БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ 03.00.23 -Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Красноярск 2009

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

На правах рукописи

ШИШАЦКАЯ Екатерина Игоревна БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ:

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ 03.00.23 -Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Красноярск 2009

Работа выполнена в Институте биофизики Сибирского отделения РАН

Научный консультант: академик РАН, доктор медицинских наук Гительзон Иосиф Исаевич

Официальные оппоненты: академик РАН, доктор медицинских наук Пирузян Лев Арамович доктор биологических наук Бондарь Владимир Станиславович доктор медицинских наук, профессор Якимов Сергей Владимирович

Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится л 6 октября 2009 года в 10-00 час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50,стр.50, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан л_____ __________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. биол. наук Л.А.Франк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание и изучение новых биосовместимых материалов, необходимых для современных реконструктивных медикобиологических технологий, является актуальной проблемой биотехнологии.

Повышение эффективности лечения и качества жизни невозможно без внедрения в практику реконструктивной медицины высоких технологий с применением новых материалов высокой функциональности и специфичности, включая конструирование систем, способных воспроизводить биологические функции живого организма (Bioartificial organs, 1999; Биосовместимость, 1999;

Sudesh et al., 2000; 2004; Biopolymers, 2002; Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents, 2004; Biopolymers, 2002; Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications, 2005; Штильман, 2006; Хенч, Джонс, 2007).

Активно развиваемый в настоящее время новейший подход - это создание биоискусственных органов и тканей, развитие которого делает необходимым освоение новых функциональных материалов (Шумаков, 1995; Шумаков с соавт., 2003; Штильман, 2006).

Получение фундаментальной основы для разработки и реализации новых материалов и устройств требует комплексных исследований. Для понимания механизма взаимодействия материалов и изделий из них с тканями организма необходимы глубокие исследования закономерностей ответа организма на инородное тело, характера регенераторного процесса, с одной стороны, и изучение судьбы (включая кинетику биоразрушения и динамику прочностных свойств) имплантируемого материала, с другой.

Имплантированные материалы/изделия и живой организм при контакте подвержены взаимовлиянию, как правило, негативного характера, при этом характер и степень выраженности этого воздействия определяются как комплексом физико-химических свойств собственно материала, массой и геометрией имплантата, так и природой и силой ответных физиологобиохимических реакций организма-хозяина. Поэтому для освоения новых материалов основополагающей задачей является необходимость глубокого изучения механизма совместимости материала с кровью, тканями и организмом; при этом необходимо ответить на следующие ключевые вопросы:

1) как собственно материал и изделия из него влияют на организм, 2) каков характер ответа организма на имплантацию материала/изделия, 3) под действием каких факторов in vivo материал/изделие и каким образом изменяются. Эти исследования реализуются на стыке биотехнологии, химии высокомолекулярных соединений, биофизики, молекулярной и клеточной биологии, медицины и включают разработку новых материалов и переработку их в специализированные изделия; изучение механизма взаимодействия материалов с тканями; оценку биотехнологических, физико-химических и медико-биологических свойств.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в биотехнологии материалов в последние годы, пока не удалось создать материалы, полностью совместимые с живым организмом. Основными факторами, сдерживающими широкое применение остро востребованных биоразрушаемых полимерных материалов, являются небогатый ассортимент данных материалов, а также пока не решенная проблема регулируемости процессов их функционирования и деструкции в живом организме (Zhu et al., 2003; Liu et al., 2005, Yun et al., 2004; Balthasar et al., 2005; Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents, 2004; Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications, 2005; Штильман, 2007; Хенч, Джонс, 2007).

Открытие и изучение полигидроксиалканоатов (ПГА) - полиэфиров микробиологического происхождения, явилось значимым событием для биотехнологии новых материалов. ПГА - это термопластичные, биоразрушаемые и биосовместимые полимеры, сферы применения которых потенциально широки и могут включать восстановительную хирургию, клеточную и тканевую инженерию, трансплантологию. Исследование этих полимеров активно проводится всеми развитыми странами, однако многие ключевые вопросы биотехнологии и материаловедения ПГА остаются открытыми. Это вопросы, связанные с получением высокоочищенных образцов и способами получения из ПГА специализированных изделий медикобиологического назначения различных типов. Остаются не изученными в полной мере кинетика и закономерности биоразрушения этих полимеров in vivo. Отсутствие четких представлений о механизме взаимодействия изделий из ПГА с клетками и тканями различной структуры, а также медико-технических характеристиках и эффективности их функционирования in vivo делают эти вопросы первоочередными для исследований.

Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на комплексное исследование ПГА применительно к конкретным биомедицинским задачам: конструирование экспериментальных изделий из ПГА медико-биологического назначения и проведение всесторонних исследований закономерностей их взаимодействия с тканями и организмом для получения доказательства биосовместимости и функциональности как необходимой основы для внедрения в практику.

Цели и задачи исследования. Цель работы - комплексное исследование и экспериментальное обоснование применения биоразрушаемых полигидроксиалканоатов в качестве хирургических элементов, самостоятельных эндопротезов и систем доставки лекарственных средств.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

1. На основе ПГА разработать семейство функциональных изделий медико-биологического назначения, исследовать физико-механические свойства, устойчивость к воздействию биологических сред и физикохимических факторов.

2. Исследовать биосовместимость ПГА в культурах клеток и в экспериментах на животных на уровне клеточного ответа, реакции тканей и всего организма 3. Изучить кинетику биоразрушения ПГА в биологических средах in vivo в зависимости от технологии переработки полимера, формы и места имплантации изделия.

4. Оценить эффективность ПГА в качестве биосовместимых эндопротезов, шовного материала, остеопластических имплантатов, для депонирования и доставки лекарственных средств.

Научная новизна. Сконструировано семейство экспериментальных образцов хирургических изделий и имплантатов биомедицинского назначения, разработанных из биоразрушаемых полимеров ПГА; впервые проведены комплексные исследования этих изделий. В культурах клеток и в экспериментах на лабораторных животных показана биологическая безопасность созданных полимерных изделий на уровне клеток, тканей и организма. Показано, что биодеградация ПГА in vivo реализуется гуморальным и клеточным путями с участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел с высокой активностью клеточной и сывороточной кислой фосфатазы;

течение процесса биоразрушения ПГА зависит от химической структуры полимера, формы и места имплантации изделия. Впервые исследована реакция различных тканей и закономерности регенераторного процесса в ответ на имплантацию изделий из ПГА и получены количественные данные, характеризующие реакцию тканей на имплантацию ПГА. Показано, что ответная реакция тканей характеризуется не продолжительным посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и неблагоприятных реакций. Впервые изучена возможность применения полностью биоразрушаемых эндопротезов из ПГА для реконструкции желчевыводящих путей. Исследованы свойства серии объемных имплантатов из ПГА и доказано, что ПГА и композиты ПГА с гидроксилапатитом биоинертны и не вызывают цитотоксических реакций in vitro и воспалительных, некротических и иных негативных реакций in vivo; обладают остеопластическими свойствами, медленно деградируют и способствуют новообразованию костной ткани, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза. ПГА исследованы в качестве матрикса для депонирования и доставки лекарственных средств; доказана безопасность разработанных форм в виде пленок, таблеток и микрочастиц при различных способах введения, изучено распределение и биодеградация полимерных микрочастиц во внутренних органах животных.

Практическая значимость. Разработано семейство изделий из высокоочищенных образцов ПГА, отвечающих требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям биомедицинского назначения. На основе изученных свойств растворов, расплавов, эмульсий и порошков определены параметры для переработки ПГА в специализированные изделия в виде шовных волокон, пленочных и объемных матриксов, микрочастиц, полимерных эндопротезов.

Отработаны способы модификации структуры матриксов из ПГА с применением химических и физических методов, обеспечивающие получение функциональных матриксов (scaffolds) в виде гибких пленок и мембран, пригодных для клеточных технологий. Биологические и физико-химические свойства полимерных изделий позволяют рекомендовать их для использования в различных областях реконструктивной медицины. Моножильный шовный материал из ПГА обладает необходимыми физико-механическими свойствами и пригоден для хирургии. Показана возможность использования ПГА для изготовления полностью биоразрушаемых эндопротезов, эффективных для реконструкции желчевыводящих путей. Разработанные объемные имплантаты из ПГА и в композиции с гидроксилапатитом пригодны для реконструкции дефектов костной ткани. Полимерные микрочастицы являются перспективной лекарственной формой для длительного функционирования in vivo при различных способах введения и позволяют осуществить местную доставку антипролиферативных препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная серия экспериментальных изделий из ПГА в виде плоских и объемных матриксов, шовного материала, биосовместимых эндопротезов, систем депонирования и доставки лекарственных средств;

результаты их комплексных исследований, свидетельствующие об их биосовместимости и соответствии требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медико-биологического назначения.

2. Характер взаимодействия разработанных полимерных изделий с биологическими тканями различной структуры (мышечной, костной, тканями внутренних органов); течение регенераторного процесса; ответная реакция тканей на имплантацию ПГА, характеризующаяся непродолжительным посттравматическим асептическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и других неблагоприятных реакций.

3. Закономерности биодеградации полигидроксиалканоатов in vivo в зависимости от способа и места введения, реализуемой гуморальным и клеточными путями с участием макрофагальных клеток; возможность длительного функционирования полимерных изделий in vivo, от нескольких месяцев до года.

4. Экспериментальное обоснование возможности применения изделий из ПГА в качестве биосовместимых и функциональных эндопротезов, шовного материала, остеозамещающих имплантатов и матриксов для депонирования и доставки лекарственных препаратов.

Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН (№№ государственной регистрации: 0120.0 404601;

01.200703092) и при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) (гранты REC 002, RUX0-002-KR-06, Y1-B-02-07, P1MO002, BG5202, BG8102), Международного научно-технического центра (МНТЦ-ISTC, проект № 2218), РФФИ (гранты №№ 05-04-08024офи-а, 07-03-00112-а, РФФИ-КФН 02-0497701), Красноярского краевого фонда науки (ККФН) (гранты №№ 9F154C, 13G028, 15G104, 16G104), Программы Президента РФ для молодых кандидатов наук (гранты №№ МК-4149.2006.4 и МК-577.2008.4), Фонда содействия отечественной науке-2008 года по программе Молодые кандидаты наук, Программы Президиума РАН Фундаментальные науки-медицине (проекты №№ 11.1, 12.5, 12.11, 20.11), Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты № 14 Стволовые клетки - основа клеточных биотехнологий будущего; № 54 Научные основы разработки новых лекарственных препаратов; № 96 Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов);

Программы Министерства образования и науки РФ Развитие потенциала высшей школы, проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXXVIII и XXXIX Международных конференциях Студент и научнотехнический прогресс, (Новосибирск, НГУ, 2000 и 2001); Южно-Сибирской международной научной конференции студентов и молодых ученых (Абакан, 2000); Второй республиканской конференции Молодежь и пути России к устойчивому развитию (Красноярск, 2001); Международном симпозиуме Биология клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2001); II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН Новые технологии в медицине (Новосибирск, 2002); Сессиях научной молодежи Красноярского научного центра СО РАН (Красноярск, 2002, 2006); International Symposium on Biopolymers 2002 ISBP02 (Germany, Munster), II International Symposium on Biopolymers (UK, Kordif, 2003); Advanced Research Workshop (NATO Science Programme), УMacromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering SystemsФ(Sofia, Bulgaria, 2003); Конференции по Программе Президиума РАН ФФундаментальные науки-медицине (Москва, 2003, Новосибирск, 2006, 2007);

III-ей конференции молодых ученых России с международным участием Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины (Москва, 2004);

XI и ХV научно-технической конференции с участием зарубежных специалистов Вакуумная наука и техника (Украина, Судак, 2004; Дагомыс, 2008); European Symposium on Biopolymers ESBP04 (S-Gallen, Switzerland, 2004); European Symposium on Biopolymers ESBP05 (Madrid, Spain, 2005); 3-й Международном биотехнологическом конгрессе "Bio - 2007" (Москва, 2006);

Всероссийской научно-практической конференции Новые технологии создания и применения биокерамики в восстановительной медицине (Томск, 2007); British-Russian Workshop in Association with the European Comission Stem Cell: Policy, Research, and Innovations Perspectives, (Москва, 2007); 4th European Congress on Biopolymers (Madrid, Spain, 2007); 4th Europen Symposium on Biopolymers ESBP07 (Turkey, Kusadasi, 2007); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов c международным участием Биохим2008 (Новосибирск, 2008); XVI International Conference on Bioencapsulation (Dublin, Ireland, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 89 работ:

монография, 42 статьи в центральных РФ и зарубежных журналах, включая статей в журналах, входящих в список ВАК.

Вклад автора: Планирование и проведение всех экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.

Структура работы. Диссертация изложена на 260 страницах машинописного текста и содержит 22 таблицы и 94 рисунка; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 485 источника, в т.ч. 380 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы и ее вклад в решение проблемы освоения новых материалов медико-биологического назначения.

Аналитический обзор посвящен анализу литературы по биотехнологии материалов медицинского назначения и включает характеристику потребностей в новых биоматериалах, требования, предъявляемые к материалам медикобиологического назначения; проведен анализ результатов в области разработки и применения биоматериалов и изделий из них в медицине. В заключительном разделе анализируется современное состояние исследований полигидроксиалканоатов (ПГА) и перспективы их применения в реконструктивных технологиях.

Объекты и методы исследования. Исследованы образцы ПГА, полученные в Институте биофизики Сибирского отделения Российской Академии наук: полимер 3-гидроксимасляной кислоты (ПГБ) и сополимеры 3гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата (ПГБ/ПГВ) с включением гидроксивалерата от единиц до 30 мол %. Исследованы исходные образцы ПГА (полимер, выделенный из биомассы микроорганизмов), водные вытяжки, разработанные экспериментальные образцы изделий медико-биологического назначения в виде микрочастиц, моножильных волокон, пленочных и объемных плотных и пористых матриксов, полностью биоразрушаемых полимерных эндопротезов. Физико-химические свойства полимеров и разработанных изделий изучены с использованием хроматографии (Hewlett Packard, США), дифференциального термического анализа (синхронный термоанализатор STA 449 Jupiter (фирмы NETZCSH, Германия), сочетающего одновременное измерение изменений массы (термогравиметрия) и тепловых потоков, рентгеноструктурного анализа (рентгеноспектрометр D8 ADVANCE фирмы Bruker (Германия), электронной микроскопии (JEM-100C, Япония);

физико-механические характеристики образцов регистрировали на универсальной электромеханической испытательной машине Инстрон 55(Великобритания).

Медико-биологические исследования ПГА и изделий из них включали клеточные системы in vitro и эксперименты на лабораторных животных.

Цитотоксичность ПГА изучена в культурах клеток с регистрацией морфологии клеток, синтеза белка, пролиферативной активности (в тесте ММТ по реакции восстановления соли тетразолия митохондриальными дегидрогеназами живых и метаболически активных клеток с образованием окрашенных кристаллов формазана). Разрешение на проведение экспериментов с использованием позвоночных животных получено от Комиссии Института биофизики СО РАН по биоэтике. Токсикологические и медико-биологические свойства полимерных изделий из ПГА различной формы исследованы в острых опытах на белых мышах линии Balb/c длительностью 7 суток; в каждой серии было задействовано по 8 животных в каждой группе (интактные животные, положительный контроль, экспериментальные группы) и в хроническом опыте на белых крысах Вистар. Биосовместимость и функциональные свойства шовных волокон из ПГА исследованы на крысах Вистар (180 суток, животных); трубчатые эндопротезы - на беспородных собаках (100 суток, животных); остеопластические свойства объемных имплантатов - на крысах Вистар: в тесте эктопического костеообразивания (45 суток, 15 животных) и на модели сегментарной остеотомии (90 суток, 72 животных); лекарственную эффективность и биосовместимость полимерных микрочастиц при различных способах введения - на крысах Вистар (133 животных) и белых лабораторных мышах (200 животных). Оценивали общее состояние животных, массу тела, вес, картину крови, микро- и макроскопию внутренних органов. Анализ периферической крови и биохимических показателей выполнены общепринятыми методами; анализировали общее содержание и фракции белка, остаточный азот, мочевину, креатинин; активность ферментов: кислой и щелочной фосфомоноэстераз (КФ, ЩФ), аланин- и аспартаттрансфераз (АЛТ и АСТ). Исследование лимфоидной ткани проводили патоморфологическим анализом отпечатков региональных лимфатических узлов (ЛУ). Анализировали макро- и микроскопические характеристики внутренних органов (печени, почек, сердца, селезенки и легких). Реакцию тканей на имплантацию изделий из ПГА исследовали общепринятыми гистологическими методами. С использованием Image Analysis System Carl Zeiss Jena (Германия) проводили анализ изображений и морфометрические исследования срезов.

Микроскопические исследования срезов тканей выполнены на электронном микроскопе (УJEM-100CФ Япония). Биодеградацию изделий из ПГА изучали in vivo; показателями биоразрушения служили изменения массы, микроструктуры и физико-механических свойств изделия. Статистическая обработка результатов проведена с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Находили средние арифметические вариант и ошибки среднего. Достоверность отличия средних значений в контрольных и экспериментальных группах проверяли в зависимости от величины выборки по U-критерию Манна-Уитни и t- критерию Стьюдента (уровни значимости: 0,и 0,01).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Конструирование и исследование свойств полимерных изделий из ПГА медико-биологического назначения Физико-механические свойства полимерных изделий зависят от способа получения и структуры и физико-химических свойств исходного полимера, а свойства ПГА, в свою очередь, определяются химическим строением и могут значительно варьировать в зависимости от типа и соотношения мономеров в полимерной цепи, поэтому для сравнительного исследования взята серия высокоочищенных образцов гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты (ПГБ) и сополимеров 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (ПГБ/ПГВ) с различным соотношением мономеров. Показано, что молекулярная масса ПГА - вариабельный параметр; разброс величины у серии образцов составил от 180 до 720 кДa; степень полимеризуемости ПГА зависит в основном от технологии синтеза, выделения и очистки полимера.

Температура размягчения ПГБ (Тр) лежит в диапазоне 110-115 С, плавления Тпл - 170-185С, разложения Тразл - 270-305С. Для сополимеров ПГБ/ПГВ характерны более низкие значения параметров, снижающиеся с увеличением доли гидроксивалерата в полимере. У сополимерных образцов с соотношением гидроксибутирата и гидроксивалерата как 1:1 значения Тпл и Тразл составили, соответственно, 140 и 220С. Включение гидроксивалерата существенно влияет на степень кристалличности полимера. Линейная зависимости Сх/ГВ наблюдается в диапазоне включения гидроксивалерата от единиц до 25-мол.%; образцы с более высоким содержанием гидроксивалерата (свыше 30-мол.%), также имеют значения кристалличности порядка 50%. Это связано с закономерностями кристаллизации мономеров и формированием кристаллической решетки. Охарактеризованный набор образцов ПГА с различным соотношением мономеров гидроксибутирата и гидроксивалерата, позволяет использовать материал с различными базовыми свойствами. Важно отметить, что, несмотря на снижение температурных характеристик у сополимерных образцов, разрыв между температурой плавления и температурой деградации сохраняется, следовательно, полимер сохраняет свойство термопластичности при значительной вариабельности степени кристалличности. Для получения специализированных полимерных изделий использовали образцы ПГА в виде растворов, эмульсий, расплавов и порошков, 1.1. Растворимость ПГА и получение изделий из растворов Для отработки условий изготовления пленок изучено поведение растворов ПГБ и ПГБ/ПГВ различной концентрации в серии растворителей.

Максимальная температура растворения образцов ПГА составила, соответственно, 60 С для хлороформа, 80 С для дихлорметана, 100 С для диоксана и 140 С для тетрахлорэтана. Вязкость растворов ПГА колебалась в широких пределах (1Ц1000 Паскаль/сек) в зависимости от концентрации раствора и температуры среды. Из растворов ПГА в хлороформе и дихлорметане методом полива на поверхность полированного металла или тефлона получена серия гибких прозрачных пленок толщиной от 0,0160,0до 0,10,01 мм, прочностью 4,00,28 кг/мм2, модуль упругости 13028 кг/ мм2, удлинение при разрыве около 4%. Вычисленные на базе измеренных контактных краевых углов смачивания водой ( ), характеристики поверхности матриксов из ПГБ и ПГБ/ПГВ имели близкие значения: поверхностного натяжения () 34,66-36,18; свободной энергии межфазовой поверхности 6,357,00, величины сил сцепления (WSL) 100,81-102,63 эрг/см2. Показано, что пленочные матриксы из ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ с различным включением гидроксивалерата обладают высокой биосовместимостью по отношению к культивируемым клеткам. Фибробласты мыши линии NIH 3Tхорошо адгезировали на поверхности всех типов матриксов и их количество было сопоставимо с контролем (стекло, полистерин). Морфология клеток, культивируемых при прямом контакте с поверхностью матриксов, не отличалась от клеток в контроле; жизнеспособность клеток в тесте прижизненного окрашивания трипановым синим составила 99,80,2% Культивирование фибробластов в течение 3-х суток на поверхности данных матриксов не влияло на время генерации клеток и синтез белка.

Для модификации и повышения гидрофильности матриксов проведена обработка их поверхности СО2-лазером, мощность которого варьировала в диапазоне от 3,0 до 30,0 Вт. Получена серия пленок с измененной поверхностью, от выраженных шероховатостей до сквозных перфораций (рис.

1). Исследована микроструктура и свойства поверхности в зависимости от характера облучения и найдены условия, позволяющие снизить контактные краевые углы смачивания поверхности водой пленок до 50о (относительно 7680о у исходных изделий), то есть значительно повысить гидрофильность матрикса без разрушения структуры материала. Прикрепляемость фибробластов на таких матриксах была на 18% выше по сравнению с исходными.

а б в Рис. 1. Топография поверхности пленочных матриксов из полигидроксибутирата, обработанных лазером с различной мощностью (Р) излучения: 6,15 Вт (а); 8 Вт (б);9,0 Вт (в). Маркер 50 мкм Для получения пористых матриксов использована техника введения в растворы полимера кристаллических наполнителей (хлорида натрия, сахарозы) с последующим выщелачиваем их водой и метод взаимодействия растворов ПГА и осадителей - тетрагидрофурана (ТГФ), диметилформамида (ДМФ), диоксана и воды. Изучены четыре системы полимер-растворитель-осадитель в весовом соотношении 10:80:10 (ПГБ/ПГВ-хлороформ-ТГФ, ПГБ/ПГВхлороформ-ДМФ, ПГБ/ПГВ-тетрахлорэтан-ТГФ и ПГБ/ПГВ-диоксан-вода);

учшие результаты получены для системы ПГБ/ПГВ-диоксан-вода. На основе исследованных свойств полимерных растворов и их взаимодействия с осадителями отработаны условия получения высокопористых полимерных матриксов с различными размерами пор, от 5-10 до 50-100 мкм (рис.2 б).

Рис. 2. Ультраструктура пленочных матриксов из полигидроксибутирата гибкая пленка (а), маркер 10 мкм; мембрана, полученная с применением техники выщелачивания (б), маркер 10 мкм; мембрана, полученная осаждением трехкомпонентной системы ПГБ-хлороформ-тетрагидрофуран (в), маркер мкм Исследованы условия для получения из ПГА матриксов в виде ультратонких волокон и микрочастиц методами нанотехнологии (техникой микроинкапсулирования и электростатического формования (ЭСФ). Первый пример использование метода ЭСФ для получения ультратонких волокон из ПГА реализован на примере сополимера ПГБ/ПГВ (рис. 3а). Изучено влияние плотности полимерных растворов и параметров формования на диаметр и качество получаемых волокон, в результате выявлены оптимальные условия, позволяющие получать однородные волокна диметром от 1 до 5 мкм.

в Рис. 3. Ультраструктура матриксов, полученных из полигидроксибутирата:

ультратонких волокон (а), маркер 10 мкм; микрочастиц (б, в), маркер 10 и мкм Методы микроинкапсулирования позволяют получать микро- и наноразмерные частицы, которые в силу высокой развитости поверхности имеют большие перспективы не только для разработки систем доставки лекарственных средств, но и в качестве матриксов для выращивания клеток.

Исследование применимости ПГА для этих целей показало возможность получение микрочастиц хорошего качества и различного диаметра. Выявлено влияние техники изготовления (типа эмульсии и способа диспергирования, температуры среды) на выход микросфер, их структуру и размер. С применением технологии испарения растворителя из двух- и трехкомпонентной эмульсий на основе ПГА отработана процедура стабильного получения микросфер высокого качества (рис. 3 б-в).

1.2.Переработка ПГА из расплава Наличие у ПГА выраженного диапазона между температурой начала о о плавления (150-160 С) и температурой начала разложения (260-280 С) позволяет получать из них изделия общепринятыми термическими методами переработки материалов. С использованием лабораторного мини-экструдера (Brabender, Германия) из расплавов ПГБ и ПГБ/ПГВ получены различные изделия: плотные гибкие пленки толщиной от 0,2 до 1,0 мм и пластины толщиной от 2,3 до 8,0 мм. Физико-механические характеристики пленочных полимерных матриксов и полимерных пластин, полученных из расплавов ПГА, выше на 25-38%, чем у аналогичных изделий, полученных растворными технологиями. Волокна (диаметром 0,10-0,35 мм), полученные из расплавов ПГБ и сополимера ПГБ/ПГВ, характеризуются высокими физикомеханическими свойствами (абсолютная прочность до 306 МПа, модуль упругости -3 ГПа, удлинение при разрыве 24 %).

1.3. Объемные имплантаты из ПГА и композитов ПГА с гидроксилапатитом Для целей репаративного остеогенеза сконструирована серия объемных имплантатов из полигидроксибутирата и композитного материала полигидроксибутират/гидроксилапатит (ПГБ/ГАП) различных размеров и формы. Наполнение полимера гидроксилапатитом значительно влияло на гидрофильность полимерных конструкций. Влагопоглощение у образца с самым низким (10 %) содержанием ГАП оставило 2,3 % и возрастало практически линейно с ростом содержания ГАП, достигнув 18,9 % у образца, в котором соотношение ПГБ:ГАП было равным 50:50; таким образом, варьируя соотношение составляющих возможно получение биоматериала различной степени гидрофильности. Все матриксы из композита имели более низкий начальный краевой угол смачивания; при наполнении полимера ГАП на 10 и 50% показатель составил, соответственно, 680 и 460; при этом степень кристалличности (Сх) композитов в целом выше (81-89 %), чем у ПГБ (67-%). Самые высокие значения Сх характерны для образцов с высоким содержанием ГАП - 40 и 50 %. Наполнение ГАП не влияло на температуру плавления, но изменяло температуру деградации композитного материала: с ростом содержания ГАП от 10 до 50 % температура деградации композита снижалась от 260 до 225оС. Из композитов ПГБ/ГАП и образцов полимера (ПГБ и ПГБ/ПГВ) методом прямой холодной компрессии сформованы плотные объемные конструкции (рис. 4), которые имели абсолютную прочность до 3040 МПа, модуль Юнга 4-6 ГПа. Композитные изделия имели в целом более высокие значения обоих показателей. У сополимерных образцов ПГБ/ПГВ с наполнением на 20% гидроксилапатитом, максимальные значения абсолютной прочности - 40 и 65 МП соответственно, модуль Юнга 8-11 ГПа. Важно отметить, что конструкции поддаются механической обработке, что позволяет придавать образцам различную форму.

Рис. 4. Объемные имплантаты для репаративного остеогенеза (маркер 1 см) Разработанные матриксы характеризуются высокой адгезионной способностью и пригодны для культивирования клеток in vitro. Лучшие результаты получены для матриксов с содержанием ГАП до 20%.

Установлено, что для стерилизации разработанных полимерных изделий пригодны общепринятые методы: автоклавирование в течение 45 мин при 1о о о С (1,1 атм) и 130 С (2,0 атм), сухожарочная обработка при 105-130 С, облучение (доза 2,5 Мрад), обработка стерилизующими жидкостями. Все методы стерилизации не влияют на прочностные свойства изделий, а также структуру и свойства поверхности изделий из ПГА.

Экспериментальные исследования биосовместимости и эффективности применения полимерных конструкций и эндопротезов из ПГА Для выявления механизма взаимодействия имплантатов из новых биоматериалов с тканями организма необходимо комплексное исследование закономерностей местного регенераторного процесса тканей, реакции целого организма, а также наблюдения за состоянием имплантированного материала.

В отношении ПГА в настоящее время отсутствуют четкие представления о механизме взаимодействия полимеров различной химической структуры и устойчивости in vivo при кратковременном или длительном функционировании.

Разработанные полимерные конструкции различной формы и массы позволили ввести их в мышцу, кость, кровоток, внутренние органы и впервые исследовать реакцию различных тканей на имплантацию ПГА.

2. Результаты исследования полимерных волокон Исследования биосовместимости и функциональных свойств разработанных полимерных изделий были начаты с определения реакции на ПГА скелетной мышечной ткани на модели ушивания мышечно-фасциального разреза экспериментальными моножильными шовными волокнами, полученными из ПГА двух типов - ПГБ и ПГБ/ПГВ. Целью работы было оценить не только биологическую совместимость волокон, но и определить, обладают ли они необходимой прочностью, адекватной требованиям, предъявляемым к хирургическому шовному материалу. Динамика деградации и прочностных свойств волокон из ПГА in vivо изучена при непосредственном контакте с тканями животных, а также дополнительно в диффузионных камерах, помещенных подкожно в шейную складку крыс, что исключает контакт материала с окружающими тканями и препятствует формированию фиброзной капсулы вокруг него; это позволяет исследовать биостабильность и биоразрушение материала с точки зрения истинной клеточной деструкции (Розанова, 1999).

2.1. Биодеградация ПГА in vivo Биодеградация полимерных волокон in vivo весьма замедлена по сравнению с современными разрушаемыми шовными волокнами на основе полимолочной и полигликолевой кислот. Волокна, имплантированные в мышцу, где они, помимо воздействия ферментов тканей и клеточных элементов, дополнительно подвержены динамическим нагрузкам, сохранили целостность в течение 1 года. Для изучения процесса биодеградации ПГА образцы волокон, расположенные внутри силиконовых диффузионных камер, вводили в шейную складку крыс. Камеры периодически извлекали и оценивали состав жидкости, внешний вид, массу и физико-механические свойства волокон. В начальный период наблюдения (до 60 суток) изменение массы волокон были менее значительными по сравнению с последующим периодом (90-180 суток). Спустя 180 суток остаточная масса волокон из ПГБ и ПГБ/ПГВ составила 74 и 62% соответственно, при этом убыль массы сополимерных волокон была выше. Физико-механические свойства волокон изменялись незначительно; за 180 суток экспозиции камер in vivo абсолютная прочность волокон, изготовленных из ПГБ и ПГБ/ПГВ снизилась, соответственно, до 5,2 и 6,0 Н, то есть всего на 33-35% от исходных значений.

Анализ клеточного содержимого диффузионных камер показал увеличение в них количества клеток макрофагального ряда за счет одноядерных макрофагов, а также гигантских клеток инородных тел (ГКИТ). Состояние волокон через суток после имплантации не изменилось. Существенных дефектов на их поверхности не было отмечено, несмотря на достоверное уменьшение массы. В более поздние сроки (120 и 180 суток) на поверхности волокон отмечено наличие адгезированных клеток, после удаления которых в ряде случаев наблюдали мелкие локальные дефекты, возможно, явившиеся результатом лизосомальной деятельности полиядерных макрофагов, доля которых в клеточном содержимом камер в эти сроки составляла 20-30% от общего числа клеток. Таким образом, биоразрушение ПГА in vivo происходит при постепенном разрушении материала с поверхности волокон без образования грубых дефектов и резкой потери прочности. Активное участие в этом процессе принимают макрофаги и гигантские клетки инородных тел. В окружающих волокна тканях видно присутствие большого количества макрофагов, ГКИТ и нарастание активности кислой фосфатазы, определенной по Гомори, которая служит надежным показателем интенсивности биодеструкции полимерных материалов (Пхакадзе с соавт., 1982; Gogolevskii et al.,1993).

Рис. 5. Гистохимическая реакция тканей на кислую фосфатазу (КФ) по Гомори: 1(а), 2(б) и 4(в) недели после имплантации ПГБ волокон. Обозначения: п- полимерная нить, м-макрофаги, ГКИТ- гигантские клетки инородных тел. Маркер - 0,01 мм Одновременно с результатами гистохимических исследований отмечено увеличение активности КФ в сыворотке крови экспериментальных животных, от 5-7Ед/л в начале наблюдения, до 20-25 Ед/л вконце.

2.2. Оценка биосовместимости шовного материала из ПГА Исследования биосовместимых и функциональных свойств моножильных шовных волокон, изготовленных из ПГБ и ПГБ/ПГВ, проведены на крысах Вистар, которым под ингаляционным наркозом в асептических условиях на правом бедре делали продольный разрез кожи и мышцы длиной 2 см, на мышцу накладывали три одиночных узловых шва из испытуемого материала (общая длина 3,0-3,5 см), кожу ушивали шелком. Животные были распределены на пять групп: I группа - отрицательный (интактный) контроль; II группа - положительный контроль (хирургический шелк); III группа - биодеградируемая нить сравнения (кетгут); IV группа - экспериментальная нить из сополимера ПГБ/ПГВ, включение гидроксивалерата 15 мол%; V группа - экспериментальная нить из ПГБ. Учитывая возможные проявления токсичности ПГА и принимая во внимание литературные данные о функциональных реакциях организма, имеющих место при испытаниях новых биоматериалов, исследовали физиологические и биохимические показатели, комплексно отражающие состояние животных.

Наблюдения за поведением животных показало, что в течение всего эксперимента все животные в экспериментальных группах были здоровы и активны, равномерно прибавляли в весе. Достоверных изменений по сравнению с контрольными группами обнаружено не было. Относительные массы внутренних органов у животных всех экспериментальных групп также не отличались от таковых в контроле. Анализ морфологического состава периферической крови показал, что в основном эти показатели находилось в пределах физиологических величин и не отличались существенно у животных экспериментальных групп относительно контролей. Функциональное состояние почек животных оценивали по количеству мочевины, креатинина и остаточного азота в сыворотке крови. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии негативного влияния ПГА на показатели азотного обмена и функцию почек животных. Содержание белка и его фракций в основном массиве данных оставались в норме. Для оценки дезинтоксикационной функции печени исследована в динамике активность печеночных ферментов, аланин- и аспартаттрасфераз, значения которых в ходе всего эксперимента оставались у всех животных экспериментальных групп в пределах физиологической нормы.

Отсутствие достоверных различий между всеми животными по всему комплексу физиологобиохимических показателей, включающему 26 параметров (весовые показатели массы животных и внутренних органов, морфологии и биохимии крови) в течение всего эксперимента подтверждено кластерным анализом, включая начальный постоперационный период (1, 2 и недели, когда были отмечены достоверные отличия по наибольшему числу показателей между группами), не выявили достоверных отличий между группами сравнения и контрольными (рис. 6).

Рис.6. Результаты кластерного анализа: 1,2,3 и... до 45 - животные по группам (1-9 интактный контроль;

10-18 - нить шелк, 19-27 - нить кетгут, 28-36 - нить ПГБ/ПГВ, 37-45нить ПГБ) В связи с тем, что реакция организма на воспаление может сопровождаться изменениями в состоянии иммунной системы, проявления иммунных реакций опережают показатели крови и надежно фиксируются в периферических органах иммуногенеза, исследовано состояние лимфоузлов (ЛУ) животных. Во всех группах животных макроскопически ЛУ не изменены, их размеры были в пределах нормы.

Достоверных изменений в соотношении клеточных популяций ЛУ у экспериментальных групп относительно контролей не выявлено. В течение всего наблюдаемого периода доминирующей популяцией были малые лимфоциты; соотношение зрелых и делящихся клеток также не изменилось.

Это свидетельствует об отсутствии влияния имплантированных в мышцу животным полимерных волокон из ПГА на периферические органы иммунитета и продукцию ЛУ иммунокомпетентных клеток. Макроскопические исследования внутренних органов животных не выявили в них патологических изменений.

2.3. Реакция мышечной ткани на имплантацию волокон из ПГА Изучение процесса взаимодействия в системе лимплантаты ПГА-ткани включало анализ реакции и морфогенеза тканей на имплантированные нити с учетом силы и длительности воспаления, динамики образования и инволюции фиброзной капсулы и ее клеточного состава, времени развития и созревания коллагеновых волокон, а также состояния шовных волокон в сроки 1, 2, 4, 8, и 24 недели после операции.

Функциональные свойства шовного материала из ПГА оценены положительно. Макроскопические исследования постоперационных швов показали, что моножильные волокна из ПГБ и ПГБ/ПГВ, аналогично материалам сравнения, надежно удерживал швы мышечно-фасциального разреза в течение наблюдаемого периода у всех животных. Реакция тканей на оперативное вмешательство и последующую имплантацию шовного материала из ПГА обоих типов протекала по обычной схеме, характерной для раневого процесса и реакции на инородное тело (рис.7).

Рис. 7. Морфология тканей вокруг волокон, изготовленных из ПГА (а) и кетгута (б), имплантированных в мышцу крыс в разные сроки наблюдения. Обозначения: фкфиброзная капсула; мвмышечные волокна.

Гематоксилин-эозин. Маркер 0,01 мм а б Ответная реакция тканей по силе была аналогичной реакции мышц на шелк, и существенно менее выраженной в сравнении с реакцией на кетгут.

Микроскопическая картина в месте имплантации ПГА нитей обоих типов на 7-е сутки после операции характеризовалась незначительным отеком тканей вокруг имплантированных нитей, лейкоцитарной инфильтрацией и единичными тонкими зонами некроза. Через 2 недели признаки воспаления уменьшились, незначительная отечность тканей вокруг всех имплантатов сохранялась; в зоне воспаления по-прежнему встречались лейкоцитарные клетки; отмечено начало формирования вокруг имплантатов фиброзных капсул.

1 2 4 8 16 Время, недели 6543211 2 4 8 16 Время, недели ПГБ ПГБ/ПГВ шелк кетгут Рис.8. Морфометрические показатели реакции мышечной ткани на имплантацию шовных волокон из ПГА и традиционного шовного материала в разные сроки наблюдения Количество макрофагов, п/зр.

Толщина фиброзной капсулы, мкм Через 4 недели толщина фиброзных капсул вокруг нитей из ПГА составила 172,2313,64 мкм. Это было сопоставимо с реакцией на шелк и значительно меньше показателей в месте имплантации кетгута. Вокруг нитей из ПГА продолжало увеличиваться количество активных, с большим количеством выростов и клеточных лизосомальных структур макрофагов, до 11-12 в поле зрения. Капсулы в основном были представлены фибробластами и коллагеновыми волокнами, которые начинали формироваться в пучки. Через недель гистологическая картина тканей в зоне имплантации экспериментальных и контрольных нитей оставалась практически без изменений, как и толщина капсул и их клеточный состав. Спустя 16 недель вокруг нитей из ПГА зафиксировано значительное истончение капсул, их средняя толщина сократилась до 54,093,28 при рядности фибробластов на уровне 4,640,37; количество активных макрофагов в тканях, примыкающих к имплантату, по-прежнему оставались на высоком уровне. Через 24 недели отмечена дальнейшая инволюция фиброзных капсул вокруг шовного материала из ПГБ и ПГБ/ПГВ, при этом ТК уменьшились, соответственно, до 48,025,25 и 33,732,05 мкм (рис.7,8).

Спустя 9 месяцев толщина капсул вокруг экспериментальных нитей составляла 20-40 мкм, они были окружены здоровыми тканями из вновь сформированных волокон, которые ориентированы вокруг полимерного имплантата. Через 12 месяцев фиброзной капсулы вокруг имплантатов практически не наблюдали. В непосредственной близости с полимерной нитью, по ее окружности, а также в примыкающих тканях по-прежнему фиксировали значительное количество моно- и полиядерных макрофагальных клеток (рис.9). В эти сроки, несмотря на присутствие ПГА в мышечной ткани животных, отрицательной реакции тканей на инородное тело не зафиксировано.

а б Рис.9. Макрофагальная инфильтрация в зоне имплантации ПГА: а-макрофаги на поверхности полимерного имплантата, маркер 1 мкм; б- ГКИТ в структуре фиброзной капсулы вокруг волокон, изготовленных из ПГА; маркер 0,01 мм.

Обозначения: ГКИТ- гигантские клетки инородных тел; м-макрофаги В целом, показано, что реакция тканей на ПГА сопоставима с реакцией на хирургический шелк и по силе и длительности асептического воспаления выражена в меньшей степени по сравнению с реакцией на разрушаемый кетгут.

Ответ тканей на имплантацию ПГА характеризуется типичной реакцией на инородное тело в виде непродолжительного асептического воспаления и пролиферации с выраженной макрофагальной стадией, приводящих к образованию фиброзной капсулы вокруг имплантата, которая спустя 4-месяцев подвергается инволюции, достигая толщины 40-60 мкм.

Соединительно-тканные капсулы вокруг материалов сравнения подвержены инволюции в значительно меньшей степени. В целом, установлено, что экспериментальные образцы шовного материла из ПГА обладают необходимой прочностью в течение всего периода заживления мышечно-фасциальных ран и не уступают по функциональным характеристикам традиционным шовным материалам.

3. Исследование эффективности применения ПГА для конструирования биосовместимых эндопротезов Материалы для изготовления эндопротезов, используемых для реконструктивных операций на сосудах и внутренних органах, остро востребованы. Для повышения биосовместимости эндопротезов исследуются различные подходы, включая нанесение специальных покрытий на металлические изделия и создание полностью биоразрушаемых полимерных стентов. Возможность использования ПГА для конструирования эндопротезов исследована в настоящей работе.

3.1. Разработка экспериментальных моделей эндопротезов из ПГА Использованы высокоочищенные образцы ПГА на основе разработанной методики (Шишацкая, 2003; Севастьянов с соавт., 2003), обладающие тромборезистентностью и не инициирующие ферментные системы крови.

Разработаны три модели стентов: ячеистой структуры, спиральный и трубчатой. Прототип ячеистого внутрисосудистого стента был изготовлен методом плетения из полимерных волокон диаметром 0,2 мм, полученных экструзией из расплава ПГБ с последующим ориентированием. Для закрепления волокон в месте переплетения последних применяли термическую обработку или полимерный раствор высокой плотности. Созданные экспериментальные образцы прототипа полностью разрушаемого полимерного стента диаметром от 4 до 6 мм и длиной 40-60 мм. Стенты спиральной структуры изготовлены из фрагментов предварительно изготовленной плотной полимерной пленки из ПГБ шириной 2 мм и длиной 120 мм.. Полимерным полоскам придавали форму спирали с использованием нагретых до температуры деформации полимера металлических стержней. Стенты обеих конструкций имели удовлетворительные значения прочностных показателей:

модуля Юнга 1,5-2,3 и абсолютной прочности от 15 до 20 МПа.

Для конструирования трубчатого стента были использованы растворы ПГБ, которые наносили на поверхность стеклянной матрицы. После испарения растворителя сформированную полимерную трубочку снимали с матрицы.

Получена серия трубчатых стентов различного диаметра, толщины и прочности, гладкие и со складчатой поверхностью. Абсолютная прочность трубчатых стентов составила до 25 МПа; стенты сохраняли эти показатели при экспонировании в фосфатном буфере в течение 100 суток.

3.2. Исследование экспериментальных моделей полностью разрушаемых стентов из ПГА Впервые исследованы модели полностью биоразрушаемых стентов, изготовленных из ПГА для эндобилиарного протезирования.

Экспериментальные образцы стентов трубчатой структуры, изготовленных из сополимера ПГБ/ПГВ, были имплантированы в общий желчный проток животным (беспородные собаки весом 10-12 кг) с фиксацией к стенке протока моножильным шовным материалом из ПГБ/ПГВ; однорядный холецистодуоденоанастомоз также был наложен шовным материалом из ПГБ/ПГВ (рис.10).

а б в Рис. 10. Внешний вид экспериментальных трубчатых эндопротезов и шовных волокон из сополимера ПГБ/ПГВ (а). После выполнения верхнесрединной лапаротомии верифицирован желчный проток и произведена холедохотомия. Стент имплантирован в супрадуоденальную часть желчного протока (б) и фиксирована к стенке протока моножильным волокном, изготовленным из ПГБ/ПГВ (в) Группе сравнения были установлены стенты из силикона и наложен холецистодуоденоанастомоз с помощью шовного материала Викрил;

негативным контролем служили интактные животные. В раннем послеоперационном периоде всем животным проводили антибиотикопрофилактику цефтриаксоном, вводили анальгетики и спазмолитики.

Все животные удовлетворительно перенесли оперативное вмешательство;

выживаемость составила 100%. Наблюдения осуществляли в течение 100 суток.

Анализ состава периферической крови в контрольной и исследуемой группах показал, что в основном эти показатели находились в границах физиологической нормы. В лейкоцитарной формуле крови во все сроки наблюдения выявили незначительный постоперационный лейкоцитоз, от до 12*109/л, и повышение СОЭ до 10-15 мм/ч у всех оперированных животных относительно интактного контроля. У животных в группе положительного контроля повышение СОЭ сохранялось до конца наблюдения. Анализ результатов определения мочевины, общего белка в сыворотке крови свидетельствует об отсутствии негативного влияния имплантированных полимерных изделий из ПГА на показатели азотистого обмена и функцию почек. Достоверных различий между группой сравнения и исследуемой группой среди показателей, характеризующих функцию поджелудочной железы (амилаза крови), также выявлено не было. У животных группы сравнения с 30-х суток было зарегистрировано умеренное повышение уровня общего билирубина, которое было обусловлено нарушением оттока желчи. В экспериментальной группе содержание общего билирубина, основного маркера холестаза, было в границах нормы.

Во время аутопсии оценивали наличие выпота, спаечного процесса в свободной брюшной полости и подпеченочном пространстве, внешний вид желчного протока в области нахождения протеза, внешний вид холецистоэнтероанастомоза, печени и двенадцатиперстной кишки. У животных, которым был установлен стент из силикона, на аутопсии имело место незначительное количество серозного выпота, в подпеченочном пространстве - умеренный спаечный процесс; в области установки стента определялась инфильтрация, расширение протока, рубцовые изменения.

Слизистая протока в месте контакта со стентом имела бледно-розовый цвет, отмечались участки атрофии. Стенты были хрупкими, в конце опыта на них имелись отложения солей и пигментов желчи; отмечен умеренный воспалительный процесс со стороны слизистой; швы, наложенные Викрилом, были состоятельными с незначительной инфильтрацией. При морфологическом исследовании препаратов протока, желчного пузыря, двенадцатиперстной кишки, печени у животных отмечены признаки воспалительной клеточной реакции и фиброза. В печени определялись признаки холестаза, разрушение гепатоцитов и балок. В зоне анастомозов также присутствовали признаки воспалительной клеточной реакции, множество лейкоцитов, макрофагов, грубая рубцовая ткань.

У животных экспериментальной группы на аутопсии патологии в свободной брюшной полости и подпеченочном пространстве не выявлено.

Стенты, изготовленные из ПГБ/ПГВ, сохраняли первичные физические характеристики, не были подвержены процессам кальцификации, не было отмечено сужения просвета стентов, их внутренний диаметр составил 3,50,1мм. При макроскопическом исследовании холецистодуоденоанастомозов со стороны слизистой данных за наличие воспалительных, инфильтративных и рубцовых изменений не отмечено (рис.11); все анастомозы функционировали. Просвет анастомоза в среднем составил 12,34,3 мм.

В Б А В Б Рис. 11. Гистологическое строение зоны анастомоза двенадцатиперстной кишки собаки с использованием шовного материала из сополимера ПГБ/ПГВ: А- собственный слой мукозной мембаны; Б -мышечный слой- гладкомышечные клетки;

В - субмукозный слой. Окраска гематоксилин-эозин; увеличение х 2Морфологическое исследование участков желчного протока и желчного пузыря у экспериментальных животных патологических изменений не выявили (рис.12).

а б Рис. 12. Слизистый (а) и мышечный (б) слой желчного протока в месте имплантации трубчатого стента из ПГБ/ПГВ. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 2Желчный проток в месте установки стента имел обычный вид; миграции стентов не отмечено. Просвет протока у всех животных был сохранен, имел обычные размеры (0,4-0,5 мм). Общий желчный проток выстлан слизистой оболочкой со складчатым высоким цилиндрическим эпителием с микроворсинками. Эпителий располагается на собственной пластинке слизистой, которая представлена рыхлой соединительной тканью, а вся слизистая лежит на слое гладкомышечной ткани, между которыми располагается соединительная ткань и эластические волокна. Серозная оболочка желчного протока представлена тонким слоем мезотелия.

Морфологическая картина подтверждает отсутствие воспалительной клеточной реакции. В результате процесса биоразрушения ПГА к концу эксперимента отмечено уменьшение массы стентов на 30-35% от исходной;

толщина стенки стентов несколько уменьшилась, в среднем 0,05-0,08 мм, с сохранением изначального диаметра изделий - 3,50,1мм.

Таким образом, физиологические, биохимические и морфологические исследования животных экспериментальной группы, которым были имплантированы экспериментальные стенты из ПГА, не выявили данных, свидетельствующих о том, что полимерные изделия (стенты и моножильные волокна) вызывают патологические реакции тканей желчевыводящих путей.

Это позволяет заключить о перспективности применения ПГА для конструирования эндопротезов для эндобилиарной хирургии.

4. Биосовместимые и остеопластические свойства объемных имплантатов из ПГА Конструирование полимерных композитных материалов для регенерации костных тканей является актуальной и сложной задачей. Успех создания и применения костнозамещающих имплантатов зависит от многих составляющих. Остеозамещающие имплантаты должны обладать биосовместимостью, многофункциональностью, достаточной механической прочностью и возможностью стерилизации без изменения свойств. ПГА представляют интерес для реконструкции дефектов костной ткани, так как обладают высокой механической прочностью, а скорости их разрушения in vivo в несколько раз ниже, чем у других известных биоразрушаемых материалов, что позволяет рассматривать ПГА для длительно текущей регенерации дефектов костной ткани.

4.1. Исследование биосовместимости полимерных (ПГБ, ПГБ/ПГВ) и композитных (ПГБ/ГАП) имплантатов Исследования биологической совместимости разработанных объемных полимерных имплантатов из ПГА и композита ПГА с гидроксилапатитом выполнены в культуре клеток при прямом контакте с экстрактами, полученными из этих изделий. Тестирование потенциальной цитотоксичности экстрактов проведено в первичной культуре остеобластов. Тест с трипановым синим показал, что 7-дневные экстракты не вызывают грубых морфологических изменений клеток и их гибели. Различий между биологическим действием экстрактов ПГБ и сополимерных образцов ПГБ/ПГВ не выявлено, что согласуется с ранее полученными результатами при тестировании полимерных пленок и волокон из ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ с различным включением гидроксивалерата. Экстракты, полученные из композита ПГА/ГАП, наполненного гидроксилапатитом на 10, 20 и 30 % не влияли на состояние клеток, число которых варьировало в пределах 90-100 % и статистически не отличалось от показателей в контроле (экстракт культурального полистерина). Только продукты экстракции биологического ГАП и образцов композита ПГБ/ГАП с соотношением компонентов 50:50 по массе вызывали на 20-22% снижение прикрепляемости клеток по сравнению с контролем, что может быть связано с присутствием в исходном биологическом ГАП аморфных (нестехиометрических, растворимых) фракций фосфатов кальция, влияющих на активную реакцию среды, а также прикрепляемость и пролиферацию клеток (Oreffo et al, 1998). Результаты тестирования остальных образцов не выявили отклонений от контроля.

Пролиферативный потенциал матриксов исследован в культуре остеобластов. Клеточную пролиферацию определяли после 10-ти суток культивирования, используя ММТ-тест с одновременным определением активности щелочной фосфатазы (рис. 13). Количество пролиферирующих остеобластов было несколько выше на композитных (ПГБ/ГАП) матриксах по сравнению с матриксом из ПГБ, не содержащем гидроксилапатита.

Наибольший прирост клеток зафиксирован на матриксах из композита с содержанием гидроксилапатита 10 и 20%, соответственно, 240 и 260 х 106, гидрофильная поверхность гибридных матриксов способствовала более активной прикрепляемости клеток, в результате этого исходная концентрация прикрепленных клеток на ПГБ/ГАП была выше, чем на гидрофобном матриксе из ПГБ. При более высоком содержании ГАП в композите (50% по массе) плотность клеток была ниже, однако достовернее выше, чем на ПГБ-матриксе.

Активность щелочной фосфатазы, которая является маркером дифференцировки остеобластов, была достоверно выше на всех типах матриксов, содержащих ГАП, по сравнение с клетками, растущими на матриксе из ПГБ. При этом наибольшей активностью обладали клетки, растущие на матриксах с невысоким содержанием ГАП (10 и 20%), соответственно, 4,2 и 4,мМ/мин клетка.

Рис. 13. Пролиферация остеобластов крысы в тесте ММТ (A) и активность щелочной фосфатазы (ЩФ) (Б) in vitro на 10-й день культивирования на композитных матриксах ПГБ/ГАП с содержанием гидроксилапатита 10, 20, 30, 40 и 50 вес.% (2,3,4 и 5, соответственно) по сравнению с матриксом из ПГБ (1) Исследование возможного общетоксического действия имплантатов из ПГБ и композита ПГБ/ГАП выполнено в остром опыте на белых мышах линии BALB/c, которым подкожно были имплантированы матриксы разных типов, изготовленные из полимера (ПГБ и ПГБ/ПГВ) и композита ПГБ/ГАП с различным соотношением компонентов.

Внешних проявлений интоксикации у животных после операции и введения всех типов имплантатов в течение всего наблюдаемого периода не выявлено. Отклонений в массе тела, массе внутренних органов у экспериментальных животных относительно интактных животных не отмечено. Макроскопические исследования внутренних органов животных не выявили каких-либо патологических изменений. Макроскопический анализ тимуса и селезенки (центральных органов иммунной системы) и динамика их массы в эксперименте по сравнению с контрольными животными показали отсутствие у животных выраженных иммунных реакций на имплантированные матриксы. Колебания концентрации количества эритроцитов и лейкоцитов в крови находились в пределах физиологических величин; сдвигов в лейкоцитарной формуле крови всех экспериментальных животных также не выявлено. Исследование реакции тканей на подкожную имплантацию изучаемых объемных матриксов в конце эксперимента показало отсутствие у животных признаков выраженной воспалительной реакции. Не выявлено значительной инкапсуляции имплантатов, что свидетельствует о слабом раздражении клеток соединительной ткани. Ответная реакция соединительной ткани, связанная с развитием фиброза на имплантацию матрикса, изготовленного ПГБ, зафиксирована на уровне 1 балл, из композита ПГБ/ГАП с 10 и 20-% наполнением ГАП - также 1 балл. При анализе тканей в месте введения имплантата из композита ПГБ/ГАП с соотношением компонентов 1:по массе зафиксировано увеличение адгезии образца с тканями (2 балла), что может свидетельствовать о наличии некоторого раздражающего воздействия на ткани со стороны ГАП (аналогично реакции, зафиксированной выше в культуре клеток in vitro). В целом, показано, что имплантаты из ПГБ, а также в композиции с кальций-фосфатными материалами (ПГБ/ГАП) биосовместимы и не вызывают реактивных изменений со стороны системы крови, а также выраженных воспалительных реакций тканей in vivo.

4.2. Оценка остеогенного потенциала ПГА в тесте эктопического костеобразования Остеопластические свойства ПГА исследованы в тесте эктопического костеобразования методом гетеротопной трансплантации имплантатов, который позволяет оценить адгезионные свойства материала по отношению к клеткам костного мозга, способность продвигать (кондукция) клетки по его поверхности; индуцировать рост тканевой пластинки из столбика костного мозга. Для проведения эксперимента были изготовлены объемные имплантаты из ПГБ и композита ПГБ/ГАП (наполнение полимера ГАП на 20% по массе), на поверхность которых в стерильных условиях в полной культуральной среде (90 % среды DMEM, 10 % ЭТС, гентамицин 80 мг/л, L-глутамин 280 мг/л) наносили столбик костного мозга, извлеченного из бедренной кости половозрелых крыс Вистар (15-20 х 106 клеток) и помещали в СО2-инкубатор на 60 мин для адгезии костномозговых клеток к поверхности. Биоактивные матриксы имплантировали подкожно половозрелым крысам Вистар. Cпустя суток животных выводили из эксперимента; имплантаты извлекали, проводили цифровую съемку объектов для последующей компьютерной морфометрии размеров выросшей тканевой пластинки и стандартные гистологические исследования.

Имплантаты из ПГБ, ПГБ/ПГВ и композита ПГБ/ГАП практически в равной степени показали высокую биосовместимость in vivo. При анализе ответной реакции тканей на имплантаты, изготовленные из ПГА и композита ПГА/ГАП, не выявлено неблагоприятных проявлений, выраженного развития фиброзных капсул вокруг всех имплантатов. Клетки костного мозга, нанесенные на поверхность имплантатов, пролиферировали на поверхности и в объеме материала. Пролиферация и дифференцировка клеток способствовала заполнению пор имплантата соединительной тканью. Новообразованная ткань была представлена клетками с вытянутыми ядрами (фибробластами и фиброцитами), мононуклеарами (макрофагами и лимфоцитами), многоядерными клетками, пронизана капиллярами, располагающимися между коллагеновыми волокнами. В многочисленных участках, прилежащих к имплантату, отмечено формирование костной ткани (рис. 14).

Рис. 14. Образование костной ткани в порах имплантата ПГБ/ГАП через 45 суток после подкожной имплантации.

Окраска гематоксилином- эозином. Увеличение х1Основное вещество остеоидной ткани окрашивалось гомогенно, главным образом базофильно (что говорит о незрелости ткани), с примесью оксифилии.

Наблюдали "слоистость" основного вещества ткани, определяемую ходом коллагеновых волокон и расположенных вдоль них клеток. Костные клетки располагались более или менее регулярно, имели вытянутую или округлую форму с овальными либо уплощенными ядрами. Эти результаты показали, что сконструированные имплантаты из ПГБ и композита полимера с гидроксилапатитом (ПГБ/ГАП), обладают остеокондуктивными свойствами и способствуют образованию костной ткани на поверхности и внутри имплантатов.

4.3. Результаты исследования остеоиндуктивных свойств имплантатов из ПГА на модели сегментарной остеотомии Для определения остеоиндуктивных свойств ПГА и выявления оптимальных условий протекания репаративного остеогенеза проведен эксперимент на крысах линии Вистар с заполнением модельных дефектов костей (тест сегментарной остеотомии), которые были разделены на 6 групп:

три экспериментальные группы (имплантаты, разработанные на основе ПГБ), две группы сравнения (имплантаты из коммерческих материалов), контрольная группа (без имплантата, заживление дефекта - под свертком крови). Область для формирования дефекта выбрана с учетом известных данных о том, что оптимальной моделью у крыс, позволяющей корректно оценить эффективность влияния на репаративный остеогенез имплантатов из различных материалов, является дефект метаэпифизарной зоны большеберцовой кости диаметром от 1,5 до 3,0 мм и глубиной от 1,0 до 3,5 мм (Берченко с соавт., 2006; Арсентьев, 2007). Для формирования дефекта костной ткани у животных под ингаляционным наркозом в области эпифиза большеберцовой кости после обнажения мыщелков и верхней трети правой голени с помощью остеотома диаметром 2,5 мм при постоянном охлаждении физиологическим раствором создавали дефекты диаметром 3,0 мм и глубиной до 2,0 мм, которые заполняли сконструированными имплантатами.

Исследованы экспериментальные имплантаты трех типов, изготовленные из полигидроксибутирата (ПГБ), композитного материала полигидроксибутират/гидроксилапатит (ПГБ/ГАП) с содержанием ГАП 20 % (фирмы ЗАО НПО Полистомо, Москва) и полигидроксибутирата, наполненного рекомбинантным морфогенетическим белком человека ПГА/rhBMP-2 (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd, Израиль) (рис 15). В качестве материалов сравнения использовали композитный материал гидроксилапатит/коллаген (препарат Коллаполо, ЗАО НПО Полистом, Москва) и препарат аллокости Bio-OSSо (фирмы "Geistlich", Швейцария).

Анализировали общее состояние животных, опороспособность оперированной конечности, состояние тканей в месте дефекта (по результатам замеров плотности костной ткани с использованием компьютерной рентгенографии (установка Kodak Trophy IRIX-70 и стандартной гистологической техникой.

С использованием Image Analysis System Carl Zeis (Германия) проводили анализ изображений и морфометрические исследования структуры костной ткани в месте дефекта, оценки состояния и динамики биоразрушения материала имплантатов.

У всех животных раны зажили первичным натяжением; через 7-8 дней животные нагружали оперированную конечность в полном объеме. По данным рентгенологических исследований зон разрежения костной ткани, образования фиброзных капсул вокруг имплантатов всех типов не выявлено. Заживление костных дефектов у животных протекало по общим закономерностям, включая фазы посттравматических изменений тканевых элементов, регенерации и адаптивной ремоделяции.

Заполнение модельных дефектов имплантатами, изготовленными из различных материалов, способствовало регенерации костного дефекта в различной степени (рис.15).

Сут.

I II III IV V Рис. 15. Поперечные спилы костей в области дефекта: I -ПГБ, II - композит ПГБ/ГАП (наполнение полимера ГАП 20% по массе), III - ПГБ+ костный морфогенетический белок-2 (BMP-2), IV - Bio-OSSо, V -Коллаполо. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х При использовании для заполнения костного дефекта имплантата, изготовленного из ПГБ, через 14 суток вокруг фрагментов полимера зафиксирована пролиферация остеогенных клеток, дифференцировка их в остеобласты и образование новой костной ткани в виде костных трабекул с формированием в межтрабекулярных пространствах сосудов капиллярного типа. В костных полостях зафиксированы большие фрагменты полимера, на границе которого происходило образование хрящевой и незрелой костной тканей. На препаратах видны новообразованная компактная кость и гаверсовы системы, остеоциты и остеоны, линии цементации (рис.16а). Через 1 месяц в зоне дефекта на фоне активной перестройки в компактную кость, что подтверждалось наличием остеонов с четкими линиями цементации, зафиксировано значительное сокращение количества полимерного имплантата;

фрагменты полимера на гистологических срезах составили около 60% от исходной площади. В отдельных участках препаратов наблюдали разрастание остеогенной ткани вокруг ПГБ с пролиферацией остеобластов и образованием остеоида. К окончанию эксперимента (3 месяца) в зоне имплантации ПГБ отмечено активное формирование новообразованной кости, имеющей дефинитивное строение, о чем свидетельствовали пластинчатая организация и формирование остеонов. В препаратах видны отдельные мелкие фрагменты разрушающегося полимера. Площадь, занимаемая фрагментами полимера, составила не более 25% от исходной. Присутствие полимерного материала в эти сроки свидетельствует о медленном процессе его биодеградации.

Проявлений воспалительной реакции в месте контакта имплантата с нативной костью и формирования капсулы не отмечено.

а б Рис. 16. Тканевой регенерат в области имплантации ПГБ, 14 суток; а - формирование остеогенной ткани вокруг фрагмента ПГБ (1); б-пролиферирующие остеобласты; б- новосформированные гаверсовы системы. Окраска гематоксилинэозин, увеличение х 100 (а) и 200 (б) При замещении модельных дефектов костной ткани имплантатами из композита ПГБ/ГАП картина репаративного остеогенеза несколько отличалась.

На 14 сутки в области дефекта наблюдали формирование незрелой костной ткани (рис. 17 а). В костных полостях частицы композитного матрикса располагались вместе с кроветворными клетками в виде крупных агрегатов.

Отмечено формирование тонких костных пластинок с большим количеством пролиферирующих остеобластов. Отчетливо фиксировались зоны значительных массивов не разрушенного матрикса (рис.17 б).

а б Рис.17. Тканевой регенерат в области имплантации ПГБ/ГАП, 14 суток; ановообразованные костные балки, построенные из незрелой костной ткани; б - фрагменты имплантированного материала, окруженного соединительной тканью и костными балками. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 1 Через 1 месяц объем остеогенной ткани заметно увеличился, но расположение костных пластин было хаотичным; система остеонов выражена в меньшей степени, чем при использовании ПГБ. На срезах отчетливо видны фрагменты имплантатов, не интегрированные в новообразованную костную ткань;

отмечено усиление продукции гемопоэтических клеток. Формирующаяся компактная кость с сохранением крупных полостей достаточно рыхлая, что позволяет предполагать отличия биомеханических свойств. Через 3 месяца зафиксирована практически полностью сформированная компактная костная ткань, содержащая систему остеонов, однако костные пластинки в отдельных участках гистологических препаратов имели не продольную, а хаотическую направленность. По-прежнему в препаратах видны достаточно крупные фрагменты имплантатов, суммарная площадь которых составляла до 30-40% от исходной, что в 2 раза выше этого показателя при использовании имплантата из ПГБ. Таким образом, резорбция композитного матрикса протекала значительно медленнее по сравнению с матриксами из ПГБ.

При регенерации костной ткани в месте имплантации матрикса из ПГБ, нагруженного стимулятором остеогенеза - костным морфогенетическим белком-2, на 14 сутки отмечены признаки индукции преимущественно хрящевой ткани с образованием массы хондробластов и хондроцитов (рис. 18).

а б Рис.18. Тканевой регенерат в области имплантации ПГБ/rhBMP-2б, 14 суток:

а- поле хрящевой ткани, являющейся плацдармом для развертывания энхондрального остегенеза; б-фрагменты имплантата, окруженные соединительной тканью.

Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 1Новообразованная костная ткань имела рыхлую структуру и разнонаправленность пластинок. Количество имплантата в агрегатах в препаратах было таким же, как у животных, которым имплантировали ПГБ.

Часть этих агрегатов была окружена клетками соединительнотканной природы.

Через 1 месяц эксперимента в препаратах отмечено массивное разрастание созревающей соединительной ткани; имелись признаки прямого остеогенеза (интрамембранозная оссификация) с формированием тонких кружевных костных балок, между которыми расположены соединительная ткань и единичные гемопоэтические клетки. Костные балки покрыты остеогенными клетками, отмечалось образование костно-хрящевых структур, имеющих хаотичное направление. В препаратах обнаружено много крупных фрагментов имплантата. Через три месяца новообразованная костная ткань представлена в основном компактной костью с большим количеством остеонов с наличием на границах соседних систем линий цементации. Межтрабекулярные костные полости широкие, практически пустые, выстланы остеогенными клетками. Не смотря на то, что система остеонов сформирована, направление костных пластинок не всегда строго параллельно, а костная ткань имеет достаточно рыхлую структуру. Количество полимера существенно уменьшилось, но попрежнему присутствовало в препаратах; его площадь составила 20-25% от исходной.

При использовании имплантатов из остеозамещающих фирменных материалов Коллаполо и Bio-OSSо регенерация костного дефекта протекала на фоне более активной резорбции матриксов в сравнении с матриксами на основе ПГБ. При использовании Коллаполо спустя 14 суток в зоне имплантации отмечены немногочисленные костные трабекулы.

Пролиферативная активность остеогенных клеток, выстилающих костные полости, выражена очагово. Отмечено значительное утолщение периоста за счет разрастания фиброзного слоя, при этом остеогенный слой периоста тонкий, представлен неактивными остеогенными клетками. В препаратах рядом с нежными костными пластинками видны фрагменты имплантата;

площадь фрагментов составила 20-25%. Через месяц костные трабекулы более выражены, чем на сроке 14 суток; межтрабекулярные костные полости более узкие, содержат много зрелой неоформленной волокнистой соединительной ткани, а также кроветворные клетки. Активность остеогенных клеток и остеобластов умеренная, то есть остеогенез продолжается с началом перестройки и формирования компактной кости. Признаков имплантированного материала не обнаружено. К концу эксперимента встречаются области, не до конца заполненные новообразованными костными структурами. При использовании препарата Bio-OSSо на сроке 14 суток материал в препаратах практически не определяется; признаки остеогенеза выражены слабо. Определяются немногочисленные костные трабекулы с оптически плотным органическим матриксом. Пролиферативная активность остеогенных клеток, выстилающих костные полости, выражена очагово. Через месяц в препаратах в основном представлена компактная кость с четкими гаверсовыми системами. Периост утолщен за счет фиброзного слоя. Костномозговой канал широкий, заполнен костным мозгом. Спустя три месяца, картина остеогенеза аналогична сроку 1 месяц. В препаратах зафиксирована кость с широким костно-мозговым каналом, заполненным костным мозгом.

Эндост выстлан остеогенными клетками. Периост фиброзирован. В целом, в этом варианте эксперимента морфологические признаки репаративной регенерации выражены слабее, объем новообразованной костной ткани меньше, чем при использовании всех типов имплантатов, полученных на основе ПГБ.

Восстановление костного дефекта в контроле, без имплантата (лпод свертком крови), протекало по обычной схеме реконструкции. Через 14 суток в препарате отмечены признаки непрямого (энхондрального) остеогенеза.

Отмечены области рыхлой волокнистой соединительной ткани в зоне формирования хрящевой ткани. Через месяц зафиксирована менее зрелая по сравнению с экспериментальными группами животных компактная кость с гаверсовыми системами и линиями цементации. Активность остеогенных клеток и остеобластов при этом невелика; остеокластический феномен отсутствует. На сроке три месяца препарат представлен компактной костью, костно-мозговой канал широкий, заполнен кроветворными клетками. Эндост представлен одним слоем остеогенных клеток.

Для сравнительной оценки эффективности остеогенеза в местах дефекта костной ткани проведена компьютерная рентгенография препаратов.

Регенерация костного дефекта с образованием более плотной костной ткани через три месяца была достоверно выше в случае применения имплантатов из ПГА по сравнению с процессом репаративного остеогенеза, протекающего в местах имплантации коммерческих материалов. Результаты проведенных исследований показали, что имплантаты из ПГБ препятствуют прорастанию в зону дефекта костной ткани рыхлой соединительной ткани, способствуют образованию новой кости; полимер обладает выраженными остеопластическими свойствами, даже без использования стимулятора остеогенеза; медленно, адекватно росту новой костной ткани деградирует in vivo, постепенно замещается ею, обеспечивает оптимальное течение репаративного остеогенеза.

6. Исследование ПГА в качестве биосовместимого матрикса для депонирования и доставки лекарственных средств Разработка долговременных систем доставки лекарственных средств является наиболее перспективным и быстро развивающимся направлением в современной фармакологии. Главное достоинство этих систем заключается в возможности длительного и стационарного поддержания требуемого уровня лекарственного препарата в крови и/или тканях пациента (Kim et al., 2002; Yeh and Huang, 2003). Успех конструирования таких систем во многом определяется наличием адекватного материала, используемого в качестве матрикса для депонирования препарата.

С использованием ПГА в различных фазовых состояниях (растворы, эмульсии, порошки) отработаны способы конструирования полимерных матриксов в виде пленок, прессованных таблеток и микрочастиц; исследована биосовместимость и кинетика ликвации препаратов in vitro и in vivo. Медленная кинетика выхода препаратов из полимерного матрикса в среду и отсутствие резких выбросов в начальные периоды наблюдения свидетельствуют о перспективности ПГА в качестве матрикса для депонирования и долговременной доставки лекарственных средств.

Микросферы - наиболее перспективная форма лекарственного матрикса, однако при введении микросфер в организм в силу большой поверхности при малом объеме материала суммарная зона контакта с тканями велика, что может вызвать выраженную ответную реакцию.

6.1. Реакция мышечной ткани на имплантацию полимерных микрочастиц Для изучения ответной реакции мышечной ткани на имплантацию микрочастиц из ПГА 20 мг стерильных микросфер в 0,3 мл физиологического раствора были введены внутримышечно в мышцу бедра самкам крыс линии Вистар. Через сутки после введения микросфер и далее еженедельно животных выводили из эксперимента; оценивали общее самочувствие, динамику веса, макроскопию внутренних органов и реакцию тканей на имплантацию микросфер. Все экспериментальные животные хорошо перенесли инъекцию полимерных микросфер. Ответ тканей характеризовался незначительной по силе и непродолжительной воспалительной реакцией, образованием нежной, хорошо васкуляризированной соединительно-тканной капсулы, истончающейся со временем, на границе зоны введения микрочастиц и мышечной ткани, а также выраженной и постепенно нарастающей макрофагальной инфильтрацией с присутствием гигантских клеток инородных тел (рис.19). Спустя неделю после имплантации на границе зоны введения микросфер и неповрежденных интактных мышечных волокон отмечена инфильтрация фибробластическими клеточными элементами и начало формирования тонкой фиброзной капсулы как ответной реакции на инородное тело. Через 2 недели кластер имплантированных микросфер был окружен тонкой фиброзной капсулой, в эти сроки количество крупных (свыше 10-15 мкм) частиц значительно сократилось и не превышало 14% в поле зрения. В структуре капсул идентифицированы активные фибробласты; средняя толщина фиброзной капсулы не превышала 5060 мкм; рядность фибробластов в ней составила 4-6, что практически в 3 раза ниже по сравнению с зафиксированной ранее реакцией мышечных тканей на имплантацию шовных волокон из ПГА. Площадь отека в зоне имплантации значительно уменьшилась, некротических участков не отмечено. С увеличением длительности наблюдения отмечено нарастание макрофагальной инфильтрации в зоне введения микросфер, как моноядерных макрофагов, так и ГКИТ. Через 5 недель отмечено увеличение количества моно- и полиядерных макрофагальных клеток; фракция крупных частиц сократилась и не превышала 4-5 % от общего числа в поле зрения, что свидетельствует о процессе разрушения полимерного матрикса. Вокруг крупных микросфер (диаметром более 10 мкм) отмечено скопление ГКИТ с 6-8 ядрами. На границе мышечной ткани и зоны микросфер отмечено сохранение истонченной фиброзной капсулы, образованной 2-3-мя рядами зрелых фибробластических клеток.

Тенденция к усилению макрофагальной реакции сохранялась также через 7- недель после введения микрочастиц с увеличением численности среди микрочастиц ГКИТ и ростом количества ядер в них. Образования грубых фиброзных капсул на границе зоны введения микрочастиц и тканей, а также вокруг отдельных микрочастиц не обнаружено. Это весьма важное обстоятельство, так как в случае формирования фиброзных капсул вокруг полимерных частиц вероятно существенное замедление оттока лекарственных веществ из полимерного матрикса.

Рис. 19. Микроскопическая картина тканей в месте имплантации микросфер из полигидроксибутирата внутримышечно (полутонкие срезы). Обозначения: мч - микрочастицы, мф - макрофаги, ГКИТ - гигантские клетки инородных тел, мв - мышечные волокна, фк - фиброзная капсула. Маркер - 20 мкм В конце эксперимента (11-12 недели наблюдения) по-прежнему характерной реакцией тканей было наличие выраженной макрофагальной инфильтрации с большим количеством ГКИТ, окружающих полимерные частицы или сгруппированными вокруг кластера мелких микрочастиц;

отмечено наличие ГКИТ с 10-12 и более ядрами (рис.20). Отмечено значительное уменьшение в поле зрения количества крупных микросфер диаметром свыше 10-15 мкм (около 2-3%) и появление фрагментов разрушенных микрочастиц.

Рис.20.

Морфометрические показатели реакции мышечной ткани на имплантацию микрочастиц из ПГА в разные сроки наблюдения Однако, в течение всего эксперимента в тканях присутствовало большое количество неразрушенных микросфер, что свидетельствует о длительности процесса биоразрушения микрочастиц из ПГА in vivo.

5.2. Распределение и биоразрушение полимерных микрочастиц в тканях внутренних органов лабораторных животных Биосовместимость материала по отношению к крови является самым высоким уровнем биологической совместимости, и разработка материалов, пригодных для контакта с кровью, является актуальной задачей высокой сложности. Для оценки возможности введения изделий из ПГА в кровоток и доставки в ткани внутренних органов микрочастицы, полученные из радиоактивного по С полигидроксибутирата, диаметром до 4 мкм, были введены крысам в хвостовую вену (2 мг в 0,5 мл физиологического раствора на животное, радиоактивностью 6050 имп/мин/мг частиц). Это позволило изучить распределение микрочастиц во внутренних органах и впервые оценить реакцию тканей сердца, легких, печени, селезенки, почек на введение ПГА. Спустя 3 и 24 часа после введения микрочастиц, и далее еженедельно в течении 90 суток по три животных выводили из эксперимента, выделяли внутренние органы, проводили морфологический анализ, подвергали счету радиоактивности с использованием диоксанового сцинтилляционного раствора на автоматическом жидкостном сцинтилляционном счетчике TriCarb 2100TR (Perkin Elmer/Packard, США).

Все животные после внутривенного введения микрочастиц и далее в течение всего эксперимента были здоровы. Различий в росте и развитии животных и массе внутренних органов контрольной и экспериментальной групп не отмечено. Макроскопические исследования внутренних органов животных отклонений не выявили; гистологическая картина внутренних органов всех экспериментальных животных во все сроки наблюдения была идентичной интактному контролю. Распределение и аккумуляция частиц в тканях органов были различными с наибольшей аккумуляцией в печени и селезенке. Начиная с 28 суток эксперимента и далее зафиксировано достоверное снижение суммарной радиоактивности тканей органов, что позволяет говорить о том, что полимер разрушается, а С продукты разрушения полимера выводятся из организма.

Для сравнительной оценки активности биодеградации полимера в органах и определения времени жизни микрочастиц ткани органов животных были подвергнуты хроматографическому анализу. Анализировали содержание мономеров 3-гидроксимасляной кислоты, а также высокомолекулярного (не разрушенного) полимера. Для этого последний экстрагировали из тканей хлороформом и анализировали с использованием хроматографии. Анализ содержания радиоактивного углерода в тканях внутренних органов в сопоставлении с наличием в них высокомолекулярного полимера и продуктов деструкции полимера в виде мономеров 3-гидроксимасляной кислоты показал, что к концу эксперимента значительная доля радиоактивного полимера присутствует in vivo в виде мономеров. При этом, однако, зафиксировано наличие в органах животных в различные сроки наблюдения части целых полимерных микрочастиц. Обнаруженное относительно невысокое содержание высокомолекулярного полимера в органах, в особенности, в печени и селезенке, на фоне зарегистрированной высокой радиоактивности тканей этих органов, свидетельствует о высокой активности процесса разрушения полимерного матрикса в них. Этими экспериментами впервые доказана возможность использования полимерных микрочастиц из ПГБ для внутривенного ведения и доставки во внутренние органы. Зарегистрированное наличие высокомолекулярного полимера в органах свидетельствует о состоятельности полимера для долговременной (до 12 недель) доставки лекарственных препаратов в ткани внутренних органов путем внутривенного введения.

3.3. Лекарственная эффективность полимерных микрочастиц Лекарственная эффективность полимерных микрочастиц исследована на мышах с привитой асцитной карциномой Эрлиха (АКЭ) в 100-%-но летальной дозе (3 млн. клеток/животное) на примере депонированного в полимерный матрикс рубомицина гидрохлорида. Экспериментальной группе животных одновременно с суспензией клеток АКЭ были введены нагруженные рубомицином микрочастицы. Противоопухолевый эффект разработанной формы рубомицина оценивали по динамике смертности животных, уменьшению объема опухоли и концентрации клеток в асцитной жидкости.

Одновременно определяли количество некротически погибших клеток по окрашиванию трипановым синим.

Через 7 суток после прививания АКЭ в контрольной группе объем опухоли у животных составил в среднем 0,620,08 мл; у экспериментальных животных - менее на порядок (0,020,004 мл). При сопоставимом уровне общего количества клеток в 1 мл асцита в контрольной (3,490,41)108 и экспериментальной (1,250,31)108 группах, количество опухолевых клеток, погибших по типу некроза, у животных, получивших препарат, был достоверно выше, и их доля от общего количества клеток составила 3,04 % (в контроле - 1,88 %). Через 14 суток после прививания опухоли проявление противоопухолевого действия рубомицина было более наглядным. В контрольной группе объем опухоли у животных составил 5,260,49 мл, а у экспериментальных животных признаки асцита отсутствовали. Общее число клеток АКЭ в контрольной группе животных возросло до (6,410,89) 108, это в 4 раза выше, чем у экспериментальных животных. Количество клеток, погибших по типу некроза у животных контрольной группы, сократилось относительно первого срока и составило только 0,49 %, в это же время у животных, получивших пролонгированную форму рубомицина, доля погибших клеток выросла до 3,59 %. В контрольной группе с 14 суток началась массовая гибель животных, и к 21 суткам смертность составила 100%. Средняя продолжительность жизни мышей опухоленосителей в контрольной группе составила 8 суток. Кривая смертности мышей, получивших рубомицин, депонированный в полимерные микрочастицы, существенно отличалась от контроля. Начиная с 13 суток, отмечены единичные случаи гибели животных;

к 21 суткам среди животных, получивших пролонгированный рубомицин, средняя продолжительность жизни составила 16 суток, что 2 раза выше, чем в контроле. В течение последующего наблюдения (еще 30 суток) интенсивность гибели животных в экспериментальной группе снизилась. Спустя 55 суток от начала эксперимента у 40% выживших животных признаки АКЭ отсутствовали.

Этими экспериментами показана высокая биосовместимость микрочастиц, полученных из ПГА, и возможность их введения внутримышечно и внутривенно. Разработанная форма высокотоксичного препарата, депонированная в полимерный матрикс в виде микрочастиц, при однократном внутрибрюшинном введении ингибирует пролиферативную активность АКЭ и позволяет вводить препарат местно, без негативных реакций, характерных для свободного рубомицина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ С использованием высокоочищенных и охарактеризованных образцов ПГА разработано и исследовано семейство специализированных изделий для медицины в виде шовных волокон, 2-х и 3-х-мерных плотных и пористых матриксов, микрочастиц, моножильных волокон; исследованы структура, физико-химические и физико-механические характеристики. Разработанные полимерные конструкции различной формы и массы позволили ввести их в мышцу, кость, кровоток и внутренние органы и впервые исследовать реакцию тканей различной структуры на имплантацию ПГА. Показана высокая биосовместимость ПГА с различными тканями и возможность имплантирования на длительные сроки без развития негативных реакция со стороны системы крови, клеток, тканей и целого организма. Решение комплекса сформулированных задач обеспечило получение фундаментальных знаний о новом перспективном биоматериале и позволило ответить на заданные вопросы: 1) доказано, что собственно ПГА и конструкции из него различной массы и формы безопасны для организма и обладают высокой биосовместимостью; 2) ответ различных тканей на имплантацию ПГА характеризуется непродолжительной фазой асептического воспаления с активной регенерацией тканей без каких-либо негативных реакций; 3) ПГА под воздействием клеток макрофагального ряда, выcокоактивных по кислой фосфатазе, медленно разрушаются in vivo без резкой потери прочности, обеспечивая длительное функционирование изделий, от нескольких месяцев до года. Показано, что ПГА эффективны в качестве самостоятельных эндопротезов, шовного материала, остеозамещающих имплантатов и матрикса для депонирования и доставки лекарственных препаратов.

Проведена сертификация технологии синтеза и очистки образцов ПГА;

получен гигиенический сертификат соответствия Опытного производства полимеров медицинского назначения Главной санитарно-эпидемиологической службы РФ; разработаны и зарегистрированы Технические условия на ПГА различной химической структуры в качестве матриксов функционирующих клеток и лекарственных средств, хирургических имплантатов; в Роспатенте РФ зарегистрирована торговая марка БИОПЛАСТОТАНЩ на ПГА и изделия медико-биологического назначения. Серия экспериментальных образцов полимеров медицинской степени чистоты и экспериментальных образцов изделий из ПГА передана в исследовательские и медицинские учреждения, что позволило начать локальные исследования применения конструкций из ПГА для реконструкции дефектов тканей и органов в условиях клиники (в реконструктивных технологиях ортопедии и травматологии, челюстно-лицевой и абдоминальной хирургии). Полученные результаты имеют значение для биотехнологии новых материалов и современных реконструктивных медикобиологических технологий. С учетом существующих потребностей практики результаты направлены на снижение существующего дефицита в биосовместимых имплантатах для реконструктивных технологий.

ВЫВОДЫ:

1. С использованием высокоочищенных и охарактеризованных образцов полигидроксиалканоатов, на основе изученных свойств полимерных систем в различных фазовых состояниях сконструировано и исследовано семейство экспериментальных образцов изделий в виде микрочастиц, волокон, плоских и объемных матриксов, полностью биоразрушаемых полимерных эндопротезов;

доказаны высокие медико-биологические свойства изделий, устойчивость к воздействию биологических и физико-химических факторов.

2. Разработанные способы получения и модификации поверхности матриксов из ПГА с применением химических и физических методов позволяют получать функциональные платформы в виде гибких пленок и мембран, которые характеризуются высокой адгезией по отношению к клеткам разных типов, способствуют нормальной пролиферации клеток in vitro и пригодны для клеточных технологий.

3. В культурах клеток in vitro, в острых и хронических экспериментах на лабораторных животных изучена реакция организма на имплантацию ПГА на уровне клеточного ответа, морфологии и биохимии крови, реакции тканей разных типов на имплантацию полимерных конструкций из ПГА подкожно, внутримышечно, внутривенно; доказана биологическая безопасность всех типов изделий из ПГА и соответствие требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медико-биологического назначения.

4. Биодеградация ПГА в биологических средах зависит от химической структуры полимера, формы изделия и места имплантации, происходит медленно гуморальным и клеточным путями, главным образом с поверхности изделий, без образования локальных дефектов и резкого снижения прочности.

В биодеградации ПГА принимают участие макрофаги и гигантские клетки инородных тел с высокой активностью кислой фосфатазы, коррелирующей с активностью фермента в сыворотке крови животных. ПГА устойчивы к воздействию биологических сред и пригодны для функционирования in vivo от нескольких месяцев до года.

5. Моножильные волокна из ПГА обладают высокой биосовместимостью и прочностью (абсолютная прочность до 306 МПа, модуль упругости 3 ГПа, удлинение при разрыве 24%) и пригодны для хирургии. Ответная реакция тканей на ПГА характеризуется коротким (1-2 недели) посттравматическим воспалением, и не сопровождается осложнениями.

6. ПГА пригодны для депонирования и доставки лекарственных средств при различных способах введения для длительного функционирования.

Доказано отсутствие негативных реакций со стороны крови, мышечной ткани и тканей внутренних органов на введение микрочастиц. На примере лабораторных животных с привитой карциномой Эрлиха показано, что цитостатический препарат рубомицин, депонированный в полимерные микрочастицы, ингибирует пролиферативную активность АКЭ и позволяет обеспечить локальную доставку препарата.

7. Сконструирована серия имплантатов для репаративного остеогенеза на базе ПГА. В первичной культуре остеобластов и на лабораторных животных доказано, что имплантаты биоинертны, не вызывают цитотоксических реакций in vitro и воспалительных, некротических и иных негативных реакций in vivo. Имплантаты обладают остеопластическими свойствами, медленно деградируют in vivo и обеспечивают нормальное протекание репаративного остеогенеза.

8. Впервые разработаны и исследованы полностью биоразрушаемые эндопротезы из ПГА. Результаты физиологических, биохимических и морфологических исследований тканей животных, которым были имплантированы трубчатые стенты из ПГБ, свидетельствуют о перспективности разработанных эндопротезов для выполнения реконструктивных операций на желчевыводящих путях.

9. Результаты исследования дали новые фундаментальные знания о медико-биологических свойствах нового перспективного биоматериала и закономерностях его взаимодействия с биологическими тканями. Полученные результаты имеют значение для биотехнологии полигидроксиалканоатов и являются научной основой для их медико-биологического применения.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шишацкая Е.И. Исследование цитотоксичности полиоксиалканоатов в культуре животных клеток / Е.И. Шишацкая, А.В. Еремеев, И.И. Гительзон, Н.А. Сетков, Т.Г. Волова // Доклады РАН. - 2000. - Т. 374, N.4. - С. 561-564.

2. Волова Т.Г. Исследование структуры и свойств полиоксибутирата - термопластичного биоразрушаемого полимера / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, С.А. Гордеев, Э.П. Зеер // Перспективные материалы. - 2001. - N. 2. - С. 40-48.

3. Шишацкая Е.И. Исследование свойств биодеградируемых полимеров (полиоксиалканоатов) в культуре животных клеток / Е.И. Шишацкая, И.И.

Гительзон, А.В. Еремеев // Перспективные материалы. - 2001. - N. 3. - C. 40-47.

4. Севастьянов В.И. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров // В.И. Севастьянов, Н.В.

Перова, И.А. Довжик, И.А. Титушкин, Е.А. Немец, З.М. Беломестная, Е.И.

Шишацкая, Т.Г. Волова // Перспективные материалы. - 2001. - N. 5. - С. 4655.

5. Шишацкая Е.И. Исследование цитотоксичности полиоксиалканоатов в культуре животных клеток / Е.И. Шишацкая, И.И. Гительзон, А.В. Еремеев // Цитология. - 2001. - Т. 43, №.9-С. 904-905.

6. Шишацкая Е.И. Гигиеническая оценка полиоксиалканоатов - природных полиэфиров нового поколения / Е.И. Шишацкая, Е.Н. Есимбекова, Т.Г.Волова, Г.С. Калачева, В.А. Кратасюк // Гигиена и санитария. - 2002. - N. 4.

Ц С. 59-63.

7. Шишацкая Е.И. Биодеградация шовных нитей на основе полиоксиалканоатов в биологических средах / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, С.А. Гордеев, А.П. Пузырь // Перспективные материалы. - 2002. - N. 2. - С. 5662.

8. Шишацкая Е.И. Реакция тканей на имплантацию биодеструктивных шовных нитей на основе полиоксиалканоатов / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, С.Н. Ефремов, А.П. Пузырь, О.А. Могильная // Медицинская техника. - 2002. - № 4. - С.23-26.

9. Шишацкая Е.И. Морфогенез тканей при имплантации биоразрушаемого полигидроксибутирата / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, А.П. Пузырь, О.А.

Могильная, С.Н. Ефремов, И.И. Гительзон// Доклады РАН. - 2002. - Т. 383, №.6. - С. 838-841.

10. Шишацкая Е.И. Об участии макрофагов и реакции фосфомоноэстераз в ответе тканей на имплантацию полиоксиалканоатов / Е.И. Шишацкая, Т.Г.Волова, И.И.Гительзон // Доклады РАН. - 2002. - Т.383, №5. - С. 702-705.

11. Шишацкая Е.И. Исследование токсикологических свойств полиоксиалканоатов в эксперименте in vivo / Е.И. Шишацкая, Т.Г.Волова, И.И.Гительзон // Доклады РАН. - 2002. - Т.383, № 4. - С. 565-567.

12. Шишацкая Е.И. Исследование биологических свойств полиоксиалканоатов в хроническом эксперименте in vivo / Е.И. Шишацкая, Т.Г.Волова, Т.Г. Попова // Медицинская техника. - 2002. - № 4. - С. 29-32.

13. Shyshatskaya E.I. Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV / E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova, V.I. Sevastianov, N.Perova // Abstr.

Int. Symp. Biopolymers ISBP 2002. - Germany, Munster, 22-26 Sept. 2002. - P.

157.

14. Shyshatskaya E.I. Tissue response to the implantation of PHB and PHB/PHV sutures / E.I. Shyshatskaya, T. Volova, S. Efremov // Abstr. Int. Symp.

Biopolymers ISBP 2002. - Germany, Munster, 22-26 Sept. 2002. - P. 156.

15. Волова Т.Г. Характеристика изделий на основе полиоксиалканоатов - разрушаемых природных полиэфиров / Т.Г. Волова, Ю.П. Некрасов, Е.И.

Шишацкая, А.П. Пузырь, С.А. Гордеев// Пластические массы.Ц 2003. - № 3. - C. 6-8.

16. Volova T.G. E.I. Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers / T.G. Volova, E.I. Shishatskaya, V.I. Sevastianov, S.N. Efremov, O.A.

Mogilnaya // Biochemical Еngin. J. - 2003. - V.16, N.2. - P. 125-133.

17. Sevastianov V.I. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood / V.I. Sevastianov, N.V. Perova, E.I.

Shishatskaya, G.S. Kalacheva, T.G. Volova // J. of Biomater. Sci. Polymer. Edn. - 2003. - V. 14. - P. 1029-1042.

18. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая (под ред. ак.

В.И.Шумакова) // Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения РАН. - 2003. - 330c.

19. Волова Т.Г. Биотехнология новых полимерных материалов: синтез, свойства, применение / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая // Очерки экологической биофизики. - Новосибирск: Наука. - 2003. - С. 106-119.

20. Shyshatskaya E.I. Tissue response to the implantation of biodegradable polyhydroxyalkanoate sutures / E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova, S.N. Efremov, A.P.

Puzyr, O.A. Mogilnaya // J. of Material Science: Material in medicine. - 2004. - V.15, №. 6. - P. 719-728.

21. Shyshatskaya E.I. А comparative investigation of biodegradable polyhydroxyalkanoate films as matrices for in vitro cell cultures / E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova // J. of Material Science: Material in medicine. - 2004. - V.15, № 8. - P.

915-923.

22. Shyshatskaya E.I. Results of investigations of of histo- hemo- and in vivo compartibility of two PHA types (PHB and PHBV) as materials for tissue and organ prosthesis / E.I. Shyshatskaya, I.I. Gitelson, V.I. Sevastianov, T.G. Volova // Abstr.

II Int. Symp. Biopolym. - UK, Kordif, 3-8 April 2003.

22. SHYSHATSKAYA E.I. MATRIX ON THE BASIS OF POLYHYDROXYBUTYRATE COPOLYMERS FOR BIOARTIFICIAL TISSUES / E.I. SHYSHATSKAYA// ADVANCED RESEARCH WORKSHOP (NATO SCIENCE PROGRAMME) УMACROMOLECULAR APPROACHES TO ADVANCED BIOMATERIALS ENGINEERING SYSTEMSФ. - SOFIA, BULGARIA, 8-11 NOVEMBER 2003. - P.15.

23. Шишацкая Е.И. Исследование свойств полигидроксиалканоатов, перспективных для получения пористых матриксов / Е.И. Шишацкая, С.А Гордеев, Т.Г.Волова // Перспективные материалы. - 2004. - № 6. - С. 40-44.

24. Волова Т.Г. Физико-химические свойства одно-, двух- и трехкомпонентных полигидроксиалканоатов / Т.Г. Волова, В.Ф. Плотников, Е.И. Шишацкая, П.В. Миронов, А.Д. Васильев // Перспективные материалы. - 2004. - № 3. - С. 42-48.

25. Шишацкая Е.И. Исследование биоразрушающихся полигидроксиалканоатов в качестве носителя противоопухолевых препаратов / Е.И. Шишацкая, А.В. Жемчугова, Т.Г. Волова// Антибиотики и химиотерапия.

Ц 2005. - № 2-3. - С. 3-14.

26. Волова Т.Г. Физико-химические свойства двухкомпонентных -[поли (3ГБ/3ГВ)] полигидроксиалканоатов / Т.Г. Волова, В.Ф. Плотников, Е.И.

Шишацкая, П.В. Миронов, А.Д. Васильев // Биофизика. - 2004. - Т. 49, №.6. - С. 1038-1046.

27. Shyshatskaya E.I. Degradation of P(3HB) and P(3HB-co-3HV) in biological media / E.I. Shyshatskaya, T.G. Volova, S.A. Gordeev, A.P. Puzyr // J. of Biomater.

Sci. Polymer. Edn. - 2005. - V. 15, N.5. - P. 643-657.

28. Shyshatskaya E.I. Investigations of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood / E.I. Shyshatskaya, V.I. Sevastianov, T.G.

Volova // Abstr. Europ. Symp. On Bopolymer ESBP-04. - Gallen, Switzerland, May 12-15 2004. - P.38.

29. Шишацкая Е.И. Структура и физико-химические свойства гибридного композита полигидроксибутират/гидроксиапатит / Е.И. Шишацкая, Б.А.

Беляев, А.Д. Васильев, П.В. Миронов, Т.Г. Волова// Перспективные материалы.

Ц 2005. - №1. - С.40-46.

30. Гордеев С.А. Получения ультратонких волокон из полигидроксиалканоатов методом электростатического формования / С.А.

Гордеев, Е.И.Шишацкая, Т.Г. Волова // Пластические массы. - 2006. - № 4. - С.49-52.

31. Гордеев С.А. Получение и исследование ориентированных волокон из сополимеров поли(гидроксибутирата/гидроксивалерата) /С.А. Гордеев, Е.И.Шишацкая, Т.Г. Волова // Перспективные материалы. - 2005. - № 3. - С.

50-55.

32. Волова Т.Г. Опытное производство разрушаемых биополимеров / Т.Г.

Волова, Н.А. Войнов, В.С. Муратов, Н.В. Бубнов, К.В. Гурулев, Г.С. Калачева, О.В. Горбунова, В.Ф. Плотников, Н.О. Жила, Е.И. Шишацкая, О.Г. Беляева. // Биотехнология. - 2006. - № 5-6. - С.28-34.

33. Shyshatskaya E.I. A hybrid PHB-hydroxyapatite composite for biomedical application: production, in vitro and in vivo investigation / E.I. Shyshatskaya, I.A.

Khlusov, T.G. Volova // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. - 2006. - V. 17, №-5. - P.

481-498.

34. Волова Т.Г. Характеристика ультратонких волокон, полученных электростатическим формованием термопластичного полиэфира [поли(гидроксибутирата/гидросивалерата)] / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, С.А. Гордеев // Перспективные материалы. - 2006. - № 3. - С. 25-29.

35. Шишацкая Е.И. Микрочастицы из биоразрушаемого полиоксибутирата в качестве матрикса для депонирования рубомицина / Е.И. Шишацкая, А.В.

Горева // Перспективные материалы. - 2006. - №.4. - С.65-70.

36. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая ( под ред. ак. В.И.

Шумакова) // Красноярск: Платина, 2006. - 287 c.

37. Шишацкая Е.И. Биосовместимые и функциональные свойства гибридного композита полигидроксибутират/гидроксиапатит / Е.И.

Шишацкая // Вестник трансплантологии и искусственных органов.Ц 2006.Ц № 3. - С. 34-38.

38. Шишацкая Е.И. Клеточные матриксы из резорбиреумых полигидроксиалканоатов / Е.И. Шишацкая // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. - Т. II, № 2. - С.68-76.

39. Волова Т.Г. Разрушающийся пластик БИОПЛАСТОТАН: высокая технология - материал XXI века / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, О.Н.

Шишацкий // Интеграл. - 2007. - № 4. - C. 8-9.

40. Shishatskaya E.I. Resorbable polyhydroxyalkanoates as a carrier of antitumor drugs / E.I. Shishatskaya, A.V. Goreva, O.N. Voinova, T.G. Volova. // J.Biotechnology. - 2007. - Vol.131, №.2/ - P.50.

41. Шишацкая Е.И. Реакция тканей на имплантацию микрочастиц из резорбируемых полимеров при внутримышечном введении / Е.И. Шишацкая, А.В. Горева, О.Н. Войнова, Т.Г. Волова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - №12. - С. 635-639.

42. Шишацкая Е.И. Биоактивные имплантаты на основе резорбируемых полиэфиров и гидроксиапатита для реконструктивного остеогенеза / Е.И.

Шишацкая // 3-й Международный биотехнологический конгресс УBio-2007Ф. - Москва, 12-16 марта 2006. - С.136.

43. Shishatskaya E.I. Resorbable polyester/hydroxyapatite matrices for growing mesenchymal stem cells of bone marrow and reparative osteogenesis / E.I.

Shishatskaya // British-Russian Workshop in Association with the European Comission Stem Cell: Policy, Research, and Innovations Perspectives. - Moskow, 15-16 March 2007. - P.40-41.

44. Shishatskaya E.I. Biodegradable PHAs: Production, Biomedical investigations, Applications / E.I. Shishatskaya // 4th Europen Congress on Biopolymers. ESBP. - Turkey, Kusadasi, 2-4 October 2007. - P. 32.

45. Markelova N.M. Experimental justification of using endobiliary stents made of bioresorbable polyhydroxyalkanoates / N.M. Markelova, Yu.S. Vinnik, D.V.

Cherdantsev, I.I. Beletskiy, E.I. Shishatskaya // 4th Europen Symposium on Biopolymers ESBP. - Turkey, Kusadasi, 2-4 October 2007. - P. 56.

46. Shishatskaya E.I. Biocompatibility of polyhydroxybutyrate microspheres: in vitro and in vivo evaluation / E.I. Shishatskaya, O.N. Voinova, A.V. Goreva, O.A.

Mogilnaya, T.G. Volova// J. Material Science: Materials in Medicine. - 2008. - V.

19, №. 6. - P. 2493-2502.

47. Шишацкая Е.И. Противоопухолевая эффективность рубомицина, инкапсулированного в резорбируемый полимерный матрикс / Е.И. Шишацкая, А.В. Горева, Е.В. Инжеваткин, О.Н. Войнова, Р.Г. Хлебопрос, Т.Г. Волова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - №3. - С.333336.

48. Shishatskaya E.I. Biocompatability of polyhydroxybutyrate Microspheres: in vitro and in vivo evaluation / E.I. Shishatskaya, O.N. Voinova, A.V. Goreva, O.A.

Mogilnaya, T.G. Volova // Journal of Siberian Federal University. Biology. - 2008. - №1. - P. 66-77.

49. Shishatskaya E.I. Biocompatability of polyhydroxybutyrate Microspheres: in vitro and in vivo evaluation / E.I. Shishatskaya, O.N. Voinova, A.V. Goreva, O.A.

Mogilnaya, T.G. Volova // J. Mater Sci: Mater Med. - 2008. - V.19, № 6. - P.24932502.

50. Shishatskaya E.I. Production biomedical investigation, application of PHA / E.I. Shishatskaya // Macromol Symposia. - 2008. - V. 269. - P. 65-81.

51. Shishatskaya E.I. In vivo justification of using endobiliary stents made of bioresorbable polyhydroxyalkanoates / N.M. Markelova, E.I. Shishatskaya, Y.S.

Vinnic, D.V. Cherdansev, I.I. Beletskiy, M.N. Kuznecov, L.D. Zykova. // Macromol.

Symposia. - 2008. - V. 269. - P.82-91.

52. Камендов И.В. Морфологический особенности остеогенеза с применением биополимера из полигидроксибутирата и его композиций / И.В.

Камендов, С.И. Старосветский, Е.И. Шишацкая. Т.Г. Волова // Институт стоматологии. - 2008. - №2. - Стр.92-93.

53. Shishatskaya E.I. Biocompatability and drug eficency of microspheres from resorbable Poly(3)hydroxybutyrate / E.I. Shishatskaya // XVI International Conference on Bioencapsulation. - Dublin, Ireland, September 4-6, 2008.

54. Шишацкая Е.И. Экспериментальное обоснование к применению резорбируемых полигидроксиалканоатов в медицине / Е.И. Шишацкая, В.И.

Шумаков, Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов и др.// Материалы IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. - С.364.

55. Shishatskaya E.I. Preparation and properties of polyhydroxybutyrate microspheres as drug carriers / E.I. Shishatskaya, A.V. Goreva, T.G. Volova // XVI International Conference on Bioencapsulation. Bioencapsulation. - Dublin, Ireland, September 4-6, 2008. - 4p.

56. Шишацкая Е.И. Экспериментальное обоснование применения резорбируемых полигидроксиалканоатов в реконструктивной медицине / Е.И.

Шишацкая, Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов и др. // Материалы V Всероссийского съезда трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова. - Москва, 2008. - С.323-324.

57. Volova T.G. Production of oriented fibers out of poly (hydroxybutyrate/hydroxyvalerate) copolymers and testing of mechanical stabilityv under static and cyclic loads / T.G. Volova, S.A. Gordeev, E.I. Shishatskaya // Journal of Siberian Federal University. Biology. - 2008. - V.2. - P. 126-135.

58. Шишацкая Е.И. Исследование остеопластических свойств матриксов из резорбируемого полиэфира гидроксимасляной кислоты / Е.И. Шишацкая, И.В.

Камендов, С.И. Старосветский, Т.Г. Волова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2008. - Т.III, №4. - С. 41-47.

59. Волова Т.Г. Свойства композитов резорбируемого полиэфира Биопластотан с волластонитом и гидроксиапатитом / Т.Г. Волова, Е.И.

Шишацкая, П.В. Миронов // Пластические массы. - 2008. - № 12. - С.41-43.

60. Волова Т.Г. Структура и физико-химические свойства гибридного композита полигидроксибутират/волластонит / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, П.В. Миронов, А.В. Горева // Перспективные материалы. - 2009. - №1. - С. 4350.

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog