Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
на правах рукописи
ФЕДОРОВ АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ
БИОСИНТЕТИЧЕСКОЕ СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКОВ
03.00.04-биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва-2009
Работа выполнена в ОАО Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ) и Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии (МНИИМЭ).
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корр. РАН Габибов Александр Габибович доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич доктор биологических наук, профессор Чернов Николай Николаевич
Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН
Защита состоится л__ ______________ 2009г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, д.8, Медицинский факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, д.6.
Автореферат разослан л__ ___________ 2009г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203.Профессор, доктор биологических наук Е. В. Лукашева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.
Актуальность проблемы.
Проблема, как линейная аминокислотная последовательность полипептида сворачивается, чтобы принять уникальную пространственную структуру, является одной из фундаментальных проблем современной науки. Многие принципы и характеристики сворачивания белков были изучены при анализе ренатурации денатурированных полипептидов. Однако проблема сворачивания белков не может быть полностью понята без соотнесения ее к биологическому контексту, особенно для больших, мультидоменных и мультисубъединичных, белков. Одно из основных различий между биосинтетическим сворачиванием белка и его ренатурацией является котрансляционное сворачивание- сворачивание, которое происходит во время синтеза полипептидной цепи на рибосоме. Основная отличительная черта котрансляционного сворачивания- векторное (направленное) появление полипептидной цепи из рибосомы и возможность инициации сворачивания появляющегося растущего полипептида. При этом самым существенным образом может отличаться кинетика процесса сворачивания, его пути и возможное распределение продукта между несколькими формами (например нативная и агрегированная форма) и их относительный выход. Обеспечение эффективного сворачивания белков и есть суть биосинтетического процесса сворачивания и векторного (котрансляционного) сворачивания как его интегральной части, как мы постараемся показать в данной работе.
За последние 15-20 лет появился огромный вал работ, связанный с участием белков теплового шока, теперь обычно называемых молекулярными шаперонами или просто шаперонами. Тем не менее, даже основные принципы и механизмы действия шаперонов не являются достаточно изученными.
Работы, направленные их выяснение, являются несомненно актуальными.
Достаточно очевидна актуальность создания, исследования и возможного применения новых вариантов природных белков и искусственных полипептидов с заданной пространственной структурой как для проверки понимания самоорганизации белков, так и создания белков с определенными функциями для медицины, биотехнологии и т.д.
Внимание к изучению вируса гепатита С (ВГС) легко объяснимо. Вирусом инфицировано 3-5% населения, у 30% инфицированных развиваются терминальные болезни печени. При этом, несмотря на колоссальные усилия в течение около 20 лет после обнаружения ВГС, отсутствуют как соответствующая вакцина, так и эффективная терапия.
Создание рекомбинантной противотуберкулезной вакцины несомненно является актуальным и объявлено одним из приоритетов ВОЗ ввиду ограниченной эффективности БЦЖ.
Целями настоящей работы являются: изучение биосинтетического сворачивания белков, в том числе котрансляционного этапа и вклада молекулярных шаперонов в процесс сворачивания; разработка подходов для изучения сворачивания, структурно-функционального и иммунологического анализа белков в бесклеточных системах экспрессии; изучение природных и искуственных белков с применением, в том числе, разработанных подходов;
изучение подходов к созданию противотуберкулезной вакцины на основе молекулярных шаперонов.
Основными экспериментальными задачами данной диссертационной работы являлись: изучение этапов котрансляционного сворачивания белков;
характеристика пути биосинтетического сворачивания белков и прямое сравнение с ренатурацией из денатурированного состояния; выяснение принципов действия молекулярных шаперонов в достижении белками биологически активной нативной конформации и минимизации альтернативных непродуктивных путей сворачивания. Кроме этого, задачами являлись: изучение альбебетина, искуственного белка с заранее заданной пространственной структурой, и структурных белков вируса гепатита С;
изучение шаперона HSP70 M. tuberculosis как основы противотуберкулезной вакцины.
Научная новизна диссертационной работы.
Детально исследован процесс котрансляционного сворачивания полипептидов. Для этой цели разработаны целый ряд оригинальных подходов.
Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что процесс сворачивания полипептида может начинаться до завершения синтеза соответствующего домена белка. При этом образующаяся структура рибосомосвязанного полипептида близка к структуре нативного белка.
Впервые, на примере субъединицы бактериальной люциферазы, изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитирующий интермедиат при сворачивании и кинетика процесса.
Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы. Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках. Показано, что ключевым для быстрой кинетики биосинтетического сворачивания является нестабильный интермедиат, освобождающийся из рибосомы после завершения синтеза.
На основании полученных результатов выдвинуты некоторые основные принципы котрансляционного сворачивания.
Изучена роль молекулярных шаперонов в биосинтетическом сворачивании белков. Показана вовлеченность шаперонов в процесс котрансляционного сворачивания полипептидов; продемонстировано, что эти взаимодействия могут быть ключевыми для определения пути сворачивания полипептида. Показано, на примере GroEL, что шапероны могут играть активную роль в сворачивании белка, максимально повышая путь сворачивания, ведущий к биологически активной структуре белка и минимизируя альтернативные пути, приводящие к появлению биологически не значимых форм. Предложен механизм такого действия шаперонов.
Изучены эволюционные аспекты сворачивания полипептидов.
Показано, что биосинтетическое сворачивание полипептида в гомологичном для него окружении может отличаться от сворачивания в гетерологичной системе.
Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет сказать, что начато новое научное направление- изучение биосинтетического сворачивания белков как комплексного процесса, определяемого совокупностью факторов, которые делают указанный путь сворачивания уникальным: это и векторный неравновесный характер процесса, определяемый его котрансляционной стадией, и вовлеченность шаперонов, и эволюционная адаптация для сворачивания в определенном клеточном окружении. Этот подход включает определение путей биосинтетического сворачивания и их прямое сравнение с процессом ренатурации полноразмерных полипептидов.
Предложен новый подход к структурно-функциональному и иммунологическому анализу белков- анализ белков, синтезированных в бесклеточных системах экспрессии. Данный подход позволяет изучать белки, которые затруднительно или невозможно получать традиционной наработкой в клеточных системах культивирования. Для этого предложен или адаптирован целый ряд методов. Используя данный подход, изучен искуственный полипептид альбебетин, белок с заранее заданной пространственной структурой. Проведен начальный структурно-функциональный анализ структурных белков вируса гепатита С. Изучен конъюгат шаперона HSPM. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием как возможная основа противотуберкулезной вакцины.
Практическая значимость диссертационной работы. Установленные закономерности биосинтетического сворачивания белков вносят заметный вклад в понимание процесса их сворачивания и самоорганизации. Полученные результаты позволяют оптимизировать продукцию рекомбинантных белков в клеточных и бесклеточных системах экспрессии, а также процедуры ренатурации в биологически активные формы.
Разработанные подходы для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов, в том числе синтезированных в бесклеточных системах, могут применяться для быстрого анализа природных и искуственных полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена, например из-за токсичности, подверженности протеолизу и т.д. Возможности подхода продемонстрированы на начальном структурном анализе альбебетина, полипептида с заранее заданной пространственной структурой.
Большое практическое значение имеет изучение структурных белков ВГС.
В настоящее время отсутствуют вакцина против ВГС. Структурные белки вируса рассматриваются как кандидаты на создание соответствующей вакцины и терапии. Их анализ и использование в данных качествах затруднены сложностью работы с данными белками. Получены несколько форм структурного белка Е2, пригодных для структурно-функционального анализа.
Установлена его доменная организация.
Показано, что конъюгат шаперона HSP70 M. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием может являться основой противотуберкулезной вакцины.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Gordon conference (USA, 1994, 1998-2000), Conference of Protein society, USA (USA, 1994-2000), Conference of Biochemical society, USA (USA, 1995, 1997-2000), Protein folding conference (USA, 1992- 2000), Keystone Simposium (USA, 1995, 1996, 1997, 2000), International congress on HCV (Japan, 2004), conference of Royal Society on British-Russian scientific cooperation (UK, 2004), всесоюзной конференции биохимического общества (Тбилиси, 1989), российско-французской конференции (Москва, 1992).
Результаты работы докладывались на семинарах в Институте белка (Пущино), Институте Пастера (Франция), Центре ядерных исследований (Франция), Высшей политехнической школе (Франция), Университете Страсбурга (Франция), Техасского А и М университета (Колледж Стейшн, США), университетов Техаса в Остине, Сан-Антонио, Хьюстоне, Далласе и Гальвестоне, Университете Пенсильвании (Херши, США), Институте биологии (Бостон, США), Гарвардском университете (Бостон, США), Гарвардской школе медицины (Бостон, США), Университете Глазго (Великобритания), Отделении вирусологии медицинского исследовательского совета (Великобритания).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 статей в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шестнадцати глав, заключения, выводов и списка 381 цитируемого литературного источника. Материалы диссертации иллюстрируют рисунков и 4 таблицы.
Используемые сокращения.
ВГС- вирус гепатита С.
HSP- белок теплового шока (heat shock protein), эти белки также называются молекулярными шаперонами.
GroEL- бактериальный белок теплового шока с молекулярной массой 60 кДа.
DnaK- бактериальный белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа.
HSP70 M. tuberculosis - белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа микобактерии туберкулеза.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении формулируются направления и цели исследования.
ГЛАВА 1 посвящена анализу литературных данных.
I. Котрансляционное сворачивание белков.
ГЛАВА 2. Ранние стадии сворачивания белка, проходящие котрансляционно.
Сворачивание полипептидов является спонтанным процессом и может в принципе начинаться и проходить по мере синтеза белка, т.е. появления и постепенного удлинения растущей полипептидной цепи до завершения синтеза полноразмерного полипептида. С другой стороны, связь С-конца полипептида с тРНК и фиксация пептидил-тРНК на рибосоме может ограничивать конформационную подвижность растущего полипептида и влиять на сворачивание. Вопрос состоит в возможных экспериментальных подходах, способных детектировать появление тех или иных элементов структуры белка по мере синтеза полипептидной цепи на рибосоме в бесклеточных системах экспрессии при количествах синтезируемого полипептида от фентомолей до пикомолей и в окружении огромного избытка белков и других компонентов бесклеточной системы.
Анализ котрансляционного сворачивания белков возможен при использовании моноклональных антител, реагирующих с конформационнозависимыми эпитопами. Такая работа была проведена с субъединицей триптофан синтазы E. coli. Белок является гомодимером с молекулярной массой мономера 44 кДа. Белок двухдоменный с N-концевым доменом 21 кДа.
Использовали конформационно-зависимое моноклональное антитело, mAb19, с эпитопом в N-концевом домене. При ренатурации белка структура, узнаваемая конформационно-зависимым антителом, появляется после завершения начальных этапов сворачивания (Blond-Elguindi, Goldberg, 1990).
При выполнении работы использовали тот факт, что при синтезе в системе трансляции из E. coli бета субъединица триптофан синтазы образует ограниченный набор пептидов возрастающего размера. Такая особенность является характерной для многих белков. Мы показали, что антитело mAbвзаимодействует именно с рибосомо-связанными пептидами бета субъединицы триптофан синтазы, выделяя рибосомную фракцию. Антитело начинает взаимодействовать с синтезируемой триптофан синтазой при достижении пептидом массы 11.5 кДа (Рис. 1А). После этого, антитело взаимодействует со всеми рибосомо-связанными пептидами большей массы.
Чтобы подтвердить полученные результаты, был экспрессирован рибосомосвязанный N-концевой 11.5 кДа фрагмент белка. Для создания стабильных рибосомо-связанных комплексов, несущих синтезируемый полипептид, мы разработали подход, в котором использовали мРНК, оканчивающуюся на один или два нуклеотида после последнего 3Т концевого триплета. Полученный рибосомо-связанный N-концевой 11.5 кДа фрагмент белка взаимодействует с антителом (Рис. 1Б). Таким образом, на качественном уровне мы доказали, что синтезируемый пептид начинает сворачиваться по мере синтеза, задолго до появления соответствующего полноразмерного домена, т.е. мы наблюдаем внутридоменное сворачивание по ходу синтеза белка. Необходимо учесть, что около 20 С-концевых аминокислот синтезируемого полипептида находятся Рис. 1 Иммунореактивность А Б растущих цепей бета субъединицы триптофан синтазы с моноклональным антителом mAb19. A. Синтез белка в системе из E. coli. a-контроль иммуноадсорбции, b- иммуноадсорбция с mAb19, c-реперные белки. Б. Синтез 11.5 кДа фрагмента в системе из зародышей пшеницы. а и с- синтез фрагмента со стоп кодоном и без стоп кодона, b и d-иммуноадсорбция с mAb19.
внутри рибосомы, таким образом, с антителом могут взаимодействовать около 80 аминокислот. Данный N-концевой фрагмент бета субъединицы триптофан синтазы образует в нативном белке две взаимодействующие между собой альфа спирали.
Чтобы доказать идентичность или близость структуры в районе конформационного эпитопа у синтезируемого пептида и полноразмерного белка, нам необходимо было определить аффинность взаимодействия антитела в обоих случаях. Мы разработали метод, позволяющий провести такое исследование. Его детали изложены ниже (см. главу 13). Для рибосомосвязанного 11.5 кДа пептида и антитела mAb19 мы получили сродство 6x108 M-1. Такое же значение было получено для 11.5 кДа фрагмента в растворе. Сродство антитела mAb19 к нативному гомодимеру триптофан синтазы составляет 6x108 M-1 (Friguet et al, 1986), что очень близко к полученным нами результатам.
Полученные данные о близости аффинности антитела mAb19 к рибосомосвязанному N-концевому фрагменту и нативному белку исключают возможность, что наблюдаемая иммунореактивность отражает конформационное равновесие между минорной фракцией иммунореактивного рибосомо-связанного пептида и мажорной фракцией пептида, не взаимодействующего с антителом. Также и в случае, если иммунореактивная конформация индуцируется антителом, аффинность взаимодействия с антигеном уменьшается (Friguet et al, 1989).
Наличие структурированной конформации у фрагмента было подтверждено гель-фильтрацией и электрофорезом с горизонтальным градиентом мочевины, перпендикулярным к направлению электрофореза.
Мы показали, что бета субъединица триптофан синтазы E. coli начинает сворачиваться по мере ее синтеза на рибосоме и локальная пространственная структура, соответствующая нативной, может формироваться еще до завершения синтеза соответствующего домена.
Глава 3. Кинетика котрансляционного сворачивания.
Чтобы однозначно показать, что растущая полипептидная цепь приобретает элементы пространственной структуры действительно по ходу процесса трансляции, мы разработали процедуру пульсового радиоактивного мечения синтезируемого пептида и короткой пульсовой имммуноадсорбции полипептидных цепей бета субъединицы триптофан синтазы на антителе mAb19. Ее наиболее важные детали состоят в следующем. Взаимодействие mAb19 с синтезируемыми полипептидами было ограничено 30 секундами.
Анализировали связавшиеся с антителом радиоактивно меченые рибосомосвязанные полипептиды 11.5, 30 и 40 кДа.
Синтез основных пептидных фрагментов идет линейно по времени, после лага, характерного для каждого пептида. Кинетика накопления всех рибосомосвязанных цепей данного размера была сравнена с кинетикой появления иммунореактивных, т.е. свернутых, полипептидов (см. Рис. 2 для фрагментов 11.5 и 30 кДа). Для всех фрагментов время их появления совпадало со временем их синтеза. Так как использовавшийся иммунохимический пульс, 30 секунд, значительно короче времени синтеза полипептидных цепей в используемой системе, мы можем утверждать, что данный белок начинает сворачиваться задолго до завершения его синтеза.
Рис. 2 Сравнительная кинетика синтеза и появления иммунореактивности с mAb19 при синтезе фрагментов 30 кДа (А) и 10.5 кДа (Б) субъединицы триптофан синтазы. Количество синтезированных фрагментов (, правая шкала) и иммунореактивных фрагментов (, левая шкала) Глава 4. Влияние котрансляционного этапа на кинетику биосинтетического сворачивания белка.
Принципиальная особенность котрансляционного сворачивания полипептида состоит в том, что в ходе процесса возникающие внутрипептидные контакты могут отличаться от контактов, образующихся при сворачивании полноразмерного полипептида из денатурированного состояния.
Кроме этого, может меняться порядок формирования внутрипептидных контактов. Задачей данной работы было выявить возможный вклад котрансляционного сворачивания в скорость формирования нативной структуры белка. Экспериментально это означало впрямую сравнить скорости биосинтетического сворачивания белка в бесклеточной системе трансляции со скоростью ренатурации этого же белка в аналогичных условиях. В качестве модельного белка в этой и нескольких последующих работах была выбрана бактериальная люцифераза. Белок представляет собой гетеродимер. cубъединица люциферазы является типичным представителем многих цитоплазматических белков: у нее отсутствуют пре- и пропоследовательности. Отсутствуют выраженные взаимодействия с молекулярными шаперонами при оптимальной температуре. Чувствительность ферментативного теста позволяет следить за формированием очень небольших количеств активного гетеродимера в ходе синтеза и в процессе ренатурации.
Достаточно важно, что обе субъединицы при сворачивании формируют интермедиаты, i и i, компетентные к последующей ассоциации в течение достаточно долгого периода времени при оптимальной температуре 29 С.
Синтезировали субъединицу в бесклеточной системе трансляции из E. coli при оптимальной температуре в присутствии достаточно высокой концентрации ренатурированной i субъединицы. Таким образом, появление активного гетеродимера зависит от скорости сворачивания субъединицы и ее ассоциации с i. Было показано, что процессы синтеза субъединицы и появления активного гетеродимера протекают со схожей кинетикой, при этом между завершением синтеза полноразмерного полипептида и формированием активного гетеродимера есть лаг в 3-4 минуты (Рис.3А). Это лаг включает не только процессы сворачивания/ассоциации субъединицы после ее освобождения из рибосомы, но и терминацию синтеза и диссоциацию завершенного полипептида из рибосомы. Чтобы лучше оценить скорость образования нативной люциферазы, в ходе трансляции блокировали дальнейший синтез, УзамораживаяФ растущие полипептиды на рибосоме.
юбое дальнейшее увеличение ферментативной активности люциферазы должно отражать только процесс сворачивания/ассоциации субъединицы диссоциировавшей из рибосом к моменту ингибирования синтеза. Полученные результаты показали, что плато активности люциферазы достигалось через 1-минуты после наложения блока.
А Б Рис. 3 (А)- кинетика синтеза субъединицы люциферазы ( ) и появления активного фермента () при трансляции в системе из E. coli. (Б)- кинетика появления активного фермента при ренатурации субъединицы в буфере () и системе трансляции ().
Эксперименты проводились в присутствие ренатурированной субъединицы.
Полноразмерная субъединица, ассоциированная с рибосомой в стабильном комплексе с мРНК, лишенной стоп кодона, не способна ассоциировать с субъединицей. Чтобы впрямую сравнить скорость ренатурации субъединицы в тех же условиях, полипептид, денатурированный в мочевине, добавляли к буферу или системе трансляции в отсутствие мРНК. Видно, что формирование активной люциферазы начинается после лага, достигая 50% от конечной активности через 9-12 минут (Рис.3Б).
Несколько более быстрая скорость ренатурации в системе трансляции может быть следствием действия молекулярных шаперонов.
Было проведено моделирование сворачивания субъединицы при синтезе в системе трансляции при допущениях, что котрансляционное сворачивание отсутствует, полипептид начинает сворачиваться только после завершения синтеза и скорость сворачивания аналогична скорости ренатурации в системе трансляции (Рис. 4). Результаты моделирования показывают, что в этом случае лаг между синтезом субъединицы и появлением активной люциферазы составлял бы 10 мин вместо наблюдавшихся 3-4, а после блокирования синтеза происходил бы очень существенный прирост активной люциферазы и плато достигалось бы лишь через время около 17 минут. Результаты моделирования находятся в очевидном контрасте с экспериментальными данными сворачивания субъединицы в ходе синтеза. Итак, были впрямую сравнены скорости сворачивания субъединицы люциферазы при синтезе в бесклеточной системе трансляции и в ходе ренатурации. Полученные результаты позволили предположить, что полностью развернутые формы полноразмерных полипептидов отсутствуют при биосинтетическом сворачивании в клетках.
Вне зависимости от взаимодействий субъединицы люциферазы в ходе биосинтетического сворачивания, котрансляционное сворачивание полипептида на рибосоме является необходимым условием для быстрого приобретения нативной структуры.
Рис.4 Математическое моделирование сворачивания бета субъединицы и образования гетеродимера активной люциферазы. Экспериментальная кинетика синтеза бета субъединицы ( ). Модель кинетики формирования люциферазы при допущении, что бета субъединица сворачивается со скоростью денатурированной субъединицы в аналогичных условиях (), модель кинетики формирования люциферазы после блока синтеза при том же допущении (- -).
Глава 5. Путь сворачивания субъединицы люциферазы при биосинтетическом процессе. Его сравнение с путем сворачивания из денатурированного состояния.
Экспериментальной задачей данной работы было установление биосинтетического пути сворачивания субъединицы люциферазы в нативный гетеродимер и его сравнение с путем ренатурации денатурированной субъединицы. Процесс ренатурации субъединицы может быть разбит на два основных этапа: сворачивание индивидуальной субъединицы и ассоциация с субъединицей (Ziegler et al, 1993). В первую очередь, был проведен анализ скорость-лимитирующей стадии при биосинтетическом сворачивании субъединицы в активный гетеродимер. Для этого проводили эксперименты по кинетике образования люциферазы в бесклеточной системе трансляции из E. coli, аналогичные представленным выше. Вначале субъединица должна принять конформацию, способную к ассоциации, и затем реагировать с субъединицей. Более медленный из этих процессов определяет скорость образования гетеродимера. Моделирование проводилось, основываясь на экспериментально наблюдавшихся скоростях образования люциферазы в бесклеточной системе и допущении, что субъединица начинает ассоциировать с субъединицей после диссоциации из рибосомы. В ходе моделирования каждый из двух этапов делался скоростьлимитирующим. Когда скорость-лимитирующим этапом была изомеризация, Rs-освобожд. *, и скорость ассоциации лимитировалась диффузией, моделирование наилучшим образом совпадало с экспериментальными данными при константе изомеризации 0.012 s-1. При моментальной скорости изомеризации, лучшее совпадение с результатами получалось при скорости ассоциации + * , соответствующей 5х104 М-1s-1.
Была охарактеризована скорость-лимитирующая стадия ренатурации в аналогичных условиях. Ренатурация является достаточно медленным процессом, который протекает с одинаковой скоростью вне зависимости от того, начинается ли она с денатурированной субъединицы или свернутым интермедиатом i. Это демонстрирует, что в указанных условиях скоростьлимитирующая стадия находится на поздних стадиях процесса сворачивания.
Кажущаяся константа ассоциации для ренатурации составляет 0.7х104 М-1s-1, что существенно ниже аналогичного показателя для биосинтетического процесса, определенного выше. Моделирование кинетики биосинтетического сворачивания субъединицы, основываясь на константе ассоциации, определенной для ренатурации, показало, что в этом случае процесс протекал бы существенно более медленно. Ассоциация и субъединицы требует многочисленных и специфичных белок-белковых взаимодействий на их взаимодействующих поверхностях. Соответственно, было допущено, что механизм ассоциации субъединиц является одинаковым для биосинтетического сворачивания и ренатурации, иными словами, интермедиат *, реагирующий с субъединицей, является общим для обоих процессов. В таком случае скорость реакции ассоциации будет определяться распределением субъединицы между i и *, i*, где i является более стабильной формой и, следовательно, доминирует, а *-менее стабильная минорная форма. В соответствие с этой моделью *, которая появляется при диссоциации с рибосомы или вскоре после этого, имеет две возможности: или быстро ассоциировать с субъединицей, или изомеризоваться в i форму.
Модель позволяет сделать экспериментальные предсказания. Если вести трансляцию субъединицы в отсутствие субъединицы, чтобы позволить субъединице находиться в течение определенного времени без напарника, и затем добавлять , то она должна изомеризоваться в i и ее скорость ассоциации должна соответствовать наблюдаемому при ренатурации.
Предсказание было подтверждено, когда субъединицу добавляли после завершения и блокирования синтеза субъединицы. С-концевой сегмент субъединицы, который освобождается из рибосомы после завершения синтеза и появления полноразмерного полипептида в растворе, является необходимым для ассоциации, хотя и расположен вдалеке от контактирующей поверхности.
Мы предположили, что формирование интермедиата * может включать промежуточные взаимодействия С-концевой части со свернутой N-концевой частью субъединицы после освобождения полипептида из рибосомы. В этом случае, исходя из предложенной нами модели, если освобождение субъединицы в раствор происходит с присутствии субъединицы, то должна наблюдаться быстрая скорость ассоциации, характерная для *. Добавление же субъединицы спустя определенное время после диссоциации субъединицы из рибосомы должно характеризоваться медленной скоростью ассоциации, типичной для процесса ренатурации. Эксперимент, в котором синтезированную субъединицу диссоциировали в раствор пуромицином в присутствии субъединицы, или же добавляли ее потом, подтвердил предсказания, следующие из нашей модели (Рис. 5).
Рис. 5 Кинетика образования люциферазы, когда субъединица освобождается из рибосом пуромицином в присутствие субъединицы () или в отсутствие, когда субъединица добавлялась позже (). ()- кинетика освобождения субъединицы из рибосом пуромицином.
Ключевым моментом в предложенной нами схеме сворачивания субъединицы является то, что ренатурированный мономер находится в равновесии между доминирующей более стабильной формой i и меньшей фракцией нестабильного конформера *. В таком случае при быстром смешении свернутых субъединиц должно наблюдаться две различные кинетические фазы формирования люциферазы: более быстрая УвзрывнаяФ фаза с амплитудой, определяемой фракцией субъединицы в форме *, за которой следует более медленная фаза, пределяемая скоростью изомеризации i в компетентную к ассоциации *. Если, с другой стороны, реакция ассоциации протекает через i, которая реагирует с субъединицей с некоей фиксированной константой, то должна наблюдаться одна линейная фаза ассоциации. Для проверки данного предположения были проведены соответствующие эксперименты с Уостановленным потокомФ (quench-flow experiments). Суть экспериментов состояла в смешивании предварительно свернутых и субъединиц для их ассоциации в течение заданного периода времени, после чего дальнейшая ассоциация блокировалась сильным разбавлением при пониженной температуре и немедленно измерялась активность образованной люциферазы. Эксперименты действительно выявили двухфазную кинетику реакции ассоциации (Рис. 6). В зависимости от использовавшихся концентраций субъединицы, начальная быстрая фаза заканчивалась в первые 1-2 секунды реакции и начиналась более медленная линейная фаза. Данные наблюдения соответствуют выдвинутой нами модели, но противоречат модели +i . Мы провели далее анализ полученных результатов, определяя константы протекающих реакций, которые наилучшим образом моделируют полученные экспериментальные данные.
Рис. 6 Анализ механизма ассоциации свернутой бета субъединицы с альфа субъединицей методом остановленного потока (quench-flow). (A) схема эксперимента, (Б)(Д) экспериментальные результаты (x), сплошная линия представляет наилучшее приближение результатов для * модели.
Были получены следующие значения констант: i * 4х10-4 s-1, * i 0.s-1, * + 0.9х107 М-1 s-1. Из приведенных данных видно, что равновесие i * сдвинуто резко в сторону i (соотношение прямой и обратной констант составляет 10-3), как мы и предполагали изначально. Реальная константа ассоциации больше чем на три порядка превышает кажущуюся константу ассоциации.
Данные, полученные для биосинтетического процесса сворачивания субъединицы и ее ренатурации, позволяют оценить взаимоотношение между двумя процессами (Рис. 7). Биосинтетическое сворачивание и ренатурация субъединицы сливаются при образовании интермедиата *, который способен быстро ассоциировать с . В контексте биосинтетического сворачивания форма i, образующаяся в отсутствие , является интермедиатом на альтернативном непродуктивном пути сворачивания. Медленный путь сворачивания, через образование конформера i, попросту отсутствует. В пути сворачивания при ренатурации i является продуктивным интермедиатом, через который протекает реакция.
i k3 (очень быстро) k2 (быстро) k освобожденная из * биосинтез Лимитирующая рибосомы стадия (29С
Таким образом, в случае данного белка взаимодействия С-концевого фрагмента определяют появление продуктивного для сворачивания интермедиата. Было предположено, что существуют два варианта взаимодействия С-концевой части с основной частью полипептида. Первый вариант кинетически предпочтителен в условиях биосинтетического сворачивания. Второй вариант является термодинамически более предпочтительным и доминирует в ходе ренатурации.
Глава 6. Котрансляционное сворачивание белков и его физический смысл.
На наиболее фундаментальном уровне понятно, что физические принципы сворачивания белков одинаковы как для процесса ренатурации полноразмерных денатурированных белков, так и для их биосинтетического сворачивания. В то же время, процесс биосинтетического сворачивания УбольшихФ белков не может быть адекватно сведен к ренатурации развернутых полипептидных цепей и понят вне биологического контекста. На основании полученных результатов нами выдвинуты гипотезы относительно некоторых принципов сворачивания белков в клетке.
Векторная природа синтеза и сворачивания растущей полипептидной цепи позволяет избегать непродуктивных взаимодействий, неизбежных при ренатурации полноразмерного полипептида. Отсутствие сворачивания в ходе синтеза приводит к тому, что сворачивание начинается с развернутого полноразмерного полипептида и схоже с процессом ренатурации денатурированных белков. Такой процесс характеризуется высоким барьером активации, а значит, медленной скоростью сворачивания. Образование промежуточных структур в ходе котрансляционного сворачивания позволяет избегать кинетических ловушек, лимитирующих скорость ренатурации у Рис. 8 Диаграмма модели быстрого биосинтетического сворачивания белка в контексте его медленной ренатурации. Биосинтетическое сворачивание проходит через ряд промежуточных интермедиатов (I1, I2, I3) и избегает кинетических ловушек, таких как Mi.
В отсутствие котрансляционного сворачивания (Iu1, Iu2, Iu3), синтезированный полипептид начинает сворачивание из полностью развернутого состояния Mu, и проходит через медленно сворачивающийся интермедиат Mi сходно с реакцией ренатурации. Скорость обеих процессов лимитируется барьером активации. Полипептид, освобожденный из рибосомы M* близок к переходному состоянию TS и, следовательно, быстро приобретает нативную конформацию Mn в отличие сворачивания Mu через Mi с высоким барьером активации.
больших белков, уменьшает барьер активации и ускоряет процесс сворачивания (Рис. 8). Мы предполагаем также, что некоторые сегменты белков могут определять котрансляционный путь сворачивания, играя роль, схожую с ролью про последовательностей в полипетидах, которые необходимы для сворачивания в нативную структуру.
В течение последних лет развивается новое представление о сворачивании как процессе, проходящем в конформационном пространстве, доступном данному полипептиду (Onuchic et al, 1995). Сворачивание в таком случае можно представить как УскольжениеФ полипептида вниз по поверхности воронки, которая представляет собой энергетический ландшафт данной белковой цепи. Каждый уровень поверхности соответствует определенной конформационной энергии полипептида. Нативной структуре соответствует состояние с глобальным энергетическим минимумом.
Рис. 9 Схема котрансляционного сворачивания белков с использованием концепции энергетических ландшафтов сворачивания. Воронка слева представляет биосинтез в отсутствие сворачивания (энергии растущих пептидов отражены стрелками), в этом случае сворачивание начинается с появлением полноразмерного полипептида с высокой конформационной энергией Mu и идет, как отражено стрелками в воронке справа.
Котрансляционное сворачивание представлено серией тоннелей, в которых, через промежуточные интермедиаты растущих пептидов, полноразмерный полипептид появляется в форме M* с существенно меньшей конформационной энергией и быстрее и с большей эффективностью достигает нативного состояния Mn. Модель является упрощением, т.к. растущие пептиды при каждом шаге синтеза формируют свои собственные энергетические ландшафты; тоннелями представлены наиболее населенные энергетические уровни сворачивающихся растущих пептидов.
Этот подход был адаптирован нами для представления процессов котрансляционного сворачивания (Рис. 9). Процессы биосинтеза и сворачивания соответствуют движению слева направо. Энергетическая поверхность слева представляет собой гипотетический случай в отсутствие сворачивания растущего полипептида. По мере роста синтезируемого полипептида на рибосоме общее количество его доступных конформаций возрастает (воронка расширяется) и, в отсутствие сворачивания, поверхность воронки стремится вверх к более высоким энергиям. Энергетическая поверхность справа отражает нековалентные взаимодействия в ходе сворачивания полностью синтезированного, но не свернутого полипептида.
Пути сворачивания указаны стрелками. Котрансляционное сворачивание представлено как тоннельный процесс, в котором растущий полипептид сворачивается по мере синтеза через серию промежуточных интермедиатов, таким образом сохраняя более низкую энергию, чем в случае синтеза без сворачивания. Когда появляется синтезируемый пептид, достаточный для начала процесса сворачивания, процесс синтеза и сворачивания полипептида покидает левую воронку и к моменту завершения синтеза переходит в правую в виде интермедиата М*. Данный интермедиат может быстро доходить до минимума конформационной энергии, т.е. приобретать нативную структуру.
Данное представление котрансляционного сворачивания также явно демонстрирует, что при этом удается избегать высокого барьера активации процесса и кинетических ловушек при сворачивании денатурированного белка (представляют собой локальные провалы энергии на пути сворачивания, из которых трудно выбраться).
II. Биосинтетическое сворачивание белков и молекулярные шапероны.
В начале 1960 годов был описан феномен теплового шока и показана его универсальная природа. Суть явления состоит в репрессии общего синтеза белка при повышении температуры у организма (или клеток) выше физиологической, называемой температурой теплового шока. При этом в клетках начинает вырабатываться ограниченный набор белков, названных белками теплового шока. В течение достаточно продолжительного времени стало ясно, что эти белки помогают справиться с появлением в клетке больших количеств денатурированных белков вследствие повышения температуры и других стрессов. Далее было показано, что и при нормальной температуре данные белки, теперь также называемые молекулярными шаперонами или просто шаперонами, участвуют в процессах сворачивания, процессинге, деградации белков, формировании иммунного ответа. Мы изучали роль двух шаперонов E. coli: GroEL (представитель семейства HSP 60) и DnaK (представитель семейства HSP 70).
Глава 7. Взаимодействие синтезируемых полипептидов с молекулярными шаперонами.
Потенциальное взаимодействие синтезируемых полипептидных цепей, рибосомо-связанных и диссоциированных с рибосомы, изучали на бета субъединице триптофан синтазы, синтезируемой в бесклеточной системе трансляции из E. coli. Анализ показал, что концентрации основных шаперонов, GroEL и DnaK, составляют соответственно 0.25 и 1 мг/мл в экстракте E. coli, использовавшемся в системе трансляции. Данные концентрации являются достаточно высокими, чтобы обеспечить взаимодействие со значительной долей вновь синтезированных белков в ходе их сворачивания. Трансляцию проводили, как и в описанных выше работах по котрансляционному сворачиванию, на мРНК без стоп кодона. Вновь синтезированные полипептидные цепи, диссоциировавшие с рибосомы и рибосомо-связанные, разделяли центрифугированием. Супернатант, содержащий диссоциировавшие полипептидные цепи, подвергали электрофорезу в неденатурирующих условиях и анализировали распределение радиоактивно меченых цепей триптофан синтазы, а также GroEL и DnaK (используя моноклональные антитела к GroEL и DnaK). Было продемонстрировано совпадение распределения цепей триптофан синтазы и этих шаперонов. Таким образом, вновь синтезированные незавершенные полипептиды, освобожденные из рибосомы, были обнаружены в стабильных высокомолекулярных комплеках, содержащих GroEL или DnaK. Чтобы определить, были эти комплексы образованы с пептидами до их диссоциации с рибосом или после этого, анализировали ассоциацию рибосомо-связанных полипептидов с данными шаперонами. Синтезируемые пептиды из рибосомной фракции образовывали комплексы только с DnaK, но не с GroEL. Таким образом, выглядит, что растущие рибосомо-связанные полипептиды могут образовывать комплекс с DnaK, в то время как диссоциировавшие пептиды могут, в дополнение, реагировать с GroEL.
Глава 8. Шаперон GroEL модулирует кинетику распределения сворачивающихся полипептидных интермедиатов между альтернативными формами белка, максимально увеличивая выход биологически активного белка.
Центральным вопросом в функционировании шаперонов является механизм, благодаря которому доля полипептидов, сворачивающихся по продуктивному пути сворачивания, может быть максимально увеличена, а непродуктивные пути сворачивания сведены к минимуму. Задачей данной работы было изучить механизм действия системы GroEL на сворачивание и ассоциацию олигомерного белка. Для этого использовали бактериальную люциферазу. В первую очередь, было установлено распределение субъединиц в различные конечные продукты в зависимости от температуры. При оптимальной температуре 29 С гетеродимер образуется с выходом 100%. При повышении температуры до 34 С выход активного фермента падает, а при С активный фермент не образуется вовсе. Падение выхода активного гетеродимера происходит за счет инактивации субъединиц, для субъединицы этот процесс гораздо более быстрый, чем для . Константы инактивации для субъединицы составляют 0.0744 мин-1 и 0.84 мин-1, для 34 С и 42 С.
Инактивация не зависит от концентрации субъединиц и отражает формирование альтернативных мономерных форм х и х, не способных к ассоциации.
GroEL эффективно связывает как , так и субъединицу, при 42 С шаперон полностью защищает связанные субъединицы от термоинактивации (Рис. 10, А, Г). Добавление полной системы, т.е. GroEL, GroES и АТФ, к субъединицам поодиночке также приводило к замедлению их термоинактивации (Рис. 10). Для субъединицы этот эффект выражен более ярко. Как мы показали, система GroEL/ES не способна обращать инактивацию.
Рис. 10 Эффект GroEL и полной GroE системы на инактивацию субъединиц люциферазы при повышенных температурах. (А) и (Г)- влияние GroEL на инактивацию. Б, В, Д, Е- влияние полной системы GroE на инактивацию.
Так как концентрация свободной субъединицы существенно падает в присутствие GroEL/ES, то скорость формирования активной люциферазы должна снижаться, поскольку зависит от концентрации. Кроме этого, логично было бы ожидать уменьшения конечного выхода активной люциферазы при повышенной температуре. При 34 С, где сосуществуют два пути сворачивания, в гетеродимер и неактивные х и х субъединицы, конечный выход активного гетеродимера, 80%, был выше этого показателя без добавления GroEL/ES (60%), а выход неактивной х субъединицы, 20%, соответственно ниже (составлял 40% без GroEL/ES) (Рис. 11). Эти результаты очевидным образом не согласуются с предпосылкой, что сворачивающиеся интермедиаты х и х просто связываются и освобождаются из GroEL без изменения своих параметров ассоциации.
Рис. 11 Эффект полной системы GroE на формирование люциферазы при повышенных температурах. А- влияние GroE на гетеродимер при различных температурах, Б- влияние на образование х при 34, В и Г- эффект временной инкубации субъединиц в присутствие системы GroE при 42 С на образование х и . Б-Г- эксперименты в присутствии GroE (), в отсутствие- ().
Простейшим объяснением этих результатов является предположение, что субъединица, освобожденная из GroEL, отличается от i и реагирует быстрее с i при гетеродимеризации. Детальный количественный обсчет полученных результатов подтверждает такой вывод.
В полной системе GroEL/ES субъединицы ведут себя по разному: субъединица связывается относительно слабо, а i субъединица обладает высоким сродством к GroEL. Вероятно, это не простое совпадение, что именно субъединица, быстро образующая альтернативную мономерную структуру, обладает повышенным сродством к шаперону. Мы видим вовлечение системы GroEL/ES в распределение субъединицы между альтернативными путями сворачивания как результат эволюционной адаптации, чтобы максимально увеличить выход биологически активной гетеродимерной формы люциферазы.
Из наших экспериментальных наблюдений следует, что форма субъединицы, освобождаемая из GroEL реагирует с субъединицей быстрее, чем i. Такая форма соответствует по кинетическим свойствам форме. Итак, система GroEL/ES, сдвигает равновесие i, связываясь с i и освобождая с определенной вероятностью (см. модель на Рис. 12).
i x x i i i-GroE * * i-GroE i i i ? i-GroE i-GroE x x Температура Рис. 12 Схема действия системы GroE на образование люциферазы при различных температурах. Слева- образование гетеродимера при оптимальной температуре, в центре- образование альтернативных продуктов, , х, х, справа- образование только х и х. При существовании альтернативных путей сворачивания GroE сдвигает равновесие в сторону биологически активного гетеродимера; при температуре, при которой гетеродимер не может образовываться, у GroE повышается сродство к субъединицам и замедляется образование биологически инертных х и х.
Глава 9. Обобщенная схема действия шаперонов.
В нашей модели (Рис. 13) развернутый полипептид (U) и интермедиаты сворачивания (I, Iмедл) могут быть субстратами для шаперонов. Связывание шаперонов с медленно или непродуктивно сворачивающимися интермедиатами (Iмедл) может (частично) разворачивать неправильно сворачивающийся полипептид и возвращать его в форму, предшествующую точке разветвления в процессе сворачивания. Это дает возможность полипептиду заново пройти процесс сворачивания. Хорошо известно, что многие сворачивающиеся белки склонны к агрегации, особенно в высоких концентрациях. Связывание сворачивающегося полипептида с шапероном само по себе должно уменьшать скорость агрегации, что было отмечено разными авторами. Наиболее принципиально, наша модель предполагает возможность, что шаперон может освобождать полипептид в форме, которая способна достигнуть нативной структуры быстрее, чем форма, начально связанная шапероном.
Iмедл CH Рис.13 Обобщенная схема возможных путей действия шаперонов на сворачивание белков. U- развернутый белок, I- Iмедл интермедиаты сворачивания, TS- переходное [ состояние белка, N- нативный белок, СН- ] шаперон.
U TS N [I*] I I CH Такая форма (I*) неизбежно должна обладать большей энергией, чем изначально связанная форма, т.е. являться интермедиатом с высокой энергией, и ближе приближаться к переходному состоянию полипептида. Таким образом, шаперон способен ассистировать сворачивающемуся полипептиду в преодолении барьера энергии, который определяет скорость-лимитирующую стадию процесса сворачивания. Наша модель предлагает альтернативное объяснение влияния шаперонов на кинетику сворачивания других белков, может объяснять наблюдавшееся увеличение скорости сворачивания для некоторых олигомерных белков в присутствии GroEL/ES, дает экспериментальные предсказания эффектов шаперонов на сворачивание белков для ее дальнейшей проверки и тестирования.
Глава 10. Быстрый и медленный пути биосинтетического сворачивания субъединицы бактериальной люциферазы.
субъединица бактериальной люциферазы быстро сворачивается в бактериальной бесклеточной системе из E. coli, т.е. в близком к природному клеточном окружении. Экспериментальной задачей данной работы было изучение биосинтетического сворачивания субъединицы люциферазы в эволюционно отдаленном клеточном окружении. Для этого использовали эукариотическую систему трансляции из ретикулоцитов кролика. При трансляции субъединицы в бесклеточной системе экспрессии из ретикулоцитов кролика (в присутствии субъединицы) наблюдается существенная задержка, около 20 минут, между синтезом полипептида и формированием активной люциферазы. После блокирования белкового синтеза в системе трансляции наблюдался дальнейший существенный рост активной люциферазы, который выходил на плато только примерно через минут после остановки трансляции. Таким образом, в эукариотической системе экспрессии для субъединицы люциферазы характерно медленное сворачивание, в очевидном контрасте с быстрым сворачиванием в прокариотической системе. Кинетика сворачивания в эукариотической системе экспрессии сходна с кинетикой ренатурации данного полипептида.
Мы предположили, что задержка вызывается взаимодействием полипептида с шаперонами в ходе синтеза или после освобождения из рибосомы. Для проверки данного предположения субъединицу транслировали, добавив в систему трансляции избыток необратимо денатурированного овальбумина, который хорошо связывается с шаперонами и должен вытеснять другие субстраты из комплексов с ними. Действительно, задержка между синтезом полипептида и формированием гетеродимера драматически сократилась и составила 2-3 минуты, характерные для сворачивания в бактериальной системе трансляции. С использованием антител к HSP70 было показано, что вновь синтезированная субъединица в экстракте из ретикулоцитов кролика способна связываться с этим шапероном.
Взаимодействие денатурированной субъединицы с HSP70 не сказывается на скорости сворачивания полипептида и ассоциации в активный гетеродимер, как свидетельствуют эксперименты по ренатурации в экстракте из ретикулоцитов кролика, в том числе в присутствие денатурированного овальбумина. Таким образом, связывание HSP70 с субъединицей именно в процессе ее синтеза является ответственным за существенную задержку сворачивания. Как мы предполагаем, это непродуктивное взаимодействие приводит конформационным изменениям *, переводящим ее в i форму.
медленно i * HSPбиосинтез * быстро Рис. 14 Сравнительная схема биосинтетического сворачивания субъединицы люциферазы в эукариотической системе трансляции в присутствии HSP70 и в прокариотической системе. Взаимодействие синтезируемых полипептидов субъединицы с HSP70 приводит к тому, что из рибосомы полипептид освобождается в форме i, которая для ассоциации с субъединицей должна медленно изомеризоваться в компетентную к ассоциации * форму, что определяет медленную скорость реакции. В прокариотической системе трансляции такое непродуктивное взаимодействие отсутствует, что определяет быструю скорость образования гетеродимера люциферазы.
Трансляция в системе из E. coli с фракцией растворимых белков экстракта ретикулоцитов кролика характеризуется длительным лагом в формировании люциферазы. Можно сделать вывод, что эукариотические шапероны (HSP70) способны и в бактериальной системе взаимодействовать с синтезируемой субъединицей, способствуя образованию i формы из *.
Таким образом, в эукариотической системе экспрессии непродуктивное взаимодействие синтезируемого полипептида с одним из шаперонов приводит к его сворачиванию по медленному пути, в то время как сворачивание в бактериальном окружении осуществляется по быстрому пути. Быстрый путь сворачивания и в прокариотической системе трансляции и в эукариотической (при блокировании шаперонов избытком денатурированного белка) характеризуются сходными кинетическими параметрами. Таким образом, быстрый путь сворачивания исследуемого полипептида фундаментально зависит от его котрансляционного этапа сворачивания и не может быть воспроизведен вне синтеза на рибосоме.
Глава 11. Адаптация процесса биосинтетического сворачивания белков в заданном окружении в клетках. Гипотеза.
Мы предполагаем, что процесс сворачивания белков адаптирован к их естественному клеточному окружению, т.е. наличию других белков, факторов, и т.д. Это касается и соответствующих шаперонов и ферментов, участвующих в процессе сворачивания. Процесс адаптации носит взаимный характер.
Экспрессия гетерологичного белка в ином клеточном окружении может приводить к изменению эволюционно селектированного пути сворачивания.
Это может приводить к изменениям в существующем пути сворачивания (например, кинетики процесса), возникновению других путей сворачивания, что может проявляться в изменении скорости и процента выхода свернутого белка, изменении соотношения между альтернативными состояниями (например, появление агрегатов вновь синтезированного белка). Очевидными примерами является образование телец включения (т.е. агрегированной формы белка) при экспрессии белков как в бактериальных, так и эукариотических клетках.
Необходимо отдельно сказать в этом контексте о шаперонах. Конечно, большинство шаперонов узнают различные белков, часто структурно весьма различные. Тем не менее, такая УнеизбирательностьФ является продуктом эволюционной селекции в контексте всего разнообразия белков в данной клетке (или, более точно, в данном компартменте клетки).
III. Структурно-функциональный анализ белков.
Достаточно часто традиционно применяемые подходы к структурнофункциональному анализу белков оказываются малопродуктивными или неприменимыми. Это может происходить в случае белков, которые трудно или невозможно получить экспрессией в клетках, например, в силу их токсичности или из-за протеолитической деградации. Многие белки при экспрессии in vivo агрегируют, образуя тельца включения. Альтернативой является синтез белков в бесклеточных системах трансляции с их последующим анализом.
Возможность получения радиоактивно меченных синтезированных полипептидов in vitro позволяет проводить анализ их чрезвычайно малых количеств. Набор подходов, созданных или адаптированных для радиоактивно меченных полипептидов в рамках представляемой работы, являются приложимыми к широкому кругу задач.
Глава 12. Локализация антигенных детерминант с использованием растущих полипептидов на рибосомах.
Подходы, используемые для локализации эпитопов антител на белках включают в себя гидролиз белков с идентификацией полученных пептидов, получение библиотек фрагментов кДНК, использование дисплея фрагментов белка на фагах. Каждый из указанных подходов имеет свои ограничения. При экспресии полипептидов в системе сопряженной транскрипции-трансляции синтез приводит к появлению дискретного набора N-концевых растущих пептидов увеличивающихся размеров. Простые и быстрые эксперименты позволяют определить размер наименьшего пептида, узнаваемого определенным антителом в ходе иммунопреципитации аликвоты системы экспрессии и, таким образом, определить C-концевую границу эпитопа.
Были определены C-концевые границы эпитопов для восьми антител, распределенные вдоль всей полипептидной цепи субъединицы триптофан синтазы. Чтобы оценить надежность полученных результатов, эти же эпитопы были локализованы скринингом библиотеки фрагментов кДНК соответствующего гена. Кроме этого, для трех антител результаты были сравнены с результатами локализации эпитопов, полученными при химическом и протеолитическом гидролизе данного белка. Все полученные результаты хорошо согласуются между собой.
Глава 13. Измерение истинной константы связывания полипептидов с моноклональными антителами и лигандами.
Моноклональные антитела являются одним из наиболее используемых реагентов для изучения и характеристики полипептидов. Определение афинности взаимодействия антитела с соответствующим антигеном является необходимым во многих случаях. Для этого существует целый ряд методов, которые все имеют недостатки и ограничения. Как правило, требуются высокоочищенные антитело и антиген в достаточно больших количествах, часто чувствительность является недостаточной, измерения на твердой фазе могут приводить к искажению измеряемых параметров и определению Укажущегося сродстваФ. Мы разработали новый высокочувствительный метод измерения сродства моноклональных антител (и лигандов) к антигенам.
Подход может использоваться для измерения подлинной равновесной константы связывания пары антиген-антитело в случаях, когда антиген доступен в чрезвычайно малых количествах в неочищенном виде и является радиоактивно меченым. Метод включает в себя инкубацию постоянной аликвоты антигена с различными известными концентрациями моноклонального антитела в большом избытке по отношению к антигену.
После инкубации, когда достигнуто равновесие между свободным антигеном и его комплексом с антителом, концентрация свободного антигена определяется иммуноадсорбцией с тем же самым антителом, иммобилизованном на носитель (смолу). Действительно, только свободный антиген будет специфически связываться с иммобилизованным антителом. Затем определяется пропорция иммуноадсорбированного антигена по его радиоактивности, которая является пропорциональной концентрации свободного антигена в равновесии. Полученные результаты, с учетом известных концентраций антитела, позволяют определить равновесную константу связывания.
Рис 15. Измерение сродства моноклонального антитела mAb19 к 11.5 кДа N-концевому фрагменту бета субъединицы триптофан синтазы, связанному с рибосомой. Аликвоты системы трансляции с мРНК со стоп кодоном инкубировали с mAb19 в различных концентрациях. Свободный, т.е. не связавшийся с антителом 11.5 кДа фрагмент, адсорбировали на смоле со связанным mAb19, подвергали электрофорезу, его количество определяли по радиоактивности на бета имеджере. (А)- включение радиоактивности в гели, в слоты а-h добавляли соответственно 0, 6x10-10, 2x10-9, 6x10-9, 2x10-8, 6x10-8, 2x10-7, 10-6 M антитела, слот j - контроль неспецифической адсорбции. (Б)- подсчет радиоактивности в 11.5 кДа фрагменте по слотам из соответствующего геля, (В)- график определения афинности антитела к 11.5 кДа фрагменту, 1/Y- обратное значение фракции фрагмента, связанного с mAb19, при использовавшихся концентрациях антитела, против обратного значения концентраций антитела, 1/[AB].
Сплошная линия показывают наилучшее приближение экспериментальных данных методом линейной регрессии и дает значение равновесной константы диссоциации 1.62 nM.
Метод был апробирован с использованием 11.5 кДа N-концевого фрагмента субъединицы триптофан синтазы, в комплексе с рибосомой и свободном виде, и моноклонального антитела mAb19. В качестве контроля, фрагмент, состоящий из первых 102 аминокислот белка, был экспрессирован в E. coli, очищен и его сродство к антителу измерено общепринятым иммуноферментным анализом, которое составляло 6x108 M-1 +/-1x108 M-1.
Сродство фрагмента к антителу mAb19 было определено предложенным нами подходом (на Рис. 15 представлен результат для свободного фрагмента в растворе). Константа связывания составляла те же 6x108 M-1 +/-2x108 M-1.
Таким образом, данные, полученные двумя независимыми методами, отлично согласуются друг с другом. Этот же фрагмент, полученный в форме комплекса растущего пептида с рибосомой, также дал близкое значение равновесной константы связывания предлагаемым нами методом, 7x108 M-1 +/-1x108 M-1.
Предложенный подход может быть использован для определения равновесной константы взаимодействия между любой макромолекулой и радиоактивно меченым специфическим лигандом, в том числе для белок-белковых взаимодействий и взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами.
Глава 14. Изучение структуры альбебетина, белка с заданной пространственной структурой.
Наиболее сильным тестом нашего понимания принципов структурной организации белков и их сворачивания является дизайн и синтез de novo (т.е.
искуственных) полипептидов с определенными пространственными структурами. Целью описываемого проекта был дизайн полипептида, пространственная укладка которого не нарушала бы известные структурные правила, но не встречалась бы в природных белках. Пространственная структура создаваемого белка основывалась на разработанной О. Б. Птицыным и А. В. Финкельштейном теории пространственной и вторичной структуры белков (Finkelstein & Ptitsyn, 1987). Структура должна была представлять собой слой из четырех антипараллельных структур, прикрытый с одной из сторон двумя спиралями (Рис. 16). Любопытно, что впоследствие похожая структура была обнаружена в природных белках (Lindahl et al., 1994).
Рис. 16 Предполагаемая структура альбебетина. Стрелками указаны тандемы аргининов.
.
Предложенная структура представляет собой Уоткрытый сэндвичФ и состоит из дважды повторенной структурной единицы , в связи с чем данный белок был назван альбебетином. Полипептидная цепь из 73 аминокислотных остатков построена из двух практически идентичных половин. Начальному анализу была подвергнута и половина альбебетина, т.е предполагаемая структурная единица . Гены альбебетина и его половины были химически синтезированы. Радиоактивно меченый полипептид синтезировали в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Компактность альбебетина и его половины характеризовали хроматографически- гель фильтрацией.
А Б Рис. 17 Изучение структуры альбебетина электрофорезом с горизонтальным градиентом мочевины (А) и трипсинолизом в нативных условиях (Б). Слева в (Б) указано положение образующихся протеолитических фрагментов.
Подвижность альбебетина и его половины при хроматографии в нативных условиях соответствовала плотно упакованным природным белкам соответствующих молекулярных масс, а гидродинамические радиусы Стокса составляли для альбебетина и его половины 17 и 11. Хроматография в присутствие 9М мочевины показала увеличение радиусов Стокса до 24 и 16.5, т.е. разворачивание полипетидов.
Стабильность структуры белка и ее кооперативность при денатурации (или ренатурации при восстановлении структуры) может быть исследована электрофорезом с горизонтальным градиентом мочевины, перпендикулярным к направлению электрофореза (Creighton, 1979). Смысл метода состоит в том, что электрофоретическая подвижность белка в нативных условиях является существенно большей (т.к. белок компактен), чем в денатуранте, где белок разворачивается и его подвижность резко падает. Электрофоретическая подвижность альбебетина показывает переход между быстро мигрирующей свернутой формой и более медленно мигрирующей развернутой формой, с началом разворачивания полипептида при 3 М мочевины и точкой полуперехода около 5.5 М мочевины (Рис. 17А). Это подтверждает, что у альбебетина в отсутствие мочевины существует компактная структура.
Наличие стабильной компактной структуры было исследовано также ограниченным трипсинолизом. В полипептидную цепь альбебетина были включены два аргининовых тандема, Арг 14-Арг15 и Арг49-Арг50.
Сравнительный протеолиз в нативных условиях и 4М мочевины показал, что полипептид существенно устойчивее к трипсинолизу в нативных условиях.
Была исследована кинетика трипсинолиза (Рис. 17Б) и показано, что тандем Арг 14-Арг15 существенно стабильнее к протеолизу, чем тандем Арг49-Арг50.
Так как последовательности непосредственно вокруг аргининовых тандемов идентичны, такая разница может быть вызвана только дальними взаимодействиями в компактной структуре. Таким образом, дизайн привел к созданию полипептида с достаточно стабильной и кооперативной структурой.
Глава 15. Структурно-функциональный анализ белка оболочки вируса гепатита С.
Гликопротеин оболочки Е2 вируса гепатита С (ВГС) играет важнейшую роль в морфогенезе вируса и считается кандидатом для разработки вакцины против ВГС. О его структуре и функциях известно очень мало. Одним из главных препятствий в изучении белка являются трудности получения гомогенных растворимых форм, пригодных для структурнофункционального анализа. Нами были разработаны методы получения с высоким выходом рекомбинантных форм Е2, пригодных для структурнофункционального анализа: иммобилизованной, растворимой (мета)стабильной и связанной с рибосомой. Е2 в этом случае находится в негликозилированной форме. Было показано, что полученные формы Е2 являются функциональными, в том числе взаимодействуют с рецептором для Е2 на поверхности клеток человека, CD81. Иммобилизованный Е2 взаимодействует с набором моноклональных антител, полученных к нативному гликозилированному белку, в том числе к конформационно-зависимому антителу, взаимодействие с которым принято считать характеристикой нативности белка. Используя ограниченный протеолиз иммобилизованного мономера Е2, была выявлена доменная организация белка (см. Рис. 18).
Кинетика появления протеолитических фрагментов позволила сделать предположение о междоменных взаимодействиях и структурных перестройках полипептидной цепи.
Рис. 18 Доменная организация Е2 по данным ограниченного протеолиза. Стрелками отмечены домены и галочками- экспонированные аминокислоты, принимающие участие в образовании комплекса с CD81. Номерами указаны аминокислоты, формирующие границы доменов.
Глава 16. Возможность создания субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе молекулярного шаперона HSP 70 M. tuberculosis.
Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно уносит жизни более 1 млн. человек.
Протективный уровень вакцины БЦЖ против легочного туберкулеза значительно варьирует, необходимо создание противотуберкулезной вакцины нового поколения. Белки теплового шока M. tuberculosis, включая HSP70, являются ключевым фактором, определяющим стимуляцию иммунитета.
Полиоксидоний- иммуномодулятор, используемый в медицинской практике, является сополимером N-окиси 1,4-этиленпиперазина и N -карбоксиэтил-1,4этиленпиперазиний бромида с молекулярной массой 100 Кд, относящийся к классу водорастворимых производных гетероцепных алифатических полиаминов. Было показано, что шаперон HSP70 M. tuberculosis индуцирует сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей. Конъюгация с полиоксидонием приводит к значительному увеличению антигенности HSP70.
Клеточный иммунитет является самым важным компонентом ответа иммунной системы на туберкулезную инфекцию. Была показана индуцированная рекомбинантным белком HSP70 и его конъюгатом пролиферация Тлимфоцитов, установлено соотношение CD4+ и CD8+лимфоцитов. В настоящее время изучается протективный эффект конъюгата на модели острого туберкулеза у мышей.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.
1. Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что субъединица триптофан синтазы E. coli начинает сворачиваться во время синтеза на рибосоме. Процесс сворачивания начинается до завершения синтеза N-концевого домена белка. Образующаяся структура рибосомо-связанного полипептида близка к структуре нативного белка.
Сделан вывод, что котрансляционное сворачивание полипептидов может начинаться по мере их синтеза, задолго до завершения синтеза соответствующего домена.
2. Изучен процесс биосинтетического сворачивания субъединицы бактериальной люциферазы. Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы.
Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках.
3. Изучен и охарактеризован путь биосинтетического сворачивания субъединицы бактериальной люциферазы. Показано, что синтезированный полипептид освобождается из рибосомы в энергетически нестабильной форме *, которая способна очень быстро ассоциировать с субъединицей. Этот интермедиат находится в равновесии с более стабильной, но инертной формой i. В отсутствие субъединицы, большая часть субъединицы переходит в форму i.
Показано, что процесс ренатурации денатурированной субъединицы проходит через указанный энергетически стабильный конформер i. Именно равновесие i определяет медленную скорость формирования нативного фермента при ренатурации.
Таким образом, впервые охарактеризован путь биосинтетического сворачивания полипептида, определена его скорость-лимитирующая стадия и показано различие между биосинтетическим путем сворачивания и его ренатурацией.
4. Сформулирована гипотеза, что котрансляционное сворачивание может приводить к появлению синтезированных полипептидов в форме интермедиатов с высокой энергией, которые близки по структуре и энергии к переходному состоянию и, значит, способны быстро формировать уникальные нативные структуры.
5. Изучено участие молекулярных шаперонов в процессе синтеза и котрансляционного сворачивания полипептидов.
Показано, что синтезируемые в бактериальной системе трансляции рибосомо-связанные полипептиды субъединицы триптофан синтазы E. coli могут ассоциировать с DnaK, членом семейства белков теплового шока HSP70, но не с GroEL, представителем семейства HSP60.
6. Изучено влияние системы GroEL на сворачивание олигомерного белка на примере бактериальной люциферазы. Показано, что при повышении температуры возрастает сродство системы GroEL к субъединице и она защищает полипептид от термоинактивации. Показано, что GroEL/ES ускоряет сворачивание субъединицы в активную люциферазу и минимизирует альтернативный непродуктивный путь сворачивания.
7. Высказана гипотеза, что молекулярные шапероны могут ускорять сворачивание полипептидов, понижая энергетический барьер реакции сворачивания. При этом понижение энергетического барьера обеспечивается сдвигом равновесия от стабильных интермедиатов, имеющих высокий барьер до переходного состояния, к кинетически нестабильным интермедиатам с высокой энергией, имеющих меньшую разницу энергии до переходного состояния.
8. Показано, что при синтезе в гетерологичной эукариотической системе трансляции субъединица бактериальной люциферазы сворачивается по медленному пути сворачивания, характерному для процесса ренатурации денатурованного полипептида. Показано, что за перевод с быстрого пути сворачивания на медленный отвечает непродуктивное взаимодействие синтезируемого полипептида с эукариотическими шаперонами, включая HSP70.
9. Высказана гипотеза об адаптации сворачивания белков в своем клеточном окружении.
10. Разработан набор подходов для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов в количестве нанограмм в бесклеточных системах экспрессии. Данные подходы могут применяться для быстрого анализа полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена (изза токсичности, нестабильности к протеолизу и т.д.) 11. Изучен альбебетин, искуственный белок с заданной пространственной структурой. Проведен структурный анализ альбебетина на основе разработанных подходов к анализу белков в бесклеточных системах экспрессии. Показано, что белок обладает стабильной структурой, совпадающей в основных элементах с заданной пространственной структурой 12. Начато изучение структурного белка оболочки Е2 вируса гепатита С.
Получены формы рекомбинантного белка Е2, пригодные для его структурнофункционального анализа и показано, что они являются функциональными.
Проведен структурно-функциональный анализ Е2, показано, что эктодомен белка состоит из четырех структурных доменов.
13. Изучена возможность создания рекомбинантной противотуберкулезной вакцины на основе молекулярного шаперона HSP 70 M. tuberculosis и иммуномодулятора полиоксидония. Показано, что конъюгация HSP 70 с полиоксидонием резко усиливает гуморальный и клеточный иммунный ответ.
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
1. Долгих Д. А., Федоров А. Н., Чемериз В. В., Чернов Б. К., Финкельштейн А. В., Шульга А. А., Алахов Ю. Б., Кирпичников М. П. и Птицын О. Б. Синтез и изучение альбебетина- белка с заданной пространственной структурой.
Доклады Академии Наук СССР (1991), 320(5):1266-9.
2. Fedorov AN, Dolgikh DA, Chemeris VV, Chernov BK, Finkelstein AV, Schulga AA, Alakhov YuB, Kirpichnikov MP, Ptitsyn OB. De novo design, synthesis and study of albebetin, a polypeptide with a predetermined threedimensional structure. Probing the structure at the nanogram level. J Mol Biol.
(1992), 225(4):927-31.
3. Долгих Д. А., Кирпичников М. П., Птицын О. Б., Федоров А. Н., Финкельштейн А. В. и Чемериз В. В. De novo белки с заданной пространственной структурой: новые подходы к дизайну и анализу.
Молекулярная биология (1992), 26(6):1242-50.
4. Fedorov AN, Friguet B, Djavadi-Ohaniance L, Alakhov YB, Goldberg ME.
Folding on the ribosome of Escherichia coli tryptophan synthase beta subunit nascent chains probed with a conformation-dependent monoclonal antibody. J Mol Biol. (1992), 228(2):351-8.
5. Friguet B, Fedorov AN, Djavadi-Ohaniance L. In vitro gene expression for the localization of antigenic determinants: application to the E. coli tryptophan synthase beta 2 subunit.
J Immunol Methods. (1993), 158(2):243-9.
6. Friguet B, Fedorov AN, Serganov AA, Navon A, Goldberg ME. A radioimmunoassay-based method for measuring the true affinity of a monoclonal antibody with trace amounts of radioactive antigen. Analyt. Biochem. (1993), 210:
344-50.
7. Chemeris VV, Dolgikh DA, Fedorov AN, Finkelstein AV, Kirpichnikov MP, Uversky VN, Ptitsyn OB.A new approach to artificial and modified proteins: theorybased design, synthesis in a cell-free system and fast testing of structural properties by radiolabels. Protein Engineering (1994), 7(8):1041-52.
8. Fedorov AN, Baldwin TO. Contribution of cotranslational folding to the rate of formation of native protein structure. Proc Natl Acad Sci U S A. (1995), 92(4):1227-31.
9. Tokatlidis K, Friguet B, Deville-Bonne D, Baleux F, Fedorov AN, Navon A, Djavadi-Ohaniance L, Goldberg ME. Nascent chains: folding and chaperone interaction during elongation on ribosomes. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.
(1995), 348(1323):89-95.
10. Dolgikh DA, Uversky VN, Gabrielian AE, Chemeris VV, Fedorov AN, Navolotskaya EV, Zav'yalov VP, Kirpichnikov MP. The de novo protein with grafted biological function: transferring of interferon blast-transforming activity to albebetin. Protein Engineering (1996), 9(2):195-201.
11. Fedorov AN, Baldwin TO. GroE modulates kinetic partitioning of folding intermediates between alternative states to maximize the yield of biologically active protein. J Mol Biol. (1997), 268(4):712-23.
12. Fedorov AN, Baldwin TO. Cotranslational protein folding. J Biol Chem.
(1997), 272(52):32715-8.
13. Fedorov AN, Baldwin TO. Protein folding and assembly in a cell-free expression system.
Methods Enzymol. (1998), 290:1-17.
14. Fedorov AN, Baldwin TO. Process of biosynthetic protein folding determines the rapid formation of native structure. J Mol Biol. (1999), 294(2):579-86.
15. Yurkova MS, Patel AH, Fedorov AN. Characterisation of bacterially expressed structural protein E2 of hepatitis C virus. Prot. Exp. Purif. (2004), 37:119125.
16. Федоров А.Н., Юркова М. С., Гудима Е. А, Тоневицкий А. Г.
Создание и характеристика рибосомных комплексов, несущих вновь синтезированный белок Е2 вируса гепатита С. Аллергия, астма и клиническая иммунология (2003), 7: 41-44.
17. Юркова М. С., Лауринавичюте Д.К., Федоров А.Н. Экспрессия, выделение и характеристика функционального негликозолированного структурного белка Е2 вируса гепатита С. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии (2006), 4: 32-37.
18. Калюкина А.С., Лауринавичюте Д.К., Юркова М.С., Федоров А.Н., Северин Е.С. Изучение основных физико-химических параметров и влияния на пролиферативную активность Т-лимфоцитов рекомбинантного белка HSP 70 M.tuberculosis. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии (2006), 4: 37-41.
19. Федоров А.Н., Юркова М. С. и Лауринавичюте Д.К. Начальный структурный и функциональный анализ иммобилизованного recE2, белка оболочки вируса гепатита С. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, (2007), 3: 20-26.
20. Шарапова О. А., Федоров А.Н., Северин Е.С., Медведев С.А., Некрасов А.В. Рекомбинантный белок HSP 70 M. tuberculosis как основа для субъединичной противотуберкулезной вакцины: получение, изучение свойств.
Иммунология, (2009), 2: 108-111.
Федоров Алексей Николаевич Биосинтетическое сворачивание белков.
Исследован процесс котрансляционного сворачивания полипептидов.
Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что процесс сворачивания полипептида может начинаться до завершения синтеза соответствующего домена белка. Впервые изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитирующий интермедиат при сворачивании и кинетика процесса. Показано, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активного белка. Показана вовлеченность шаперонов в процесс котрансляционного сворачивания полипептидов; продемонстировано, что эти взаимодействия могут быть ключевыми для определения пути сворачивания полипептида. Показано, на примере GroEL, что шапероны могут максимально повышать путь сворачивания, ведущий к биологически активной структуре белка. Предложен новый подход к структурно-функциональному и иммунологическому анализу белков в нанограммовых количествах - анализ белков, синтезированных в бесклеточных системах экспрессии. Изучен искусcтвенный полипептид альбебетин, белок с заранее заданной пространственной структурой. Проведен начальный структурнофункциональный анализ структурного белка Е2 вируса гепатита С. Изучен конъюгат шаперона HSP70 M. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием как основа противотуберкулезной вакцины.
Fedorov Alexey Nikolaevich Biosynthetic protein folding The process of cotranslational protein folding is investigated. The process of polypeptide folding may start before the completion of synthesis of the corresponding domain of the protein as demonstrated with a conformationdependent antibody. For the first time, the pathway of biosynthetic protein folding is investigated; the main rate-limiting protein intermediate and kinetics of the process are characterized. It is shown that cotranslational folding contributes to the kinetics of the appearance of the active protein. Involvement of molecular chaperones in the process of cotranslational protein folding is demonstrated; these interactions may be critical for determining pathway of protein folding. It is shown with GroEL that chaperones may maximize productive protein folding leading to the biologically active structure. A new approach to structure-function and immunological analysis of proteins at the nanogram level, based on the analysis of proteins synthesized in cell-free systems, is proposed. Albebetin, de novo polypeptide with a predetermined three-dimensional structure, is investigated. Initial structure-functional analysis of E2, structural protein of hepatitis C virus, is performed. Conjugate of chaperone HSP70 from M. tuberculosis and immuno-modulator polyoxidonium is investigated as a basis of anti-tuberculosis vaccine.