Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное  

 

  на правах  рукописи

КАЗУБСКАЯ ТАТЬЯНА ПАВЛОВНА

Генетические основы этиологической

гетерогенности злокачественных новообразований

14.01.12 - онкология

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2010 г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук, онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН

(Директор академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)

 

Научные консультанты:  доктор медицинских наук, профессор 

Раиса Федоровна Гарькавцева,

доктор медицинских наук, профессор,

Владимир Юрьевич Сельчук.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

  Петр Васильевич Новиков,

  член-корреспондент РАМН,

  доктор медицинских наук, профессор

  Николай Евгеньевич Кушлинский,

  доктор медицинских наук, профессор

  Валентин Сергеевич Мазурин.

Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия постдипломного образования Минзравсоцразвития России

Защита диссертации состоится л  2010 года  в  часов  на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02.) по адресу:115478 Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан л   2010г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор медицинских наук, профессор  Ю.А.Барсуков

Общая характеристика работы  н 

Актуальность темы. 

Интерес клиницистов к роли генетинчеснких факторов, как первичных факнтонров риска в этиологии рака понвыншался с последонвантельнными открынтиями гернминнальнных мутаций генов Rb, BRCA1/2, RET, ассоциированных с ранзвинтинем ретинонбланснтомы (Friend SH. et al.,1986, Lee WH.et al.,1987), рака молочнной женлезы (Woнoster R. at al.,1994, Ford D. at al.1994), синдромов  множестнвенннннных энндонкнриннных неоплазий 2 типа (МЭН2) (Takahashi M.еt al.,1985). Иннтеннрес стал более интенсивным, когда выяснилось, что анализ клининчеснкой карннтины болензни, выявление связи между клининчеснкинми проявлениянми занбонлевания и лежащими в их основе молекулянрнными поврежденниями, отнкнрынваннют вознможнности идентинфинканции новых форм болезнни и установления принчин их возникнонвенния, что может привести к более наценленному изменению ранкового контнронля и таргетнной терапии. 

С генентичеснкой точки зрения главной особенностью неоплазий является клинический полиморфизм и генетическая гетеронгенннонсть, а для так назынванемых мультифакториальных злокачественных опухолей - сунщенствонванние их нанследственных и ненаследственных форм без четких гранниц. Проблема генненннтичеснкой гетерогенности нанследственных форм опухолей занимает важное место, поскольку кажущееся фенонтипиченски однородным, генетически гетенрогенное заболевание, может включать в себя несколько клинически, генетинчески и бионхимически самостоятельных форм (Гинтер Е.К.,2001). Анализ клининчесннкой картины болезни (фенотипа) и выявление взаимосвязи между генотипом и фенотипом, пренндонставляет возможность установить не только какие генетинченснкние изменненннния лежат в основе формирования предрасполонженности к неонплазии, но и разработать стратегию формирования прицельно однороднных групп риска, опнтимизинронвать процедуру проведения ДНК-ананлиза. Изунчение особеннностей проявления неоплазий и причин, которые их форнминрунют, являнется одним из важнейших направлений в мединциннне вообще и клининчеснкой генентике в частности, и лежит в основе успешной диагнноснтинки и мединко-генентического консультирования больных и их семей.

Указанные осонбеннности характерны и для рака щитовиндной железы (РЩЖ), меланномы кожи (МК) и первично-множественнных злокачестнвенных опухолей (ПМЗО). Имеюнщниеся на сегоднняшний день работы, посвященные гетерогеннности этих форм опухолей, не имели сиснтемнного подхода и огранинчинвались областью профессионнальнных интеренсов (монлекулярно-генетичеснкинми изученниями отдельных нозонлогичеснких форм неонпнлазий). Однако недонснтанннточная изученннонсть отдельнных генетинческих вариантов злокачественных опунхонлей может привести к тому, что в рамках одной нозонлонгинчеснкой формы рака, монгут раснсматнриваться занбонленвания с различнной генентинченской принрондой и различными патогенетическими механизмами развития.

Пронбнлема своевременнного выявления РЩЖ, МК, ПМЗО закнлюнчается не только в беснсимптомном развитии, но и в отнсутствии нандежнных марнкеров, способствующих их раннему выявлению. Наряду с этим, пернвично-мноннжеснтнвеннные опухоли предстнанвнляет собой особую диагнноснтиченснкую пронбнлему. Изунннченния, прицельно направнленннные на выявление спенцинфиннческих принзнаков, котонрые могли бы у пациеннтов увеличивать риск проявнленнния вторых первичнных раков, являются актунанльнными с клинической и биолонгической точек зренния. Значение проблемы возрастает еще и в связи с неуклонным ростом заболенванемости и  смертнности от этих новонобразований (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). В этой связи осонбое значение имеет иденнтификанция нанснледнстнвеннных форм РЩЖ, МК, ПМЗО, разработка стратегии преодонления генентинческой гетеронгеннонсти с иснпольнзованием биологических паранметров на клининчеснком, геннетиченском и моленкунннлянрнном уровнях, которая познвонлит иденнтифициронвать семьи со схонднными клиническими признаками. При этом активннное выявнленние даже относительно небольшого числа случаев злонкачеснтвенннных новонобнранзований среди практинчеснки здоровых родственников из сенмей больных этими забонленваниями монжет рассматриваться как важная наунчно-практинчеснкая задача.

И хотя оценка геннентичеснких параметров наснледнстнвенных форм опухолей затнруднена, решенние этих вопросов имеет первонснтенннпенное значение для разнработки прогнрамнмы клинико-генетической динангннонстики, профинлактики (в том числе и преннантаннльной) и патогенетически оринентированной терапии. Все эти вопросы планнинровались и разработаны на монденли  рака щитовидной женлензы, меланомы кожи, перннвичнно множестнвенных злонканченснтвенных опухонлях. 

Цель и задачи исследования.

Цель работы: определить роль наследственных факторов в этиолонгии рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично множестнвенных злокачестнвенных опухолей, выделить генетически детерминнированнннные формы этих заболеваний, изучить их генетическую гетерогеннность, разнработать тактику медико-генетического консультинронвания при разных их ванринантах.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить размах вариабельности клинико-генетического проявления рака щитовидной железы (РЩЖ) меланомы кожи (МК) и первично множестнвеннных злокачественных опухолей (ПМЗО).

2. Определить фенотипические и генетические корреляции различных  фонрм опухолей в семьях больных РЩЖ, МК и ПМЗО.

3.  Изучить клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности РЩЖ, МК и ПМЗО.

3.1  Изучить частоту и спектр молекулярных изменений при медуллярном РЩЖ (МРЩЖ).

3.2  Определить частоту и спектр повреждений некоторых участков хромонсом в клетках крови больных МК и диспластических невусов (ДН).

3.3  Изучить молекулярно-генетические и эпигенетические изменения гена р16/CDKN2A в образцах опухолей МК.

3.4  Оценить значимость биологических микрочипов в диагностике генрнминнальных мутаций генов BRCA1,2 и CHEK2 у больных первично множенснтвеннным раком с поражением яичников.

3.5  Изучить статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: RASSF1A, RAR2, SEMA3B, опреденлить их значение в молекулярном патонгеннезе и диагностинке солитарного и первично мнонжеснтвенного рака молочной железы и яичников.

4. Установить структуру и соотношение генетически детерминированнных форм РЩЖ, МК и ПМЗО.

5. Разработать основные приннципы медико-генетичеснкого консультированния семей РЩЖ, МК и ПМЗО.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые на основе комплексного клинико-генетического и молекулярно- биологического изучения больных раком щитовидной желензы, меланомой кожи и первично множественными злонкачественными опухолями выявлены основные клинико-генетические особенности этих заболеваний. Расширены представления о генетической гентенронгенности (алнлельного или локусного пронисхождения) РЩЖ, МК, ПМЗО, определена структура и соотношение их генетически детерминированнных форм, разработаны критенрии для вынделения генетически самоснтоннятельных вариантов.

  Показано, что молекулярнной основой МЭН2 являются мутации в гене RET, установлена четкая ассоциация мунтанций в этом гене с синдромами множестнвенных эндокринных неоплазий 2 типа, определен спектр его мутаций, обнанружены новые мутации гена RET у роснсийских больных, что позволяет раснширить спектр мутаций, который можно рекомендонвать для рутинного лабонраторного анализа. Установлено, что принчиной клининческого понлиннморнфинзма медуллярного РЩЖ является разное положение точконвой мутации в одном из циснтенинннонвых кодонов гена RET, обнаружинвая алленльннную гетерогеннность этого занболевания. Впервые в стране по  результантам ДНК-диагноснтики мендунллярного РЩЖ пронвендено пронфилакнтинчеснкое удаление щитовиднной желензы, вненднрена в пранкнтинку пренантанльнная  диагнноснтика этого  заболеванния. ннннннн Разработана комплексная программа выявнленния лиц предрасположеннных к развитию МРЩЖ, позвонляющая не только утончннить индивидуальный генентический диагноз, дать более точный прогнноз тенченния заболевания, но и осунщеннстнвить своевременные лечебно-профилактинческие меропринятия, направнленнные на предотвращение развития этой опухоли. н  ннн 

Выявлено наличие характерных для МК и ДН генетических и эпигенетинчеснких нарушений. У индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей диспласнтинческих невусов в трех участках коронтнкого плеча хромосомы 1-1р22,1р31, 1р32 наблюдается общннонсть в инндивиндунальном распренденленнии ранзрывов и отличается от нормы с высонкой достонвернностью, что ассоциинруется с локальнной хромонсомннной нестанбинльностью и является ранним событием в цепи изнменнннений, предшествующих МК. Аномальное метилирование пронмоторного райнона гена CDKN2A является неслучайным изменением у больных МК и вынявляется у всех больных ПМЗО с поражением МК. 

  С использованнием технологии олигонукнлеонтидных биончипов показано, что частота наиболее распространенных герминальных мутанций в гене BRCA1 у больнных ПМЗО с поражением яичнинков выявнлянется в 53% случаев.

  Впервые проведено определение статуса метилирования СрG-островков геннов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолевых и нормальных тканях молончнной железы, яичников больных первично множественными опухолями, больнных сонлитарным РМЖ и РЯ и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Показана высокая частота аномального метилирования промоторнных районов этих генов в тканях больных ПМЗО с поражением молочной женлезы и яичнинков и солитарных РМЖ и РЯ, с частотами от 30% до 90%. Впервые показано, что бонльные с аномальным метилиронванием генов RASSF1A, RAR2 могут иметь тенденцию к первично множественнному поранжению РМЖ и РЯ. Выянвннлена доснтоверная положительная корреляция часнтонты метинлирования генов RAR2 и SEMA3B со стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ. Понканнзанно, что аномальнное метилирование промоторной области гена RASSF1A можнно обнанрунжить на доклинической стадии развития этих опухолей, что позвонляет реконмендовать их в качестве молекулярных маркенров диагностики и прогноза этих заболеваний и свидетельнснтвует о больших возможностях ментилирования ДНК для разработок неинванзивнной диагноснтики рака.

Внедрение в практику.

Результаты исследования внедрены и используются в клинической практике различных подразделений РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Апробация работы. 

  Материалы диссертации представлены и обсуждены на Российснких онконлогинчесннких конгрессах:VII,X,XI,XII (Москва 2003, 2006-2008 г.); научно-праннкнтинчеснкой конференции "Пробнленмы онконгенентики: научнные и принкланднные аснпекнты", Украина, Киев, 2002; Conference on Frontiers in Canнcer Prevention Reнsearch (USA, Boston, 2002), научно-практической конференнции НИИ оннконлогии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2003); Conference on Frontiers in Cancer Preнvenнtion Research (Toronto, 2003); Human Genome MeetingУHGM'99Ф( Scotнland, Edinburgh, 2001); 28th Meeting of the Federation of Euroнpean Biocнhemica Sociнeties (Turkey, Istanbul, 2002); Российской конференции по онкогинеконлонгии (Москва, 2009); European School of Oncoloнgy УМеланонмаФ (Москва 1995), УThyнroid cancerФ (Moscow, 2004); cъезде онкологов реснпунблики Казахстан (Алма-Ата, 2003); I Всероссийнском съезде онкологов Совнременнные техннонлогии в онколонгии (Ростов-на-Донну, 2005); IV съезде онконлогов и радионлонгов СНГ (Баку, 2006);  коннференннции с межндуннародным учанснтием "Генетика в Роснсии и мире" (Москнва, 2006); 30th Conference of American Society of Preнventive Oncology (USA, Bethesda, 2006); 4-й Российской коннференции по фуннданментальной онкологии УПетнровские ЧтенияФ, (Санкт-Петербург, 2008); 19th Internatiнonal Congнress on Anti Cancer Treatment (ICACT) (Paris, France, 2008); III коннгрессе с междуннародным участием Опунхоли головы и шеи, (Сочи, 2009); II Роснсинйском симпозиуме Моленкулярнно-геннентическая диагнностика злокачеснтнвенных опухолей человека (Москва, 2009).

Апробация работы состоялась 11 декабря  2009 года на совместной научной конференции с участием лаборатории клинической онкогенетики, отделения биотерапии опухолей, отделения гинекологичеснкого, отденленния опухолей молочных желез, проктологического отделения, отдела опухонлей головы и шеи НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН; а также кафедры генетики и кафедры онкологии факультета послендинпломного образования Московского государственного медико-стонмантолонгинческого университета Министерства здравоохранения и социального развинтия.

  По теме диссертации опубликовано 83 печатных работы в российских и занрубежных журналах, из них - 36 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, 3 работы оформлены как главы в справочниках и учебных пособий.

Структура и объем диссертации.  Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литерантуры, материалов и методов, трех глав собственных результатов исследонвания и их обсуждения, выводов, списка литературы, который содержит 22  отечественных и 290 зарубежных источников. Работа илнлюстнрирована 39 таблицами, 2 графиками, 52 рисунками.

Материалы и методы исследования.

В  НИИКО РОНЦ им.Н.Н.Блонхина РАМН за 1988-2008 годы сформирован канннцер-ренгистр лаборатории клинической онкогенетики, cтавший оснонвой исннннслендуемой выборки, объем которой составил 1495 больнных и 8700 их роднстнвеннников 1-2-й степени родснтва. Из них 208 больных РЩЖ (140 папилнлярнным и фолнлинкулярным РЩЖ и 68 больнных медунлнлярнным РЩЖ), 460 бонльнных МК, 400 больных ПМЗО, жителей Москвы и облансти. Каждая семья ренгистриронванлась через одного члена семьи, т.е. путем одиннончннного отбора.  Особое внинмание уденлялось подтверждению диагноза онколонгиннчеснконго занболевания у ронднственннинков I степени родства: родителей, сибсов (братьнев и сестер),  дентей,  которые затем включались в дальнейший анализ. н н н  н  н  н  н 

В анализе испольнзонвались клинические, эпидемиологические, клиннниннко-генннеанлоннгичеснкие, цитонгеннетинческие, молекунлярно-генетические, генненнтико-мантенматинченснкие методы иснследования. У всех пацинентов было полунчено инфорнминрованное согласие об участии в исслендованинях. Все случаи рака классифинциронваны по TNM согласно требованиям Международного противоракового сонюза (UICC, версия 1989 г.) 

В качестве контроля использовались популяционные частоты распростнранненнности разнличных злокачественных новообразований, которые  были вынчиснлены по данным учетнных форм № 090/V поснтунпивнших из всех районных онконлогических отделений г. Москвы в отдел медицинской статистики МГОД. Даннные о половозраснтном составе насенления г. Москвы в изучаенмый перинод бынли получены в Московском городском статистическом упранвленнии. Поканзатели заболенваемости были стандартинзованы по возрасту прянмым методом с испольнзонванием мирового стандарта возрастного распреденленния населения.

  Идентификация наследственных синднромов проводилась в соответствии с уснтанновленными междуннароднными критериями для каждого из них.

  Изучение распнронстнранненности ДН в г. Москве проводилось на основании резульнтатов осмотра 509 человек, случайно отобраннного континнгеннта взроснлого насенления. Для поиска специфических опухолевых ассоцинаций в семьях больных МК исннпольнзованлись клинико-генеалогические данные, включавшие 98 челонвек именнюнщих на коже мнонжеснтвенные меланоцитарные невусы и их 259 родстнвеннников 1-й стенпени родства и 22 человека с мнонжественными невусами, отонбнранных при осмотре 247 близких родственнников из семей 91 больнного с гиснтонлонгинчески подтвержденным диангннозом МК. Каждый пацинент-носитель множественных ненвусов получил леченние и наблюндался от 5 до 18 лет в клиннических отделеннинях РОНЦ в пенринод с 1988 по 2005 г. В качеснтнве контрольнных групп слунжили 2 вынборки: одна из них состояла из 1001 болньного с гиснтонлонгически подтвержнденнным диагнонзом - рак желудка и 3793 их родстнвеннника 1-й стенпени роднства; втонрая включала 1048 клининчески здонровых лиц, не имевнших злоканчественных опунхолей и их 4654 родстнвенника 1-й степени родства также собнраннных среди моснковского населения в период с 1985 по 2003 годы. Все анализирунемые групнпы были подобраны по полу и вонзнрасту и были жителями Москвы и Московнснкой области.

  Молекулярные исследования, ДНК-диагнноснтика наличия точконвых мутанций в протононнконнгене RET проводилась на базе Медико-генетинчеснкого научнного центнра РАМН совместно с лабонраторией молекунлярной генетики и клиннникой Гамнбургнского унинверсинтета. Материалом для исследонваний служинла ДНК пацинентов медунлнлярным РЩЖ находившиеся в РОНЦ им.Н.Н.Блохинна РАМН с 1998 по 2007г. Геномную ДНК выделяли из лимнфоцитов перифенрической крови, обнразнцов опунхонленвых и нормальнных тканней щиннтоннвидной железы (кусочки или гиснтолонгические срезы) и испольнзовали в качестве матринцы для ПЦР-ампнлинфинканции экзонов гена RET.

Цитогенетическое изучение наиболее частых перестроек встречающихся при МК, вклюннчаюнщих в себя сайты повыншенннной ломкости хронмонсом(СПЛХ), конститунтинвные (кСПЛХ) или fragile sites пронвондили на G-окраншенных ментаннфазных пластинах лимфонцинтов периферинченской крови, кульнтинвируемых по стандартной метондике, проводилось совместно с лабораторией цитогенетики в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. МолекулярноЦгенетические исслендонванния МК пронводинлись в лаборатонрии эпигенетики Медико-генетиченского нанучннонго центнра РАМН. Материалом исследования служила ДНК лимнфоцинтов пенриферичеснкой крови и ткани опухолей больных МК. Для исследонваний иснпонльнзовали 10 микросателлитных маркеров на хромосоме 9р, распонложеннных в райноне гена р16/CDKN2A. Анализ метилирования пронмонторной облнаснти генна р16/CDKN2A был проведен методом метилчувствитенльнной ПЦР.

Определение спектра и частоты наиболее частых точковых мутаций в геннах BRCA1/2 и CHEK2 у больных первично-множественнными опухолями с поранженнием яичников и больнных органонспецинфичеснким раком яичников в понпуляции российнских женщин проводились на базе Инстинтута молекунлярнной биологии им. В.А.Энгельдгарднта. Методом аллель-специнфичной гибриндинзанции, сочетанюнщего мунльтиплексную ПЦР и гибриндизацию с олигонукнлеоннтиднными биочипами, опнренденлялась часнтота встречаемости мутаций в гене BRCA1- 185delAG, 300T>G, 4153delA, 4158A>G и 5382insС, в гене BRCA2- 695insT, 6174delТ и в гене CHEK варианта 1100delC.

  Исследование уровня метинлиронвания промоторных районов геннов RASSF1A, RAR2, SEMA3B проводилось на базе Государственного Научнного Центра РФ ГосНИИ генетика и совместно с Каролиннским инннстинтунтом (Швенция). Исслендонваннние включало комбинацию методов: ПЦР-ананннлиз образцов геннонмной ДНК, поснледовательно расщипленной с помощью набора метилнчувнствительных рестнрикнтаз (МЧРА), бисульфитной модификации ДНК с поснледующей метилспенцинфинчнной ПЦР. В анализ включены 330 пар обнранзнцов ДНК, выделенной из опунхонленвой и гистологинченски нормальной ткани бонльнных раком молочной железы, яичников и первично-множественннынми опухонлями с поражением молочной железы и яичнниннков. В качестве коннтннроля иснпоннльннзовали лимфонциты периферинческой крови здоронвых индинвидов (15 челонвек). ДНК выденляли из ткани опунхоли и из лимфонцитов крови по стандартнной метондинке.

Перенсмотр гистологических препаратов проведен в отделе патоморфолонгии РОНЦ им. НН.Блохина РАМН.

Исследование проведено с использованием генетико-математических ментондов изложенных в методических разработках  (Трубников В.И., Москва, 1998), в пакете программ УBiometrikaФ. Для создания базы данных испонльнзонвался прогнрамнмный продукт фирмы VNIINSoft КАРАТ. Основные стантиснтинческие методы Ц критерии Фишера, ранговая корреляция Спирмана с испольнзонваннием t-теста Стьюдента и критериев .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование посвящено одной из сложных проблем в клиннинческой онкологии: изучению генетической обусловленности и генетинченснкой гетерогенности и клинического полиморфизма рака щитовидной желензы, меланннонмы кожи и первично-мнонжественных злокачественных опухолей. 

Клинико-генетический анализ рака щитовидной железы. н  н  н  Раннее выявление РЩЖ, клинико-генетическая идентификация его наснлендннстнвенных варианнтов, разработка методов выявления аналогичного забонленванния среди родстнвенннинков больных РЩЖ и тактика лечения бессимпнтонмнных нонсинтелей патонлогинческих мутаций гена/ов, ответственных за разнвинтие  РЩЖ,  являнентнся важнной задачей онкологии и генетики. Хотя папиллянрнный и фолнлинкулярнный (ненмендуллярный) РЩЖ (НМРЩЖ) является наинболее часнтой форнмой рака этой локализации, о его наследнстнвеннном эквиванленннте изнвенснтнно очень мало.

для решения вопроса о наследственной предрасположеннности к НМРЩЖ бынли изунчены 140 больных, у которых папиллярный рак набнлюндалнся у 74%, папилнлярно-фолнликунлярный в 23% и в 3% слунчаев - фолликунлярный. При ананнлизе установлены различия в проявнленнии этого заболенваннния в занвиннсинннмонсти от пола (сонотноншение мужнчин и женннщин -1:5), что указывает на сунщенснтнвонвание разнличных величин риска развития НМРЩЖ для мужчин и женннщин. Вознраст динангностики заболеванния в среднем составляет 47,7 1,61 года, у 78% бонльннных пернвые признаки заболевания проявляются в среднем на 6 -7 лет раньнше. У бонльнных с НМРЩЖ обнанрунжено сочетанное пораженние разнных органов, частота первинчнно-мнонжеснтвеннных неопланзий составила 5,7%, что выше часнтоты в попунляции (0,003%)(р0,01). Анализ показал нанлинчие сенмейного нанкопнления разных неоплазий, частота которых составила 4% и добнронкачественных опухоленвых и неопухолевых заболеваний щинннтонвиндной желензы - составила 3,2%.  .  нн  При изучении семейных случаев НМРЩЖ впервые установлен наследснтнвенннный синдром семейного папиллярного РЩЖ (ПРЩЖ), признаками котонрого явнлянются нпреимущеснтнвенно мультифонканльнное и двустороннее пораженние панпилнлярным раком только ткани щинтонвиднной женлезы у трех и более членнов сенмьи, рис.1. Вознраст диагностики ПРЩЖ оказанлся мнонго монложе общей вынборнки больнных НМРЩЖ, составив 34,1 6,8 года против (47,7 1,6 года) (р 0,05), в ценлом, показынвая бонлее тяженлый фенотип и аутосомно-доминнантный тип (рондинтели-дети) наснлендонванния занбоннленванния.

Родословная семей больных С и В, диагноз: синдром семейного ПРЩЖ

I

II

 

 

III

Рис.1. Отец больной (II-2) умер в 36 лет от ПРЩЖ, (II-1) умер в 38 лет от ПРЩЖ, (III-2) Цпапилнлярный РЩЖ, его бабушка (I-4) умерла от ПРЩЖ на фоне множественнных аденонмантозных узлов щитовидной железы, а (I-5) Цумерла в 73 года от рака поджелудочной железы.

В результате исследования выявлены наследственно обусловленные синнднронмы, компонентом которых является папиллярный и фолликулярный РЩЖ. Эти синдромы характеризуются двумя клинико-генетическими ванринантами. Пенрвый, ассоциирован с множественными типами опухолей, возннинканющих в тканнях ранзнных органов и наследуенмых по аутонсомнно-доминнантннонму типу. Это синнндромы -Гарднненра, Каудена и МЭН1, которые в ананлинзируненмой вынборнке больных идентинфинцинронваны в 3,6% случанев. Второй - синдром семейного ПРЩЖ(СПРЩЖ), при котонром преобладаюнщим и постонянным призннаком является панпиллярнный РЩЖ, обнарунжен в 1,4% слунчаев.

  Проведенное иснследование показало существование наснледнснтнвенно обуснлонвннленнных форм НМРЩЖ и в отдельно взятых семьях консегренганцию НМРЩЖ с неонплазиями почки, моннлончнной железы, кожи (меланнонмы), нервнной системы и толснтой киншки. В целом, среди больных НМРЩЖ наследнственно детерминнированнные форнмы этого заболевания выявлены в 5% слунчаев.

Полученные данные позволяют иденнтифицировать семьи с наследственно обунсловленными формами НМРЩЖ и форминронвать группы "высокого риснка" сренди родственников из семей больных НМРЩЖ, а такнже осуществлять индивиндунальный прогноз развития заболевания для членов семьи больннонго в зависимоснти от конкретной семенйнной ситуации. На основании полученной информации, разнранботаны критерии идентинфинкации лиц с высоким риснком развития НМРЩЖ, которые включают: 1) поранжение НМРЩЖ до 40 лет и наличие поранженных членнов семьи аналонгичным заболеванием; 2) наличие в анамнезе или в сенмье друннгих неонпнлазий: в почнках, толстой кишке, молочной железе, нервной сиснтенмы, кожи и наличие ганмарнтом; 3) наличие в анамнезе или у членов семьи добронканченснтвеннных опунхолей в щитовиндной железе; 4) наличию в сенмье ПМЗО с понраннжением щитонвидной железы; 5) внимание к щитовидной женлензе при иденнтинфинканции у панциентов наследснтнвенных мульнтинопухолевых синднромов.

Важной пронблемой является выявление С-клеточной гиперплазии или мендунлнлярного РЩЖ (МРЩЖ) на ранней стандии заболевания. В этой связи, донстиженния  в молекунлярной биологии, позвонлили не только понять причинны развития медулнлярнного рака, но и реально понндойти к решению вопроса раннней диагноснтики и профилактики этой форнмы РЩЖ.

  Проведенный анализ 68 семей больных МРЩЖ выявинл генетически дентенрнминированнный МРЩЖ в 24,9% случаев, которые имели разные формы пронявления, такие как МЭН2А, МЭН2Б, синндром СМРЩЖ и медуллярный РЩЖ как компонент нейннронфиброматоза 1 типа. Иснхондя из важного наблюнденния, что ген RET экспнрессируется только в опренденленнных тканях нейроэнндокнриннной дифннференнцинровки, включая паранфоллинкунлянрные С-клетки щитонвиднной железы, экстра и интраадренанлонвые хроманфинннные клентки надпочечннинков, перинферинческие нервы, описываемые случаи совнместнного пораженния этиннми редкинми формами забонлеваний как нейрофибнронматоз и МРЩЖ преднполанганют возможнность существования обнщего бионлонгичеснкого механнинзма, ответнстнвеннного за их развитие. Частота спорадинческого МРЩЖ соснтанвила 75,1%, среди конторых, монгут быть случаи обуснлонвннленные  мутацией "de noнvo" в полонвых клетках одного из родинтелей.

  При изучении семей с синдромами МЭН 2 типа уснтанонвлен широкий спеннктр клиничеснкого проявления МРЩЖ, высокая варианбенльность риска раннннзннннвинтия неонплазии среди родственников. Для синдрома МЭН2А характерно бинлантенральнное разнвитие феохромоцитом у больных и их роднстннвенников, контонрые являлись частой причиной внензапнной смерти. Наличие феохромонцинтонмы уснтаннновнлено в 50% семей, у одного из больных, помимо МРЩЖ и фенонхронмонциомы, был обнаружен трентий первичный рак молочнной железы. Выявнлена аснсоцинация МРЩЖ с анонманлией почек, обнарунженная у носинтельницы мунтации гена RET.

Ананлиз семей с синдромом МЭН2Б показал, что 90% бонльных является рензульнтатом мутации de novo. МРЩЖ при этом синдроме возникает гонранздо ранньше (как правило, до 5 летнего возраста) и протекает более агреснсинвно. Для синдронма семейного МРЩЖ характерно поражение родственннинков сайт-спенцинфичеснким медуллярным раком при отсутствии клининчеснких или биохинмиченснких призннаков поранженния паращитоннвинндных желез или наднпоннчечнников.

  Возраст манифестации МРЩЖ у пациентов и их родстнвеннников с МЭН2 ванрьирует в зависимости от метода диагностики. При МЭН2А возраст диангноснтинки в среднем 28 лет (колебался от 7 до 45 лет), а у ненннкоторых родстнвенников к монменту изучения этих семей возраст превыншал 50, 62 и 75лет. При СМРЩЖ он в среднем составил 30 лет, в то время как при МЭН2Б развитие заболенвания наблюнданлось в среднем 8,6 года, поканзынвая самый тянжелый фенотип.

  Впервые в России проведен скрининг герминальных мутаций в гене RET в семьях больных с МЭН2. В результате установлена четкая ассоциация мунтанций в этом гене с МЭН2 синдромами. В семьях с МЭН2А идентифицинронваны 2 спенцифинческие мунтанции в кодоне 634 гена RET, в семьях с МЭН2Б вынянвлена мутанция в кодоне 918 гена RET. При синнднроме сенмейного МРЩЖ обнанружена мунтанция в кодоне 620 гена RET. Ханранкнтернные для этих синднромов межниндинвидунальная изнменнннчивость, как по вознрасту нанчала забонлеванния, так и по тянженсти его проянвнленния (даже в пренденлах однного поднтипа) могут быть обуснловленны не только варьнирунющей экспнрессивннонстью и пенентнраннтнностью гена RET, но и положением точковой мунтанции в одном из циснтениновых кодонов этого гена. Молекулярная ДНК-диангностика гена RET, станла ренальным подтвернжнденнием выявленнных наследснтвеннных форм МРЩЖ.

  Налинчие аллельной гетерогенности находит свое отражение в выявнленнной взаннимосвязи между феннонтипом- RET генотипом и тяжестью проявления занболенванния. У больных с MЭН2A мунтанция в кодоне 634 ассоцинируется с феонхронмонцитомой и гиперпаратиреозом и до сих пор, не бынла обнарунженна ни в одной из семей с синнндромом семенйнного МРЩЖ, что позволянет рассматнринвать ее в каченснннтнве марнкенра при пронгннозинровании ринска развития этих забонлеваний у беснсимнптомных носинтелей этой мутанции. Генрнминнанльные мутации в кодоне 918 ханранктенрнны искнлючинтельно для МЭН2Б и свянзанны с пороками развития скелета и слинзинстых. Выявленная ассоциация позволяет дать более точный прогнноз теченния заболевания у больных МЭН2.

Единственным эффективным метондом лечения МРЩЖ является тиреноиднэкнтонмия, поэтому так важна раннняя и донклинническая динангностика этого заболенвания. Однако вопрос о профилактической тиреоидэктомии остается преднментом поснтонннянной дискуссии, поскольку все еще отсутстнвуют данные длинтенльнного наблюнденния за пациентами, перенесшими в раннем детском возрасте тиреоиднэкнтомию, осннованнную на прямом тестировании гена RET, и которые могли бы поканзать, что МРЩЖ радикально изленчен. Прямое тенстирование гена RET среди родстнвенннников больных МЭН2А обнннаружило 8 бессимпнтомнных носитенлей герминанльнных мутанций этого гена в возрасте от 3,5 до 42 лет из 4-х обснледованнных  нами семей (табл.1). Первый российский опыт профинланкнтинчеснкого хиннннруннрнгичеснкого леченния вынполннен у 6 из них, согласившихся на опеннративное леченние. Как оказалось, тольнко у двух из них, самых юных пациненнтов (3,5и 9 лет), опенранция была пронннфилактинчеснкой, у остальных обннанруженны очаги С-клентончнной гипернпланзии и медуллярный рак. 

Таблица 1.

Клиническая характеристика родственников семей с МЭН 2А и результаты тестирования гена RET (выявленный генотип) каждой семьи.

Пациенты: № семьи, (возраст/пол)	Наличие феонхронмоцитомы/ медулнлярнного рака у панциеннтов ( Ф/М)	Мутация гена RET (генотип) замена аминокислоты/кодон	Бессимптомные носители мутации гена RET  (+ ), тиреоидэктомия
Семья №1: 32 года/м 50 лет/м 3,5 года/ж 9 лет/м 38 лет/ж 9 лет/ж 10 недель, беременности	ф/м ф - - - - -	TGCCGC,кондон 634, экзон 11 Не тестировался TGCCGC, кондон 634, экзон 11   ( - )   ( - )   ( - )   ( - )	(+ ) тиреоидэктомия
Семья №2: 35 лет/ж 25 лет/ж 29 лет/ж 20 лет/м 9 лет/ж 2 года/м	ф/м ф ф м - -	TGCCGC,кондон 634, экзон 11 Не тестировалась Не тестировалась TGCCGC, кондон 634, экзон 11 TGCCGC, кондон 634, экзон 11   ( - )	(+ ) тиреоидэктомия (+ ) тиреоидэктомия
Семья №3: 14 лет/ж 21 год/ж 42 года/ж 31 год/ж 69 лет/ж	М - М Не обследована Визуальное увенличение щитонвиндной железы	TGCCGC, кондон 634, экзон 11   ( - ) TGCCGC, кондон 634, экзон 11 TGCCGC, кондон 634, экзон 11 TGCCGC, кондон 634, экзон 11 От обследованния и лечения отказалась	(+ ) тиреоидэктомия ( + ) ( + )
Семья №4: 14 лет/ж 12 лет/м 38 лет/ж 74 года/ж	М М М щинтовид. железа уданленна в 45 лет	TGCGGC ,кодон634, экзон11 TGCGGC, кодон634, экзон11 TGCGGC, кодон634, экзон11 Не тестировалась, от обследованния и лечения отказалась	(+ ) тиреоидэктомия (+ ) тиреоидэктомия

Эти даннные поканзанли, что носинтели мутаций могут быть подвергнуты тиреноиднэкнтомии до понянвнления МРЩЖ. Послеопенранционное нанблюндение от 1,5 до 8 лет (в средннем 4,8 года) позволило установить, что тинреннонидэктомния пронвенденнная на донклинннинченском уровне, позвонлянет изнбенжать меннтанстанзиронванния и имеет бонлее благопринятнный исход занбонлеванния (табл.2), раннее выявнление занбонлеванние на оснонве ДНК-теснтиннрования может изменить течение МРЩЖ.

  Изучение исходного и стимулинрованнного уровня канльцитонина - как диангннноснтического маркера показало, что этот тест не всегда является абсонлютнным кринтерием. У пациентки 3,5 лет из семьи с МЭН2А набнлюдаенмый уронвень кальнннцинтоннинна был вынше нормы почнти в 2,5 раза (76,8 пг\мл), одннанко при гиснтолонгинчеснком иснслендонваннии призннаков МРЩЖ обнанрунжено не бынло (табл.2). Неоспоринмая ценнонсть этого метода в вознмонжнности оценнить полнонту хинрурнгинчеснкого лечения.

Таблица 2.

  Клиническая характеристика членов семей больных МЭН 2А, до и после

  тиреоиднэкнтомии

Данные обследования пациентов до тиреоидэктомии
Возраст	3,5 года	9лет	14 лет	20 лет	38 лет	42 года
Кальцито- нин (пг/мл)	76,8	42,3	97,0	20,3	40,0	83,4
Катехола-мины	норма	норма	Норма	норма	норма	норма
Мутация гена RET	+	+	+	+	+	+
Данные обследования пациентов после тиреоидэктомии
Гистолонгин ческое ис-н следование щитонвид. железы	Без приз- ннаков С-н  н клеточ. гинперпннланзии	Без признна  ков С-кле- точной ги- перплазии	С-клеточная гиперплазия, узлы медул- лярного рака (0,7-1,0 см)	Множ. узлы медулл. рака (0,7-1,0 см), очаги С-кл. гиперпл. в обеих  долях	Множ. узлы медулл. рака (до1,0 см) с амилоидо-зом в обеих долях	Множеств. узлы медул- ляр.рака (до 1,0 см) на фоне С-клет. гиперплазии
Кальцито-  нин (пг/мл)	норма	норма	норма	норма	80,3	норма
Катехол-амины	норма	норма	норма	норма	норма	норма
Длительно-сть наб-ния после опер.	4 года	8 лет	3 года	7  лет	5 лет	2 года

  Иснннхондя из принобнретенного опыта, пациненннтам с мутанцией  в кодоне 634, мы реконмендуем провондить тиреноиднэкнтонмию независимо от уровння кальнцинтонннинна. Выянвннленная взаимонсвязь генотинпа и фенотипа у носинтелей этих мунтаций монжет способнствовать планниронваннию тиреоидэктомии, приннятию реншенния отнноннсительнно объема и времени провенннния профилакнтичеснкой тиреноиднэкнтонмии, разнработнке теранпевнтинченских подхондов по отношеннию к пацинентам-носинтенлям мутаций. Комбиннированный с моленкулярными технонлонгинями поднход к клиннинченской, бионхинмичеснкой диагнностике и ведению пациненнтов из сенмей с МЭН2А может стать основным в уменьншение летальнности от МРЩЖ.

  Первый опыт дорондонвой диагностики синднрома МЭН2 в нашей стране проннннвенден в семьях с МЭН2А и синдромом семейного МРЩЖ. Пренатальная диангннноснтика пронведенна в семье №1 (табл.1), где у панциента 32  лет с синднронмом МЭН2А (носителя мутанции в кодоне 634) ожидалось появнленние потонмства. На сронке бенренменнности 10 нендель проведена из кленток ворсин хонринона, у его будунщего ренбенка, была выделена геномная ДНК и выполннена прямая ДНК-диагннонснтика гена RET. Для исклюнченния контаминации исслендунемого материнала матенринннсннкинми тканями провендено контнрольнное исследованние. Мутанции гена RET не обнанрунжено, выннявлен мужнской пол плода, рондинлся здоронвый мальчик. В возрасте 1 менсяца, ему пронвендено повторное тестиронвание ДНК, анализ оканзался отрицантенльннным. В сенмье с синдромом СМРЩЖ, у панцинентки с мутанциней TGC(Cys)CGC(Arg) в кондоне 620 (экзон10), в 35 лет на фоне лечения МРЩЖ встал вопнрос о дорнондовой диагнностике. На сронке бенренменннности 13-14 недель провендено прямое тестированние гена RET, у плонда выявнлена ананлонгинчнная мутациян  гена RET. Пациентка принняла решение пренрнвать беременнность.

Таким образом, принменненние RET-анализа дает возможнность диангнностиронвать (или искнлюнннчить) наследственную форму МРЩЖ, подготовить рондитенлей к рожндению больннонго ребенка или предотврантить рождение таконвого.

  Проведенный поиск сонматиченсннких мутаций в гене RET у больнных со спонрандическим МРЩЖ позвонлил иденннтинфинцировать мутанции в 28,6%. Выявнлено 6 тинпов соматических мутаций, три из которых - гетеронзинготные мутанции в кодоннах 639, 641 и 922 оказались неизвестными ранее. Это дает новые сведенния по молекулярной генетике синдромов МЭН2 и позволяет расшинрить спенктр мутанций, который можно рекомендонвать для рутинного лабонраторного ананлиза. При изучении мутанций гена RET в образцах крови 13 больных со спонрандичеснким МРЩЖ, обнанружена герминнанльнная мунтаннция Уde novoФ тем санмым показана неонбходинмость ДНК-тестинрования спонрадичеснких форм МРЩЖ. Созданы предпонсылки для формирования банка геннентической иннфонрнманции клинически верифинцированных больных с МЭН2 в России.

На основе полученных в ходе исследования данных, высокий риск развинтия гипернпарантироза и феохронмоцитомы в семьях с синдронмом МЭН2А пренннднннполангает необходимость включения в скрининруюнщие прогнраммы дианнгнноснтинку этих заболеваний. Выявление мунтанции в кодоне 918 генна RET свиндентенльнствует о санмом  агрессивном типе синдромов - МЭН2Б и вонннзнможнннонснти раннннего меннтанснтазинрования заболенвания и соотнветнственно планнинронвания возннраста тиреониднэкнтонмии, вынбор котонрого провондится индивидунанльно, но не позднее первых 5 лет жизни. Синнднром сенменйннного МРЩЖ пронтенкает менее тяжело и возникает в более позндннем возрасте. ДНК-диагностику в семьях с МЭН2 слендует проводить оснонвынванясь на варинантах этого синднронма и в соответнснтвии с харанктериснтинками мутаций гена RET.

Структура и соотношение генетически детерминированных форм МРЩЖ вклюнчает: 1) семейный синдром МЭН2А (7,4%); 2) МЭН2Б (11,7%); 3) синнднром СМРЩЖ (4,4%); 4) в составе синднрома Реклингхаузена (1,4%).

  Проведенный генетический анализ МРЩЖ позволил разработать компнленксную программу выявления лиц, предраспонложенных к развитию этого занбонлевания, включающую три этапа мероприятий:1) выявление и ренгиснтнраннция сеннмей с MЭН2; 2) ДНК-диагностика беснсимптомнных членов сенмей с наследнснтвеннным МРЩЖ (лгрупнпа риска), дающая индинвиндунальнный прогнноз, прендунсматнриваюнщий в завинсинмости от типа герминальнных мутаций такнннтику венденния панциентов; 3) клининчеснкий мониторинг индинвиндов из групнпы риска, вклюннчаюнщий общее клиннинческое обслендование, опнренделение уронвнння базальнного и пентангастнрин-стинмунлированного кальцинтоннинна, а такнже динангнноснтику симнпнтомов феонхроннмонцитонмы и гиперпарантинреноза (табл.3). Программа вклюнчает тактику создания профилактического регистра носинтелей онкопатонлонгинченснких генов, которая оснонванна на соблюдении приннцинпов добронвольннонго пронведения ДНК-диагноснтики, конфеденциальности генентинчеснкой инфорнмации, права человека самому решать быть или не быть прониннформинрованным о результантах генетинченсннкого анализа и его последстнвиях. Только после согласия пациненнта-носителя, он включанется в профилакнтинчеснкий ренгистр с последующей организацией и коорндинннанцией клинико-генетинческого монитонринга за состонянием его здоровья, пронфилакнтичеснких операнций, псинхолонгинческой помощи.

н  Таблица 3.

Выявление наследственных форм МРЩЖ и формирование групп риска

 

н  Разранбонтанная нами система комплексной диагностики этих заболенванний позволила эффективно провести ДНК-диагностику в онкологическую пракнтику.

Клинико-генетический анализ меланомы кожи.

Генетическая детерминация МК в определенной степенни монжет опреденлянться частотой поранженния членов семьи. Изучено 460 бонльннных МК, оценка сенмейнной часнтоты этонго заболевания (2,620,42%) в 4 раза преннвынсинла таковую УнакопленннуюФ занбонленваеннмость (0,66%) в популянции, свидентельнствуя о ненслуннчайной сегренганции МК в семьях этих больнных.

Анализ выявил особенности сенменйнного пронявления МК. Развитие МК у женннннннннщин настунпает в бонлее молондом возрасте (37,103,98) против общей вынборнки женнщин (44,530,70) (р<0,05). Возраст проявления МК у мужчин (52,20 5,26) превышает этот поканзатель общей выборнки (44,651,09). Полнунченнные даннные о половых различиях вознраста пронявнленния МК указынванют на существонвание разнличнных кринтериев риска для мужчин и женщин и поддернживанют идею геннетичеснкой гетерогеннноснти этого заболевания. Частота появнленнние первично-множестнвеннных очагов МК - 0,22 во мнонго раз вынннше ананлонгичной частоты несенмейнных форм (0,02) (р0,01 при =28,067). В 17% слунчаев ПММК разнвинлась на фонне атинпичннных и ДН, пронтив 2,6% для общей выбнонрнки больных. Часнтота нанкнонпления ДН у родстнвенннников больных с сенменйннынми форнмами (0,86), донсннтонвенрнно выше таконвых, без сенмейнных наконпнленний МК (0,41) (р0,05 при =3,87), а наличие меланонциннтарнных и ДН оканзанлось тинпичным, как для больнных МК, так для здоронвых родственников из семей с накопнленниями МК.

  Изучена степень внутриклассовой корреляции фенотипического сходнства по возрасту начала заболевания семейных форм МК, данные представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Данные возраста манифестации заболевания МК в парах родственников, их средняя оценка и коэффициенты корреляции.

№ п/п	Пробанды	Родители	Побанды	Дети	Пробанды	Сибсы
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	34 33 30 41 32 23 34 34	60 49 44 80 78 49 28 59	64 57 77 64 57 41 68 42	34 25 52 35 42 33 39 19	33 64 42 37 44 61 64 57 52 61	35 29 36 32 44 49 30 58 42 56
Среднее значение	32,63	55,88	58,75	34,88	51,50	41,10
Дисперсия	25,13	301,55	153,64	102,13	135,83	110,54
Критерий Фишера	12,0021  Р0,005		1,5044		1,23
Критерий Стьюдента	3,6384 Р0,001		4,2216  Р0,001		1,87
Корреляция	R1=0,41790,2919 =1,14		R2=0,74180,1590 =4,40		R3=0,06790,3148  =0,0461

Полученные знанчения коэффициентов корреляции для пар: пробанды-родинтели 0,418, пронбаннды-дети 0,742, пробанды-сибсы 0,068 не показали достонверных разнлинчий по методу , подтверждая гипотезу доминантного наследонвания семенйнных случаев МК. Следонвательно, характерные для семейных форм МК танкие признаки как, сегрегация этого заболевания, понявленние пернвично-мнонжестнвеннных очагов опухоли, наличие ДН и атинпинчных менннланнноцинтанрнных ненвунсов и могут быть использонваны в диагноснтике наследстнвеннных варианнтов этого заболевания.

Оценнивая степень участия меланоцитарных и ДН в развитии МК, были изуннчены три группы пациентов с большим количестнвом меланоцитарнных ненвусов, изначанльно имеющих разный риск развития МК. Первая вклюнчала 29 человек, отобранных одномоментно среди 509 индивидов органинзонванного населения г.Монснквы. Вторую группу составили 70 человек, обратившихся в поликнлиннику РОНЦ с жалобами на нанлинчие множестнвеннных пигментных ненвусов на конже. Третья группа, отонбнрана при осмотре 247 родственников 91 больного МК и соснтанвила 22 челонвека с большим количенснтвом разнообранзных невусов на коже туловища. ДН выявнленнны и подтверждены гистолонгинчески во всех трех изунченнных групнпах индивидов и у членов их семей. Полученные данные понканзали, что множеснтнвенные меланонцитарные невусы, также как и ДН, имеют теннденнцию накаплинваться в семьях. Лица-носители множественнных меланонцинтарнных и атипичнных невусов имеют понвыншенный, хотя и разный риск разнвинтия МК, конторый значительно понвыншанетнся при наличии в сенмье родстнвеннника поранженного МК. Об этом свинндетельнствует 0,8% обнанрунженннных нами новых случаев МК среннди близнких родстнвенннинков бонльнных МК, что в 3 раза превысило популянциноннную часнтоту (0,34%) этонго забонлеванния. Из полученных данных слендует, что ДН не всегда несут злоннканчеснтнвенннный понтеннциал и, по-видимому, сунщенстнвует ряд изменнений в менланнонцинтарнных ненвунсах, часть из которых, на опреденленнной биолонгичеснкой стадии менланнноннцинтарнных повнрежденний, способна трансфорнминроваться в меланому и это являнется причиной того, что клиннинческие и морфолонгические призннаки атиннннпичнных (динспласнтинченснких) невусов не всегда совпаданют. Активный ментод выявленния МК у лиц с больншим количеством меланонцинтарных невусов является преднпочнтинтельнным.

Свидетельством гетерогенности МК в пределах категории наследственнных меланом стали моногенно наследуемые синннднронмы, компоннентом которых  являнентся МК, выявленные в 3,9% случаев. Одни из них, характеринзунются разнвинтинем опухолей разных локализаций, такие как синднром семейнного рака (синннднрома Линча II), синдром Li-Fraumeni. Друнгие, вклюнчают нейронкожные нарушения, так называемые нейнронкристонпантии, такие как нейронконжный менланноз, синднром банзальнонклетончнонго невуса, Реклингханунзенна, Гардннера, изунченние котонрых, даёт оснонвание для предполонженния о сунщенстнвонваннии обнщей пантогеннентинчеснкой оснонвы семейнной предранснпоннложеннности к менланнноме, понранженнию нервной системы и денриннвантов кожи. К нейнронкринстоннпатиям относится и синндром диспласнтинчеснких невусов, контонрый установлен в 1,1% от общей выборки больнных МК.

Частота поражения разными неоплазиями членов семей больных МК сонснтанвила 14%, превысив аналогичную часнтоту в популяции - 4,0% (р0,01). Чтобы уяснннить налинчие или отнсутнствие законнонмернностей в разнвитии тех или иных форм опухолей, поражающих родственников бонльнных МК, проведен анализ часнтоты разных неоплазий встречающихся в семьях: больных МК, лиц-носинтелей множественных невусов, больных раком желудка и здоронвых лиц контнрольнной группы, данные приведены в таблице 5. 

  Как видно из таблицы родстнвеннннники лиц-носинтенлей множенстннвенных меланнонцинтарных невнунсов, наиболее часнто поражаются МК (p<0,01), опуннхонлью мозга (p<0,01), раком кожи (p<0,01) по сравнению с таковыми из группы здоровых индивидов. Сравнительный анализ частоты поражения неопланзинями членов сенмей бонльнных МК с аналогичной частотой лиц носителей мнонжественных невунсов достоверных разлинчий не выявил. Однако сравнение частоты поражения неоннпнлазиями родственников этих двух групп с таковыми, поражающими родстнвенников здоровых индивидов из контрольной группы, показало, что члены их семей статистически достоверно чаще поражаются  МК, опухолями мозга и ранком кожи. Следовательно, опухоли, которыми наиболее часто поражаются роднстнвенники из семей больных МК и лиц-носителей множеснтнвеннных невусов, имеют теннденцию к косегрегации МК, опухоли мозга и ранка кожи, доснтоверно отличаясь от таковых, накапнлинвающихся не только среди роднственников здоронвых лиц контрольнной группны, но и в семьях больнных рнанком желудка.

  Таблица 5.

Частота различных форм опухолей в семьях исследуемых выборок

	Число пораженных (в %) среди родственников 1-й степени родства
окализация злоканчественнной опухоли	иц- носинтенлей меланоцитарных невуннсов (общее кол-во родственнников-259  чел-к)	Больных меланнонмой кожи (обнщее кол-во роднственников Ц1667 челонвек )	Больных ранком желудка (обнннщее кол-во родств-ков -3733 челов.)	Контрольной групнпы лиц, не болевнших неонплазиями (общее кол-во родственннинков - 4654 челов.)
Желудок	1,93	1,6	3,88  (p< 0,01)	1,42
Толстая кишка	0,4	0,6	0,58	0,43
Молочная железа	1,54*	1,76*	0,48*	0,43*
егкое	0,39	0,89  (p<0,05)	1,27 (p< 0,01)	0,32
Поджелудоч- нная железа	0,38	0,42	0,43 (p< 0,05)	0,15
Мозг (нерв ная система)	1,54 (p< 0,01)	0,42  (p<0 ,05)	0,21	0,085
Меланома кожи	1,54 (p< 0,01)	0,89  (p< 0,01)	0.08	0,024
Базальноклеточный рак кожи	1,54(p< 0,01)	0,48  (p< 0,01)	0,29	0,15
Почка	-	0,48 (p< 0,05)	0,13	0,085
ейкоз	0,39	0,66 (p< 0,01 )	0,24	0,15
Саркома мягнких, костнных тканей	-	0,54 (p< 0,01 )	0,19	0,065
Эндометрий	0,4*	0,5*	0,77* (p< 0,05 )	1,1*
Мочевой пузырь	-	0,24	0,21 (p< 0,05 )	0,02

*Расчет частоты поражения проводился только на женщин.

Выявленная закономерность подтверждена  поснренднством расчета оценок корреляций между установленными формами опунхонлей на основе частоты этих заболеваний: у родственников носителей мелнанонцинтанрнных невусов, в популяции и лиц контрольной группы ( табл. 6). 

Таблица 6. Оценки генентинческих корреляций между изучаемыми признаками на основе семейной выборки лиц-носителей меланоцитарных невусов

Дисплас-  тический невус	Родственники 1 степени родства
	Меланома кожи	Опухоль мозга	Рак желудка
	0,4350,092 (H=0,87)	0,4020,123 (H=0,81)	0,138 0,071 (H=0,28)
Популяционная частота изучаемых заболеваний
(0,7%)	273 (0,1%)	4 (0,08%)	1467 (0,7%)

  Оценнки генетических корреляций: ДНЦМК - 87%, ДН - опухоль мозга - 81% показали существованние высокого генетинчесннкого сходства между ДН, МК и опухолью мозга. Устаннновленную в ходе исследонвания связь между опунхоленвой и предопунхолевой патологией, у родстнвеннников из семей больных МК и у родстнвенников лиц с множественными невусами, можно рассматнринвать как факнтор фонрнминрунющий повыншеннный риск разнвития вышенуканзанных забонленванний, а поянвннленние этих заболенванний в семьях лиц-носителей множестнвеннных меланоцинтарннных невусов и МК, более закономерно, чем следует из трандинциноннных клининченсннких представнлений. Возможность поранженния этими злонкаченснтнвенными опухонлями должна учинтынваться при опнренденленнии риска в сенмьнях больных МК и лиц с мнонжестнвеннными невунсами. .  н Цитогенетическое изучение частоты и харанкнтера распределения сайтов понвыншенннной ломкости хронмосом (СПЛХ), проведено у пациеннтов, уснлонвнно ранснпренденленнных на 4 групнпы: больные МК, больные МК и ДН, пациеннты носинтенли диспнластических невусов, здоронвые дононры (табл.7). Как видно из таблицы, наинбонлее высокая частота спонтаннных аберраций нанннбнлюнданется у пациентов с ДН. Среднний процент аберрантных метафаз в груннпннпе ДН соснтавил 6,690,8, в группе меланома +ДН -6,79 0,7, по сранвнненнию с 2,430,6 у здоронвых индивидов (Р0,01). У 6 из 8 обснлендованных бонльнных МК иденнтиннфициронван синдром ДН и для кажндого из них зафиксинронван понвыншеннный уровень споннтаннных аберраций. н н ннн н н н  н н н  н н н Полученные даннные познвонляют раснсматринвать синдром ДН как заболеванние с хромонсомной нестанбинльнноснтью, что соотнветннснтвует современным преднставлениям об этом синднронме.

  Таблица 7.

  Результаты цитогенетических исследований разных групп пациентов

Здоровые доноры

Больные меланомой

Пациенты с ДН

Больные с МК и ДН

Пол (воз-раст)

Частота аберрант-ных метанфаз  (%)

Пол (воз-раст)

TNM класси- фикация

Частота аберрантных метанфаз  (%)

Пол (воз-  раст)

Частота аберрант-ных метанфаз  ( %)

Пол (воз-раст)

TNM Класс-ифинканция

Часта аберрант-ных метанфаз  (%)

Спонтан-ных

Индуци-ров.

Спо-нтанных

Инд--цир.

Спо-нтанных

Инд-уци-ров.

Спо-нтан.

Индуцир.

Ж (33) Ж (34) М (35) Ж (36) М (36) Ж (41) Ж (42) Ж (51) Ж (53) Ж (53)

5.0 2.0 0 0 6.0 4.0 0 0 0 3.0

60.8 27.3 33.3 47.4 36.5 61.4 51.8 60.6 42.1 58.5

М(35) Ж(37) Ж(37) М(37) Ж(42) Ж(44) Ж(51) М(51) Ж(52) Ж(53) М(56)

ToNoMo Рецидив T3NoMo T2NoMo ToN2Mo T3NoMo T3NoMo T4NoMo T3NoMo T3NoMo ToNoM3

5.0 4.0 6.0 5.0 6.0 2.0 4.0 2.0 1.0 3.0 2.0

61.4 58.8 66.7 54.2 38.0 64.1 39.8 54.3 43.0 55.8 43.1

М (14) Ж (22) Ж (24) Ж (27)

3.0 0 14.0 9.0

37.6 80.4 34.1 47.1

Ж (23) М (38) Ж (41) М (52) М (53) М (63) М (70) М (72)

T3NoMo T4NoMo T2NoMo T2NoMo T2N+Mo ToNoMo T1NoMo T4NoMo

4.6 8.0 1.0 4.0 9.0 6.0 8.0 14.0

60.0 64.2 30.5 67.3 26.0 65.4 72.8 55.1

  н

н  У индивидов с МК, ДН и МК+ДН в трех участках коронтнкого плеча хромонсонмы 1 -1р22,1р31,1р32 наблюдается общннонсть в инндивиндунальном распренделении ранзрывов и отличается от нормы с высонкой достонверностью. Что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью ( рис.2).

Рис.2. Сайты повышенной ломкости хромосом, экспрессия которых увеличена у больных МК и или ДН по сравнению со здоровыми индивидами контрольной группы.

Поскольку эти изменения принсутствуют у пациеннтов с ДН, лонкальная хронмонсомная нестабильнность отнонсится к ранним событиям предншествующих развинтию МК. 

  Анализ потери гетерозиготнности в районе локализации гена p16/CDKN2A по микросателлитным маркерам (D9S157, D9S161,D9S171,D9S169, D9S301) у 37 больных МК показал, что в 24% слнунчаев больных МК набнлюдается геминзиготнность по различному набору испонльнзуемых маркеров.н

  Изучение аномального метилирования промоторного района гена CDKN2A показало, что метилирование этой области ДНК генна CDKN2A определяется в

24,3% образнцов МК. Причем гиперметилирование промонтонрнного района гена CDKN2A выянвнлено у всех больнных с первично-множестнвенными злокаченстнвенннными онпухолями, включаюнщинми МК, позволяя предположить, что бонльнные МК с анонмальным метилированием гена CDKN2A имеют теннденнцию к разнвитию понлиннеонплазии.

Структура генетически детерминированных форм МК включает: 1) семейнные форнмы заболевания (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%);  3) первичнно-множественную МК (2,6%); 4) первично-множеснтнвенные злоканчеснтннвенннные опухоли в сочетании с МК (4,1%); 5) МК в составе наследстнвеннных синдромов (3,9%).

  Как показали наши исследования, сенмейнный анамнез позволяет устанонвить, является ли МК изонлированнной патологией, одним из пронявлений опунхоленвых понранжений в семейнном класнтере или является интенгранльной частью опунхолевого спекнтра наследственнных синдромов, ассоциируясь с друнгиннми опунхонлями. Полунченные в ходе исследования данные, явились оснновой для фонрминрованния групп риска среди семей больных МК, индивидунальнного пронгнонзинрования развития заболевания для родственников больного в завинсинмонсти от формы МК и конкретной семейной ситунации. Поканзаннинем для вклюнченния панцинента в группу риска, является: 1) МК у членнов семьи (риск повыншанется при наличие более одного родстнвенника бонльного МК); 2) нанлинчие в семье пернвично множеснтнвенной МК или ПМЗО, вкнлючанющую МК 3) налинчие в семье множественных невусов и опухоли монзга или немеланномнного рака конжи; 4) наличие в семье ДН и МК; 5) наличие бонльнншонго колинчеснтнва меланонцитарных невусов и/или атипинчнных невусов у членна семьи; 6) наличие в сенмье мононгенно наследуемого синндрома, комнпоннентом которого монжет быть МК.

Клинико-генетический анализ первично-множеснтннвеннных  злокачественнных опухолей.

Другими изученными локализациями явились первично множестнвеннные злонканнчестнвенные опухоли, включавшими оценку клинннических, эпинденмиолонгинчеснких и молекунлярнных осонбенннностей 400 бонльнных с синхронным и метанхнронным ПМЗО. Проведенный анализ создал оснонву для выденления раннзных вариантов патонлогии и показал существонванние консегрегации отдельнных форм опухолей в семьях таких больных. Устанонвлено, что риск разнвинтия этих заболеваний тесно коррелинрует с семейным анамннезом заболенванния. Чанснтота ПМЗО среди родснтнвеннников (0,8%), во мнонго раз превышает аналонгичнную частоту в понпулянции г.Моснквы (0,008%). Чаннснтота поражения разннынми злокачественными новообразованиями членов семей больных ПМЗО (26,9нн1,8 %) также превысила ананлонгинчнную частоту (4,00,03%) в попунляции (Р<0,001). Сравнение частоты понранженнннния неоплазниянми родстнвенннников больнных ПМЗО с таковой у больнных солитарнным раком контрольных групп (больных раком желудка,  монлоннчнннной желензы и меланомы кожи) показало не тонлько более тяжелый феннонтип заболевания при ПМЗО, но и то, что члены семей этих больных являются прендметом высокого онколонгинннченского риска (Р<0,001) ( рис.3).

Рис.3. Частота злокачественных опухолей среди различных групп родстнвеннников 1-ой степени родства больных ПМЗН, больных раком желудка и меланномой кожи и раком молочной железы.

Выявлена теннденция к предпочтительному поранженнию идентичных орнганнннов в семьях бонльных с первично множественнным поранженнием раком тонлннстой кишки (рис. 4).

Рис.4. Семейная агрегация колоректального рака в семьях больных единснтнвенным раком толстой кишки и в семьях больных первично-множественным раком толстой кишки (ПМЗНТК).

Частота накопления одннонтипных опухолей в семьях больнных с первично мнонжественнным раком толстой кишки (5,80,6%) выше, чем ананнлогичный понканзантель в семьях больных с солитарным раком толстой киншннки (3,00,2%) (Р0,001), следовательно для членнов сенмей болньнных с ПМЗО с поранженнинем толнстой кишнки ринск развинтия рака этой локализации повышен. Частота ранзвития первично множественного рака у больных раком толснтой кишнки вынше, чем у больнных раком прямой киншнки. Пронпорция пораженния мнонжестнвеннной малигннинзанцией толстой кишки у мужчин больнных раком толнснтой кишки (2,41,6%), по отноншеннию к таконвой у мужчин больных раком прямой кишнки (0,81,8%), состанвинла 3:1 (Р0,001). У женнщин бонльных ранком толнстой кишнки и раком прямой кишки, таких разнлинчий не выянвлено. Отсунтннснтвие этих различий у женнщин исклюнчанет возмонжность арнтенфанкта из-за венронянтноснти вклюнчения в анализ синдрома ННКРР. Исходя из понлунченных данных, бонльннных с первично мнонжеснтнвеннным раком толстой киншнки и раком прямой киншнки следует раснсматринвать как две отдельные, биолонгичеснки более гомогеннные группы.

  В семьях больных ПМЗО выявлена теннденнция к совместному развинтию ненконторых видов рака. Из группы женщин больных ПМЗО, при первом пернвичном раке молочной железы, втонрая пернвичная опунхоль чаще всего поранжает: толснтую киншку -25%, эндонментнннрий - 5,8%, яичнники -5,8%, шейку матнки -4,5%, молочнную железу -2,7%, желудок -  11%, и  др. Если разнвинтие единнстнвеннного РМЖ в знаннчительной степени обунснловлено влиняннинем окнрунжающих факторов риска, то у пациеннток, пораженнных допонлннинтенльннными первичными опухонлями, влиняние геннентических факнторов монжет быть донминнирующим. Подтверждением этому явнляннется то, что 16% родстнвенников, из семей этих пациенток, также были поранжены полиннеопнланзиянми, частота котонрых пренвышала таконвую в популянции (4,2%) (р0,05).  н н  н н  н нн нн  Изучение совместных лонкализаций понлинннеонплазий среди 543 женнщин с ПМЗО, у половины контонрых, однной из первичных опухолей был РЯ, а у друнгой - рак эндометнрия, выявило, что в обених грунпнпах, сочетание понранженния раком: яичнников, эндонметрия, моннлочнной женлензы и органнов желудочнно-кишенчнного транкнта, имеет устойчивую ассоциацию, данные представлены на рисунках 6,7.

Рис. 6. Локализация второй первичной Рис.7. Локализация второй первичной н опухоли у 211 больной ПМЗО с пораже-  опухоли у 232 больных ПМЗО с жением эндометрия.  пораннжением яичников.

  Полученные данные стали основанием для оценки генетических корнренлянций между выявленнными формами рака в семьях больных ПМЗН. Устаннонвнлены достаточно высокие оценки коррелянций между раком эндонментрия и ранком толстой кишки (0,90,2), между раком молончной желензы и раком толснтой кишки (0,70,3), между раком желудка и раком монлочнной железы (0,80,6). н  н

Хотя каждая из указанных форм опухолей имеет харакнтернные именнннно для нее системы детерминации, однако доля общих геннов пондверженнности свидентенльннствует о наличии общих этиологических механизнмах (генентинческой общннонсти) их разнвинтия и выраженности связей опренделенных типов опухолей в семьях больнных ПМЗО. Эти наблюдения предснтавнляют интерес, поскольку, если у больного одна из первичных опухолей соотнветствует уканзаннным вынше, то можно ожинндать в отдельно взятых семьях ананлогичные сонлитарные опунхоли у рондственнников.

  н  н Установленная общность генетических менханизмов поднвенрннженннности к проявнленнию указаннных форм опунхолей подтвернждает наличие генетинчеснкой гетенронгенннности менжду спонрандиченскими формами рака женнских репродукнтивнных орнганов, женлундка, толснтой кишки и ПМЗО, компонентами которых они являются. 

н  нннннн Показано, что развитие ПМЗО ассоциируется с мононгенно наследуемыми синнндромами. Эти синдромы, обландают уникальнными клиннинческими особеннноснтянми к поранженнию первичной злоканчестнвеннной опунхонлью неснкольких анантонминческих обласнтей. Ассоцииронваннная геннентическая предраспонложеннность особеннно выражена для остео-, мягконтканых сарком, лейкозов, РМЖ и для нонвых опухолей в области мозга и ЦНС при синднроме Li-Fraumeni, при синднроме Каудена - рака молочной железы, щитовиндной желензы и толстой кишки и др. В семьях больнных ПМЗО наследстнвенные варианты злоканчеснтнвенных опунхонлей встренчаюнтнся значительно чаще (17,3%), по сравнению с таковыми, устаннонвннленнными при раннвных условиях в семьях 460 больных МК (3,9%) и сенмьнях 950 больных раннннком желудка (2,1%) (р0,01). Возраст диагностики пернвонго первичнного ранка у бонльннных с синдронманми оказался более ранним (43,6 1,6 года), по сранвннению с таковым в общей группе больнных ПМЗО (49,80,9 года) (р0,01).

н  Коэффициент наслендунемости ПМЗО, рассчитанный на основе коррелянций, оказанлся равным - 77,4%, что без учета гетерогеннности этих опухолей, свидентенльнствунет о высокой генетической детерминнанции и, следовательно, геннентинченской отягощеннности этих семей. н н н н  нн 

Определение частоты наиболее распространенных герминальных мутанций в генах BRCA1/2 и CHEK2, с использованнием технологии олигонукнлеонтидных бионнчипов у 20 больнных ПМЗО с поражением яичнинков и 68 больнных одним РЯ показало, что герминальные мутации в гене BRCA1 выявнлянются в 52,63% бонльнных ПМЗО и только у 10,3% больных солитарным РЯ (р<0,01). Наличие у панциненнтки ПМЗО с поражением яичников увелинчинвает вероятнность обнарунженния в семье мунтанции в гене BRCA1.Синдромы лсенмейнного ранка идентинфинцированы у 55% больных ПМЗО - носителей гернминнальной мунтнации в гене BRCA1. У больных одним РЯ вынянвнлено два типа мутаций: 185delAG (1,47%) и 5382insC (8,82%). У больнных ПМЗО с поранжением яичнинков, иденннтифицинрованы 4 типа мутаций гена BRCA1 (табл.8). н 

  Таблица 8.

Типы мутаций гена BRCA1 обнаруженные у 11 из 20 пациенток, у которых одной из первичных опухолей был рак яичников.

окализация опухоли	Мутация в гене BRCA1	Количество случаев
РЯ - РМЖ	5382insC  (экзон 20) 4153delA  (экзон 11) 185delAG (экзон 2) 300T>G  (экзон 5)	3 1 1 2
РЯ + злокач.гистиоцитома пр.гематоракса	300T>G  (экзон 5)	1
РЯ + рак щитовидной железы	5382insC  (экзон 20	1
РЯ + рак почки	5382insC  (экзон 20)	1
РЯ + меланома кожи	5382insC  (экзон 20)	1

Анализ семей больных с выявленными генотипами гена BRCA1 показал, что формы опухолей, которыми поражаются родственники  этих больных, ранзнлинчанется в зависинмости от вариантов мутаций в пределах гена. В семьях аснсоциниронванных с мутанцией в позиции 5382insC, по сравнненнию с друнгими тинпами мутанций в гене BRCA1, родственнники чаще поранжаются раком женнснких репродункнтинвных органов, предстательной железы и меланомы кожи (МК), (рис. 9). Родословная больной С. (мутация 5382insC гена BRCA1).

Рис. 9. У больной ( III-2) с герминальной мутацией 5382insC, меланома кожи верхней трети правого бедра диагностирована в 41 год, РЯ в 51 год, у матери (II-3) МК лица уданлили в 41 год, а через 10 лет у не обнаружен рак эндометрия, умерла в 70 лет, дедушка (I-1) рак кожи. Сестра (III-1) полипоз эндометрия, мутации не обнаружено.

  В семьях носинтенлей мутации в позиции 300 замена T>G гена BRCA1, члены семей поражались раками разных типов, среди которых рак толстой кишки и желунднка встречался чаще, чем при других типах мутаций (рис.10).

н нн  Родословная больной Н. (мутация 300T>G гена BRCA1).

Рис.10. У больной (II-2) с герминальной мутацией 300T>G, рак молочной железы обнанружен в 34 года, а в 38 лет диагностирован второй первичный рак яичников, мать (I-4) умерла 54 года от РЯ, брат (II-3) умер от рака толстой кишки, сестра (II-4) рак эндометрия, бабушка (I-4) - РЯ, у дочери (III-1) выявлена мутация 300T>G.

 

  При мунтанциях 4153delA и 185delAG, роднсннтвеннники наиболее часто поранжанлись раннком той же самой анатоминчеснкой лонканлизации и/или РМЖ (рис.11).

Родословная больной О, (мутация 185delAG )

Рис. 11. У больной (II-3) РМЖ обнаружен в 41 г, РЯ в 50 лет, у дочери (III-1) рак обеих яичников обнаружен в  39 лет, мать больной (I-2) умерла от РЯ в 44г.

Мутация во 2 экзоне гена BRCA1 -  185delAG обнаружена у матери (II-3) и дочери (III-1), у детей (IY-1,2) мутации не обнаружено.

  Хотя полученные данные статистически незначимы, встречаемость этих форм рака следует учитывать в семьях больных ПМЗО с поражением яичников и их использование могло бы быть полезным при прогнозе риска развития неоплазий у родственников в зависимости от ванрианта выявленной герминнальной мутации у больного.

В анализируемых грунппах мутации в гене BRCA2 выявнленны у больных с билатенральнным РМЖ, мутанций в гене CHEK2 не обнанрунженно. н н н Статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RAR2 и SEMA3B ннисследован в представительной выборке, вклюнчавнших 330 обнразнцов РМЖ и РЯ. На рисунке 12 приведены примеры анализа метилирон- вания CpG-островка гена RASSF1A в образцах РМЖ и яичннинков.

Рисунок 12. Примеры типичных результатов анализа метилирования промоторной обнлансти гена RASSF1A с применением метода МС-ПЦР в образцах РМЖ и РЯ. Электнронфонретинческое разденленние в 10 % ПААГ продуктов МС-полимеразной цепной реакции (ПЦР), понлунченных для образцов ДНК. ПЦР проводили на ДНК конвертированной бисульфитом. Иснследован фрагмент 168 п.н. гена RASSF1A. М-маркер длин фрагментов с шагом 10 п.н. (10 bp DNA ladder ). Контроль полноты рестрикции Ц фрагмент 445 п.н.; контроль целостнности ДНК - фрагмент 229 п.н.; анализируемый фрагмент гена RASSF1A  357 п.н.. К (-) - отрицательный контроль  ( в отсутствие ДНК). М - маркер длин фрагментов с шагом 100 п.н. (100 bp DNA ladder). Т- опухоль, N- норма.

Вынявлена высокая частота аномального ментиннлированния CpG-остронвка генов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолях молнончной железы: 78% (32/41), 46% (26/56), 35% (22/65), в опухонлях яичннинков:73% (33/45), 30% (15/50), 50% (25/51), соотвентственно. Впервые обнанрунжено, что у больных ПМЗО метинлинрование ДНК из образцов ткани рака монлончной женлезы, принаднленжащих СрG остронвнкам генов RASSF1A, RAR2 выявлялось практически во всех слунчаях -90% (11/12) и - 90% (4/5), соотнвентнственно. При наличии у больных ПМЗО с поранжением яичнинков, анонманльнное метилинрование CpG островка генна RASSF1A выявлялось в 67% (8/12), а гена RAR2 практически во всех случаях 90% (4/5). На рисунке 13 показано схематическое изображение метилированния промоторного района гена RASSF1A  в образцах РМЖ. 

Рисунок 13. Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе метинлинрования CpG-островка промоторной области гена RASSF1A. Сверху даны позиции CpG-динуклеотидов; CpG- динуклеотиды 2,3, 9.. и 31; с левого края принведены номера обранзнцов РМЖ. Черный прямонунгольник указывает на выявление метилирования, белый прянмонугольник - метилирование не выянвнлено. Приведены данные анализа для 12-ти образцов ДНК первичных опухолей РМЖ, №341-527, № 510 и 374- образцы, принадлежанщие больным с ПМЗО. Справа понканзаны клинико-гистолонгинческие характенриснтики опухоли: D - инфильтративно-протоковый рак молочной железы; L Ц иннфильнтративно-дольковый рак молочной железы, Mix Ц смешанный; стандия и степень анаплазии опухоли.

  Понканнзанно, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A можнно обнанрунжить на доклинической стадии развития этих опунхонлей. В морнфонлонгичеснки нениннзмененной ткани уровень метилирования для гена RASSF1A составил 14% (РМЖ) и 5% (РЯ). Отнсутнснтнвие метилирования этих учаснтков ДНК в крови здоровых доноров (0/15), что позннвонляет считать менннтиннлированние этого гена ранним молекунлярнным маркером злоканчественнной траннснфонрнманции РМЖ и РЯ. Выявлена корренлянция часнтонты метилинрованния промоторных районов генов RAR2, SEMA3B с клининченснкой стадией и стенпеннью анапнланннзии РМЖ и РЯ ( рис.14).

Рис.14. А. Частота метилирования промоторного CpG-островка гена RAR2 в обнразцах ДНК первичных опухолей РМЖ и РЯ по сравнению с образцами ДНК гиснтологически-нормальной ткани от тех же пациентов. B. Корреляция уровня метинлирования (с учетом плотности метилирования CpG островка) гена RAR2 со стенпенью анаплазии опухоли (1/2 против 3, 1-я пара столбиков) и с клинической стандией рака молочной железы (I/II против III/IV, 2-я пара столбиков). Достовернность рассчитана с помощью теста Фишера (P0.005).

  Как видно на рисунке 14 значение частоты метилирования в ДНК опунхонлей монннлончной железы и яичников достонверно выше соответствующих велинчин, понлученных для ДНК морфологически нормальной ткани из этих органнов, полученных от тех же пациентов (Р0,001).                

  Результаты исследования метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B, свидентельнснтвуют о значительной роли эпигеннентинчеснких факторов в регулянции фуннкции этих генов в канцерогенезе рака монлочнной железы и рака яичнинков. Выявленные в ходе исследования даннные понказали, что бонльные с гиперментинлиннрованием гена RASSF1A и RAR2 имеют тенденцию к развинтию первинчнно множественнных поранженний, вклюнчающих молочную железу и яичники. Метинлинннроннвание промоторных районнов геннов RASSF1A, RAR2, SEMA3B, может испонльзонватьнся в качестве марнкенров в комнпнлексной диагнностике и прогнозе этих заболеванний и имеет бонльшие вознможннонснти для разнранботки неинвазивнной диагностики рака. н н  н н нн н н  н  н  Генетически детерминированных формы ПМЗО выявлены в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследснтвеннных синдронмов -17%. Еще одним существенным обстоятельством, в плане использования как диагноснтиннческого инструмента определения предрасположенности к раку в семьях больных ПМЗО,  является: 1) ранний возраст манифестации рака у больного или у члена его семьи; 2) наличие в семье больных с первично множественнным поражением злокачественными опухолями; 3) наличие в семье большого числа мультифонканльнного и двустороннего поражения парных органов; 4) большое число поранженнных индивидов более чем в одном поколении родственников; 5) наличие в семье специфических опухолевых ассоциаций, которые можно объединить в понятие синдром; 6) выявление мутации гена, специфически связанного с возникновеннинем неоплазии у одного из членов семьи.

  Таким образом, разработаны и внедрены, основанные на применнении клиннико-генеалогических, цитогенентинченнских и молекулярно-биологических иснсленндоннваний, методы оценки генетической детерминации развития рака щинтонвиднной железы, меланомы кожи, пернвичнно-мнонженстнвенных злоканчестнвеннных опухолей и их генетической гетеронгенннонсти, позволившие созндать в мединко-генетическом консультировании этих неоплазий нонвые вознмонжннноснти для ранней диагностики, профилактики, пронгноза развития неопнланзий у клинниченски здоровых родстнвеннннинков из семей этих больных, выборе такнтики леченния, вопросах планирования семьи.

Разработаны реконменндации по ранней диагноснтике и оценке эффекнтивнности прогноза развития неоплазий у клинически здоровых родстнвеннннинков из семей этих больных и у ряда из них, с профилакнтической целью, пронведены дородовая диагностика и хирургическое вмешантельство, что практинчески исключало риск развития рака.

  Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий выявнленние и регистрацию семей с отягощенным семейнным анамнезом, уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагноснтинку), формирование групп риска и их мониторинг, который можнно представить в виде схемы:

ВЫВОДЫ

  1. Анализ 1495 бонльных раком щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично множественных злокачественных опухолей (ПМЗО) и 8727 их родстнвеннниках 1-й-2-й степени родства выявил основные особеннноснти и генетические закономерности их проявления.

  2. Наследственные варианты немедуллярного РЩЖ (НМРЩЖ) установнлены в 5% случаев, из них в 3,6% НМРЩЖ встречается у больных с наследнснтвенннынми синдромами. Впервые выявлен синдром семейного папиллярного РЩЖ (1,4%). Обнаружена тенденция к поражению разнных органов у больнных НМРЩЖ: частота первично мнонжественного поранженниня в семьях (5,4%) превынсила таковую в популяции (0,003%). Выявлена косегреганция НМРЩЖ с неонплазиями почки, молочной железы, МК, толстой кишки.

  3. Генетически детерминированные формы медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) иденнннтифицированы в 24,9% случаев и клинически они проявляются как синднром МЭН2А, МЭН2Б и синдром семейного МРЩЖ. Моленкуннлярнной основой МЭН2 являются мутации в гене RET. Выявлены мутации гена RET в цистеиннонвых кодонах: 634- в семьях с МЭН2А, 918 Цв семьях МЭН2Б, 620 - при синдроме СМРЩЖ. Показано, что причиной клининческого полинморфизма МРЩЖ являентнся аллельная гетерогенность.

  4. ДНК-диагностика МРЩЖ открынвает вонзнможнность донродонвого выявленния синнднромов МЭН 2 и позвонлянет разрабонтать терапевнтические поднходы у нонсителей мутаций гена RET. Первый опыт пренатальнной диагннонстики в сенмьннях с МЭН2А и синдромом СМРЩЖ показал высокую надежность и эфнфенкнтивность этого метода, а пронфилактинченская тиреонидэкнтомия, проведенная  у беснсимнннтомнных нонсинтелей мунтанции этого генна, получила гистологическое подтвержденние диагноза медуллярного РЩЖ почти во всех случаях.

5. Структура генетической детерминации МК, включает: семейнную форму (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%);  3) первично-множестнвеннннную МК (2,6%); 4) первично-множеснтнвенные злокачеснтнвеннные опухоли с включением МК (4,1%); 5) МК в составе наследстнвенных синдромов (3,9%).

Риск развития МК для лиц с бонльнншим колинчеснтнвом меланоцитарных, ати-  пинчных и ДН значительно повыншается при налинчии в семье МК. В семьях больных МК и лиц - носинтелей мнонжественнных и ДН выявлена косегрегация опухоли мозга, МК, рака кожи. Оценки генетических корреляций между ДН-МК, ДН-опухолью монзнга, понказали высокое генетическое сходство, поднтвенрнждая, что опунхонли нервной системы и МК могут независимо накапнливантьнся в этих семьях.

  6. Установлено, что цитогенетические изменения с наибольшей частонтой аккумулируются в трех участках кроткого плеча хромосомы 1(1р), обнаружинвая общннонсть в инндивиндунальном распренделении ранзрывов в регионах 1р22, р31, р32 у индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей ДН, что ассоциируетнся с локальной хромосомной нестабильностью и является раннним событием в цепи изменений, предшествующих МК.

7. Гемизиготнность по разлинчнному набору испонльнзуемых марнкеров (D9S157, D9S161, D9S171, D9S169, D9S301) в районе локализации гена p16/CDKN2A набнлюдается у 24% больных МК. Аномальнное метинлирование пронмонторнной обнлансти генна CDKN2A выявляется у 24,3%, однако инактинвация этого участка ДНК гена CDKN2A в результате ментинлинрованния выявнлянетнся у всех больнных с первично множестнвенными неонпланзиями, включанюнщинми МК.

8. ПМЗО являются наследственно детермининронванннными в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследснтвеннных синдронмов -17,3%. Часнтота поражения неонплазиями родственников из сенмей больнных ПМЗО (26,9 1,8 %) превышает ананлонгичнную частоту в популяции (4,00,03%) (Р<0,001) и таковую у больнных солитарным раком контрольных групп (РМЖ, МК и ранком желудка), определяя, что члены семей больных ПМЗО относятся к групнпе вынсокого онконлогинченского риска. У больных ПМЗО вынявлена орнганннная аснсонциация между опухолями, понранжающими бонльнных и членов их семей. Теннденция к совместному развитию рака яичнников, эндонметрия, молончной желензы и органов желудочно-кишенчнного транкта подтнвернждена оценнканми геннетинческих корреляций между РЭ и РТК (0,90,2); РМЖ и РТК (0,70,3); раком желудка и РМЖ (0,80,6), указывая на налинчие общнонсти генов, детернмининрующих предрасполонженнность к развитию этих опунхонлей.

9. Частота гернминнальных мутаций в генах BRCA1 больных ПМЗО с понранженнием яичннинков составляет 52,63%, тогда как у больнных однним РЯ - 10,3% (р<0,01). У больных ПМЗО - носителей герминальной мутанции в гене BRCA1, синдромы семейного рака выявлены в 55%. Обнаруженно, что локализация неоплазий у родственников больных ПМЗО - носителей мунтаций в гене BRCA1, различается в зависимости от типа мутаций: в сенмьнях, ассоцинированннных с мутанцией 5382insC, родственнники поранжанлись ранком женнснких ренпннродункнтинвных органнов, предстательной железы и МК; в сенмьнях нонсинтенлей муннтации 300T>G, рак толстой кишки и желунднка у членов сенмей встречался чаннще, чем при других тинпах мунтаций, а при мунтанциях 4153delA и 185delAG роднсннтвеннинки чаще понранжались ранком той же самой анантоминчеснкой лонкализации и/или РМЖ.

10. Исследованный статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолях молочной железы и яичников показал, что аномальное метилинронвание промоторных районов этих генов выявляется в опухолях молочной железы, соответственно, в: 78%, 46% и 35%; в опунхолях яичников: 73%,30% и 50%, тогда как, при наличии у больнных ПМЗО анонманльнное метилирование CpG островка гена RASSF1A выявнлянлось практически во всех случаях РМЖ и РЯ, а гена RAR2-во всех случаях РЯ. Выявлена конрренлянция часнтоты метилирования промоторных райнов геннов RAR2 и SEMA3B с клинической стадией и стенпеннью анапнланннзии опухонли. Показано, что метилинронвание промоторных районов генов RASSF1A, RAR2, SEMA3B может испонльзоваться в качестве маркеров в комплексной диагноснтике и прогнозе этих заболеваний, что дает возможность разнранботки неинванзинвной диагностики рака.

  11. Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при

РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий оценку семейной отягощенности (выявнленние и регистрацию семей с отягощенным семейным анамнезом), уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагностику), формирование групп риска и их мониторинг.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Казубская Т.П.,Ситникова Т.С., Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф. Клинин-ко -генетический анализ распространенных злокачественных забонленваний. //Сонветнская мединцина. 1989, №6, С. 16-19.

2. Гарькавцева Р.Ф., Сотникова Е.Н., Казубская Т.П., Акуленко Л.В.,

Нефедов М.Д., Лиснянский И.Е. Медико-генетические аспекты злоканченстнвеннных новообразований. // Обзорная инфорнманция  Мендинцина и здравонохнраненние, серия - Oнкология. 1990, вып.2 ,С.1-18

  3. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф. Генетические аспекты первично-множественных злокачественных новонобнразований.// Вестник ВОНЦ АМН СССР.1990 , № 1, С.28-31.

  4. Казубская Т.П., Ситникова Т.С., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Гарькавнценва Р.Ф. Роль наследственных факнторов в возникновении меланномы кожи.// Всесонюзный симпозиум Клинника и лечение меланомы кожи Саратов. 1990,  С.28-30.

  5. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П. Генетическая гетеронгеннность и прогннонзинронвание первично-множественных злокачественных новонобнразований.// YI республиканнская науч. конф. онконлогов Молдавии, Кишинев.1990, С. 9-10.

  6. Sitnikova T., Kazubskaya T. Clinical genetic analisys malignat melanoma.// Eur. J. Cancer EACR-XI, Genua, Italy, 1991, Suppl.3, V. 27, Post. 2015, S.24

  7. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Сельчук В.Ю. Анализ генетической предрасположенности к раку в семьях больных первично-множестнвенннынми злокачественными новообразованиями.// Цитология и геннентика. Киев, 1992, Т. 21, С.32-36.

8. Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Мусатов В.К., Гарькавнценнва Р.Ф. Диспластические невусы и их значимость для идентификанции предраснпонложенности и ранней диагностики меланомы.// Вестник ОНЦ АМН Роснсии. 1993, № 1, С.20-25.

9. Сокова О.И., Кириченко О.П.,Чеботарев А.Н., Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Мусатов В.К., Копнин Б. П. Повышенная частота повнреждений неконторых учанстков хромосом в клетнках крови больных меланомой и/или диснпнластическими невусами.// Вестник ОНЦ России. 1993, № 1, С. 34-38.

  10. Kazubskaya T., Selchuk V., Belev N.,Garcavtseva R. Genetic-epidemioloнgiнcal study of multiple primary malignant neoplasms.// Cancer Detection and Preнvenннtiнon, 1993, V. 17, № 99, Р.114-115.

  11. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П. Идентификация наследстнвенных варинантов меланонмы кожи.// 50-лет Акад. мед. Наук, Москва. 1994, C.153-154.

  12. Selchuk V., Kazubskaya T., Klimenkov A., Garkavtseva R. Multiple Priнmary Malignant Neoplasms.// XVI International Cancer Congress. 1994, 30 Oct.-5 Nov. India, Delhi, Ref -00110, P.284

  13. Гарькавцева Р.Ф., Ситникова Т.С., Казубская Т.П., Демидов Л.В., Харнкенвич Г.Ю. Генетический анализ предрасположенности к развитию меланнонмы кожи. Сообщение 1. Распростнранненость, семейное изунченние, генетинчеснкая гетеронгенность.// Генетика. 1995, Т.31, №11, С.557-1561.

  14. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П.,Агапова Р.К., Мусатов В.К., Трубников В.И., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ пренднрасположенности к разнвинтию меланомы кожи. Сообщение 2. Взаимосвязь и патогеннентическая общнность  меланномы кожи  с диспластинческими невусами.// Генетика.1995, Т.31, №11, С.1562-1565.

  15. Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ и разнранботка приннципов прогнонзинронвания злокаченственных опунхолей в сенмьях больных раком женлудка и первично множеснтнвенными новообразонванниями.// Генетика. 1995, Т.31, № 34, С.410-414.

  16. Базов И.В., Аксенова М.Г., Казубская Т.П., Смирнов А.В., Забаровский Е.Р. Брага Э.А. Анализ аллельных потерь в области короткого плеча хромонсомы 3 в карцинонмах почки, тела матки и яичников с помощью три- и тетранмерных маркеров.// Молекулярная бионлонгия. 1997, №31,С. 805-809.

17. Kasubskaya T.P., Bazov I.V.,Braga E.A., Pugacheva E.M., Ermilova V.D Garkavtseva R.F. Human chromosome 3p deletion mapping in carнcinomas of kidney, lang and reproductivе organs.// 17th International Cancer Congress. 1998, Brazil, A.600, P.141.

  18. Braga E, Pugacheva E, Bazov I, Ermilova V, Kazubskaya T, Garkavtseva R,

Mazurenko N, Kisseljov F.,Liu J, Garkavtseva R, Zabarovsky E, Kisselev L. Comparative allelotyping of the short arm of human chromosome 3 in epithelial tumors of four different types.// FEBS Letters.1999 July 9; V.454, №3, Р.215-219.

19. Амосенко Ф.А., Козлова В.М., Любченко Л.Н., Казубская Т.П., Гарькавнцева Р.Ф. Мутации в протононконгене RET у больных с медулнлянрннннным раком щитонвиндной женлезы и возможности доклинннической диагнностинки и пронфилакнтинченснкого лечения  нонсителей этого заболевания.// Вестник онконлонгинческого научнного центра им.Н.Н.Блохина РАМН. 2000, № 1, С.20-26.

  20. Braga E., Bazov, I., Senchenko V., Liu J, Loginov V., Ermilova V., Kazubsнkaya T., Garkavtseva R. Common deletion regiнons on chromosome 3p in different types of cancer.// Abstracts of HUGO's Human Genome Meeting УHGM'99Ф, Vanнcouнver, Canada, April, 2000, Р.75.

  21. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Генетика рака желудочно-кишечного тракта.// Современная онкология. 2001,Т.3, №4. С.151-153.

  22. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Парфенова Д.Н., Михайловский А.В., Трубников В.И., Сельчук В.И., Гарькавцева Р.Ф. Результаты длительного акнтивнного наблюдения и клинико-генетический анализ пигментных невусов.// Вестник дермантологии и вененрологии. 2001, №1, С.4-9.

  23. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н, Козлова В.М., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Наследственный рак: иденнтинфикация, генентинческая гетеронгенность, медико-генетическое консультирование.// Вестник РАМН. 2001, №9, С.27-33.

  24. Амосенко Ф.А.,Фриллинг А.,Козлова В.М.,Любченко Л.Н., Казубская Т. П., Гарькавцева Р.Ф. Молекулярная диагнностика множественной эндонкнриннной неоплазии 2 типа.// Вестник Академии наук. 2001, №2,С.34-37.

  25. Braga E.,Bazov I.,Ermilova V., Kazubskaya Т., еt al. Critical tumor-supнpresнsor gene regions on chromosome 3p in major.// Int. J.Cancer.2002,V.100,P.534-41.

  26. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Лиснянский И.Е. Генeтические аспенкты медуллярного рака щитовидной железы.// Проблемы эндонкриннологии. М. 2002, Т.48. №.4. С.16-20.

  27. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Михайловский А., Сельчук В.Ю., Шабаннов М.А., Трофимов Е.И. Меланома кожи: клинико-генетическая гетеннронгеннность и принципы медико-генетинченского консульнтинрования.// Роснсийнский онколонгический журнал. 2003, №3, С.26-33.

28. Амосенко Ф.А., Бржезовский В.Ж., Любченко Л.Н., Шабанов М.А.,

Козлова В.М., Казубская Т.П., Ванушко В.Э. Анализ мутаций в прото-онконгене RET у роснсийнских больных с медулнлянрным раком щитовидной железы.// Генетика. 2003, Т.29, №6. С.1-7.

29. Белев Н.Ф., Самотыя Е.Е., Халипли С.Д., Софрони М.Ф., Казубская Т.П., Гарькавцева P. Ф. Сегрегационный и генентико-диснперсионный ананлиз преднраснполонженности к первично-мнонженственннным злокачественным новонобнразованиям.// Съезд онкологов республики Казахстан. Алма-Ата. 2003,С. 8-9.

30. Казубская Т.П., Козлова В.М., Мусатов В.К, Михайловский А.В., Шабанов М.А.,Трофимов Е.И., Сельчук В.Ю. Идентификация наследственнных вариантов меланомы кожи.// Генетика. 2004, Т.40,  №1, С.1-9.

31. Senchenko V., Liu J, Loginov V, Bazov I. ,Ermilova V., Kazubskaya T., Garkavtseva R, Braga E., ZabarovskyYu. Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUCA and AP20 regions in renal, lung and breast carcinomas.// Oncogene. 2004, V.23, №34, P.5719 Ц5728.

  32. Логинов В.И.,Маликова А.В.,Серегин Ю.А., Ходырев Д.С, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Киселев Л.Л, Брага Э.А. Метилирование  промонтонрного региона гена RASSF1A канндиндата в опухолевые супренснсоры в первичных эпинтенлианльных опухолях.// Молекулярная биология. 2004, Т.38, № 4, С.654-667.

  33. Amosenko F., Kazubskaya T. Mutation analysis RET proto-oncogene in Rusнsian patients with inherited medullary thyroid carcinoma.// 30th American Society of Preventive Oncology. 2006, Bethesda, USA, P. 37.

  34. Корчагина Е.Л., Казубская Т.П., Сазонова М.А., Гарькавцева Р.Ф. Роль наследственной предрасположенности в возникновении  рака толстой кишки. // Медицинская генетика. 2005., Т.4, №5, C.209-210.

  35. Федорова О.Е., Любченко Л.Н., Паяниди Ю.Г., Казубская Т.П., Амоснсенко Ф.А., Наседкина Т.В. Использование биочипов при изучении распнростнраненных мутаций в генах BRCA 1/2 и CHEK 2 у больных органонспенцинфинчеснким раком яичнинков и первично-множественнными злокачественнными новонобнранзонваниями с поражением яичнников (российская попунляциян).//Моленкунлярная биология. 2007, Т.41, №1, С.37-42.

  36. Казубская Т.П., Козлова В.М., Шишков Р.В., Поляков В.Г., Бржезовнснкий В.Ж., Амоссенко Ф.А., Гарькавцева Р.Ф. Синдром множественнных эндокнриннных неоплазий типа 2А. Профилакнтичеснкая тиреоидэктомия.// Детская онконлогия (Pediatric oncology). 2007, №2 , С.24-31. н н 37. Казубская Т.П., Белев Н.Ф, Нефедов М.Д., Паяниди Ю.Г., Сельчук В.Ю. Клинико-генетический анализ первично множеснтвенных злокачестнвеннных новообразований.// Российский онкологический журнал.2007, №2, С.4-9.

  38. Казубская Т.П, Амосенко Ф.А, Козлова В.М., Гарькавцева Р.Ф. Диангннонстика и профилакнтика медуллярного рака в семьях больных синдронмом мнонжественной энндокринной неоплазии тип 2.// Материалы XI Роснсийнского оннконнлонгического конгнресса. Москва 2007. Издательская группа РОНЦ, С.179

  39. Kazubskaya T., Shatalova E., Loginov V.,  Sudomoina M., Blanchard P.,

Favorova O.O., Braga E.A. Genetic and epigenetic alterations associated with breast cancer risk in Russian women.// 19th International Congнress on Anti Cancer Treatment. Paris, France. 2008,  Р.154, Р.182.

нн40. Казубская Т.П., Козлова В.М., 5. Амосенко Ф.А., Шишков Р.В., Полянков В.Г., Бржезовский В.Ж., Любаев В.Л., Гарькавцева Р.Ф. Синдромы мнонжестнвеннных эндокринных неоплазий и медуллярный  рак щитовидной желензы. // Роснсийский онкологический журнал. 2008, №1, С. 4-9. н н  н  н н н нн н  н н  н н  н 41. Логинов В.И., Базов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П.,  Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Районы понтенннциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека.// Генетика. 2008, Т. 44, С.250-6  ннн

  42. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавнценва Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опунхонлях почки, молочной железы и яичников. //Генетика. 2008, T. 44, C. 1126 -1132. 

43. Корчагина Е.Л., Белев Н.Ф., Казубская Т.П., Барсуков Ю.А.,Тимофеев Ю.М., Музаффарова Т.А., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Клиннико-генентические аспекты рака толстой кишки и идентификация его наследственнных форм. // Колопроктология. 2008, Т.2, №24, С.9-14. н 44. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Изменение уровня метилировния  гена SEMA3B в эпителинальных опухолях.// Мол. биология. 2009, Т.43, №3, С.436-445. н  н  н нн  н 45. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н. Роль наследственных факторов в развитии злокачественных новообразований. // В справочнике пракнтического врача Онкология под ред. чл-корр. РАМН, проф. И.В. Подндубной, Москва 2009, издательство МЕДпресс-информ, С.18-30. 

46. Брага Э.А., Логинов В.И., Пронина И.В., Ходырев Д.С. Казубская Т.П.,

Ермилова В.Д., Забаровский Е.Р., Гарькавцева Р.Ф. От структурно-функционнальнных изменений в генах хромосомы 3 в эпинтелиальных опухолях к онконмарнкерам.// II Роснсинйский симпонзиум Моленкунлярно-геннентиченснкая диагнноснтинка злокачеснтнвенных опухолей челонвенка Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. 2009, Т.2, №1, С.79-80.

  47. Казубская Т.П. Диагностика наследственной предрасположенности к панилнлярному и фолликулярному раку щитовидной железы.// Российский онконлогинчеснкий журнал. 2010, № 2, принята в печать.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность проф. д.м.н. Р.Ф.Гарькавцевой, проф. д.м.н. В.Ю.Сельчуку, за постоянный интерес к данным исследованиям, за обсуждение результатов диссертационнной работы, критические замечания и большую помощь при подготовке рукописи.

Автор выражает искреннюю благодарность, д.б.н. Э.А. Браге,  к.б.н. Ф.А. Амосенко, к.б.н. Т.А. Наседкиной, проф. д.м.н. Н.Ф. Белеву, проф. д.м.н. Д.В. Залетаеву, и всем коллегам, сотнрудннничество с которыми позволило  осуществить эту работу.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное