Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Макарян

Эдуард Артемович

Биотехнологические экспресс-методы в микробиологии и вирусологии

03.01.06- биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Тверь- 2011

Работа выполнена на кафедре Основы ветеринарии, акушерства

и  зоогигиены  Федерального государственного образовательно

го  учреждения высшего профессионального образования Твер 

ская  государственная сельскохозяйственная академия  (ФГОУ

  ВПО ТГСХА)

Научный  Доктор биологических наук, профессор

консультант   Дегтярев Владимир Павлович,

академик РАСХН

  Официальные  Доктор биологических наук

  оппоненты:  Телишевская Любовь Яковлевна

  (ФГУ ВГНКИ)

  Доктор биологических наук, профессор

  Соколова Надежда Львовна

(ГУ ВНИИЭВ им. Я.Р.Коваленко РАСХН

Доктор биологических наук, профессор

Прунтова Ольга Владиславовна

(ФГУ ВНИИЗЖ)

  Ведущая ГУ Всероссийский научно-исследовательский

  организация  и технологический институт биологической 

   промышленности (ВНИиТИБП) 

Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится У___ У______2011 г. в___ часов на 

заседании диссертационного совета        Д220.011.01 в Федеральном

государственном учреждении Всероссийский государственный

центр качества и стандартизации лекарственных средств для живот-

ных и кормов (ФГУ ВГНКИ) по адресу: Россия, 123022, г. Москва,

Звенигородское шоссе, д. 5.        

  С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ

  Автореферат  разослан У_____ У____________2011г.

Ученый секретарь  диссертационного совета, 

  канд. вет. наук Козырев Ю.А.

                       

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И СЛОВ

   BALB/C- линии мышей

CBA- линии мышей

199- питательная среда.

46-47- почки зеленой мартышки.

CEF- фибробласты куриных эмбрионов.

FBC-слизистая прямой кишки эмбриона коровы.

FBN- слизистая носа эмбриона коровы.

FBTR-слизистая трахеи эмбриона коровы.

FLK-почка эмбриона овцы.

HeLa- карцинома шейки матки.

RPMI- питательная среда.

А.С.- Авторское Свидетельство.

А-2ПТК- стимулятор (ирритант) перитонеальных макрофагов.

АОК- антителообразующие клетки.

БОЕ- бляжкообразующие единицы.

БСА- бычий сывороточный альбумин.

БХ- бумажная хромотография.

В/Б- внутрибрюшинно.

В/М- внутримышечно.

ВА/ВП-ДФХ- вениламин-винилпирралидон в модификации дифенилхиноном.

ГЛА- гидролизат лактальбумина.

Дикалсид- антибактериальное средство наружного применения.

ДЛЭК- легкие эмбриона коровы (ВИЭВ).

ДМСО- диметилсульфоксид.

ДСН-додецилсульфат натрия.

ДЭ- дрожжевой экстракт.

ДЭАЭ- диэтиламиноэтанол.

ЖКИ- желудочно-кишечная инфекция.

И/Н- интроназально.

Игла- питательная среда.

ИМК- инфекционный мастит крыс.

ИФА- иммуноферментный анализ.

КРС- крупный рогатый скот.

ККС- клеточно- культуральная среда.

ЭЦ- левоэритроциклин.

МА-104-  почки обезьян макаки- резус.

МДВК- почка эмбриона коровы.

МЕМ- питательная среда.

МКВД- Московский кожно-венерологический диспансер.

МПА- мясо-пептонный агар.

МПБ- мясо-пептонный бульон.

П/К- подкожно.

ПААГ- полиакриламидный гель.

ПВП- поливинилпирролидон.

Пинексид- неспецифический стимулятор микробной активности.

ПМФ- перитонеальные макрофаги.

Повин-ВМ- антибактериальный, химиотерапевтический препарат широкого спектра действия.

ПС- преципитационная смесь.

ПЭ- пневмоэнтерит.

ПЭГ- полиэтиленгликоль.

ПЭК- почки эмбриона коровы.

РАЛ- реакция агглютинации латекса.

РАЦ- реакция агглютинации целлюлозы.

РДП- реакция длительной преципитации.

РЕК- реакция Ерне-Каненгема.

РКОА(М)- реакция коагглютинации стафилококка в модификации.

РН- реакция нейтрализации.

РНГА- реакция непрямой гемагглютинации.

РСВ- респираторно-синцитиальный вирус.

РСВИ- респираторно-синцитиальная вирусная инфекция.

РСК- реакция связывания комплемента.

РТММ(Л)- реакция торможения миграции макрофагов (лейкоцитов).

Т-1- почка теленка

ТБ- тестикулы бычков.

ТГК- трансмиссивный гастроэнтерит кроликов.

Тризолон- стимулятор антителогинеза.

Триптоксид- неспецифический стимулятор вирусной активности.

ТЭК- тимус эмбриона коровы.

УФЛ- ультрафиолетэкспонированная сыворотка.

ФБР- фосфатнобуферный раствор.

ФГА- фитогемагглютинин.

ХНЗЛ-хронические неспецифические заболевания легких.

ЦКВИ-центральный кожно-венерологический институт.

ЦПД- цитопатическое действие.

ЦПЭ- цитопатический эффект.

Э- легкие эмбриона коровы (ВГНКИ).

Э- почки эмбриона коровы.

Э- селезенка эмбриона коровы.

Э- тимус эмбриона коровы.

ЭДТА- этилендиаминтетраацетат.

ЭЛЭК- эксплантанты легких эмбриона коровы.

ЭС-экстракционная среда.

ЭФ- электорофорез.

1. ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1. Актуальность темы.  Значительные успехи, достигнутые в области биохимии, вирусологии и микробиологии, создали предпосылки для управления элементарными механизмами жизнедеятельности клетки, что явилось мощным импульсом для развития биотехнологии. Эти достижения поставили биотехнологию на новый уровень, качественно отличающийся возможностью качественно управлять клеточными процессами. Биотехнологический процесс включает ряд этапов: подготовку объекта, его культивирование, выделение, очистку, модификацию и использование продуктов. Многоэтапность процесса обуславливает необходимость привлечение к его осуществлению разных специалистов: молекулярных биологов, биохимиков, вирусологов, микробиологов. Биотехнология позволяет проводить раннюю диагностику инфекционных заболеваний на основе применению препаратов антигенов и антител. Для этого необходимы экспресс - методы инфекционных болезней, позволяющих в течение нескольких минут установить эпизоотический статус. Чтобы повысить эффективность диагностики и лечения в системе организации противоэпизоотических мероприятий необходимо расширить ассортимент высокоэффективных диагностикумов, лечебных препаратов и вакцин, пригодных к использованию в лабораторных и полевых условиях. С помощью новых вакцинных препаратов возможно предупреждение инфекционных болезней. Однако универсальных сред, пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, вирусов и клеток не существует. Длительное благополучие нашей страны по инфекционным болезням требует усиленного контроля над соблюдением животных в связи с их восприимчивостью.

Значительную проблему в ветеринарии представляют собой респираторные вирусные инфекции и другие заболевания инфекционной природы, которые наносят большой экономический ущерб промышленному животноводству (Дегтярев В.П. 1968; Гуненков В.В. 1975, 1977; Воронин Е.С. 1989,1991;  Сюрин  В.Н. 1998;  Белоусова Р.В., Преображенский Н.И., 2001; Петров А.М., 2002; Белоусова Р.В. 2008).Одной из них является респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота - контагиозная болезнь, вызываемая респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), относящимся к семейству парамиксовирусов, роду - пневмовирусы. Болезнь проявляется поражением нижних отделов респираторного тракта, повышением температуры, затрудненным дыханием, одышкой, истечением из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем. Сложности культивирования, в свою очередь, затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью для изготовления диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

Остается весьма важной разработка иммунологических средств и методов лабораторной экспресс-диагностики с использованием гомологичного вируса и антител. Поэтому, ускоренное культивирование РС-вирусных штаммов Long человека и РС-Б  РС-вируса крупного рогатого скота, а также инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусов, поражающих желудочно-кишечный тракт (вирус диареи, ротавирусы) для изготовления диагностикумов, разработки оптимальных условий репродукции вирусов, бактерий и грибов являются важным биотехнологическим вопросом. Решение этих проблем позволили бы получить максимальные титры микробных  антигенов и активного вируса, необходимых для производства средств лечения и специфической профилактики, приготовления иммуностимулирующих препаратов для получения антисывороток, модификации иммунологических методов исследований.

2. Цель и задачи исследований. Целью работы явилась разработка эффективных методов культивирования возбудителей вирусных, бактериальных и грибных респираторно-кишечных инфекций животных и человека, а также способов получения антигенов микроорганизмов (вирусов, бактерий и грибов), обеспечивающих максимальное накопление антигенов для получения диагностических и иммунизирующих препаратов,  экспресс-методов диагностики инфекционных болезней.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток к штамму РС-Б респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота и к штамму Long респираторно-синцитиального вируса человека. Разработать оптимальные способы культивирования микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов РС-вируса штаммов РС-Б и Long, вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота;
2. Изучить использование вирусов, выращенных на различных культурах клеток, для изготовления латексных и целлюлозных диагностикумов;
3. Разработать экспресс-методы получения вирусных антигенов для приготовления диагностических и иммунизирующих препаратов;
4. Испытать антигенные свойства РС-вируса штаммов РС-Б крупного рогатого скота  и Long человека на лабораторных животных и получить соответствующие антисыворотки;
5. Разработать ускоренный способ максимального получения микроорганизмов (вирусов, бактерий и грибов) на необогащенных средах;
6. Модифицировать методы исследования для контроля иммунизирующих свойств разных антигенов РС-вируса in vitro;
7. Разработать иммуномодулятор для повышения титра антител к РС-вирусу на лабораторных животных при моделировании заболевания;
8. Испытать антимикробные средства с расширенным спектром действия для деконтаминации питательных сред и сывороток крови животных;
9. Разработать препараты на основе антибиотиков, обладающие противовирусным и антимикробным действиями;
10. Приготовить  РС-вирусный препарат, обладающий иммунизирующими свойствами.

3. Научная новизна. Изучена репродуктивная способность штаммов РС-Б и Long РС-вируса  крупного рогатого скота и человека в первичных, диплоидных, перевиваемых, гомологичных и гетерологичных культурах клеток.

       Впервые разработаны технологичные способы культивирования  и получения вирусов, микробов и грибов с использованием стимуляторов роста.

       Определены оптимальные условия их накопления в различных культурах клеток и питательных средах, для изготовления иммунизирующих препаратов и экспресс-диагносикумов.

Разработан и апробирован  метод контроля размножения и учета инфекционной активности вирусов: РС-вируса штаммов РС-Б и Long, вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота

       Модифицированы реакция торможения миграции лейкоцитов (макрофагов) и реакция Ерне- Каненгема для иммунологических исследований.

  Разработан эффективный метод очистки и выделения антигенов РС-вирусов, ВД, ИРТ, ПГ-3, РВ.

       Предложены стимуляторы антителогенеза и  перитонеальных макрофагов для лабораторных животных.

Приготовлена лекарственная форма на основе антибиотика для лечения вирусных и микробных заболеваний.

       Разработан иммуностимулятор пролонгированного действия с противовирусной и антимикробной активностью.

       Создан иммунизирующий РС-вирусный препарат на основе синтезированных сополимеров.

  Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентом и 10 авторскими свидетельствами:

Патент РФ на изобретение №22816171 от 27.10.2006г.  Препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций бактериальной и вирусной  этиологии с/х животных и способ профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии с-х животных

Авторское свидетельство СССР на изобретение  № 1785659 от 08.09.1992 Способ определения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1596252  от 01.06.1990г. Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов.

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1719432 от 15.11.1991г. Способ выделения вирусных антигенов.

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1655983 от 15.02.1991г. Способ культивирования респираторно-синцитиального вируса.

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1834288 от 13.10.1992г. Способ культивирования микроорганизмов.

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785660 от 08.09.1992г. Способ определения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785658 от 08.09.1992г.  Способ диагностики гриппозной инфекции.

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1767517 от 08.06.1992г. Стимулятор индукции  перитонеальных макрофагов для экспериментального животного.

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1561687 от 03.01.1990г. Способ для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях.

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1536316  от 15.09.1989 Способ оценки лечения хронического катарального бронхита.

Положительное решение  на изобретение по заявке 4678450/14(054942) от 13.03.1989г. Средство для лечения заболеваний, вызванных вирусной инфекцией.

4. Теоретическая и практическая значимость  работы. Разработка и внедрение полученных препаратов, соединений и способов позволят решить важные научно-производственные проблемы, имеющие большое хозяйственное и промышленное значение.

Разработан проект лабораторного  регламента культивирования респираторно-синцитиальных вирусов КРС и человека: РС-вируса штаммов РС-Б и Long в культуре клеток для изготовления специфических вирусных антигенов, необходимых для экспресс-диагностики.

Предложен целлюлозный диагностикум для выявления антител к РС-вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота, овец и коз, который опробован  в лабораторных и производственных испытаниях.

Установлен эффект стимуляции репродуктивной активности вирусов с использованием стимулятора Триптоксид. Неприспособленные к питательным средам и клеткам вирусы в присутствии стимулятора и УФЛ-экспонированной сыворотки позволяют получить за короткий отрезок времени максимальный титр вирусов.

Выявлена неспецифическая активность препарата Пинексид, обладающего стимуляцией роста грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, мицелиальных и дрожжеподобных грибов на необогащенных питательных средах.

Доказана высокая специфичность, простота постановки и учета результатов исследований при использовании экспресс-диагностикумов на основе латексных частиц и порошковой целлюлозы.

Впервые показана возможность получения стабильной композиции  диагностикумов в связи с применением 10%-го кальция хлорида, глютар-альдегида и красителя азура II

  Показана эффективность выделения вирусных антигенов с применением преципитационной смеси (ПС) и экстракционной смеси (ЭС).

Концентрация вирусных белков, полученных в результате выделения и очистки вирусов на низкоскоростных центрифугах, во много раз превышает показатели, полученные известными способами. Об этом свидетельствуют результаты электрофореза (ЭФ) и определения белка в вирусных антигенах.

Проведена широкая апробация модифицированной пластиковой чашки Петри для проведения иммунологических, фармакологических, вирусологических и других исследований. Простая постановка камеральных опытов позволила значительно упростить проведение реакций, сократить время и учет результатов  в реакции торможения миграции лейкоцитов (макрофагов) (РТМЛ(М), реакции Ерне-Каненгема (РЕК), по бляшкообразующим единицам (БОЕ),  цитопатическому действию ЦПД и т. д.

Учет репродуктивной активности вирусов стал нагляднее в камере чашки Петри, содержащей взвесь культуры клеток в питательной среде. За короткий отрезок времени (6-10ч.) ЦПД очевидно по БОЕ.

Средство для стимулированного получения перитонеальных макрофагов стало возможным в связи с использованием А-2ПТК (смеси гидроокиси алюминия, пептона, ПГ, трипсина, и кальция хлорида). Образовавшиеся восковидные тельца после в/б введения ирританта обеспечивают быстрое появление ПМФ в течении в 100-120 дней. ПМФ, помещенные в камеру модифицированной чашки Петри в присутствии антигенов, антител, лекарственных средств, являются доступной моделью в иммунологических, фармакологических и токсикологических исследованиях.

Применение препарата Тризолон лабораторным животным, как стимулятора антителогенеза, за 2-4 часа перед интраназальным заражением РСВ позволяет получить высокотитражные антисыворотки.

Выявлена лечебная эффективность препарата Дикалсид (смесь диклоксациллина, кальция хлорида, трипсина и ДМСО) при интраназальном введении в случаях респираторных заболеваниях и разных видов герпес-вирусной инфекции.

Проведенная апробация препарата Повин-ВМ  при инфекционном мастите крыс, пневмоэнтеритах морских свинок, трансмиссивном гастроэнтерите кроликов, РС-вирусной инфекции показала высокую терапевтическую активность: однократное, парентеральное введение обеспечивает курс лечения в связи с пролонгированной формой препарата. Повин-ВМ эффективен при вирусных и микробных заболеваниях разной локализации как иммуномодулятор клеточного и гуморального ответов. Показаны положительные результаты деконтаминации питательных сред (среда Эрла, Хенкса, 199, МПБ и МПА). Апробация препарата на свиньях с профилактической целью обеспечила сохранность поголовья, увеличение прироста массы тела, экономию вакцин, антисывороток и антибиотиков.

Иммунизирующий РС-вирусный препарат на основе ВА/ВП-ДФХ при интраназальном введении стимулировал клеточный и гуморальный иммунитет.

Результаты проведенных исследований нашли отражение в методических рекомендациях: Профилактика и терапия инфекционных болезней животных, Интенсификация культивирования микроорганизмов и вирусов, Экспресс-диагностика инфекционных болезней животных, рассмотренных и одобренных на заседании научно-технического совета ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол № 2 от 16.10.09г.) и на заседании секции инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (протокол № 4 от 21.10.09г.),  методические рекомендации по применению Повина-ВМ- пролонгированного иммуностимулятора однократного применения противомикробного и противовирусного действия в свиноводстве, методические рекомендации по применению набора для выявления респираторно-синцитиального вируса и антител к нему в реакции агглютинации целлюлозы, методические рекомендации по применению чашечной камеры в ветеринарной иммунологии, одобренных методическим советом Тверской государственной сельскохозяйственной академии (протокол №10 от 19.04.06г.).

5. Апробация работы.  Основные положения диссертации были доложены  и обсуждены на межлабораторных заседаниях Государственного научного центра РФ Института иммунологии Федерального медико-биологического агентства (ГН - Институт иммунологии  (1987-88), на конференциях молодых ученых  (Саратов, 1987-88), на курсах информации и стажировки врачей-вирусологов по теме: Современные методы диагностики ротавирусной инфекции в Республиканской санэпидстанции Минздрава СССР, в Институте вирусологии им. Ивановского, Академии медицинских наук СССР (Москва, 1988), на Каунасском предприятии по производству бактерийных препаратов (1987), на Всесоюзной научно-практической конференции  МГАВМиБ (1989), на заседании лаборатории инфекционной патологии при муниципальном госпитале г. Осло (Норвегия, 1991), на свинокомплексе Владимирский  Владимирской области (1990), на племзаводе Заволжский,Тверской области  (2004), на Международных научно-практических конференциях (2006-2009), на внутрикафедральном и межкафедральном совещаниях по апробации диссертационной темы (2010).
6. Публикации. Материалы  диссертации опубликованы в 41 работе, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК РФ-6, 1 патенте РФ, 10 авторских свидетельствах, 17 - в сборниках научных конференций, а также в 6  методических рекомендациях.
7. Структура  и объем работы. Диссертация изложена на  299 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, данных о практическом использовании научных результатов,  рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы и 30 страниц приложений. Работа содержит 56 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 235 источников, из них 69 отечественных и 166 зарубежных авторов.

8. На защиту выносятся следующие положения:

1. Подобраны культуральные среды, культуры клеток и тканей, температурные режимы и другие параметры для получения вирусных антигенов в максимальных титрах.
2. Результаты применения неспецифического стимулятора роста вирусов Триптоксид, позволяющего получать максимальные титры антигенов вирусов за короткий отрезок времени.
3. ПС и ЭС способствуют быстрой очистке и получению обогащенных вирусных белков.
4. Разработан  неспецифический стимулятор роста микроорганизмов Пинексид, который способствует получению максимальных объемов бакмассы в ускоренном режиме культивирования.
5. Иммунизирующие препараты, содержащие РС-вирус на основе ВА/ВП-ДФХ, показали иммунологическую эффективность на лабораторных животных.
6. Использование диагностикумов на основе латекса или порошковой целлюлозы, 10% кальция хлорида, глютаральдегида, сенсибилизированных антигенами или антителами, разведенных ФБР рН 7,20,1 и окрашенных азуром II, которые позволяют за 5-10 мин. поставить диагноз.
7. Модифицированная пластиковая чашка Петри создает оптимальные камеральные условия для постановки иммунологических (РТММ(Л), (РЕК), вирусологических (ЦПД, БОЕ) и фармакологических исследований.
8. Препарат Тризолон, (трипсин с преднизолоном, 9:1), в/м за 2-4 часа до заражения лабораторных животных обеспечивает максимальные титры антител в сыворотке крови.
9. Препарат Дикалсид  (комплекс антибиотика диклоксациллина с ДМСО, трипсином и 10% кальция хлоридом), устраняет воспаление инфекционной этиологии при наружном применении за короткий отрезок времени.
10. Препарат Повин-ВМ (комплекс антибиотика тетрациклина с трипсином, полимерами и ЭДТА), является эффективным при лечении и профилактике инфекционных заболевании лабораторных животных, свиней и при деконтаминации питательных сред.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 1986-2010 годов на кафедре Основ ветеринарии, акушерства и зоогигиены в Тверской государственной сельскохозяйственной академии. Отдельные эксперименты были проведены в  проблемной вирусологической лаборатории ФГОУ ВПО МГАВМиБ и в лаборатории препаративной биохимии антигенов ГН - Институт иммунологии г.Москвы.

В опытах использовали штаммы: РСВ крупного рогатого скота РС-Б, и человеческие штаммы Long, также ротавирусы, парагриппа 3, аденовирусы, вирус болезни Марека и инфекционного ринотрахеита, гриппа А и В. Вирусы получены в МГАВМиБ, и в лаборатории препаративной биохимии антигенов ГН - Институт иммунологии  г. Москвы. Использованные штаммы микроорганизмов получены из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

В работе использовали органные, первичные, диплоидные и перевиваемые культуры клеток различных видов животных и человека. Органная культура клеток - эксплантаты легкого эмбриона коровы (ЭЛЭК); первичные культуры клеток: почки эмбриона коровы (ПЭК), легкие эмбриона коровы (ЛЭК), тимус эмбриона коровы (ТЭК), тестикулы бычков (ТБ) и их субкультуры (ПЭК,  ЛЭК, ТБ); диплоидные культуры клеток: легкие эмбриона коровы (ЛЭ), почки эмбриона коровы (ПЭ), селезенки эмбриона коровы (СЭ), тимуса эмбриона коровы (ТЭ), полученные в лаборатории культур клеток ВГНКИ, легкие эмбриона коровы (ДЛЭК), из лаборатории технологии культур клеток и питательных сред ВИЭВ, карциномы человека (Hela и Heр-2) в ГН - Институте иммунологии.

  С целью получения высоких титров урожая РСВ, разработали и апробировали препарат Триптоксид (А.С. № 1655983).

В экспериментах по культивированию РСВ, штамм Long использованы первичные и перевиваемые культуры клеток: фибробласты легких мышей линии ВАLВ/с, тестикулы бычка, Неlа Нер-2. Культуры клеток выращивали с использованием сред Игла и 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота в 1,5 л матрацах и 1л бутылях на роллере марки Rollacell, New Bruswick Scientific, N.Y., USA при 35+37С  24-72 ч. Дальнейшее культивирование РСВ осуществляли при добавлении разработанного нами стимулятора инфекционной активности Триптоксид: 1 мл стимулятора на 100 мл культуральной среды одновременно с заражением. РСВ очищали по методу Levine L. и разработанному  нами способу.

Разработали способ стимулированного культивирования микроорганизмов с применением препарата Пинексид (А.С. № 1834288).

Использованы МПА и МПБ в пробирках, МПБ так же в 3л. бутылях, содержащих препарат Пинексид: в 1мл стимулятора на 100мл питательной среды а в качестве контроля использовали препарат эритрит-агар. Микроорганизмы инкубировали в посевной концентрации использовали 3-510кл/мл при 37С. Учет результатов роста осуществляли со времени появления первых колоний на МПА или замутнения МПБ. Колонии подсчитывали, а степень замутнения определяли по 3-х балльной крестовой системе и стандартам мутности.

Оценку вирусной активности проводили путем титрования вируса в культурах клеток, определяли наибольшее его разведение, вызывающее ЦПЭ в 50% зараженных многослойных культурах клеток.

Для обнаружения вируса в некоторых культурах клеток использовали выявление цитоплазматических телец - включений и образование синцитий, характерных для РС-вируса. Препарат окрашивали гематоксили-эозином (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971), подсушивали и монтировали покровное стекло на канадском бальзаме. С этой целью культуры клеток ЛЭ, FLK и HeLa выращивали в 50мл флаконах. Клеточную суспензию (в обычной посевной концентрации) вносили по 6-7 мл во флаконы. Культуры инкубировали при 370С. Монослой формировался на 2-3 сутки.  На фоне окрашенного не разрушенного монослоя бляшки диаметром 1-2 мм были видны в виде бесцветных пятен. Титр вируса выражали в БОЕ/мл.

2.2 Титрование РС-вируса по бляшкообразующим фокусам в модификации

Использовали приготовленные камеры из пластиковой чашки Петри, предложенные нами для определения инфекционной активности вируса, а также для некоторых иммунологических реакций, представленных в настоящей диссертации. Для приготовления камеры  совмещали наружную поверхность чашки с внутренней поверхностью крышки. Имеющийся на чашке ободок не позволял двум поверхностям плотно сомкнуться (А.С. № 1596252). Во внутреннюю поверхность крышки вносили культуру клеток в объеме 0,8 мл в оптимальной посевной концентрации, добавляли 0,2 мл РС-вируса в различных разведениях на культуральной среде № 199, или Игла, к которой адаптирована культура клеток, затем аккуратно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, совмещали 2 части чашки и помещали в чашку Петри, диаметром 90-100мм. Инкубировали при 37С, 5% СО, 1-3 суток. На 1 сутки можно заметить бляшки на черном фоне в косых лучах света и сосчитать. Титр вируса вычисляли по формуле:

Т - титр вируса, выраженный числом ФОЕ в мл;

А - среднее количество фокусов в камере;

Р - разведение вируса.

Рис. 1 Макроскопическая картина БОЕ вирусов на клеточно-культуральной среде в модифицированной чашке Петри

Реакции агглютинации

РС-вирусы крупного рогатого скота,  человека и другие респираторно-кишечные штаммы вирусов использовали для приготовления антительных и антигенных диагностикумов на основе стафилококка, латекса и порошковой целлюлозы (носители). Специфические сыворотки или гаммаглобулины применяли для приготовления антительных диагностикумов.

Постановка РА:

1. специфический РС-вирусный диагностикум на основе стафилококка, латекса или целлюлозы;
2. положительная сыворотка или антиген;
3. отрицательная сыворотка  или антиген;
4. 0,15 М (ФБР), рН 7,2-7,4 для разведений.

Постановку РА осуществляли на предметных стеклах, выложенных по длине, горизонтально, на белом фоне. На каждое предметное стекло наносили по 2 капли ФБР в объеме 0,05 мл. В первую каплю вносили 0,05 мл исследуемой сыворотки, 2-3 раза пипетировали в этой капле и 0,05 мл переносили в следующую каплю. Из последней капли, после пипетирования, 0,05 мл разведения удаляли. В каждую каплю вносили по 0,05 мл того или иного антигенного диагностикума, перемешивали стеклянной палочкой, начиная с большего разведения до меньшего. Через 5-10 минут учитывали  результаты РА до максимального разведения образца, в котором отмечали агглютинацию  в 2 креста.

2.3 Экспресс-методы диагностики вирусных  инфекций в реакции агглютинации целлюлозы

2.3.1 Разработка экспресс-способа диагностики вирусной инфекции с использованием порошковой целлюлозы в реакции агглютинации

На обезжиренное предметное стекло наносили по 0,05 мл исследуемого и контрольного образцов с последующим добавлением антигенного или антительного диагностикума в равном объеме. Положительные результаты РА учитывали через 5-10 минут в крестах по 3-х балльной системе. Разработан способ приготовления экспресс-диагностикума на основе порошковой целлюлозы ЭКТЕОЛА, ОН-формы, 0,1-0,25 мкм, для сорбции на ней белка. Целлюлозу растворяли в 10% растворе СаСl и глютаральдегида (7:100:1). Сенсибилизация раствора целлюлозы: 37С, 1-1,5 ч. на магнитной мешалке, в соотношении: 1 мл раствора целлюлозы, 1 мл. 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФБР, рН 7,2-7,4 и 1 мл сенситина (сыворотка, гаммаглобулины или антиген). Отмывали в ФБР рН 7,2-7,4, вносили 1 мл 1% азура II, и 9 мл ФБР, рН 7,2-7,4. Диагностикум готов к применению. РА - учитывали в качественной и полуколичественной постановке по трехбалльной крестовой системе через 5-10 мин.

Рис. 2  Способ постановки реакции агглютинации целлюлозы

3+ - крупнозернистая агглютинация;

2+ - мелкозернистая агглютинация;

1+ - мелкозернистая агглютинация в незначительных количествах;

-- - кучкование диагностикума в центре или его равномерное распределение  в исследуемом образце. Диагностический титр: агглютинация в 2 креста.

2.3.2 Разработка способа приготовления и диагностики с использованием латексного диагностикума

Способ получения антительного латекс-диагностикума: 2 мл. РСВ - сыворотки разводили 1 мл ФБР, рН 7,2-7,4, замораживают при Ц20С, 45 мин., размораживали 7 мл водно-метаноловой смеси (3:4), 30 мин, 0С, центрифугировали 3000g, при 5 мин, осадок ресуспендировали в 2 мл физраствора с 0,04% азида натрия. 3 мл, 8% полистиролового латекса трижды отмывали в дистиллированной воде (3000g, 5 мин.), осадок латекса ресуспендировали в 3 мл, -глобулиновой фракции, в разведении 1:20 на ФБР, рН 7,8-8,0 с 0,1% сыворотки КРС или БСА и 0,04% азида натрия. Инкубация: 45-60 мин., 37С, на магнитной мешалке. Дважды центрифуговали на ФБР, рН 7,2-7,4, 3000 g, 5 мин. Осадок ресуспендировали в 9-10 мл 1% раствора азура II на ФБР, рН 7,8-8,0. Способ постановки и учета реакции аналогичен РАЦ.

2.3.3 Разработка бумажной хроматографии для диагностики респираторных заболеваний

Метод разработан нами для определения степени эндобронхита и воспаления верхних и нижних отделов дыхательных путей. Использовали синпоровые фильтры диаметром 0,23 мк, Химопол, Прага. Фильтр обрабатывали в буфере, состоящим из 0,02 М триса и 0,19 М глицина рН 8,3-8,6 при 37С, 30-45 минут, высушивали 20-30 минут при 37С, наносили на поверхность фильтра по 5 мкл исследуемых образцов носовых или бронхиальных смывов. После высыхания образцов фильтр окрашивали 0,25% водным раствором азура II при 18+22С, 30 сек., трижды промывали в дистиллированной воде, высушивали 15-20 мин. при 37С, изучали хроматограмму. При воспалении образцы окрашивались в темно-синие тона в виде колец. Чем меньше воспалительный процесс, тем менее отчетливы круги. При отсутствии воспаления нет окрашивания образца.

Реакцию нейтрализации вируса применяли для определения титра нейтрализующей активности гипериммунных и лполевых сывороток к РС-вирусу. Для постановки РН обычным методом использовали пробирки с культурой клеток или платы. Реакцию ставили общепринятым методом (Сюрин В.Н. и др., 1986).

2.4. Экспериментальные животные

  Использовали белых мышей линии BALB/с, массой 20-30г (более 1000 мышей), морских свинок массой 300-350 гр. (более 400 морских свинок), цыплят месячного возраста для получения сыворотки крови (более 500 цыплят), кроликов 1,5-3 кг. (более 2000 кроликов), поросят 5-8 кг (более 13000 поросят).

2.5  Исследованные и используемые сыворотки

  Испытуемые сыворотки крови в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ), РСК, РН, ИФА и РНГА получали от крупного рогатого скота, коз, мышей, морских свинок, кроликов и поросят различных половозрастных групп из некоторых регионов страны. Использовали также образцы сывороток людей, заболевших РСВ-инфекцией и реконвалесцентов.

Для получения гипериммунных сывороток в лабораторных условиях, разработали и применяли препарат Тризолон. Гипериммунные сыворотки к штаммам РС-Б и Long РСВ получали на морских свинках и кроликах. В работе также использовали специфические гипериммунные сыворотки телят и лошадей, получаеме путем интраназальной иммунизации РСВ антигенами.

2.6. Разработка способа максимального выделения вирусных антигенов

Для повышения выхода вирусных белков разработали способ  (А.С. № 1719432) путем осаждения клеточно-культуральной среды (ККС), экстрагирование антигенов раствором, содержащим хлорид калия, центрифугирования в смеси следующего состава ( об.%):ПС- Твин-20-7-13,10%р-р хлорида кальция-10-20, 32-40% р-р ПЭГ ( М.М. 4000-6000),р-р Хенкса, рН 7,2-7,4- остальное, при постоянном перемешивании 4-5 часов, 4+10С, центрифугировали при 4300-5200g, 35-40мин. Экстрагирование антигенов из образовавшегося осадка осуществляли ЭС: 0,02% р-р Версена, содержащим додецилсульфат натрия (ДСН) и хлорид калия, г/л: ДСН- 8-12, хлорид калия- 74-75, 1,5-2 часа, 8600-10400g, 10-15мин., с последующим удалением надосадочной жидкости. Осадок, содержащий, вирусные антигены ресуспендировали в 1-3мл. среды Игла или 199.

Электрофорез вирусных антигенов осуществляли в присутствии ДСН в полиакриламидном геле (ПААГ)  на установке Мультифор 2117 (LKB, Швеция), с применением имидазольного буфера в 10% ПААГ без системы концентрирующего геля.

2.7 Разработка иммунизирующего препарата, содержащего РС-вирусные антигены

  Конструирование иммунизирующего РСВ препарата проводили на основе сополимеров виниламиниа - винилпирролидона, модифицированного дифенилхиноном (ВА/ВП-ДФХ). Экспериментальную апробацию проводили на лабораторных животных. Эффективность иммунизирующих препаратов оценивали при определении первичного и вторичного иммунных ответов в сыворотках крови с помощью антигенного диагностикума ВИРОЦЕЛЛ, в РАЦ, РСК, РН, ИФА через 3-5 и 21-25 суток, соответственно. Через 21-25 суток после однократной интраназальной иммунизации мышей заражали 10 ЦПД/0,05 мл на мышь РСВ штаммов Long или РС-Б. Через 5-9 суток готовили гомогенат легочной ткани на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 в соотношении: 1 мл раствора на 100 мг ткани, однократно дефростировали, центрифугировали, при 3000-6000 об/мин., в супернатанте определяли титр вируса и его антигенов с помощью антительного целлюлозного диагностикума ВИРОЦЕЛЛ, ЦПД, РСК. Клеточноопосредованный иммунитет легких определяли в реакции торможения миграции макрофагов в нашей модификации, заключающейся в использовании пластиковых чашек Петри диаметром 35-40 мм, диска из фильтровальной бумаги диаметром 6 мм, на который наносили 10 мкл исследуемого материала, и макроскопического учета результатов реакции через 10-12 часов при инкубации 37С в растворе Хенкса без и с антигеном (40 мкг/мл вирионной фракции РСВ). Осуществляли реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) путем введения в объеме 50 мкл нуклеокапсидной фракции /80 мкг/мл/ в плантарную поверхность стопы задней лапки мыши. Через 18-24 часа учитывали результаты РГЗТ путем отсечения лапки на уровне скакательного сустава и взвешивания на торсионных весах.

2.8 Иммунизирующий препарат респираторно-синцитиального

вируса

Использовали вирус, инактивированный УФЛ- облучением в тонком слое культуральной жидкости (2 лампы по 30Вт, на расстоянии 50 см от объекта, 30мин.). Иммунизацию и заражение мышей BALB/C 16-20г. культурой РСВ (510 БОЕ/мл) осуществляли интраназально. Иммунизация: 4-х кратно, один раз в 7 дней и через 7, 14 и 21 день определяли иммунный ответ. Титры антител к РСВ в сыворотке крови определяли в РКОА(М), РАЦ,  РН и ИФА. В ИФА вируссодержащую среду наносили на планшет фирмы Flow, добавляли разные разведения исследуемых сывороток и уровень присоединившихся антител выявляли антиглобулиновыми кроличьими сыворотками, мечеными пероксидазой (производство НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Клеточный иммунитет оценивали по РТМЛ в  модификации Э.А. Макаряна и В.П.Дегтярева.

2.9 Состав для получения перитонеальных макрофагов А-2ПТК

Готовили водные растворы ПВП, хлорида кальция и пепсина (20г. поливинилпирролидона (ПВП) растворяли в 100мл дистиллированной воды), смешивали все жидкие компоненты состава: гель гидроокиси алюминия (014мг/мл)-17-23мл 20% р-р ПВП (ММ 280000-360000), 10%р-р кальция хлорида- 8-12мл, 10%р-р пепсина 4-6мл, 0,25%р-р, трипсина 100-120ЕД- до 100мл (А.С. № 1767517). Стерилизация: А-2ПТК- 1,5атм., 30мин. Перед в/б введением состав взбалтывали, набирали в стерильный шприц. Мыши- 0,3-0,5мл/гол., крысы и морские свинки- 0,8-1 мл/гол., кролики - 3-5мл/гол. Дренаж брюшной полости осуществляли средой - 199 с 10ЕД/мл гепарина и помещали на 2 часа в пластиковые чашки Петри, диаметром 90-100 мм в стерильных условиях, смыв удаляли, а адгезированные ПМФ заливали средой 199 с 20% сыворотки крупного рогатого скота.

2.10 Модификация реакции торможения миграции лейкоцитов

В  две группы по 10 чашек Петри диаметром 35-40мм вносили по 1мл р-ра Хенкса с 5% сывороткой КРС, в опытную группу- 0,1% фитогемагглютинин (ФГА), в контроле - без. Наносили по 5мкл цельной, без стабилизатора крови, полученной из ушной вены кролика. После свертывания 2 части чашки Петри совмещали, инкубировали при 37С, 10-12ч.

  Рис. 3. Схема приготовления чашечной камеры для постановки реакции торможения миграции лейкоцитов

I. Пластиковая чашка Петри в разобранном виде;

II. Внесение 1 мл миграционной среды в крышку и нанесения

5 мкл исследуемого образца на наружную поверхность чашки;

III. Наложение фильтровального диска на исследуемый образец;

IV. Чашечная камера в готовом виде.

Учёт результатов: в косых лучах света на черном фоне очерчивали контуры миграции лейкоцитов маркером, переносили на кальку, взвешивали на торсионных весах. Индекс миграции по формуле:

где:  ИМ - индекс миграции;

А - средний вес кальки в опыте;

В - средний вес кальки в контроле.

2.11 Реакция Ерне-Каненгема

Во внутреннюю поверхность крышки от пластиковой чашки Петри, диаметром 35-40 мм, вносили: 0,6 мл нестабилизированной крови исследуемого (иммунизированного) животного, 0,2 мл  антигена (вирусного или микробного) и 0,2 мл цельного комплемента морской свинки. Полученную смесь пипетировали несколько раз без образования пузырьков и осторожно совмещали с наружной поверхностью чашки Петри (см. РТММ). Получали равномерную,  без пузырьков  воздуха, камеру  со средой, которую помещали на 20-30 минут в термостат при температуре 37С. Оценку результатов осуществляли невооруженным глазом. Можно использовать увеличительное стекло. В косых лучах света на темном фоне подсчитывали зоны гемолиза, в центре которой находилась антителообразующая клетка (АОК):

а - среднее количество АОК;

в - разведение исследуемого образца крови;

V - объем исследуемого образца крови.

В качестве исследуемого образца можно использовать гомогенат различных органов иммунизированных лабораторных животных (см. приготовление образца для постановки РТММ), мазки, смывы и т.д.

 

       

               

 

  1 2

Рис. 4.  Макроскопическая картина реакции Ерне-Каненгема:

1- без АОК, 2- с АОК

2.12 Повин-ВМ- препарат для лечения и профилактики респираторных и желудочно-кишечных инфекций вирусной и бактериальной этиологии и средство для инактивации микроорганизмов in vitro

Поставленная цель достигается составом на основе раствора 10% тетрациклина (1-1,5мл), который дополнительно содержит 20% водный р-р ПЭГ ММ 2000-6000- 17-20мл, 20% водный р-р ПВП ММ 280000-360000 -2-8мл, 0,02% коммерч. раствор Версена 17-23мл, 0,25%р-р трипсина, 100-128ЕД (Патент РФ №2286171).

2.13 Разработка схемы лечения трансмиссивного гастроэнтерита кроликов (ТГК)

Три группы кроликов, массой 2-3кг, по 10 гол. в каждой группе: первая группа: обработка препаратом Повин-ВМ, 1-2мл/гол. однократно на весь курс лечения (5-7дней), вторая группа: ЛЭЦ, 1-2мл/гол.,2 раза с интервалом в 3 дня, в течение 5-7дней. Третья группа- 0,1г/гол, 2 р./сут., 5-7 дней. Эффективность лечения оценивали по РТМЛ и антителообразующим клеткам (АОК) крови в нашей модификации (А.С. №4456827)

2.14 Разработка схемы лечения Повином-ВМ  пневмоэнтерита  морских свинок

В опыте  использовали по 25 голов морских свинок в группе и составили 4 группы: первая группа: лечение препаратом Повин-ВМ 0,5-0,8мл/гол., однократно, в/м, на весь курс лечения (5-7дней), вторая группа: лечение ЛЭЦ, 1-2мл/гол, однократно, на курс лечения (5-7дней), в/м,  третья группа: миксоглобулин, 3-5мл/гол., однократно, в течение 5-7 дней, четвертая группа: тетрациклин, 0,3-0,5г/гол., 2 раза в день, в/м, в течение 5-7 дней. Контроль за животными в течение 6-8 месяцев для выявления рецидивов ПЭ.

2.15 Разработка схемы лечения препаратом Повин-ВМ инфекционного мастита крыс

В опыты взяты крысы с острым течением заболевания и составлены 3 группы по 20 голов: первая группа: препарат Повин-ВМ, 0,5-1мл/гол., однократно, на весь курс лечения (5-7 дней). Вторая группа: тетрациклин, 0,1-0,2г./гол., 2 раза в день, 5-7 дней. Третья группа: ЛЭЦ, 1-2мл/гол., однократно, на весь курс лечения (5-7дней). Результаты лечения оценивали по выживаемости, периоду наступления клинического выздоровления.

2.16 Изучение профилактического применения препарата Повин-ВМ в свиноводстве

Препарат применяли поросятам 2-4 мес., однократно, 0,5-1мл/гол., за весь период жизни (до сдачи на мясокомбинат в 6 месячном возрасте). Препарат Повин-ВМ апробировали в Самарской, Владимирской и Тверской областях, оценивали по падежу за время опыта (6мес.), по средней живой массе тела в начале опыта (кг), по среднесуточному приросту поросят, отданных на откорм (г), по среднему весу животного при переводе на откорм (кг), и количеству свиней, переданных на откорм (гол).

Рис.5. Схема экспериментальных  исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1  Результаты определения чувствительности  культур клеток к штаммам РС-Б и Long РС-вируса крупного

рогатого скота и человека

  Важным этапом для изготовления диагностических и лечебных препаратов является подбор наиболее продуктивных клеточных систем, обеспечивающих высокое накопление вируса. Критерием служили время проявления ЦПЭ и накопление вируса. Штамм РС-вируса крупного рогатого скота репродуцировался во всех используемых в опытах культурах клеток: ТЭК, ПЭК, ЛЭК, ТБ и их субкультурах. Наибольший титр РС-вируса отмечен в культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ. Апробированы фибробласты легких мышей ВАLВ/С, тестикулы бычка, Неlа и Нер-2. Результаты показали, что штамм Long размножался во всех видах тканей, но оптимальными оказались фибробласты легких мышей ВАLВ/с (4,00 lg) и тестикулы бычка (3,10lg). В ЛЭК, ТБ, ПЭК, ЦПЭ не был отмечен в 11,1%, 16,7% и 19,2% серий, соответственно. Наибольшей чувствительностью обладали культуры клеток Л5Э и П5Э. На 2-4 сутки отмечен ЦПЭ, который сохранялся на протяжении 5 пассажей. Чувствительной к штамму оказалась линия Т-1: на протяжении пяти пассажей хорошо выражен ЦПЭ. Наиболее чувствительной оказалась клеточная линия овечьего происхождения - FLK (3,740,12 lg ТЦД/мл).

3.1.2 Оптимальные условия культивирования штаммов  Long и

РС-Б в чувствительных культурах клеток

В исследовании использовали 3-5сут. культуры клеток ЛЭК и Л5Э и трехсуточную FLK с предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя от ростовой среды, с 10% сыворотки КРС или телят, множественность заражения 0.1 ТЦД/кл., время адсорбции - 1,5 ч., поддерживающая среда - Игла, Игла - МЕМ, Игла - RРМ1 - 1640(2:1), рН 7,4-7,8 в стационарных или роллерных условиях при 37С. Разные степени разведения РСВ, штамма Long на Неlа и Нер-2 выявили: с увеличением степени разведения инокулянта РСВ с 10-2  до 10-0 увеличиваются титры урожая вируса на Hep-2. При 10 высокие титры отмечены на 24 ч. исследования (1,80 lg), в 10-3 - на 12 ч. (1,80 lg) в 10-3 - на 6 ч. изучение (2,10 lg).

3.2 Стимуляция инфекционной активности РС-вируса для получения высоких урожаев при его культивировании

Разработан способ получения максимальных титров РСВ без предварительной адаптации вируса и культуры клеток.

Штамм Long культивировали на Неlа в стационарной и роллерной системах, при 37С, среде 199,  5 - 10% сыворотки КРС. Сыворотку подвергали 30-минутному облучению УФ-лучами лампой БУФ-30, с расстояния 17-20 см от поверхности сыворотки. Добавили препарат Триптоксид в количестве: 5мл/500мл  клеточно-культуральной среды. Через 1-2 часа вносили в среду однократно дефростированную клеточно-культуральную среду с РСВ в титре 3,60-4,50 lg: 10мл/100мл среды. Через 18-24 часа получали урожай. В опытах исследовали также репродуктивную активность ВД, ИРТ и вирус болезни Марека (таблица 1).

Таблица 1. Влияние  препарата Триптоксид на урожайность вирусов

Виды вирусов	ККС с Триптоксидом		ККС с ДМСО (контроль)
	а	б	а	б
РС-вирус	6,40,4	5,530,21	74,23,50	1,470,05
Вирус диареи	6,921,21	12,30,24	82,32,41	2,360,04
Инфекционный ринотрахеит	6,821,98	8,370,29	80,42,02	2,640,03
Вирус болезни Марека	6,912,02	17,420,52	79,51,25	4,210,28

Примечание: а- время появления ЦПД вируса (ч), б- количество вирусного белка (мг)

Анализ таблицы показал неоспоримое преимущество препарата Триптоксид по сравнению с ДМСО. Титры РС-вируса учитывали в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ), которые составили 655362,48. Это в 16 раз больше по сравнению с 0,25% трипсином и в 64, по сравнению с ДМСО: РСВ в присутствии препарата Триптоксид проявил репродуктивную активность через 6 часов, а с ДМСО через 74часа. Количество вирусного белка с препаратом Триптоксид было в 4 раза больше по сравнению с контролем. Первые проявления ЦПД с препаратом Триптоксид ВД, ИРТ и болезни Марека отмечали через 7 часов, а в контроле, через 80 часов. Вирусные белки с препаратом Триптоксид были в 4-6 раз больше по сравнению с контролем. 

3.2.1 Методы контроля и определения инфекционной активности РСВ крупного рогатого скота и человека в культурах клеток

В чашечную камеру вносили 1мл клеток FLK или Неlа (200х10кл/мл), инкубировали 1-2 суток, 37С, 5% СО, заражали вирусом в разных разведениях. Через 1-1,5 ч. адсорбции вирусом, вносили среду Игла с 2% фетальной сыворотки, инкубировали в тех же условиях 5 суток и учитывали ФОЕ в косых лучах света на черном фоне. В камеру можно поместить одновременно смесь клеток и вируса. При этом за короткий период времени выявляется РСВ в больших титрах.

3.3  Разработка способа увеличения выхода бакмассы при культивировании микроорганизмов

Увеличение выхода бакмассы нами достигнуто за счет повышения ростостимулирующей активности питательных сред и сокращение времени культивирования (таблица 2).

Таблица 2. Влияние стимуляторов на скорость размножения

микроорганизмов, грибов

Виды микроорганизмов	МПА с Пинексидом		0,03% эритрит-агар (контроль)
	а	б	а		б
Грамотрицательные
B.abortus ВА-19	5,02,0	44,23,8	142,02,0		20,24,0
B.melitensis	4,81,5	50,33,0	20,10,2		25,41,7
E.сoli	1,50,5	80,14,5	2,31,0		54,22,9
P.multocida	3,01,0	58,42,1	8,80,4		29,23,5
Грамположительные
B.anthracis	2,51,0	79,3+4,2	5,00,4		35,23,1
L.monocytogenes	6,01,0	70,44,8	26,40,5		40,02.1
S.aureus	3,01,5	90,43,7	18,30,4		35,72,5
Дрожжеподобные грибы
C. albicans	36,05,0	108,710,4		195,310,4	75,76,2
C.guilliermondii	29,02,0	201,42,4		201,42,4	120,57,0
Мицелиальные грибы
A.niger	30,23,5	198,44,0	200,512,5		139,75,4
A.fumigatus	25,75,0	204,55,7	206,98,4		135,57,2
P.notatum	201,0	275,44,5	235,03,5		162,47,0

Примечание:  а- время появления первых колоний (час),  б- количество бакмассы (мг).

Показана неспецифическая стимуляция роста на плотных питательных средах, которая  связана не только с ранним появлением роста, но и с более крупными размерами колоний, обеспечивает повышенный выход бакмассы в 1,5-2 раза. Срок роста микроорганизмов сокращается в 2 и более раз. Примечателен рост P.notatum: время появления первых колоний в 12 раз быстрее (через 20ч.) на среде с препаратом Пинексид, чем на МПА с 0,03% эритрит-агаром - через 235ч. (9,7суток). Количество бакмассы на МПА с препаратом Пинексид  в 2 раза больше в сравнении с контролем. C.guilliermondii: на среде с препаратом Пинексид  рост отмечен через 29 часов ,а в контроле, через 201,4 часа (8,3суток), что в 6,8 раза быстрее. Все результаты статистически достоверны. (Р<0.01, 0.001). Предложенный нами стимулятор микроорганизмов препарат Пинексид обладает неспецифической активностью роста в отношении грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов, дрожжевых и мицелиальных грибов.

3.4 Разработка экспресс-метода определения РСВ в реакции

коагглютинации стафилококка

  Для быстрого определения титра РСВ в урожае разработали модификацию реакции коагглютинации стафилококка РКОА(м) и способ постановки реакции. (таблица3)

Таблица 3. Сравнительное определение антигенов РС-вируса

Мето-ды опреде-ления	Референс РС-вирусы	Клеточно- культураль- ная среда	Осветлен- ная куль- туральная среда	Концетрат РС-вируса	РС-вирус в градиенте сахарозы	Вирионная фракция РС-вируса
РКОА (М) РСК	1:100,12,0 1:64,012,0	1:122,36,0 1:55,46,9	1,92,24,0 1,52,32,3	1:251,53,8 1:200,06,2	1:244,47,3 1:120,84,5	1:107,04,5 1:89,76,7

  Анализ полученных  данных показал, что чувствительность РКОА(М) в 1,1 - 2,0  раза выше, чем в РСК. Так,  при определении титра в референс-образцах  РКОА(М) 1,5 раза чувствительнее РСК, а в  образцах  вируса на разных этапах его очистки, - более, чем в 2 раза. Следует отметить простоту предлагаемой модификации, что позволяет одновременно исследовать большое количество образцов.

При изучении чувствительности и процента ошибки, метод РКОА(М) был сопоставлен  с методами РСК и ЦПД. Материалом для исследования служили  15 положительных и 10 отрицательных по данным  РСК и ЦПД проб культуральной среды и смывов полости носа. Во всех случаях констатировано полное совпадение  результатов РКОА(М) и ЦПД. С помощью РСК РС-вирус  регистрировали в 12 пробах из 15, т.е. эта реакция была менее чувствительна, чем РКОА(М). При исследовании отрицательных образцов ни в  одном случае не наблюдалось агглютинации, что свидетельствует о специфичности РКОА(М).

Определяли титр вируса. Окрашивание диагностикума азуром II в синий цвет позволило облегчить учет результатов, повысить чувствительность метода в 1,1-2,0 раза по сравнению с РСК и ЦПД.

3.5 Разработка экспресс- метода диагностики РСВ  инфекции и гриппа А в реакции агглютинации целлюлозы

Учитывая кратковременную стабильность стафилококкого носителя для РКОА(М) (3-5 дней), были разработаны целлюлозные диагностикумы, которые использовали для определения lgА, М, G, С - реактивного белка, микробных и вирусных инфекций, РСВ - Вироцелл-антитело Вироцелл РС-вирус и антительный диагностикум для определения гриппа серотипа А- Вироцел- Гр. А. Было изготовлено 108 микросерий, из которых 51 была использована для выявления антител к РСВ в сыворотке крови КРС, овец и коз, для лабораторных и производственных испытаний. Исследовано более 2000 образцов сывороток (таблица 4).

Таблица 4. Применение диагностикумов Вироцелл-РС-вирус и Вироцелл-Гр.А для определения РС- вируса и гриппа А в клеточно-культуральной среде в  реакции агглютинации целлюлозы.

Тест- система	Вид вируса	Учет полученных результатов
		ЦПД	РГА	РАЦ
				Вироцелл-РС-вирус	Вироцелл-Гр.А
Опытная система	РСВ-41 РСВ-76 РСВ-77	1:100 1:1000 1:1000	- - -	1:512 1:2048 1:2048	- - -
	ГрА-смыв Гр.А-А34	- -	1:256 1:512	- -	1:2048 1:1024
Контрольная система	Гр.В енинград	-	1:128	1:2	1:2
	ПГр-3-303	-	1:32	1:2	1:4
	Ad 7-45 Ad 3-33 Ad 6-43	1:1000 1:100 1:1000	- - -	1:2 1:2 1:2	1:2 1:2 1:2

Представленные в  таблице 4 результаты показали высокую специфичность целлюлозных диагностикумов Вироцелл РС-вирус и Вироцелл-ГрА. Положительная реакция была отмечена только в тех образцах, в которых  содержались  РС-вирус и грипп А. Ложноположительных  и  ложноотрицательных  реакций в исследуемых  образцах не было. Отмечена высокая чувствительность целлюлозных диагностикумов по сравнению с ЦПД и РГА в 2-5 раз. Во внимание можно принять также простой способ исполнения и учета результатов РАЦ, который не требует специальной диагностической квалификации, оборудования, большого количества реактивов и т.д.

3.6 Разработка способа диагностики РСВ в реакции агглютинации латекса

Вирус штамма Long получен на перевиваемой ткани Нер-2  с  культуральной средой 199,  2-5% фетальной сыворотки. До исследования образцы вируса находились при Ц70С (таблица 5).

Таблица 5. Титрование РС- вируса

№№ образцов референс-РСВ	Методы и результаты исследования
	РСК	Предлагаемый метод /РАЛ/
1	1:64	1:61
2	1:64	1:128
3	1:128	1:1024
4	1:128	1:1024
5	1:1024	1:2048
6	1:64	1:2048
7	1:128	1:1024
8	1:1024	1:1024
9	1:1024	1:2048
Mm	1:405,332,00	1:1159,111,96

РАЛ оказалась чувствительнее РСК в 2-3 раза.

3.7 Способ выделения вирусных антигенов

Учитывая сложные способы выделения вирусов в условиях линейных и ступенчатых градиентов различных реагентов, а также наличия ультрацентрифуг и получение предварительно очищенного от клеток вируса, нами разработаны  ЭС и ПС с использованием низкоскоростных центрифуг для получения и выделения вирусных антигенов. Выделенные концентраты вирусных белков оценивали в РСК, ЦПД, РАЦ, структуры нуклеокапсида и вирионов изучали с помощью электронной микроскопии, содержание белка по Лоури. Полученные результаты показали следующее: вирусные белки, полученные по предлагаемому способу, в 3-128 раз превышали по своей активности результаты прототипа.  При изучении электрофореграмм вирусных концентратов, полученных по прототипу и предлагаемому способу отмечено, что в последнем случае произошло полное расщепление не только вирионов, но и инфицированных клеток, было выделено больше белковых фракций различного молекулярного веса: 10 - в предлагаемом и 4 фракции, - в прототипе. Титры белка в предлагаемом способе в 4-8 раз больше, чем в прототипе. Выход вирусных белков: РСВ- 553,2%, в РСК 1:1892017,99; вирус ИРТ- 822,7%, в РСК 39477,215,49, ВД- 1184,3%, в РСК 1:95755,920,05

3.8 Разработка способа получения специфических гипериммунных сывороток к РСВ

Для получения гипериммунных сывороток  разработали и апробировали смесь 0.25% раствора трипсина и преднизолона (30мг), Тризолон, в соотношении 9:1. Способ заключается в том, что Тризолон вводили в/м или п/к за 2-4 ч. перед каждым применением РСВ. Дозы Тризолона, мл/гол.: мыши - 0,3-0,5; морские свинки - 0,8-1,0; кролики - 1,0-2,0. Результаты однократного заражения мышей по иммуностимулирующему влиянию Тризолона показали следующее: пик выработки антител к РСВ отмечен в течение 20 суток, и в 6-7 раз превосходил контрольные группы. Так, у однократно зараженных мышей в динамике максимальный титр антител составил 1:1024 на 5 сутки, а при многократном - 1:8192 на 28 сутки. Титры у мышей, зараженных РСВ без Тризолона,  составили 1:2 и 1:32, соответственно.

3.9 Разработка стимулятора индукции перитонеальных макрофагов А-2ПТК  в эксперименте

После однократного внутрибрюшинного введения препарата А-2ПТК мышам линии ВАLВ/С., СВА, 0,3-0,5 мл/гол удалось сократить время формирования оптимального количества ПМФ, необходимого для получения монослоя (через 1 сутки), и быстрого его формирования на пластиковых чашках Петри.

3.10 Модификация способа определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов

  Мышей линии BALB/С, обоих полов, 12 Ц16 г. однократно интраназально заражали вирионной фракцией РСВ вируса, штамм ''Long'' (10 ЦПД 50/0,2мл/гол.). Через десять дней после заражения мышей убивали путем эвтаназии, извлекали  легкие, гомогенизировали в растворе Хенкса: 100 мг легочной ткани- 0,2 мл раствора. Полученный гомогенат в объеме 4 мкл наносили на диск фильтрованной бумаги диаметром 6 мм. Пропитанный гомогенатом диск вносили в камеру, приготовленную из чашки Петри диаметром 35 Ц40 мм, с раствором Хенкса (1 мл), содержащим раствор вирионной фракции РС - вируса на растворе Хенкса в концентрации 10 мкг/мл. Камеры (по 3 с антигеном и без него) инкубировали при 37С, 5% СО,10ч. Получены следующие данные:

  Чем меньше индекс миграции, тем выше уровень клеточного иммунного ответа. Индекс миграции, равный 0,77, указывает на высокий уровень специфической клеточно-опосредованной реакции при интраназальном заражении мышей вирионной фракцией в дозе 10 ЦПД 50/0,2 мл/гол.

  Таким образом, предлагаемый метод позволяет за сравнительно  непродолжительный период времени определить достоверный индекс миграции макрофагов и лейкоцитов.

3.11 Разработка метода бумажной хроматографии для определения степени воспаления при РСВ инфекции и СО2 в помещении

Экспресс-метод позволил определить степень воспаления в носовой полости и в бронхиальных смывах по интенсивности окрашивания хроматограмм в синий цвет. Критерием диагностики  является окрашивание нанесенного на фильтр образца в темно-синий цвет при  воспалении (I-II степень), и едва заметное окрашивание бледно-голубого цвета при отсутствии воспаления (III степень) (Рис. 6). 

 

Рис 6. Экспресс-диагностика степени эндобронхита в динамике при лечении хронической пневмонии у больной К.,26лет

Для определения углекислого газа в модификации предварительно готовили индикаторную смесь: к 500мл дистиллированной воды добавляли 1 каплю 40% нашатырного спирта, взбалтывали в этой смеси полоску фенолфталеиновой индикаторной бумаги длинной 0,5-0,8см. В два шприца на 10 (20) мл помещали по одной полоске, которые после обработки индикаторной смесью приобретали фиолетовый цвет. Учитывали объем насасываемого и выдуваемого образцов воздуха поршнем шприца до появления желто-зеленой окраски индикаторных бумаг. Учет результатов опыта:

0,03*, где

0,03- количество атмосферного СО в %;

V1-объем уличного воздуха;

V2-объем воздуха помещения.

Упрощенный способ может найти  применение в условиях производства (животноводческие фермы, свинокомплексы и т.д.) и в помещениях для людей.

3.12 Результаты определения инфекционной активности РСВ в  присутствии фармакологических препаратов

  Изучали влияние РСВ-вакцин, интерферона и антибиотиков на бляшкообразование РС-вирусом в культуре клеток легких мышей ВАLВ/С в условиях чашечной камеры. Вакцины состояли из нуклеокапсидной и суперкапсидной белковых фракций РСВ в концентрациях 20%, 10%, 1% в сочетании с сополимером виниламином- винилпирролидоном в модификации  дифенилхиноном.

Таблца 6. Чувствительность РС-вируса к препаратам на основе вирусных белков по ЦПД

НК-20%	НК-10%	НК-1%	F-20%	F-10%	F-1%	СП-НК	СП-F	СП-НО	НК -НО	F-НО
22,52,8	14,02,0	6,60,7	27,21,0	2,1 0,3	28,6,8	25,0 6,2	41,6 3,3	25,04,1	59,54,1	40,8,3

Неклеокапсидные белки (НК),  Суперкапсидные белки(F-белок) 20%,10%, 1% на основе сополимеров  вениламин- венилпирролидона в модификации  диффенилхиноном, сополимер-нуклеокапсид (СП-НК), сополимер  с F-белоком (СП-F-белок), сополимер, разведенный  дистиллированной водой (СП-НО), нуклеокапсид, разведенный дистиллированной водой (НК- НО ), F-белок, разведенный дистиллированной водой ( F-белок- НО). Из вакцин оптимальными оказались 10% и 1% на основе нуклеокапсидных белков, а на основании суперкапсидных (F), 10%.

3.13 Результаты сравнительной иммунизации мышей разработанными вакцинами против РС-вирусной инфекции

Для иммунизации мышей использовали нуклеокапсидную и суперкапсидную фракции (1% и 10%) вариантов вакцин против РС-вирусной инфекции. Установлено, что 10% раствор нуклеокапсидной вакцины оказался оптимальным: в 14 раз возросли титры антител в РА - на 21 день по сравнению с 7 днем (Р<0,01). Отмечалось минимальное количество РСВ в легочной ткани по БОЕ. РТМЛ и РГЗТ указывают на клеточную стимуляцию в иммунном ответе. Среди суперкапсидных вакцин выявлены оптимальные значения при 1% и 10% концентрациях конъюгированного F-белка с ВП/ВА-ДФХ. Уровень антител к РСВ на 21 день исследования возрос в 32 и 10 раз, (Р<0,05), соответственно, по сравнению с 7 днем (Р<0,001). Наименьшее количество РСВ в легочной ткани отмечено в группе мышей, иммунизированных неразведенной смесью F-белка с ВП/ВА-ДФХ. Отмечены высокие значения РГЗТ.

Таблица 7. Чувствительность РС-вируса к антибиотикам и интерферону по ЦПД

Д	А	О	К	См	Гм	Иф	Сыворотка РСВ, коммерч.	егочная ткань больной мыши
24 2,1	26, 2,6	61,13,2	450 28,1	15 17,6	6528,1	31,5 8,4	63 15,9	141 20,3

Ампиокс Ц  0,5 г. (А),  Оксациллина натриевая соль 0,5 г. (0),  Диклоксациллина натриевая соль 0,25 (Д), Канамицина сульфат, 1 г. (К), Стрептомицина сульфат 1 г. (См), Гентамицина сульфат, 0,08г (Гм), Интерферон коммерческий (Иф).

Из апробированных антибиотиков эффективны: диклоксациллин, который использовали для приготовления препарата наружного применения при герпес-вирусной и РСВ инфекциях. В состав этой лекарственной формы вошли 10% СаСl, 0,25% трипсин и ДМСО, названного Дикалсид. Он с успехом апробирован в Мосгорвендиспансере и институте стоматологии им. Семашко при разных формах герпеса и др. инфекций.

  Представленные в  таблицах 6 и 7 результаты показали, что  из вакцин оптимальными являются НК-10% и НК-1%,  из  F-белка - F-10% , а из антибиотиков, ЦДиклоксациллина Nа соль, Ампиокс - Nа,  и Интерферон. Препараты на основе вирусных белков и антибиотики в значительной степени подавляли рост РС-вирусов, о чем свидетельствует малое количество бляшек, которые образуются РС-вирусом в условиях клеток легочной ткани. Клиническая апробация Дикалсида при герпес-вирусной инфекции, локализованной на лице и половых органах показала быстрые положительные результаты. В 98% случаях удалось за 1-3 дня устранить местные очаговые реакции (зуд, отечность, гиперемия, образование корочек, регионарный лимфоаденит и т.д.). Дикалсид предупреждал развитие различной бактериальной инфекции.

3.14 Повин-ВМ Ц препарат для лечения и профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии животных и способ их профилактики

  3.14.1 Результаты лечения  трансмиссивного гастроэнтерита кроликов

Сравнительное изучение лечебного действия Повина-ВМ в сопоставлении с левоэритроциклином (1 мл/гол) (ЛЭЦ) и тетрациклином (0,1 г./гол., в объеме 1 мл). Кратность применения и сроки лечения составили: для 1гр. (Повин-ВМ) - однократное применение на весь курс лечения (5-7дн.); для 2 гр. (ЛЭЦ) - 2 раза с интервалом в 3 дня, в течение 5-7 дней в группах по 30гол, а для 3 гр. (Тетрациклин) - 2 раза в сутки 5-7 дней (таблица 8).

Таблица 8. Результаты иммунобиологических исследований

№№ гр.	Препараты для ечения	Результаты лечения
		выздоровело		пало		Иммунологический статус
		го- ов	%	голов	%	АОК	РТМЛ	РСИПЛ
1	Повин-ВМ	29	96,6	1	3,3	58,245,4	0,610,02	98,22,3
2	ЭЦ	19	63,3	11	36,6	32,152,7	0,790,04	74,32,8
3	Тетрациклин	2	6,6	28	93,3	21,933,6	0,810,02	65,84,0

Примечание: наблюдение за клинически выздоровевшими (реконвалесцентами) составило 6-8 мес.

В группе, санированной Повином-ВМ, не отмечено случаев рецидивов заболевания, в группе, леченной ЛЭЦ, частота рецидивов - 42,2%.(Р<0,001). Количество АОК в случаях применения Повина-ВМ превышало таковые(Р<0.01), в группе ЛЭ - в 1,8, (Р<0.01) в группе с Тетрациклином - в 2,6 раз. (Р<0.001). Показатели РТМЛ свидетельствуют о том, что индекс торможения к 0,1% фитогемагглютинину был в 1,2 раза активнее при лечении Повином-ВМ по сравнению с ЛЭ - и в 1,3 раза в 3 группе, что указывает на клеточную стимуляцию предлагаемого препарата. Результаты по РСИПЛ также представляют факт клеточной стимуляции Повином-ВМ. При этом % прилипших лейкоцитов при лечении Повином-ВМ был в 1,3 раза выше по сравнению с ЛЭ - и в 1,5 - по сравнению с Тетрациклином.

3.14.2 Результаты лечебной эффективности Повина-ВМ при  пневмоэнтеритах у морских свинок

Анализ больных ПЭ и павших морских свинок позволил выявить вирусы парагриппа, РС-вируса, гриппа серотипа А, аденовирусы, пастереллы, кишечную палочку и хламидии.

В опытах использовали по 25 голов морских свинок, составивших 4 группы: 1 гр. - лечение Повином-ВМ, 1,0-1,5 мл/гол, однократно, внутримышечно, на весь курс лечения (5-7 дней); 2 гр. - лечение ЛЭЦ, 1-2 мл/гол., однократно на курс лечения, внутримышечно; 3 гр. - внутримышечное введение миксоглобулина, 1-2 мл/гол., однократно в течение 5-7 дней; 4 гр. - применение Тетрациклина, 0,1-0,3 г/гол., два раза в день, внутримышечно, в течение 5-7 дней (таблица 9).

Таблица 9. Лечение пневмоэнтеритов у морских свинок

№№ гр.	Препараты	Результаты лечения
		Клиническое выздоровление		падеж
		голов	%	голов	%
1	Повин-ВМ	24	96,00	1	4,00
2	ЭЦ	13	52,00	12	48,00
3	Миксоглобулин	12	48,00	13	52,00
4	Тетрациклин	11	44,00	14	56,00

Терапевтический эффект при лечении Повином-ВМ - 96,0%, что в 1,8 раза превышает данные по лечению во 2 гр., и в 2,2 раза, - в 3 и 4 гр. (Р<0,01).

В 1 гр. появление лечебного действия препарата было отмечено спустя 6-10 часов, тогда как во 2, 3 и 4 группах он имел место спустя 12-15 и 16-22 часа, соответственно.

3.14.3 Результаты лечебной эффективности Повина-ВМ при  инфекционном мастите крыс

Цель настоящего эксперимента - показать терапевтический эффект Повина-ВМ при ИМК. В опыте были взяты крысы с острым течением заболевания. Из подобранных животных были составлены 3 группы по 20 голов: 1 гр. - лечение Повином-ВМ в дозе 1-2 мл/гол, однократно, внутримышечно, на весь курс лечения (5-7 дней); 2 гр. - внутримышечное введение Тетрациклина в дозе 0,1-0,2 г. на инъекцию, в день два раза, в течение 5-7 дней; 3 гр. - внутримышечное введение ЛЭ - в дозе 1-2 мл/гол., однократно (таблица 10).

Таблица 10. Лечение инфекционного мастита крыс

№№ гр.	Препараты	Результаты лечения
		Клиническое выздоровление		Падеж
		голов	%	голов	%
1	Повин-ВМ	19	95,00	1	5,00
2	Тетрациклин	10	50,00	10	50,00
3	ЭЦ	12	60,00	8	40,00

Анализ результатов таблицы 10 показал, что в 95% случаев отмечена лечебная эффективность Повина-ВМ, что в 1,0-1,2 раза превышает результаты терапии при лечении Тетрациклином и ЛЭЦ. В 10 раз сократился падеж при лечении Повином-ВМ (Р<0,001). Период наступления клинического улучшения после однократного применения препаратов составил 6-8 часов в 1 гр. и 12-14 часов во 2 гр. В 3 гр. эффект лечения отсутствовал.

Полученные результаты лечения инфекционных болезней лабораторных животных позволили разработать  способы лечения и профилактики болезней у сельскохозяйственных животных.

3.14.4 Профилактическое применение Повина-ВМ на свиньях

Повин-ВМ применяли поросятам однократно на весь период откорма (6мес.) внутримышечно 0,5-1,0 мл/гол., в возрасте от 4 до 40 дней. Контрольной группе препарат не применяли, т.к. использовали традиционные вакцины, антисыворотки и антибиотики. Сформировали  2 группы поросят, находившихся в одинаковых условиях кормления и содержания. В возрасте 40 дней животные опытной группы были вакцинированы против классической чумы свиней вакциной КС производства Нарвак, а контрольная группа животных другими вакцинами, применяемыми в свиноводстве. Одновременно с вакцинацией КС животным опытной группы произвели внутримышечное введение Повина-ВМ 0,5 мл в области шеи за ухом, с противоположной стороны по отношению к месту введения вакцины (таблица 11).

Таблица 11. Результаты испытания Повина-ВМ на свиньях с профилактической целью

Показатели	Повин-ВМ	Контроль
1	2	3
Доза (мл/гол)	0,5-1,0	0,5-2,0
Кратность введения препарата	1	-
Вакцины, антисыворотки, антибиотики	-	4 и более раз
1	2	3
Количество голов в начале опыта	1149	1201
Количество голов на конец опыта	1108	884
Сохранность (%)	96,4	73,6
Среднесуточный прирост на откорме (г.)	622,75	422,88
Средняя масса тела при сдаче на мясокомбинат (кг)	126,71	120,63
Падеж во время откорма и вынужденный убой	41 (3,6%)	317 (26,4%)

Примечание: Р<0,01, 0,05.

Анализ полученных результатов по апробации Повина-ВМ выявил преимущества в сравнении с контрольной группой: препарат применяли однократно, в течение всего периода выращивания и сдачи на мясокомбинат. Отмечен высокий процент выживаемости свиней в опытной группе (96,4%), среднесуточный прирост на откорме (на 47,3% больше), вес поголовья при сдаче на мясо (на 5% больше). Очевиден низкий уровень падежа  и вынужденного убоя животных при введении Повина-ВМ (3,6%),  по сравнению с контролем (26,4%). Повин-ВМ позволил предупредить вирусные и микробные заболевания. Отрицательный фармакологический эффект от применения Повина-ВМ не отмечен как в момент отъема, так и в возрасте 2-4 месяцев. Более того, животные, получившие Повин-ВМ, были гораздо активнее.

3.15 Повин-ВМ- средство для инактивации микроорганизмов

Повин-ВМ апробирован для деконтаминации культуральных и микробных сред. Эксперименты по противовирусному эффекту Повина-ВМ проведены с РСВ, ротавирусом и вирусом диареи на культурах клеток Неlа, Нер-2, ВНК-21, ПЭК ПЭС. В 95-98% Повин-ВМ блокировал формирование БОЕ. Бактерицидное влияние Повина-ВМ проведено на примерах изучения роста E. сoli, Str. Sрр., Enterobacterium Spр., Salm. Cholerea suis, на МПБ и МПА. Определение количества колоний и степени мутности показало, что число колоний с применением Повина-ВМ составило 15,20,4, тетрациклина Ц195,720,3, а без добавок - 1000,212,8 из 1500 микробных клеток, посеянных на МПА. На МПА, содержащих Повин-ВМ, отсутствие роста отмечено в 99,20,1%, Тетрациклин - в 85,72,7% случаев.

Рис.7. Схема производственных испытаний

Выводы

1. Подобраны органные, первичнотрипсинизированные клетки и их субкультуры, диплоидные и перевиваемые клеточные культуры к РС-вирусам штаммов РС-Б КРС и Long человека (диплоидные культуры клеток легкого (ЛЭ) и почки эмбриона коровы  (ПЭ), перевиваемая линия почки эмбриона овцы (FLK), первичнотрипсинизированная культура клеток легкого коровы (ЛЭК), фибробласты легких мышей BALB/с, тестикул бычка. Наибольший титр РС-вируса штамма РС-Б определен в культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ. Для штамма Long оптимальными оказались фибробласты легких мышей  BALB/c (4,00lg) и тестикулы бычка (3,10lg).
2. Установлен оптимальный режим получения РС-вируса штаммов РС-Б и Long: возраст клеточных культур (ЛЭК, ПЭК, ТБ, HeLa и фибробласты легких мышей).
3. Обработка вирусов преципитационной и экстракционной средами позволили выделить максимальное количество обогащенной фракции вирусных белков: РС-вирус- выход вирусных белков- 553,2%, в титрах РСК 1:18920,217,99; вирус ИРТ-822,7%; в титрах РСК 39477,215,49; вирус диареи- 1184,3%; в титрах РСК 1:95755,920,05.
4. Разработана система стимулированного роста вирусов с применением облученной ультрафиолетом сыворотки КРС (2%) и препарата Триптоксид- смеси 0,25% раствора трипсина с  диметилсульфоксидом в соотношении 9:1. Внесение Триптоксида в количестве 1% в суспензионную клеточно-культуральную среду, одновременно или за 1-2 часа до инокуляции вирусами, позволило получить обогащенный вирусный антиген без предварительной адаптации к условиям культивирования вирусов в клеточно-культуральных средах. Титры РС-вируса с Триптоксидом составили 1:6553620,48.
5. Установлен широкий спектр микробной ростстимулирующей активности смеси питуитрина (маммофизина, гифотоцина, окситоцина) с диметилсульфоксидом в соотношении 9:1 (Пинексид). Отмечено раннее появление роста и наибольшее накопления бакмассы грамотрицательных, грамположительных бактерий, грибов, дрожжей за короткий промежуток времени. C. albicans: Пинексид- рост через 365,0ч., бакмасса-108,710,4мг., с эритрит-агаром- 195,310,4ч., бакмасса-75,76,2мг. P. notatum: Пинексид- рост через 201,0ч., бакмасса 275,44,5мг., с эритрит-агаром - 235,03,5ч., бакмасса- 162,47,0мг.
6. Изучены иммуностимулирующие свойства смеси 0,25% раствора трипсина с преднизолоном в соотношении 9:1 (Тризолон). Парентеральное (внутримышечное, подкожное) применение (Тризолона) за 2-4 часа до 1-4-х кратного интраназального заражения РС-вирусом белых мышей и морских свинок позволило получить гипериммунные сыворотки в титрах 1:512-1:1024.
7. Разработан состав А-2ПТК на полимерной основе для стимуляции  получения перитонеальных макрофагов (ПМФ) в максимальном количестве за короткий промежуток времени. ПМФ можно использовать как модельные клетки для изучения фармакологического, иммунологического и других свойств препаратов. Через сутки в группе лабораторных животных, получивших А-2ПТК, количество ПМФ было в 2,7 раза больше в сравнении с прототипом и в 3,6 раза по сравнению с контролем. Максимальный пик индукции наблюдался на 5 сутки. Количество ПМФ в группе, получившей А-2ПТК, составило 100%, в прототипе - 95%, а в контроле - 29%. Процент жизнеспособных ПМФ в группе с А-2ПТК составил 95,80,72%, в прототипе - 71,50,2%, в контроле - 65,20,17%.
8. Предложена модификация чашки Петри для приготовления камееры, которая обеспечивает возможность проследить торможение миграции иммунокомпетентных клеток и выработки антител лимфоцитами. В используемой модели камеры наблюдается торможение миграции макрофагов и лейкоцитов, выделяющих при контакте с антигенами интерлейкины - маркеры чувствительности к антигенам, как результат положительной реакции на заболевание. Камера обеспечивает демонстративность, достоверность и повторяемость исследований. Применение модифицированной пластиковой чашки Петри позволило ускорить рост и дифференциальную диагностику возбудителей заболеваний по бляшкооборазующим единицам и другим проявлениям цитопатического действия инфектантов.
9. Вирусные антигены штаммов РС-Б и Long РС-вируса использованы для изготовления целлюлозных диагностикумов Вироцелл-вирус и Вироцелл-антитело в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ). РА - осуществляли в качественной и в полуколичественной постановке на предметных стеклах. Лабораторные, клинические и производственные испытания антительных и антигеных диагностикумов показывают их высокую специфичность, активность, воспроизводимость результатов, достоверность и простоту исполнения.
10. Модифицированные реакции агглютинации латекса на предметных стеклах обеспечивают быстрый и простой учет результатов по гриппу серотипов А и Б, РС-вируса штаммов РС-Б и Long, вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота
11. Экспресс-методы диагностики воспаления респираторного тракта человека и животных с использованием целлюлозных фильтров в хроматографическом исследовании позволило определить клинику и дифференциацию хронических неспецифических заболеваний легких. Окраска образцов смывов в темно-синий цвет указывает на обострение заболевания, а отсутствие окрашивания- на клиническое выздоровление. Модификация определения содержания СО2 в воздухе помещения позволила быстро контролировать его концентрацию в помещениях для животных и чекловека.
12. Композиция антибиотика Диклоксациллина с 10% кальция хлорида, диметилсульфоксидом и трипсином- Дикалсид, является эффективным препаратом для лечения РС-вирусной, микробной и других видов инфекции. Местное и интраназальное применение Дикалсида быстро устраняло клинику заболевания РС-вирусной инфекции (гнойно-катаральные выделения из носа, кашель и другие) и герпес-вирусной инфекции (зуд, припухание, покраснение, воспаление на коже губ, глаз, лимфоузлов). Дикалсид в 95% случаях эффективен при герпесе глаз, носа, губ, герпеса  Зостер: прекратились зуд, жжение, покраснение, разрешились очаги, исчезли пузырьки, отечность, боли, уменьшились регионарные лимфоузлы за 1-3 суток. Количество РСВ по БОЕ в легочной ткани у санированных Дикалсидом мышей составило 242,1, интерфероном- 31,58,4, коммерческой РСВ сывороткой- 6315,9.
13. Препарат Повин-ВМ- лекарственная форма, содержащая тетрациклин, сополимеры, трипсин, раствор Версен, обладает широким спектром антибактериальной и противовирусной активности при деконтаминации питательных и культуральных сред. В 95-98% Повин-ВМ блокировал формирование БОЕ РС-вируса, ротавируса, парагриппа-3. Подавление микробного роста с применением лПовина-ВМ: 15,20,4 (Р<0.01), Тетрациклина- 195,720,3 (Р<0.01).  Показана иммуностимулирующая, антибактериальная и противовирусная активность Повина-ВМ при парентеральном применении.
14. Интраназальное введение иммунизирующего комплекса ядерных (нуклеокапсидных) и оболочечных (суперкапсидных) фракций белков РС-вируса штамма Long на основе виниламин-вилилпирролидона-дифенилхинона способствовало выработке антител и обеспечило клеточную защиту  иммунизированных мышей. Отмечено преимущество нуклеокапсидных препаратов: в 14 раз возросли титры антител в парных сыворотках (7 и 21день), данные РТМЛ и РГЗТ указывали на клеточную стимуляцию иммунного ответа.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ  ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1.   Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций, рассмотренных и одобренных на заседании научно-технического совета ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол №2 от 16.10.09г.) и на заседании секции инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №4 от 21.10.09г.): Экспресс-диагносика инфекционных болезней животных, Интенсификация культивирования микроорганизмов и вирусов, Профилактика и терапия инфекционных болезней животных.
2. Методические рекомендации:  Применение набора по выявлению РСВ и антител к нему в РАЦ, Применение чашечной камеры в ветеринарной иммунологии, Применение Повина-ВМ- пролонгированного иммуностимулятора однократного применения противомикробного и противовирусного действия (протокол №8 от 14.04.2006г.).- Тверь, 2006.
3. Разработаны проекты нормативных документов для диагностики РС-вирусной инфекции.
4. Результаты исследований по биотехнологическим экспресс-методам в микробиологии и вирусологии внедрены (с 1988 по 2010гг.):

• В Витебском медицинском институте им. Дружбы народов 8.07.1988-26.09.1989г.
• В Литовской республиканской ветеринарной лаборатории, 18.05.1988г.
• В республиканской ветеринарной лаборатории  г. Таллинн, 28.06.1988г.
• В ВНИВИП, 18.06.1990г.
• В лаборатории молекулярной биологии Института биохимии и физиологии АН Кирг. ССР, 04.04.1990г.
• В Ошской областной ветеринарной лаборатории, 21.07.1989г.
• В республиканской ветеринарной лаборатории Кирг. ССР, 27.07.1989г.
• В Куйбывшевской области, совхоз Алексеевскй, 27.01.1992г.
• Во Владимирской области, свинокомплекс Владимирский, 14.10.1990г.
• В Тверской области, свинокомплекс Верхневолжский, 10.05.2005г.
• МГАВМиБ имени К.И. Скрябина в научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии от 10.01.2010г.
• В Тверской государственной сельскохозяйственной академии 19.04.2006г.
• ГН - Институт иммунологии.

5. Рекомендации по использованию научных выводов

1. Для сокращения времени роста грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов, дрожжевых и мицелиальных грибов, а также получения обогащенной бакмассы, в питательные среды рекомендуется вносить Пинексид: 1мл. стимулятора на 100мл питательной среды.
2. Для ускорения появления и обогащения урожаев ДНК- и РНК- содержащих вирусов необходимо вносить Триптоксид в клеточно-культуральную среду: 1мл. стимулятора на 100мл среды.
3. Ускоренный и упрощенный способ очистки обогащенных белковых фракций вирусов для получения антигенов, можно использовать для приготовления диагностикумов, иммунизирующих препаратов и получения антисывороток.
4. Для экспресс-диагностики в лаборатории и на производстве целесообразно использовать латексные и целлюлозные диагностикумы, способы их приготовления и постановки реакции.
5. Для получения высокотитражных сывороток, за 2-4 часа до заражения вирусами, в/м или п/к рекомендуется вводить лабораторным животным Тризолон- смесь 0,25% р-ра трипсина с ДМСО, 9:1.
6. Предлагается контролировать показатели иммунологической резистентности с помощью модифицированной чашки Петри в РТМЛ(М) и РЕК.
7. Камеральную (модифицированную) чашку Петри можно использовать для определения коли-титра, коли-индекса, токсикологческих исследований препаратов на культурах клеток или тканей, бактериальной  загрязненности молока и  т.д.
8. Для профилактики респираторных заболеваний предлагается проводить исследование воздуха на содержание СО, а носовые или бронхиальные смывы- методом бумажной хроматографии.
9. Для лечения инфекционных заболеваний лабораторных животных при наружной локализации рекомендуется применять нанесение Дикалсида.
10. Однократное в/м или п/к использование препарата Повин-ВМ с профилактический целью в свиноводстве позволяет получить максимальный прирост массы тела, сохранность поголовья и сокращение времени откорма для сдачи на мясокомбинат. Повин-ВМ можно также применять для лечения инфекционных заболеваний лабораторных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Макарян Э.А. Лечебная эффективность и методы применения лево- эритроциклина при пастереллезе кроликов /Макарян Э.А.// Автореферат канд.дисс.вет.наук М., 1984-16С.
2. Макарян Э.А. Левоэритроциклин при пастереллезе кроликов. /Макарян Э.А.// Труды ВИЭВ,1984.-Т.60.-С.120-123.
3. Макарян Э.А. Левоэритроциклин и неспецифическая резистентность кроликов /Макарян Э.А.// Бюлл. ВИЭВ, 1984.- В.54.- С.64-67.
4. Макарян Э.А. Левоэритроциклин при пастереллезе кроликов. /Макарян Э.А., Саркисов А.Х.// Ветеринария.- 1984.- № 11.-С.37-38.
5. Макарян Э.А. Иммунологические экспресс-методы исследования у больных ХНЗЛ /Макарян Э.А.// Конф. молодых ученых Института иммунологии. М., 24декарбя, 1987-1С.
6. Макарян Э.А. Сравнительное изучение антигенов РС-вируса и антител соответствующей специфичности. /Макарян Э.А.// Тез. докл. конф. молодых ученых. Саратов, 1987-1С.
7. Макарян Э.А. Способ получения высоких урожаев РС-вируса. /Макарян Э.А.// Тез. докл. X Мечниковской конференции молодых ученых-медиков, 15-17сентярбя, 1987-1С.
8. Макарян Э.А. Способ определения РС-вирусной инфекции. /Макарян Э.А., Дроженников В.А., Кремлев С.Г.// Авторское свидетельство № 4253082.-1987.
9. Макарян Э.А. Способ оценки лечения хронического катарального бронхита /Дроженников В.А., Дыханов И.И., Оглоблина О.Г., Борисов А.М., Ляшенков В.А., Макарян Э.А.// Авторское свидетельство №4330938.-1987.
10. Макарян Э.А. Способ определения РС-вирусной инфекции. /Макарян Э.А., Дроженников В.А., Красильников И.В.// Авторское свидетельство  № 4253592. 1987.
11. Макарян Э.А.Способ диагностики гриппозной инфекции. /Макарян Э.А., Дроженников В.А., Белякова Е.А.// Авторское свидетельство  №  4252494.-1987.
12. Макарян Э.А. Экспресс-диагностика хронических неспецифических заболеваний легких / Макарян  Э.А., Дыханов И.В.Белякова Е.А. Дроженников В.А.,// Конф. молодых ученных института иммунологии МЗ СССР. М.-24декабря, 1987.-С28-30.
13. Макарян Э.А. Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов. /Макарян Э.А., Красильников И.В., Дроженников В.А.// Авторское свидетельство № 4456827.-1988.
14. Макарян Э.А. Экспресс-диагностика РС-вирусной инфекции у больных при ХНЗЛ. /Макарян Э.А.// Конф. молодых ученых Института иммунологии. М., 26декарбя 1988-1С.
15. Макарян Э.А. Экспресс-метод определения РС-вируса. /Макарян Э.А., Красильников И.В., Дроженников В.А.// Вопросы вирусологии.- 1989.-№4.- С.458-459.
16. Макарян Э.А., Экспресс-диагностика РС-вирусной инфекции у крупного рогатого скота. /Макарян Э.А., Строгонова И.Я., Красильников И.В. //Интенсификация с.-х. производства в условиях радикальной экономической реформы. Тезисы.докл.- М.-МВА.-1989.- С.173-174.
17. Макарян Э.А. Способ культивирования РС-вируса. /Макарян Э.А., Красильников И.В.// Авторское свидетельство № 4651255.-1989.
18. Макарян Э.А., Экспресс-диагностика хронических неспецифических заболеваний легких. /Макарян Э.А., Дроженников В.А//Лабораторное дело.-1990.- №10.-С.16-19.
19. Макарян Э.А. Способ выделения вирусных антигенов. /Макарян Э.А.// Авторское свидетельство №4825888.-1990.
20. Макарян Э.А. Способ культивирования микроорганизмов /Макарян Э.А., Маликов В.Е.// Авторское свидетельство № 4800510.-1990.
21. Макарян Э.А. Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного. /Макарян Э.А.// Авторское свидетельство № 4838673.-1990.
22. Макарян Э.А. Состав для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях. /Макарян Э.А., Красильников И.В., Дроженников В.А.// Описание Авторское свидетельство № 4406971.-1990.
23. Макарян Э.А. Патент РФ на изобретение №2286171 Препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии с/х животных и способ профилактики и лечения респираторных желучно-кишечных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии с.-х. животных /Макарян Э.А.//  Патент РФ: заявка № 2005110473 с приоритетом от 12.04.2005.
24. Макарян Э.А. Повин-ВМ- иммуностимулятор пролонгированного действия противомикробной и противовирусной активности. /Макарян Э.А., Прокофьева Г.Н., Вельмискин И.Е.// Научное обеспечение национального проекта Развитие АПК: сб.науч.трудов.-Тверь: ТГСХА.-2006.- С.227-229.
25. Макарян Э.А. Модификация определения инфекционной активности вирусов. /Дегтярев В.П., Макарян Э.А..// Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения: Сб.науч.тр.-Дубровицы: ВИЖ, 2008.- С.24.
26. Макарян Э.А. Экспресс-методы определения вирусов /Дегтярев В.П., Макарян Э.А. // Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения: Сб.науч.трудов.-Дубровицы: ВИЖ.-2008.- С.23.
27. Макарян Э.А. Способ ускоренного роста бруцелл в диагностике и производстве биопрепаратов /Макарян Э.А., Дегтярев В.П. // Достижения супрамолекуляной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Тезисы докладов.-М:ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008.- С.93.
28. Макарян Э.А. Сравнительная динамика роста патогенных микроогранизмов при культивировании. /Дегтярев В.П., Макарян Э.А..// Достижения супрамолекуляной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Тезисы докладов.-М:ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008.- С.94.
29. Макарян Э.А. Ускоренная технология производства бактериальной массы бруцелл. /Дегтярев В.П., Макарян Э.А //Достижения супрамолекуляной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Тезисы докладов.-М:ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008.- С.95.
30. Макарян Э.А. Влияние стимуляторов на выход биомассы микроорганизмов и их биохимические свойства. /Макарян Э.А., Прокофьева Г.Н.. // Проблемы аграрной науки и образования: Сб.научных трудов.-Тверь: Агросфера, 2008.-С.167-170.
31. Макарян Э.А. Эффективный способ стимуляции роста микроорганизмов. /Макарян Э.А., Прокофьева Г.Н // Проблемы аграрной науки и образования: Сб.науч.трудов.-Тверь: Агросфера, 2008.-С.170-172.
32. Макарян Э.А. Определение углекислого газа в модификации по методу Прохорова. /Макарян Э.А., Прокофьева Г.Н., Ромашевский Э.К.//  Актуальные проблемы аграрного образования современной России и на постсоветском пространстве: Сб.науч.трудов.- Тверь: Агросфера, 2008.- С.61-63.
33. Макарян Э.А. Модификация определения инфекционной активности вирусов./Макарян Э.А., Дегтярев В.П.//Ветеринарный врач.-2009.-№1.-С.26-28.
34. Макарян Э.А. Средство для лечения заболеваний, вызываемых вирусной инфекцией. /Макарян Э.А., и др.// решение государственной научно-технической экспертизы изобретений № 4678450/14 (054942)-. приоритет от 13.03.89г.
35. Макарян Э.А. Профилактика и терапия инфекционных болезней животных. /Дегтярев В.П., Макарян Э.А.//Методические рекомендации. Москва,-2009.- 22С.
36. Макарян Э.А. Экспресс- диагностика инфекционных болезней животных. / Макарян Э.А., Дегтярев В.П.//Методические рекомендации. Москва,-2009.- 22С.
37. Макарян Э.А. Интенсификация культивирования микроорганизмов и вирусов /Дегтярев В.П., Макарян Э.А.//Методические рекомендации. Москва,-2009.- 8С.
38. Макарян Э.А., Биотехнологические экспресс-методы в эпизоотологии. /Дегтярев В.П., Макарян Э.А.// Методические рекомендации. Тверь: Агросфера, 2009.-30С.
39. Макарян Э.А., Методические рекомендации по применению Повина - ВМ пролонгированного иммуностимулятора  однократного применения противомикробного и противовирусного действия в свиноводстве. /Макарян Э.А., Прокофьева Г.Н.// Тверь: Агросфера.- 2006.-12С.
40. Макарян Э.А. Методические рекомендации по применению набора для выявления респираторно-синцитиального вируса и антител к нему в реакции агглютинации целлюлозы /Макарян Э.А., Прокофьева Г.Н.//Тверь: Агросфера.-2006.- 6С.
41. Макарян Э.А. Методические рекомендации по применению чашечной камеры в ветеринарной иммунологии /Макарян Э.А., Прокофьева Г.Н.//  Тверь: Агросфера, 2006.- 8С.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии