаты цитологического и гистологического исследования материала, полученного при ФГДС с помощью щипцовой биопсии у 186 пациентов.
Микрофотографии цитологических препаратов получали с помощью программно-аппаратного комплекса, состоящего из компьютера и системы ввода изображений. Для каждого из 186 пациентов с различными поражениями желудка было введено в компьютер от 10 до 28 цитологических изображений при разном увеличении (табл. 2).
Каждое наблюдение отнесено к одному из 20 типов цитологического заключения, использованных в базе данных. Нозологические формы для базы были взяты с учетом существующей гистологической классификации опухолей пищеварительной системы ВОЗ (Lyon, 2000).
Таблица 2
Доброкачественные и злокачественные поражения СОЖ, введенные в базу данных компьютерной информационной системы
Характер патологического процесса | Число наблюдений | Число изображений | |
Доброкачественные поражения | 69 | 699 | |
Предшествующие поражения | 47 | 429 | |
Злокачественные поражения | 70 | 851 | |
ВСЕГО | 186 | 1979 | |
Иммуноцитохимическое исследование на основе
жидкостной цитологии
Сравнивали качество препаратов, приготовленных традиционным методом и методом ЖЦ, пригодность их для ИЦХИ. Материал был получен у 75 пациентов с помощью прицельной щипцовой биопсии. С биоптатов делали отпечатки на стекло для традиционного цитологического исследования. У 40 больных помимо биоптата брали соскобы щёткой. У 21 пациента материал со щетки наносили на предметное стекло для цитологического исследования (традиционный способ приготовления цитологических препаратов со щетки). У 19 пациентов полученный материал со щётки смывали в стабилизирующий раствор для ЖЦ. У 35 пациентов брали второй биоптат из того же патологического очага и помещали его в стабилизирующий раствор.
Для фиксации, хранения, транспортировки клеточного материала и приготовления монослойных препаратов методом ЖЦ использовали стабилизирующий раствор CYTO-FAST Solution фирмы HOSPITEX DIAGNOSTICS. Стабилизирующий раствор разливали в пробирки типа Ependorff по 0,8 мл на каждый образец. Монослойные цитологические препараты готовили с помощью цитоцентрифуги Cytospin 4. Клеточный материал в объеме 100 мкл помещали в камеру для образца и центрифугировали 5 минут при скорости вращения ротора 1000 об/мин. Для оценки адекватности полученного материала один монослойный препарат окрашивали по Папаниколау. Критерием отбора монослойных препаратов для проведения иммуноцитохимического исследования было наличие в каждом из них клеток эпителия желудка в достаточном количестве (минимум 100 клеток) и их монослойное расположение. При соответствии препаратов данным критериям на оставшихся неокрашенных стеклах проводили ИЦХИ.
Для ИЦХИ использовали готовые антитела c-erbB-2 (Her-2/neu), CEACAM6 (РЭА) и систему визуализации Super Sensitive Polymer-HRP фирмы BIO CARE MEDICAL. ИЦХИ были проведены у 35 пациентов по соответствующему протоколу.
Метод атомно-силовой микроскопии в цитологической диагностике поражений желудка
Для АСМ использовали отпечатки с биоптатов слизистой оболочки желудка у 30 пациентов с различными поражениями желудка (гастрит, аденома и рак желудка), по 10 наблюдений каждой нозологической формы. Мазки окрашивали по методу Романовского-Гимза.
Изображения для морфометрических исследований вводили в компьютер при помощи исследовательского комплекса Интегра производства ЗАО НТ-МДТ, г. Зеленоград, Россия, состоящего из атомно-силового микроскопа и компьютера с программным обеспечением. Набор параметров для измерения (в нм) включал: толщину цитоплазмы, толщину ядра в области клетки, соотношение размеров ядра и цитоплазмы, толщину ядрышка.
В каждом наблюдении для получения достоверных статистических данных измеряли параметры 30 клеток в препарате (всего проанализировано 900 клеток).
Полученные цифровые данные о поверхности клетки при АСМ обрабатывали с помощью программ, входящих в состав программного комплекса Интегра. Различия между сравниваемыми величинами считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.
Методы статистического анализа
Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с помощью программы Excel-7.0. Чувствительность, специфичность, эффективность определяли по четырхпольной таблице. Различия между сравниваемыми величинами считались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценка эффективности цитологического исследования материала биопсии в выявлении рака желудка
Несовпадение результатов цитологического и гистологического исследования биоптатов при первичном обследовании больных отмечено в 24,2% наблюдений; 36% из них было связано с неинформативным гистологическим материалом (табл. 3). Если гистологическое заключение было положительным или отрицательным по злокачественному поражению, то в большинстве наблюдений его расценивали как окончательный морфологический диагноз. Если гистологический материал был неинформативным или отрицательным по раку при цитологическом диагнозе РЖ, у части пациентов выполняли повторные гастроскопии.
Таблица 3
Сопоставление гистологического и цитологического заключений по раку желудка
Гистологическое заключение | |||||
Цитологическое заключение | Отрицательное | Положительное | Неинформативный материал | Всего | |
Отрицательное | 327 | 9 | 23 | 359 | |
Положительное | 48 | 108 | 17 | 173 | |
Неинформативный материал | 26 | 6 | 10 | 42 | |
Всего | 401 | 123 | 50 | 574 | |
При повторной гастроскопии, выполненной у 21 из 82 пациентов с неинформативным материалом, у 11 больных диагностирован рак желудка, у 9 дано отрицательное по раку заключение и у одного вновь получен неинформативный материал. Повторное исследование выполнено также у 21 из 48 пациентов с положительными или предположительными по раку цитологическими заключениями и отрицательными гистологическими. У 12 из них выявлен рак, у 5 дано отрицательное по раку заключение, у 4 установлен цитологический диагноз рака.
Повторные исследования позволили внести коррективы в морфологический диагноз и пересмотреть результаты. При первичном однократном эндоскопическом исследовании чувствительность гистологического метода в выявлении РЖ составляла 86,7%, доля ложноотрицательных результатов - 13,3%, чувствительность цитологического метода - 92,3%, специфичность - 87,2%, доля ложноотрицательных цитологических диагнозов - 7,7%, а доля ложноположительныхЦ 12,8%.
При повторных исследованиях чувствительность гистологического исследования увеличилась до 95,9%, доля ложноотрицательных результатов уменьшилась до 4,1% Чувствительность цитологического исследования в выявлении злокачественного поражения увеличилась до 96,6%, специфичность до 94,8%, доля ложноположительных диагнозов уменьшилась до 5,2%, ложноотрицательных до 3,4%.
При совместном использовании двух морфологических методов значительно повысились и чувствительность и специфичность (98,7% и 99,6% соответственно), эффективность выявления РЖ составила 97,9%.
Таким образом, цитологическое исследование отпечатков с биоптатов желудка позволяет повысить эффективность в выявлении РЖ. Морфологическое заключение о неинформативном материале или лописательный ответ гистолога, а также отрицательное по раку гистологическое заключение у больных с цитологическим диагнозом рака, подозрения на рак или дисплазии является показанием к повторному эндоскопическому исследованию с более тщательным выбором участков для биопсий.
Создание системы поддержки принятия решений при цитологической диагностике заболеваний желудка
На основании опыта работы и анализа литературы были выделены критерии изменений в клетках при различных патологических состояниях желудка. С учётом этих критериев разработан словарь морфологических признаков для составления компьютерной программы. Словарь включает 12 признаков опухолей и неопухолевых заболеваний желудка. Признаки отражают характеристику структур по форме и расположению клеток, тип клеток, размер и форму клеток и ядер, наличие или отсутствие атипии, фон препарата, наличие Helicobacter pylori.
На основе разработки технологических заданий и модулей были созданы следующие режимы СППР:
- Режим просмотра информации по содержащимся в наблюдениям.
- Режим редактирования, добавления наблюдений и изображений к ним, графической разметки
- Режим поиска
- Аналитическая система.
С помощью СППР можно осуществлять последовательный просмотр всех изображений из базы данных, поиск изображений по заданным параметрам (морфологическим признакам, нозологическим формам или по их комбинациям), просмотр результатов поиска по заданному набору признаков.
В СППР предусмотрен режим просмотра изображения с увеличением выбранного участка. Это удобно в случае, когда необходимо детально рассмотреть какой-то участок, объект или клетку (рис. 1).
Рис. 1. Окно просмотра изображения с увеличением выбранного участка. | Рис. 2. Разметка выбранного признака. |
Для решения проблемы распознавания и правильного толкования цитологических признаков нами совместно с кафедрой компьютерные медицинские системы Научно-исследовательского ядерного университета Московского инженерно-физического института был разработан графический модуль для нанесения разметки на изображения, поясняющей указанные признаки (рис. 2). При выборе в описании какого-либо клеточного элемента или критерия цитологической диагностики появляется значок, акцентирующий внимание на конкретном признаке изображения. В СППР разработана аналитическая система, которая позволяет производить поиск по всем нозологическим формам.
СППР позволяет рассчитать наличие морфологического признака для одной или нескольких нозологических форм, помогает проанализировать присутствие признака или группы признаков при доброкачественном, злокачественном или пограничном поражениях желудка. Результат выводится в виде таблицы, где частота признака представлена в процентах и отсортирована по убыванию: от самого частого при данной нозологической форме до редкого. В программу заложена функция, которая позволяет провести анализ по всем морфологическим критериям, которые есть в СППР.
В апробации разработанной нами программы участвовали 23 врача с различным стажем работы в клинической цитологии, проходившие обучение на курсах повышения квалификации на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России.
Для оценки эффективности работы компьютерной программы использовали цитологические препараты, изображения которых не присутствовали в базе данных (10 наблюдений).
Результаты цитологического исследования до и после работы с СППР оценивали в сравнении с экспертными цитологическими заключениями и референтными гистологическими диагнозами. Установлено, что программа способна помочь в установлении верного цитологического заключения (рис. 3).
Рис. 3. Изменение цитологических заключений после работы с СППР: 1 - совпадение с экспертным заключением; 2 - неполное, неточное заключение; 3 - несовпадение с экспертным заключением; 4 - затруднение в постановке диагноза.
До работы с СППР в 56 наблюдениях из 230 результаты совпали с диагнозом эксперта, у 174 отмечено несовпадение результатов или неполное заключение. После работы с программой число совпадений диагнозов увеличилось до 177 наблюдений, а число неправильных заключений уменьшилось до 53. До работы с СППР по 33 препаратам врачи затруднялись с постановкой цитологического диагноза, после - заключение было установлено во всех наблюдениях.
Таким образом, после работы с СППР результаты цитологического исследования улучшились на 61,3%, остались без динамики в 33,48% и ухудшение результата цитологической диагностики отмечено в 5,22% (р<0,001). Улучшение результатов исследования было максимальным при кишечной метаплазии и аденокарциноме: на 25,2% и 24,3% соответственно (р<0,0001). У врачей без опыта работы с материалом гастробиопсий или со стажем до 1 года диагностика улучшилась на 61,67%, у более опытных коллег на 45%; отрицательная динамика в цитологических заключениях отмечена в 5,83% и 3,1% соответственно (р<0,001).
Метод жидкостной цитологии и иммуноцитохимическое исследование
Нами было проанализировано качество цитологического материала, полученного с помощью отпечатков с биоптата и взятого эндоскопической щёткой (табл. 4).
Таблица 4
Сравнение качества цитологического материала со слизистой оболочки желудка, полученного различными методами
Метод получения цитологического препарата | Неинформативный материал | Информативный материал | Всего |
Традиционный метод - мазок со щётки на предметное стекло | 20 | 1 | 21 |
Методы ЖЦ | |||
- смыв со щётки в раствор Cytoscreen | 17 | 2 | 19 |
- смыв с биоптата в раствор Cytoscreen | 21 | - | 21 |
- гомогенизация биоптата в растворе Cytoscreen | - | 35 | 35 |
Мазки-отпечатки с биоптата | - | 75 | 75 |
ВСЕГО | 58 | 113 | 171 |
В 37 из 40 наблюдений материал, полученный с помощью щетки, был неинформативным: в цитологических препаратах присутствовали только клетки плоского эпителия обычного строения или с дегенеративными изменениями, кокковая флора, неизмененные эритроциты и единичные клетки покровно-ямочного эпителия. При традиционном приготовлении препаратов (материал со щетки переносили сразу на стекло) неинформативный материал был получен в 20 наблюдениях, при использовании ЖЦ (клеточный материал смывали со щетки в стабилизирующий раствор) - в 17. Цитологические препараты, полученные при помощи эндоскопической щетки и приготовленные как традиционным методом, так и методом ЖЦ, не отвечали искомым требованиям; достоверных различий между эффективностью методов не установлено (р>0,05). Отпечатки с биоптата оказались более информативными, чем соскобы, взятые щеткой, независимо от их дальнейшей обработки (р<0,001).
На следующем этапе работы предпринята попытка разработать оптимальный метод использования биоптата из СОЖ для ЖЦ. Было выбрано два возможных способа использования биоптата. У 21 пациента биоптат помещали в стабилизирующий раствор и с поверхности перед погружением в формалин смывали клетки с поверхности биоптата путём перемешивания, затем погружали в формалин для последующего гистологического исследования. У 35 пациентов биоптат помещали в стабилизирующий раствор и гомогенизировали его путем растирания. Далее из полученной суспензии готовили препараты методом ЖЦ.
При смыве клеточного материала с биоптата в стабилизирующий раствор во всех наблюдениях был получен неинформативный материал. Во всех наблюдениях, в которых выполняли гомогенизацию биоптата, получен полноценный материал. Различие между двумя способами обработки биоптата статистически достоверное (р<0,001). Таким образом, препараты, приготовленные методом ЖЦ после гомогенизации биоптата, оказались наиболее пригодными для ИЦХИ.
В связи с тем, что удовлетворительные монослойные препараты удалось получить только при гомогенизации биоптата 35 пациентов, ИЦХИ проводили только у этих пациентов (рисунок 4, 5, табл. 5).
Рис.4. Аденокарцинома с участками слизистого рака. Мембранная экспрессия c-erbB-2 (Her-2/neu) , х1000. | Рис.5. Тубуловорсинчатая аденома с малигнизацией. Клетки покровно-ямочного эпителия с положительной цитоплазматической реакцией на CEACAM6-ИЦХ, х1000. |
Таблица 5
Результаты иммуноцитохимического исследования цитологического материала из биоптата слизистой оболочки желудка
Гистологическое исследование | Цитологическое исследование | экспрессия c-erbB-2 (Her-2/neu) | экспрессия CEACAM6 | Число наблюдений | ||||||
- | + | ++ | +++ | - | + | ++ | +++ | |||
Доброкачественные поражения | Пролиферация покровно-ямочного эпителия | 7 | - | 2 | - | 3 | 2 | 3 | 1 | 9 |
Аденома, атрофический гастрит, кишечная метаплазия | Пролиферация покровно-ямочного эпителия с кишечной метаплазией | 7 | 9 | 1 | - | 4 | 3 | 8 | 2 | 17 |
Дисплазия, рак | Дисплазия, рак | 1 | - | 7 | 1 | - | - | 1 | 8 | 9 |
Всего | 15 | 9 | 10 | 1 | 7 | 5 | 12 | 11 | 35 | |
- нет экспрессии (отсутствие экспрессии или экспрессия в <5% клеток)
+ слабая экспрессия (экспрессия в 6-25% клеток)
++ умеренная экспрессия (экспрессия 26-75% клеток)
+++ выраженная экспрессия (экспрессия в >75% клеток)
Исходя из полученных нами данных, порогом чувствительности экспрессии c-erbB-2 (Her-2/neu) в диагностике дисплазии и рака желудка можно считать наличие умеренной экспрессии, порогом чувствительности CEACAM6 - выраженной экспрессии.
Следовательно, умеренная и выраженная экспрессия может рассматриваться как маркёр возможной тяжёлой дисплазии, рака или как начальный этап неопластического процесса.
Цитологическая диагностика поражений желудка
методом атомно-силовой микроскопии
Проведены морфометрические измерения характеристик клеток покровно-ямочного эпителия (ПЯЭ) на изображениях цитологических препаратов отпечатков с биоптата слизистой оболочки желудка, полученных методом АСМ в 30 наблюдениях: 10 - доброкачественных поражений желудка (хронический гастрит разной этиологии), (рис. 6), 10 - предшествующей патологии (аденома) (рис. 7) и 10 - злокачественных поражений (аденокарцинома, перстневидноклеточный рак) (рис. 8).
А. | Б. | ||||
Рис. 6. Хронический гастрит. А - АСМ изображение. Б - Изображение с цитологического препарата, структура из клеток покровно-ямочного эпителия с дегенеративными изменениями. Окрашивание по Романовскому-Гимза, х 1000. | |||||
А. | Б. | ||||
Рис. 7. Аденома желудка. А - АСМ изображение клеток. Б - Веерообразная структура из клеток, характерная для аденомы. Окрашивание по Романовскому-Гимза, х 1000. | |||||
| А. | Б. | ||||
Рис. 8. Перстневидноклеточный рак. А - АСМ изображение клетки перстневидноклеточного рака. Б - Клетки рака перстневидной формы. Окрашивание по Романовскому-Гимза, х 1000. | |||||
Определён набор значений из 4 морфометрических характеристик для клеток при гастрите, аденоме и раке, даны количественные характеристики (таблица 6).
Таблица 6
Параметры клеток при раке желудка, полипе желудка и гастрите, полученные методом АСМ
Вид клетки | Толщина цитоплазмы над подложкой, нм | Толщина ядра над подложкой, нм | Соотношение размеров ядра и цитоплазмы | Толщина ядрышка над подложкой |
Клетки рака желудка | 39512 | 73615 | 2,490,07* | 119622 |
Клетки аденомы | 3198 | 50814 | 1,570,01 | 2951 |
Клетки при гастрите | 2434 | 4705 | 2,080,02* | Ц |
*- р<0,05
При гастрите в клетках эпителия хорошо определялась сглаженность микрорельефа ядер, контуры ядра и цитоплазмы были ровными. В клетках рака отмечали грубый микрорельеф поверхности ядер, ядрышки хорошо просматривались в виде локальных возвышений поверхности ядра, ядерно-цитоплазменное соотношение было сдвинуто в сторону ядра, контуры ядра и цитоплазмы неровные. Для клеток при аденоме и раке по сравнению с клетками при гастрите характерно статистически значимое увеличение соотношения высоты ядра и цитоплазмы.
Таким образом, проведенные предварительные исследования морфофункциональных особенностей поражений желудка с использованием АСМ, позволили получить данные, представляющие определенный интерес для продолжения работы.
Выводы
- Эффективность морфологической диагностики рака и предшествующих поражений желудка при сочетании гистологического и цитологического исследования с учетом повторных биопсий составила 97,9%. Расхождение результатов двух морфологических методов при первичном обследовании больных выявлено в 24,2% наблюдений. Установлено, что 36% несовпадений связано с неинформативным гистологическим материалом, 4,1% с ложноотрицательным по раку гистологическим заключением.
- Разработанная компьютерная система поддержки принятия решений обладает свойствами интерактивного учебно-диагностического пособия и компьютерного атласа по цитологической диагностике заболеваний желудка.
- Использование системы поддержки принятия решения позволяет выделять основные морфологические признаки при доброкачественном, злокачественном или пограничных состояниях, рассчитывать вероятность верификации патологического процесса по выбранным признакам, осуществлять поиск изображений по заданным параметрам, правильно интерпретировать признаки или их сочетание.
- Установлена эффективность использования системы поддержки принятия решений в цитологической диагностике рака и предшествующих поражений желудка. Диагноз, установленный врачами после работы с программой, в 61,3% наблюдений изменился на правильный; изменение диагноза на неправильный отмечено лишь в 5,22% (р<0,001). Улучшение результатов исследования было максимальным при кишечной метаплазии и аденокарциноме: на 25,2% и 24,3% соответственно (р<0,0001).
- Приготовление препаратов для иммуноцитохимического исследования методом жидкостной цитологии после гомогенизации биоптата в стабилизирующем растворе позволяет получить материал с максимальной по сравнению с другими методами диагностической информативностью (p<0,001).
- Определена информативность иммуноцитохимического исследования материала гастробиопсий: умеренная или выраженная экспрессия c-erbB-2 (Her-2/neu) при аденокарциноме и тяжелой дисплазии и менее специфичная экспрессия CEACAM6, отмеченная как при раке желудка, так и при выраженной пролиферации эпителия и других предшествующих поражениях.
- Метод атомно-силовой микроскопии позволяет получить дополнительные объективные морфометрические параметры. Для клеток при аденоме и раке по сравнению с реактивно-измененным покровно-ямочным эпителием характерно статистически значимое увеличение толщины ядра и цитоплазмы (р<0,05).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Информационная система в цитологической диагностике поражений органов пищеварительной системы / И.П. Шабалова, Т.В. Джангирова, Л.В Никитина, В.Г.аНикитаев, Е.Ю.аБердникович, А.Н. Проничев, Н.С. Таврина // Сборник научных трудов. - Научная сессия МИФИ-2007. -Том-1. - С. 273.
- Интерактивная информационная система в цитологической диагностике заболеваний желудка, толстой и прямой кишки / И.П. Шабалова, Т.В. Джангирова, К.Т. Касоян, С.Г. Дзуцева, Л.В. Никитина // Новости клинической цитологии. - 2009. - т.13 №3-4. - С. 56.
- Interactive computerized systems in cytopathlogy: teaching and practice / I. Shabalova, V. Dolgov, N. Petrovichev, V. Nekitajev, E.аBerdnikovich, A. Pronichev, T. Dzangirova, K. Kasojan, L.аNikitina, S. Dzutseva // Acta Cytologica. - 2010. - Vol. 54 - №а3. - P. 527.
- Рак желудка: факторы риска, диагностики рака и предшествующих поражений / Л.В. Никитина // Дальневосточный медицинский журнал.- 2010. - №1. Ц С. 122-127.
- Жидкостная цитология с использованием молекулярных исследований / И.П. Шабалова, Г.Н. Минкина, Т.В. Джангирова, О.Ю. Шипулина, Е.С. Суховская, Л.В. Никитина, Д.О. Козлов // Евразийский форум по диагностике злокачественных новообразований: Материалы докладов. - Киев, 2011. - С. 17
- Оценка методов приготовления цитологических препаратов из гастробиопсийного материала / В.И. Зюкина, Н.А. Грановская, А.В. Борисов, Л.В. Никитина // Новости клинической цитологии России: 2011. - т.15, №1-2.Ц С .58-59.
- Жидкостная цитология: возможности, ограничения, перспективы / И.П. Шабалова, К.Т. Касоян, Т.В. Джангирова, Е.В. Суховская, Л.В. Никитина, Д.О. Козлов // Новости клинической цитологии России:, 2011. -.15 №1-2. - С. 76-77.
- Значение цитологического исследования материала биопсии для выявления рака желудка / И.П. Шабалова, Л.В.аНикитина // Лаборатория. - 2011. - №4. - С. 6-8.
- Стандартизованная аналитическая технология метод жидкостной цитологии (проект) / И.П. Шабалова, Т.В. Джангирова, .В. Никитина, Н.Н. Волченко, М.В. Савостикова, .М. Пименова, И.Н. Костючек, И.В. Назарова, Г.В. ешкина // Проблемы стандартизации в здравоохранении: 2012. -№ 5-6. - С. 48-58.
- Цитологический метод в диагностике рака желудка / .В. Никитина // Российский Биомедицинский журнал Medline.ru: 2012. Ц Т. 13, ст.11. Ц С. 124-134.
- Иммуноцитохимические исследования и жидкостная цитология в диагностике поражений желудка / .В. Никитина, И.П. Шабалова, К.Т. Касоян // Российский Биомедицинский журнал Medline.ru: 2012. Ц Т. 13, ст.12. Ц С. 135-145.
- Computerized system in exposing of gastric lesions / L. Nikitina, I. Shabalova, K. Kasoyan, T. Dzangirova // Cytopathology: 2012. - Vol. 23 - Supp 1. - P. 352.
Список сокращений
АСМ | атомно-силовая микроскопия |
ЖЦ | жидкостная цитология |
ПЯЭ | покровно-ямочный эпителий |
РЖ | рак желудка |
РЭА | раково-эмбриональный антиген |
СОЖ | слизистая оболочка желудка |
СППР | система поддержки принятия решений |
ФГДС | фиброгастродуоденоскопия |
IARC | International Agency for Research on Cancer |
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине