Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
ЛИТВИН ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
БИОТРАНСФОРМАЦИЯ И ФАРМАКОКИНЕТИКА НОВОГО ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ГИМАНТАНА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении УНаучно-исследовательском институте фармакологии имени В.В.ЗакусоваФ Российской академии медицинских наук (ФГБУ УНИИ фармакологии имени В.В.ЗакусоваФ РАМН)
Научный консультант:
Доктор биологических наук Колыванов Геннадий Борисович Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Жердев Владимир Павлович
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории психофармакологии ФГБУ УНИИ фармакологии имени В.В.ЗакусоваФ РАМН Гарибова Таисия Леоновна Доктор биологических наук, главный эксперт лаборатории химико-фармацевтических препаратов № 2 испытательного центра ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздравсоцразвития РФ Соколов Андрей Владимирович
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России
Защита диссертации состоится л_____ _______________ 2012 г. в ______час на заседании диссертационного совета Д. 001.024.01 на базе ФГБУ УНИИ фармакологии имени В.В. ЗакусоваФ РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в учёной части ФГБУ УНИИ фармакологии имени В.В. ЗакусоваФ РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.
Автореферат разослан л_____ _______________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Вальдман Елена Артуровна
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы Болезнь Паркинсона - хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание. По распространенности болезнь Паркинсона стоит на втором месте после болезни Альцгеймера, встречается примерно в 1% популяции старше лет. Несмотря на наличие целого ряда противопаркинсонических препаратов, способных снижать симптоматику заболевания, поиск новых более эффективных средств патогенетической терапии остается актуальным.
В НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН в ряду производных 2-аминоадамантана было выявлено активное соединение N-2-адамантилгексаметиленимина (гимантан) [Морозов И..С. и др. 2000]. В экспериментальных исследованиях показана его высокая активность на моделях паркинсонизма, превосходящая таковую препарата сравнения амантадина [Неробкова Л.Н. и др., 2000; Вальдман Е.А. 2000, 2001; Вальдман Е.А., Воронина Т.А., 1999; Капица И.Г. и др. 2005]. Было показано, что гимантан имеет сходные с амантадином свойства неконкурентного низкоаффинного блокатора ионного канала NMDA рецепторов [Елшанская М.В. и др. 2001]. Наряду с этим, был установлен ряд других компонентов механизма действия и спектра фармакологической активности гимантана, что, возможно, обеспечивает ему более высокую специфическую активность, установленную в эксперименте [Вальдман Е.А., 2001; Вальдман Е.
А. и др. 2004; Абаимов Д.А. и др.; Зимин И.А. и др., 2010, Ковалев Г. И., 2007].
Фармакокинетические исследования гимантана у экспериментальных животных методом радиоизотопной метки [3Н] показали, что препарат хорошо всасывается из ЖКТ и очень медленно выводится из организма (период полувыведения составляет 360-402 ч, а его среднее время удерживания колеблется от 526 до 580 часов в зависимости от способа введения) [Петренко Е. С., 2003].
Метод радиоизотопной метки [3Н] не обладает достаточной селективностью, так как тритий может распределяться и в отдельных компонентах биологической матрицы. Это приводит к завышенным концентрациям определяемого вещества и, как следствие, к установлению завышенных величин фармакокинетических параметров.
В опытно-технологическом отделе ФГБУ Научно-исследовательского института фармакологии имени В. В. Закусова РАМН (руководитель профессор Б.М. Пятин) была разработана лекарственная форма гимантана - таблетки по 0,05 г [Цветкова Е. А., Волкова М. Ю. и др., 2002]. Показано, что по фармакодинамическим и фармакокинетическим свойствам она полностью соответствует субстанции препарата.
Пилотное клиническое исследование гимантана проведено у пациентов с ранними стадиями болезни Паркинсона. Определена оптимальная эффективная, переносимая и безопасная доза гимантана для лечения начальных форм болезни Паркинсона - 25 мг, однократно в утренние часы. Установлено, что повышение дозировки сопровождается развитием побочных эффектов центрального и периферического характера. Подтверждена целесообразность дальнейшего изучения гимантана на разных стадиях болезни Паркинсона, в том числе в составе комбинированной фармакотерапии [Катунина Е.А. и др. 2008].
Необходимой составляющей таких исследований является наличие данных о фармакокинетике препарата у пациентов. Ранее использованный метод радиоизотопной метки [3Н] нельзя применять у людей. В связи с вышеизложенным возникает необходимость в разработке новой безопасной, высокочувствительной и селективной методики количественного определения гимантана в биоматериале.
Данные о биотрансформации и фармакокинетике в эксперименте позволяют получить представления о путях метаболизма нового препарата, возможных лекарственных взаимодействиях и подойти к решению проблемы индивидуализации фармакотерапии.
Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ФГБУ Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В.Закусова РАМН УИзучение механизмов эндо и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средствФ (№ госрегистрации 01.2006 06601).
Целью работы явилось экспериментальное изучение биотрансформации гимантана и его фармакокинетики.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать аналитический метод количественного определения гимантана и его метаболитов в биологическом материале на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.
2. Изучить фармакокинетику гимантана и его основных метаболитов в плазме крови и мозге крыс после однократного внутривенного и перорального введения.
3. Изучить фармакокинетику гимантана и его основных метаболитов в плазме крови кроликов после различных способов введения.
4. Определить абсолютную биологическую доступность гимантана.
5. Провести на кроликах сравнительное, перекрестное, открытое фармакокинетическое исследование гимантана после однократного введения таблеток гимантана 25 мг, приготовленных по разным технологиям.
Определить относительную биологическую доступность гимантана.
6. Изучить экскрецию неизмененного препарата и его метаболитов с мочой и калом крыс.
Научная новизна работы Впервые изучена биотрансформация и фармакокинетика нового противопаркинсонического препарата гимантана у крыс и кроликов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, определены стандартные фармакокинетические параметры.
Установлено, что при различных путях введения гимантан подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и мозге крыс, а также плазме крови кроликов регистрируются значительные концентрации его метаболитов. По данным масс-спектральных характеристик были обнаружены 3 метаболита гимантана с m/z 250, m/z 266 и m/z 282, повидимому, соответствующих гидроксилированным продуктам метаболизма, которые определяются в плазме крови кроликов в течение 24 часов, а у крыс - в течение 6 часов. В результате проведенного исследования установлено, что для гимантана характерна высокая степень проникновения в орган-мишень мозг и относительно высокая абсолютная биодоступность.
Практическая значимость работы На основании данных исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием обнаружены метаболиты гимантана. Перспектива создания лекарственных форм для орального применения гимантана подтверждена его относительно высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте.
На основании определения относительной биологической доступности гимантана у кроликов после однократного введения таблеток, приготовленных по различным технологиям, дана оценка целесообразности использования тех или иных лекарственных форм.
ичный вклад автора Автором самостоятельно разработана методика количественного определения гимантана в биоматериале, проведены исследования по изучению фармакокинетики и биотрансформации гимантана у крыс и кроликов; обработаны результаты, сформулированы выводы. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Апробация работы Основные результаты работы доложены на конференции УФармация и общественное здоровьеФ (Екатеринбург, 2009, 2010 г.), V Международной конференции УБиологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствамФ (Москва, 2010 г.), XI Региональном Конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011), на конференции в лаборатории фармакокинетики ФГБУ НИИ фармакологии им.
В.В. Закусова РАМН (Москва, 2011).
Положения, выносимые на защиту Х Разработана и метрологически охарактеризована методика количественного определения гимантана и его метаболитов в биоматериале.
Х Масс-спектрометрически идентифицированы три гидрокси-производных метаболита гимантана.
Х Изучена фармакокинетика гимантана у кроликов и крыс после различных способов введения. Установлены межвидовые различия в фармакокинетических параметрах гимантана и в интенсивности его биотрансформации.
Х Неизмененное вещество и один из его продуктов превращения проникают через гемато-энцефалический барьер.
Х Целесообразность создания пероральных лекарственных форм гимантана подтверждена его достаточно высокой абсолютной биодоступностью.
Х Изучена относительная биодоступность двух таблетированных прописей гимантана и рекомендовано дальнейшее изучение одной из них.
Х Гимантан полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта в портальный кровоток и выводится из организма крыс в незначительных количествах как в неизменененном виде, так и в виде метаболитов.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ (3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией, 4 тезисов - в материалах российских и международных научных конференций). Одна статья принята в печать.
Объем и структура диссертации Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, библиографический указатель, включающий работы на русском (50) и иностранных языках (40), 19 таблиц, 17 рисунков. Диссертация изложена на страницах машинописного текста.
Экспериментальная часть Материалы и методы Гимантан (рисунок 1) - N-(2-адамантил) гексаметиленимино гидрохлорид, C16H27N HCl. Представляет собой кристаллический порошок белого цвета, обладающий легкой растворимостью в воде, этаноле, метаноле, хлороформе.
Субстанция разработана в ФГБУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН как потенциальное противопаркинсоническое средство [Вальдман Е. А. и др.
1999, Вальдман Е. А., 2000].
N HCl Рисунок 1 - Структурная формула гимантана гидрохлорида Для исследований использовали раствор для инъекций гимантана гидрохлорида в ампулах в концентрации 25 мг/мл, а также таблетки гимантана, полученные влажным гранулированием (Т-1), и полученные методом прямого прессования (Т-2), с одинаковым содержанием препарата в каждой прописи (0,025 г).
Все лекарственные формы гимантана произведены в лаборатории готовых лекарственных форм ФГБУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН.
Экспериментальные животные Крысы. Изучение фармакокинетики препарата, его выведения и распределения в мозге проводили на самцах беспородных крыс, полученных из питомника Столбовая РАМН, в диапазоне масс от 180 до 220 г. Препарат вводили крысам однократно перорально в виде водного раствора субстанции в дозе 50 мг/кг и внутривенно в дозе 25 мг/кг.
Кролиики. Фармакокинетика гимантана изучалась на беспородных кроликах-самцах массой 2,2 - 3,2 кг перекрестным дизайном, животным были присвоены соответствующие порядковые номера. Животных содержали в стандартных условиях вивария ФГБУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН при 12-ти часовом световом режиме. За 12 часов до эксперимента животных лишали корма. Гимантан вводили в виде водных растворов однократно в дозе мг внутривенно (инъекционная ЛФ) в краевую ушную вену и перорально в дозе 100 мг (в среднем 40 мг/кг). Таблетки гимантана вводили через зонд по четыре штуки, чтобы достичь дозы в 100 мг. Через две недели введение лекарственных форм гимантана повторяли в обратном порядке.
Метод количественного определения гимантана в биологических образцах.
Для количественного определения гимантана и его метаболитов в плазме крови животных и экскретах использовали оригинальный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХМС/МС) на хроматографе Agilent Technologies, серии 1200 (США).
Условия хроматографирования: аналитическая колонка Zorbax 300SB (лAgilent, США) С18 - 1502,1 мм, диаметр частиц - 5 мкм. Колонку термостатировали при 40 С. Подвижная фаза: раствор А и раствор В в соотношении 1:1. Раствор А: 25 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 2,5 мл концентрированной муравьиной кислоты, разведенные в 0,5 л воды. Раствор В:
25 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 2,5 мл концентрированной муравьиной кислоты, разведенные в 0,5 л ацетонитрила. Скорость потока подвижной фазы - 0,4 мл/мин. Скорость подачи азота - 12 л/мин, температура испарителя 350С, напряжение на капилляре составляло 3500 В [Shudan F., Yuan T. et al, 2009].
Детектирование проводили ионной ловушкой в режиме позитивной ионизации по полному ионному току в диапазоне масс от 53 до 300 m/z, а также по изолированным ионам с соотношением массы к заряду, равными 234, 264, 250, 266 и 282. Хроматографический анализ проводили при комнатной температуре (22-24С). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане и фильтровали.
В этих условиях времена удерживания составили, соответственно, для гимантана - 4,7 мин, для метаболита с m/z 266 - 3,9 мин, для метаболита с m/z 250 - 3,мин, для метаболита с m/z 282 - 3,9 мин. Время удерживания внутреннего стандарта (трамадола г/х) составило 3,2 мин [Литвин Е. А., Бочков П.О. и др., 2010].
В изучаемом диапазоне концентраций (С ) между концентрациями x анализируемых соединений и соответствующих площадей пиков отмечена линейная зависимость, которая описывалась следующим уравнением для калибровки по внешнему стандарту: S=-2,95106+0,6729106C (r=0,9998), x где S - площадь хроматографического пика гимантана. Либо S / S = x х вн.ст.
-0,214106+0,027106C, где S /S - отношение площади хромато-графического x х вн.ст пика гимантана к площади хроматографического пика внутреннего стандарта.
Концентрации метаболитов гимантана рассчитывали по калибровочной кривой неизмененного соединения.
Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации полученных данных. Основные фармакокинетические параметры лекарственного вещества (ЛВ) и его метаболитов рассчитаны модельно-независимым методом:
AUC0- (нг/мл*ч) - площадь под фармакокинетической кривой (площадь под кривой концентрация лекарственного вещества - время) после внутривенного и перорального введения. AUC0- рассчитывается от момента введения до бесконечности;
C0 (нг/мл) - концентрация препарата в плазме крови после внутривенного введения в нулевой момент времени;
Т (ч) - время достижения максимальной концентрации препарата в max плазме крови после перорального введения;
С (нг/мл) - максимальная концентрация ЛВ в плазме крови после max перорального введения;
Cmax/AUC (ч-1) - параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток;
MRT (ч) - среднее время пребывания ЛВ в организме;
kel (ч-1) - константа скорости элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;
t1/2el (ч) - период, за который выводится половина введенной и всосавшейся дозы ЛВ;
AUCТ 0- fт - тканевая доступность, рассчитывается по формуле: f =, где т AUCp0- AUC - AUC в ткани, AUC - AUC в плазме крови;
т 0- p 0- fa - абсолютная биодоступность, рассчитывалась по формуле:
AUCp 0- Di o v 100% fа =, где AUC - AUC в плазме крови после AUCi 0- Dp po 0- v o перорального введения препарата, AUCiv 0- - AUC в плазме крови после внутривенного введения препарата, Div - введенная внутривенно доза, D - po введенная перорально доза.
F - относительная биодоступность, рассчитывалась по формуле:
AUCt Ds F = 100 %, где AUCt - площадь под фармакокинетической AUCs Dt кривой таблеток тест-препарата, AUC - площадь под фармакокинетической s кривой после введения таблеток стандарт-препарата), Dt - доза таблеток тестпрепарата, D - доза таблеток стандарт-препарата.
s AUC /AUC0- - степень превращения фармакологического вещества в м0- метаболит, где AUC - площадь под фармакокинетической кривой метаболита;
м0- AUC0- - площадь под фармакокинетической кривой исходного соединения [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005].
Статистическая обработка полученных результатов. Полученные экспериментальные данные подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы Origin Pro v.7.0.
Результаты исследований и их обсуждение Биотрансформация гимантана Изучена фармакокинетика и биотрансформация гимантана в плазме крови крыс после разных способов его введения. Препарат и его метаболиты определяются в течение 6 часов.
В результате исследований биотрансформации гимантана после его введения крысам в плазме крови и экскретах животных обнаружены неизмененное соединение и три продукта его биотрансформации. Выявленные вещества обозначены в соответствии с увеличением молекулярной массы (Mw) к заряду, т.е. значения m/z. Для удобства изложения им присвоены условные обозначения:
метаболиту с m/z 250 - М-1, метаболиту с m/z 266 - М-2, а метаболит с m/z 2обозначен в тексте как М-3.
Молекулярный ион неизмененного соединения характеризуется величиной m/z 234. Точное строение метаболитов не установлено, можно предположить, что соединение с m/z 250 представляет собой моно гидроксилированную молекулу гимантана, так как отличается от гимантана на 16 углеродных единиц. Метаболит с m/z 266 - вероятно молекула гимантана, гидроксилированная в двух разных положениях. М-3 - метаболит, гидроксилированный по трем разным положениям.
В опыте с применением -глюкуронидазы показано, что значимо увеличиваются концентрации только метаболита c m/z 282, по-видимому, остальные производные с глюкуроновой кислотой не связываются. Для установления точной структуры необходимо провести встречный химический синтез.
Фармакокинетика гимантана у крыс Фармакокинетика гимантана и его метаболитов после внутривенного введения крысам в дозе 25 мг/кг.
При внутривенном введении гимантана в плазме крови крыс наряду с неизмененным веществом обнаруживается метаболит М-1 на третьей минуте, а на шестой - метаболит М-2 (рисунок 2 (I)).
Степень превращения неизмененного гимантана в М-1 характеризуется I II а б 10 в 10 г 110 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 Время (ч) Время (ч) Рисунок 2 - Фармакокинетические кривые неизмененного гимантана (в) и его метаболитов М-2 (б), М-1 (а) и М-3 (г) после однократного внутривенного введения препарата крысам (I) в дозе 25 мг/кг и перорального введения (II) в дозе 50 мг/кг (n=8; SD) Логарифм концентраций (нг/мл) Логарифм концентраций (нг/мл) величиной 0,21, а в М-2 - 3,07 для внутривенного введения. Таким образом, гимантан в значительно большей степени метаболизируется с образованием основного метаболита с m/z 266, в меньшей степени - с m/z 250.
Гимантан и М-2 быстро выводятся из организма. Так период полувыведения неизмененного препарата составил 2,03 ч, его MRT - 2,95 ч; М-2 - 1,29 ч, а MRT - 2,73. В то же время М-1 элиминирует из плазмы крови животных более чем в два раза медленнее по сравнению с неизмененным соединением. Его t1/2el составил 4,64 ч, MRT - 6,90 ч.
Рассчитанная величина тканевой доступности (f ) гимантана в мозге т составила 2,28. Из полученных данных следует, что гимантан обладает высокой интенсивностью проникновения в орган-мишень мозг. В мозге крыс отсутствуют метаболиты М-2 и М-3. Содержание метаболита с m/z 250 в мозге гораздо ниже, чем в плазме крови, что может быть объяснено его более высокой гидрофильностью.
MRT и t1/2el гимантана в мозге значительно меньше аналогичных параметров, рассчитанных по плазме крови после внутривенного введения (1,29 ч и 1,50 ч против 2,03 ч и 2,95 ч, соответственно).
Фармакокинетика гимантана и его метаболитов после перорального введения крысам в дозе 50 мг/кг.
Фармакокинетика гимантана после его перорального введения крысам (рисунок 2 (II)) существенно отличается от кинетики внутривенного введения, прежде всего более низкими концентрациями неизмененного препарата и абсолютной величиной площади под фармакокинетической кривой.AUC гимантана после перорального введения в 3,5 раза меньше, чем после внутривенного, что объясняется лэффектом первого прохождения. При приеме гимантана внутрь значения концентраций метаболитов выше, чем при внутривенном введении, они обнаруживаются на шестой минуте, их концентрации нарастают в течение часа.
Концентрации М-2 в несколько раз превышают содержание самого гимантана.
Метаболит М-3 регистрируется только при пероральном введении.
Время достижения максимальной концентрации неизмененного соединения составило 0,25 ч, а ее величина 91,11 нг/мл. Фармакокинетический параметр, характеризующий скорость всасывания препарата из ЖКТ в системный кровоток (C /AUC0-) составил 0,416 ч-1. Выведение неизмененного гимантана из плазмы max крови, так же как и после внутривенного введения, носит двухфазный характер.
Для метаболитов отмечены разные времена достижения С (1,5 ч - для max метаболита с m/z 250 и 1 ч - для метаболитов М-2 и М-3).
Полученные результаты позволяют заключить, что гимантан и его метаболиты выводятся из организма с различными скоростями, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови (k ), которые составили el для гимантана 0,198 ч-1 и для метаболитов 0,164 ч-1 (m/z 250), 0,145 ч-1 (m/z 282) и 0,412 ч-1 (m/z 266) соответственно. Выявленные зависимости отражаются в величинах среднего времени удерживания препарата/метаболитов в организме - 5,38 ч для гимантана и для М-1 - 6,51 ч и периода полувыведения препарата из организма - 3,63 ч для гимантана и для М-2 и М-3 - около 4,5 ч, соответственно. Однако MRT соединения с m/z 266 составляет 2,44 ч и время его полувыведения - 1,68 ч.
При сравнении величин констант скорости элиминации гимантана после внутривенного и перорального путей введения видно, что препарат выводится быстрее из организма животных после внутривенного введения (k после el внутривенного введения больше k после перорального в 1,7 раза), в то время el как для метаболитов отмечается обратная зависимость. Следует иметь в виду, что введение внутрь отличается от внутривенного наличием фазы всасывания, что в конечном итоге сказывается на продолжительности пребывания ЛС в организме животных.
Полученные результаты по изучению фармакокинетики гимантана после его внутривенного и перорального введения позволяют заключить, что лекарственное вещество элиминирует из организма животных с высокой скоростью и его можно отнести к группе препаратов с короткой продолжительностью пребывания в организме.
Абсолютная биодоступность гимантана после перорального введения крысам составляет 14,1%.
Установлено, что гимантан обладает высокой интенсивностью проникновения в орган-мишень - мозг, в то время как метаболиты проникают через ГЭБ плохо.
Препарат подвергается эффекту первого прохождения через печень после его перорального введения.
Фармакокинетика гимантана у кроликов Фармакокинетические кривые гимантана и его метаболитов при разных способах введения представлены на рисунке 3.
I II a 10 б 1 в 10 1 2 3 4 5 6 22 0 1 2 3 4 5 6 22 Время (ч) Bремя (ч) Рисунок 3 - Фармакокинетические кривые гимантана (а) и его метаболитов: М-1 (б), М-2 (в) в плазме крови кроликов после однократного внутривенного введения препарата в дозе 50 мг (I) и перорального введения раствора субстанции в дозе 100 мг (II) Анализ полученных параметров кинетики гимантана после различных способов его введения кроликам позволяет заключить, что гимантан быстро выводится из их организма, на что указывает среднее значение константы скорости элиминации (k ), которое составило 0,255 ч-1 для перорального способа введения и 0,247 ч-1 для el внутривенного.
Содержание гимантана в плазме крови кроликов после перорального введения достигает максимума в среднем через 0,85 ч. Затем наблюдается двухфазное снижение концентрации неизмененного гимантана. Быстрое выведение препарата из организма характеризуется также такими величинами фармакокинетических параметров, как среднее время удерживания препарата в организме (MRT) - 5,04 ч и период полувыведения препарата из организма (t1/2el) - 3,39 ч. Однако при сравнении концентрация (нг/мл) Концентрации (нг/мл) этих величин для внутривенного и перорального путей введения видно, что дольше препарат выводится из организма животных после перорального введения (t1/2el per os больше t1/2el iv в 1,2 раза, а значение MRT для внутривенного способа введения меньше перорального в 2,17 раз). Известно, что в идеальном случае эти параметры, полученные на одном виде животных, не должны значительно отличаться друг от друга. В нашем исследовании такую разницу в величинах t1/2el и MRT можно объяснить малой выборкой животных (n=5), недостаточной для более объективной статистической оценки.
После внутривенного введения AUC0- гимантана в среднем составляет 1328,6 нг/млч, а М-2 - 429,59 нг/млч, что приблизительно в 3 раза меньше величины AUC0- неизмененного вещества. Однако после перорального способа введения гимантана величина AUC0- метаболита М-2 превышает аналогичный параметр (после внутривенного) в десять раз. С гимантана при пероральном max введении в среднем составляет 68,04 нг/мл, а метаболита М-2 - 788,83 нг/мл, при незначительном содержании метаболита М-1, что указывает на основной путь метаболизма гимантана с образованием метаболита М-2.
По-видимому, после перорального введения, полностью всосавшись из желудочно-кишечного тракта кроликов в портальный кровоток, гимантан подвергается лэффекту первого прохождения, в результате чего в системный кровоток поступает менее 7,955,02% от введенной дозы препарата (абсолютная биодоступность).
И гимантан, и метаболиты выводятся из организма кроликов с высокой скоростью. Через 24 ч регистрировались лишь следовые концентрации исследуемых веществ.
После внутривенного введения гимантан интенсивнее превращается в метаболит М-1 (степень превращения 0,498), чем в М-2 (0,323). М-3 в плазме крови кроликов не регистрировался даже в следовых количествах. Вследствие лэффекта первого прохождения абсолютная величина степени превращения гимантана в М-2 после перорального введения раствора в 30 раз выше аналогичной величины, полученной после внутривенного введения.
Фармакокинетическая оценка гимантана в таблетках, приготовленных по различным технологиям.
Целью этого этапа исследования стало фармакокинетическое изучение гимантана в таблетках в сравнении между собой и субстанцией в эксперименте на кроликах. На рисунке 4 представлены усредненные фармакокинетические кривые гимантана в плазме крови кроликов после однократного перорального введения животным таблеток Т-1 в дозе 100 мг и таблеток Т-2 в дозе 100 мг.
Исследование проведено на 8 кроликах-самцах массой тела 2,75 0,кг. В случайном порядке животным с помощью зонда внутрь вводили четыре таблетки прописи Т-1 (итоговая доза составляла 100 мг) или четыре таблетки Т-(для достижения итоговой дозы 100 мг). Спустя десять дней порядок введения исследуемых препаратов животным меняли на обратный.
Время достижения максимальной концентрации (T ) для таблеток max Т-1 наступало через 0,530,31 ч и для таблеток Т-2 - через 0,690,ч. Между величинами скоростей всасывания, AUC0- и Tmax таблеток гимантана, приготовленных влажным гранулированием и таблеток гимантана, приготовленных прямым прессованием, достоверные различия не выявлены (t-критерий Стьюдента, р=0,95).
Оценка параметра, характеризующего продолжительность выведения препарата из организма, показала, что величина полупериода элиминации (t1/2el) для Т-1 составила 1,371,04 ч и для Т-2 - 1,350,91 ч.
Средняя максимальная концентрация гимантана, определяемая в плазме крови кроликов (С ) для композиции Т-1 составила 36,4510,26 мкг/мл, а для max таблеток Т-2 - 35,053,87 мкг/мл.
Помимо неизмененного вещества в плазме крови кроликов обнаружен метаболит М-2, остальные продукты биотрансформации отсутствуют, либо определяются в следовых количествах. Степени превращения гимантана в М-составляют 4,75 и 4,45 для T-1 и Т-2 соответственно, что в два раза меньше аналогичной величины, полученной после перорального введения раствора, но в 15 раз выше относительно внутривенного введения. Известно, что биодоступность лекарственных препаратов, а также их биотрансформация в значительной степени зависят от таких биофармацевтических факторов, как вид вспомогательного вещества, его количество и технология получения готовой лекарственной формы [Frick A., Moller H. et al, 1998, Iongejan G. A. M., Smit I.C.A. et al, 1989]. Повидимому, вспомогательные вещества в таблетках гимантана оказывают влияние на биотрансформацию исходного соединения. Возможно, образуется комплекс гимантан-вспомогательные вещества, предохраняющий от ферментативного воздействия исходное соединение на фазе всасывания из ЖКТ и эффекта первого прохождения.
Относительная биологическая доступность (F) гимантана, определяемая отношением индивидуальных значений AUC0- с учетом вводимых доз, для таблеток Т-1 по отношению к Т-2, оказалась близкой и составила в среднем 104,159,99% Для оценки качества таблетированных лекарственных форм гимантана были проведены исследования их биодоступности относительно субстанции гимантана. Данные представлены в табл. 1.
Таблица 1 - Относительная биодоступность (F; %) гимантана после введения кроликам субстанции перорально в дозе 100 мг и таблеток различных прописей Т-1 Т-Субстанция 101,46 104,Т-1 - 104,Т-2 95,84 В результате установлено, что AUC0- гимантана в виде любой из прописей таблеток не отличается от водного раствора, что указывает на хорошее высвобождение вещества из лекарственной формы.
Поэтому, целесообразно отдать предпочтение той таблетированной лекарственной форме, технология которой более экономична и проста.
30 прямое прессование влажное гранулирование 0 4 8 12 16 20 Время (ч) Рисунок 4 - Фармакокинетические профили гимантана в плазме крови кроликов после однократного введения таблеток гимантана, приготовленных по различным технологиям Межвидовые различия в биотрансформации и фармакокинетике гимантана Сравнительный анализ направлений биотрансформации гимантана показал, что у крыс в плазме крови после его внутривенного введения регистрируются два метаболита: с m/z 250, который, вероятно, представляет собой моногидроксилированную молекулу гимантана и метаболит с m/z 266 - молекулу гимантана, гидроксилированную в двух разных положениях. После перорального введения исследуемого вещества крысам кроме М-1 и М-2 определяется метаболит с m/z 282 - гидроксилированный по трем разным положениям. В плазме крови кроликов после любого способа введения метаболит М-3 не обнаруживается, а при пероральном способе введения отсутствует также и метаболит М-1. После внутривенного введения гимантана концентрации двух метаболитов в плазме крови кроликов значительно ниже, чем в плазме крови крыс.
Оценивая интенсивность метаболизма гимантана у крыс и кроликов, концентрация (нг/мл) необходимо отметить следующее: абсолютная величина степени превращения гимантана в основной метаболит М-2 у крыс превышает аналогичный параметр после внутривенного введения у кроликов в 9,5 раз и после перорального введения в - 2,2 раза. Однако величина степени превращения гимантана в метаболит М-после внутривенного введения больше у кроликов в 2,3 раза по сравнению с крысами.
В целом, как показали проведенные исследования, интенсивность биотрансформации гимантана выше у крыс, чем у кроликов. Что, видимо, связано с эволюционными особенностями работы микросомальных ферментов у данных биологических видов.
При сравнении дозонезависимых фармакокинетических параметров как гимантана, так и его метаболитов у крыс и кроликов были выявлены межвидовые различия.
Гимантан выводится из организма крыс и кроликов примерно с одинаковой скоростью (t1/2 el составляет 3,63 ч для крыс и 3,39 ч для кроликов, MRT - 5,ч и 5,04 ч соответственно). В тоже время выведение метаболита М-2 у крыс происходит в 1,5 раза быстрее, чем у кроликов. По-видимому, это связано с тем, что у крыс метаболит М-2 подвергается дальнейшему превращению с образованием метаболита М-3.
Биодоступность гимантана у крыс в 1,27 раза выше, чем у кроликов, максимальная концентрация препарата в плазме крови после перорального введения быстрее достигается также у крыс (15 минут) по сравнению с кроликами (50 минут).
Сравнивая AUC0-, можно заключить, что биодоступность возрастает в ряду: кролик - крыса. У крыс отмечается два максимума, что может говорить о наличии энтеропатической циркуляции препарата [Koolman J., 1990].
Экскреция гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс.
Результаты исследования по выведению гимантана с мочой и калом крыс после однократного внутривенного и перорального введения препарата в дозе мг/кг представлены в табл. 2.
Помимо неизмененного гимантана в моче и кале крыс выявлены продукты его биотрансформации, которые уже обнаруживались в плазме крови.
Исследуемые соединения получили условные обозначения по такому же принципу, который применялся для обозначения метаболитов в плазме крови: М-1, М-2 и М-3. Возрастание массы метаболитов на 16, 32 и 48 соответственно, позволяет предположить, что образуются оксо- или гидрокси-производные [Петренко Е. С., 2003].
В качестве основного метаболита в моче и кале животных можно считать соединение с 250 m/z, вследствие его высоких концентраций во всех образцах экскрементов. Из таблицы 4 видно, что в кале после внутривеного введения количество М-1 в 1,9 раза меньше, чем после перорального введения.
Подобная тенденция наблюдалось и для М-2 (3,9 раз). Полученные результаты свидетельствуют о выраженном эффекте первого прохождения гимантана через печень после перорального способа введения. Однако метаболит М-3 при пероральном введении препарата обнаружен не был.
Поскольку после внутривенного введения количество гимантана в кале в 4,3 раза выше, чем после перорального введения, можно сделать вывод, что препарат полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта в системный кровоток.
Таблица 2 - Процент от введенной дозы препарата гимантана и его метаболитов в суточной моче и кале крыс после различных способов введения Исследуемые % от введенной дозы ( + SD) Моча, в/в введение Кал, в/в ведение Кал, п/о введение соединения гимантан 0,3060,187 0,0420,093 0,00980,0М-1 0,4000,185 0,1050,125 0,21820,18М-2 0,0840,067 0,0070,005 0,02650,02М-3 0,0070,007 0,0020,001 После инкубации пробы с -глюкуронидазой М-1 0,3800,188 - М-2 0,0930,065 - М-3 0,0110,008 - После добавления к пробам мочи -глюкуронидазы и проведения гидролиза количество М-1 и М-2 достоверно не увеличилось (при Р 0,95), в отличие от М-3. По-видимому, далеко не все метаболиты гимантана образуют глюкуроноконъюгаты.
Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что выведение производных адамантана происходит за счет образования гидроксилированных метаболитов [Петренко Е. С., 2003].
Анализ процессов экскреции гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс позволяет заключить, что элиминация препарата из организма животных происходит почти полностью за счет его биотрансформации в печени: суммарное выведение метаболитов в течение суток с мочой в среднем в 9-10 раз выше по сравнению с экскрецией с калом, а основное направление метаболизма, повидимому, - гидроксилирование.
Выводы 1. Разработан и метрологически охарактеризован аналитический метод количественного определения гимантана и его метаболитов в биологическом материале на основе ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.
2. Обнаружено три метаболита гимантана, предположительно гидроксипроизводные с m/z 250, 266 и 282. Их точное строение можно подтвердить при наличии стандартов, полученных встречным синтезом.
3. Обнаружены различия в количественных соотношениях и величинах дозозависимых фармакокинетических параметров гимантана и его метаболитов при разных способах введения. При пероральном введении биотрансформация гимантана протекает интенсивнее, что вероятно обусловлено лэффектом первого прохождения через печень.
4. Определена абсолютная биологическая доступность гимантана у крыс (14,1%) и у кроликов (7,95%), на основании чего оправдано применение таблетированных лекарственных форм гимантана. Не выявлено статистически значимых отличий в фармакокинетических параметрах и относительной биодоступности между разными прописями таблеток гимантана.
Целесообразно отдать предпочтение прописи, приготовленной прямым прессованием, вследствие технологических факторов ее производства.
5. Неизмененный гимантан обладает высокой интенсивностью проникновения в орган-мишень (мозг).
6. В неизмененном виде исходное соединение определялось в моче и кале крыс в чрезвычайно малых количествах от введенной дозы после внутривенного и перорального способов введения. Последнее говорит о том, что гимантан практически полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта крыс в портальный кровоток.
Список публикаций по теме диссертации 1. Литвин, Е. А. Изучение влияния вспомогательных веществ на технологические характеристики таблеток гимантана [Текст] / Е. А. Литвин, Е.
В. Блынская, К. В. Алексеев // Сборник материалов науч.-практ. конференции Кластерные подходы к в современной фармации и фарм. образовании, г.
Белгород, 2008 г. - Белгород: изд-во БеГУ, 2008. - С. 183.
2. Литвин, Е. А. Mетодика количественного определения гимантана в плазме крови кроликов [Текст] / Е. А. Литвин, П.О. Бочков, А. И. Посконный, Д. В.
Бастрыгин, М.И. Емельянов, В.П. Жердев // Материалы ежегодной конференции УФармация и общественное здоровьеФ. - Екатеринбург, 2010. - С. 78-80.
3. Литвин, Е. А. Количественное определение гимантана в биоматериале методом ВЭЖХ-МС [Текст] / Д. В. Бастрыгин, В. П. Жердев, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, Е. А. Литвин // Материалы 5-ой международной конференции УБиологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствамФ, Москва, 2010. - М.: изд-во Фолиум, 2010. - С. 57.
4. Литвин, Е. А. Количественное определение гимантана в плазме крови крыс [Текст] / Е. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев // Вестник МГУ. Химия. - 2011. - Т. 66, №3. - С. 194-197.
5. Litvin, E. A. Pharmacokinetics of himantane in rabbits [Текст] / E. A.
Litvin, P. О. Bochkov, D. V. Bastrygin, V. P. Zherdev // Russian abstract book УXI ECNP Regional MeetingФ 14-16 apr., 2011 St. Petersburg. - St. Peterrsburg, 2011. - Р.
155.
6. Литвин Е. А. Фармакокинетика гимантана у крыс [Текст] / Е.
А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, В. П. Жердев // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74, № 11. - С. 2428.
7. Литвин Е. А. Абсолютная биодоступность гимантана у кроликов [Текст] / Е. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, В. П.
Жердев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, №2. - С. 171-174.
8. Литвин Е. А. Экскреция гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс [Текст] / Е. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, В. П. Жердев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012.
Принята в печать.