Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
КРАЕВА
юдмила Александровна
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ДИФТЕРИИ
03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург 2011
Работа выполнена в ФГУН Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора
Научный консультант:
Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,
профессор Галина Яковлевна Ценева
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор Алексей Геннадьевич Бойцов
доктор медицинских наук профессор Алефтина Михайловна Савичева
доктор медицинских наук профессор Евгений Петрович Сиволодский
Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию РФ
Защита диссертации состоится 7 июня 2011 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 при ФГВОУ ВПО Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова МО РФ.
Автореферат разослан ____________ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук профессор
Юрий Алексеевич Митин
ОБЩАЯ ХАРАКТРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Эпидемии дифтерии с глубокой древности поражали человечество, перемещаясь по странам и континентам. До получения в 1892 г. Е.Берингом антитоксической сыворотки летальность при дифтерии достигала 50%. Однако защитить от заболевания и стать средством специфической профилактики мог лишь полученный впервые Рамоном анатоксин, нашедший свое применение с 1923 г. Начавшаяся в 40-х годах XX века широкомасштабная иммунизация позволила приостановить развитие эпидемий в странах, вступивших во Вторую мировую войну, и вместе с использованием в лечебных целях антитоксина снизить летальность до 15% (Kwantes W., 1984). Возможность глобальной защиты от дифтерийной инфекции продемонстрирована на примере значительного снижения (почти в 10 раз) заболеваемости после того, как в 1980-х годах дифтерийный анатоксин стал доступен во многих странах. При индексе контагиозности 15-20% самым главным условием предотвращения заболевания становится специфическая профилактика (Galazka AM, 1995; Эмироглу Н., 2001).
Однако, несмотря на проводимую вакцинацию, эпидемии дифтерии периодически повторяются. Масштабная эпидемия дифтерии, поразившая в основном страны СНГ в 1990-х годах, помогла вскрыть недостатки специфической профилактики дифтерии и показала большую роль социальных факторов в создании условий, препятствующих распространению заболеваний среди широких слоев населения (Ценева Г.Я., 1995; Efstratiou A., 1996). Поэтому нельзя ожидать решения проблемы заболеваемости дифтерией лишь принятием мер по возможно полному охвату населения профилактическими прививками.
Без глубокого понимания механизма защиты, создаваемого вакцинными препаратами, трудно понять причину заболеваний среди привитых. Поэтому необходимы более глубокие исследования по характеристике специфических антител, вырабатываемых в ответ на вакцинацию против дифтерии. Разработка ВОЗ и повсеместное внедрение в практику оценочной шкалы защищенности от дифтерии на основании определения количества антитоксических антител позволили контролировать качество вакцинации (Efstratiou A., 1994). Однако информация о количестве вырабатываемых противодифтерийных антител не всегда дает достоверный ответ на вопрос о степени защищенности от дифтерии. Это было продемонстрировано во время последней эпидемии дифтерии в России и после нее, когда у заболевших (до 40% случаев) находили в крови антитоксические антитела защитных уровней (Васильев К.Г., 2002; Матохина А.Г., 2003; Харченко Г.А., 2003).
В современных условиях развитие биотехнологии позволяет разрабатывать эффективные методы диагностики, в том числе при дифтерийной инфекции, с высокой чувствительностью и специфичностью, и следовательно, получать более достоверные данные об иммунном ответе после вакцинации. Так, использование иммуноферментного анализа при оценке защищенности от многих вакциноуправляемых инфекций позволило перейти на новый уровень диагностики с не меньшей достоверностью получаемых результатов, чем при использовании золотых стандартов с использованием животных или культур клеток (Camargo et аl, 1987). Поэтому в основе достоверности результата лежит достоверность самого метода диагностики.
Немаловажное значение в защите от дифтерии имеет также социальный фактор. Согласно данным ВОЗ на здоровье человека в 70% случаев влияют прежде всего условия и образ жизни человека, внешняя среда и природные условия (Эмироглу Н., 2001; Харсеева Г.Г., 2009; Volzke H., 2006). Эти факторы лежат в основе формирования и развития неспецифической иммунной защиты. Рядом исследователей установлена тесная связь между регуляторными процессами врожденного и приобретенного иммунитета. Поэтому ответ на введение одних и тех же вакцинных препаратов не может быть одинаковым у всего населения.
Как известно, на ряд показателей здоровья человека влияют стрессы, болезни, вредные привычки и зависимости (Харсеева Г.Г., 2009; WHO/IVB, 2005, 2006; Neal S.E, 2009). В отношении связи специфической иммунной защиты от дифтерии и перечисленных состояний нет информации, хотя во время последней эпидемии дифтерии в России были отмечены высокая заболеваемость и смертность среди лиц, страдающих алкоголизмом.
В развитии любого инфекционного заболевания, в том числе дифтерии, кроме состояния макроорганизма значительную роль играет вирулентность штамма, участвующего в инфекционном процессе. Как известно, главным фактором патогенности C.diphtheriae является его токсигенность. Именно дифтерийный токсин выполняет основную роль в патогенезе заболевания, распространенности инфекционного процесса, развитии осложнений и частоты летальности при дифтерии (Hadfield T.L., 2000; Wellinghausen, N., 2002; Williams H.U., 2008).
В настоящее время в России наиболее распространенным методом выявления токсигенных штаммов является Elek-тест, регламентированный нормативными документами. Однако он не лишен недостатков: длителен в постановке и недостаточно чувствителен. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) обладает более высокой чувствительностью и меньшим временем постановки (Ценева Г.Я., 2000; Pallen M.J., 1994; Aravena-Roman M., 1995; Mikhailovich V.M., 1995). Однако результат ПЦР свидетельствует о наличии у микроорганизма гена токсигенности, который, как известно, может быть репрессированным и не проявлять себя в фенотипических тестах, таких, как Elek-тест. Известно, что при определенных условиях действие гена-супрессора прекращается и штамм возобновляет способность продуцировать токсин (Ценева Г.Я., 1998; Cianciotto N. P., 1997).
В этой связи поиск и разработка эффективных средств индикации и идентификации токсинпродуцирующих штаммов особенно важны, поскольку в постэпидемическом периоде чаще циркулируют штаммы C.diphtheriae, несущие молчащий ген токсигенности (Щедеркина Е.Е., 2001).
Исследованиями ряда ученых установлено влияние факторов окружающей среды, в том числе физических, на здоровье населения, неспецифический и специфический иммунитет. Известны данные о влиянии некоторых физических факторов на биологические свойства микроорганизмов, однако эти факты малочисленны, особенно в отношении C.diphtheriae (Грабина В.А., 1976; Гофман Е.Л., 1988; Манина Ж.Н., 1997). Из физических факторов наибольший интерес представляют те, с которыми население контактирует постоянно в течение длительного времени. Развитие средств коммуникации, резкое увеличение количества используемых в быту приборов - приводит к постоянному нахождению людей в электромагнитных полях, хотя и низкой интенсивности. Можно полагать, что в этих условиях микроорганизмы способны менять свои биологические свойства (Рыспаева Д.Э., 1998; Бездольная И.С., 2000, 2001; Думанский Ю.Д., 2001; Боярский М.Р., 2001; Меньшикова Л.Н., 2001; Shckorbatov Y.G., 1998). Однако данные о влиянии электромагнитных полей на те или иные свойства C.diphtheriae до настоящего времени отсутствовали.
Из всех биологических свойств C.diphtheriae наибольший интерес представляют токсинопродукция и адгезия к эпителиальным клеткам слизистых оболочек, являющиеся факторами патогенности штаммов, а также их резистентность к антибиотикам. Особенно важны исследования о возможном влиянии электромагнитных факторов на изменение чувствительности C.diphtheriae к тем антибиотикам, к которым, определялась видовая чувствительность.
Показано, что у больных с острыми заболеваниями верхних дыхательных путей в 10-15% случаев находят недифтерийные коринебактерии (Funke G., 1997; Izurieta H.S., 1997). В настоящее время род коринебактерий включает 67 видов и две таксонные группы, 40 из них представляют клиническое значение. Кроме того, существует ряд коринеформных бактерий, морфологически похожих на коринебактерии, способных вызывать инфекционные заболевания, в том числе верхних дыхательных путей. Расширение спектра новых видов коринебактерий, возможных патогенов, создает значительные трудности в биохимической дифференциации таких культур (Funke G., 1997).
В связи с изложенным представляется актуальным изучение особенностей биологических свойств циркулирующих штаммов C.diphtheriae в постэпидемический период и на этой основе разработка эффективных методов и средств для лабораторного обеспечения надзора за дифтерией.
Цель исследования
Изучить изменчивость биологических свойств C. diphthеriae и динамику показателей гуморального антитоксического иммунитета у привитых для совершенствования лабораторной диагностики и мониторинга дифтерии.
Задачи работы:
- Определить роль высокоавидных антитоксических антител в защите от дифтерии. Разработать методику определения индекса авидности антитоксических противодифтерийных антител и критерии невосприимчивости к дифтерии у привитых. Разработать способ дифференциальной диагностики между легкими формами дифтерийной инфекции и бактерионосительством C.diphtheriae.
- Разработать методику определения вероятности заболевания дифтерией на основе показателей количественного содержания антитоксических антител и индекса их авидности для оценки индивидуального и коллективного противодифтерийного иммунитета. Определить динамику накопления и регрессии антитоксических, в том числе высокоавидных, противодифтерийных антител у привитых.
- Изучить биологические свойства и факторы патогенности C. diphtheriae, выделенных в постэпидемический период (2000-2009 гг.) на территории Санкт-Петербурга, Ленинградской и Вологодской областей.
- Изучить влияние электромагнитных полей на вирулентность и чувствительность к антибиотикам штаммов C. diphtheriae.
- Разработать экспресс-способ выявления токсигенных C. diphtheriae с использованием высокоавидных антител in vitro.
Научная новизна и теоретическая значимость работы:
Впервые на основе десятилетнего мониторинга индивидуального и коллективного противодифтерийного антитоксического иммунитета в крупных регионах СЗФО РФ научно обоснована определяющая роль высокоавидных антитоксических антител в защите от дифтерии у привитых.
Разработаны новые методические подходы, критерии и способы оценки защищенности от дифтерии. Впервые на основе комплекса данных об уровнях антитоксических, в т.ч., высокоавидных, антител и прививочного статуса разработан способ прогнозирования заболеваемости контактных в очагах инфекции.
Разработан алгоритм контроля индивидульного и коллективного иммунитета для определения сроков ревакцинации с учетом динамики антитоксических, в т.ч., высокоавидных, антител.
Показано влияние некоторых факторов электромагнитного излучения на биологические свойства возбудителя дифтерии. Установлено стимулирующее влияние НИЛИ на продукцию дифтерийного токсина in vitro штаммами C. diphtheriae, в т.ч., несущими молчащий tox-ген.
Доказана эффективность использования высокоавидных антител для выявления продукции дифтерийного токсина у штаммов C. diphtheriae с низким уровнем токсинообразования in vitro. Предложен новый алгоритм определения токсигенности C. diphtheriae, в т.ч., несущих молчащий tox-ген.
Практическая значимость исследования:
Предложен комплекс современных методов и приемов для обеспечения микробиологического мониторинга возбудителя дифтерии и оценки поствакцинального иммунитета.
Обоснована целесообразность обследования с профилактической целью контингентов, особенно лиц из закрытых учреждений, на носительство C. diphtheriae в постэпидемический период.
Разработан экспресс-способ выявления токсигенных штаммов C.diphtheriae, отличающийся высокой чувствительностью, быстротой учета реакции, объективностью считывания информации, портативностью и экономичностью.
Разработан высокочувствительный экспресс-способ обнаружения потенциальной токсинопродукции у штаммов C.diphtheriae, несущих молчащий ген токсигенности и слабо продуцирующих токсин, позволяющий повысить эффективность лабораторной диагностики дифтерии.
Предложены методические материалы (схемы, прописи сред, таблицы биохимического типирования, текстовый материал) для дифференцирования C. diphtheriae и недифтерийных коринебактерий.
Полученные данные изложены:
а) в методических рекомендациях для врачей Фенотипическая идентификация бактерий рода Corynebacterium, утв. МЗ РФ 2010 г.;
б) в Руководстве по клинической лабораторной диагностике, раздел Коринебактерии, Из-во Москва, 2011 г.
Изученные штаммы C.diphtheriae и их характеристики представлены в коллекции лаборатории бактериальных капельных инфекций НИИЭМ имени Пастера, Санкт-Петербург (2003-2010 гг.).
Разработан простой и экономичный тест для измерения авидности противодифтерийных антитоксических антител на основе ИФА, позволяющий определять истинные протективные антитела. Данные по проведению и использованию ИФА в практических лабораториях изложены в Учебном пособии Дифтерия (современные методы лабораторной диагностики), Санкт-Петербург, 2009 г.
Предложен алгоритм лабораторного контроля иммунитета, включающий определение количественного показателя степени невостприимчивости обследуемых к дифтерии, сроков сохранения высокоавидных антител, серологического мониторинга и проведения очередных ревакцинирующих прививок.
Предложены новые критерии защищенности населения от дифтерии, позволяющие оперативно проводить коррекцию ревакцинации в слабо защищенных группах населения.
На основании данных индекса авидности предложена схема проведения дифференциальной диагностики заболеваний дифтерией и бактерионосительства C.diphtheriae.
Для оперативного микробиологического и серологического мониторинга дифтерии созданы базы данных, включающие данные по заболеваемости дифтерией, показатели иммунитета, сведения о выделенных штаммах C. diphtheriae, предложена методология создания геоинформационной системы по слежению за дифтерийной инфекцией. Компьютерное картирование эпидемиологических и микробиологических данных на территории наблюдения и банк специфических данных делают получение информации экстренной.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- Невосприимчивость привитых к дифтерии связана с формированием высокоавидных антитоксических антител.
- Комплексная оценка противодифтерийного поствакцинального иммунитета основана на определении количественного содержания и индекса авидности антитоксических антител.
- Штаммы C.diphtheriae, выделенные в постэпидемический период, характеризует изменчивость основных биологических свойств (патогенности, чувствительности к антибиотикам).
- Низкоинтенсивное лазерное излучение и вращающиеся магнитные поля влияют на адгезивность, токсигенность и чувствительность к антибиотикам штаммов C. diphtheriae in vitro.
- Новые биомикротехнологии повышают эффективность выявления токсинообразования штаммами C. diphtheriae in vitro .
Внедрение результатов работы:
На основе результатов работы подготовлены следующие документы:
Учебные пособия для врачей Дифтерия (современные методы лабораторной диагностики) Г.Н. Беспалова, Л.А. Краева, Г.Я. Ценева, О.Е. Пученко. СПб, 2009.-42 с. (используется в учебном процессе на кафедре микробиологии и микологии ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава и на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова).
Методические рекомендации для врачей-бактериологов Фенотипическая идентификация бактерий рода Corynebacterium Г.Я. Ценева, Л.А. Краева, Ж.Н. Манина и др. СПб-Харьков, 2010. - 76 с.
Патент на изобретение Способ контроля биологической пробы в реакции латекс-агглютинации и аналитическая система для его осуществления.- № 2298798 от 10.05.2007.- Авторы: Зимина Т.М., Лучинин В.В., Мигунова В.Е., Краева Л.А., Ценева Г.Я., Меньшикова А.Ю., Шабсельс Б.М., Дулатова М.В., Шпилюк Г.Ф.
Патент на изобретение Способ определения токсигенности бактерий Corynebacterium diphtheriae № 2370539 от 20.10.2009.- Авторы: Краева Л.А., Ценева Г.Я., Коробов А.М., Грабина В.А.
Материалы диссертации представлены в Руководстве по клинической лабораторной диагностике (Раздел: Коринебактерии) М. 2011.
Апробация работы:
По теме диссертации опубликованы: 40 научных работ, в том числе 12 - в изданиях, рецензируемых ВАК, а также в материалах симпозиумов, научно - практических конференций всероссийского и международного уровней.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2003-2010 гг.: 17-19 ноября 2003 г. Семинар ВОЗ Лабораторная диагностика дифтерии, СПб, НИИЭМ им. Пастера; 8-9 октября 2004 г. Гомель, Беларусь, ОЦГСЭН. Международная конференция Применение антибактериальных препаратов при лечении инфекционных заболеваний; 23-26 мая 2005 г. IX Всероссийский научный форум Дни иммунологии в Санкт-Петербурге; 5-8 октября 2005 г. Ялта, Украина. XXIV Международная научно-практическая конференция Применение лазеров в медицине и биологии; 7 февраля 2006 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 5-8 октября 2006 г. Луцк. Украина. XXV Международная научно-практическая конференция Применение лазеров в медицине и биологии; 15-17 November 2006. Vouliagmeni, Greece. Ninth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELGWD; 26 мая 2007 г. ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава. Всероссийская научная конференция Современные проблемы медицинской микробиологии (Хлопинские чтения); 5-7 декабря 2007 г. Алматы (Казахстан). Республиканский семинар Диагностика воздушно-капельной группы инфекций; 26 февраля 2008 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 24 апреля 2008 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, семинар для врачей-бактериологов СПб и Лен. Области; 2-4 июня 2008 г. Четвертая международная конференция, посвященная 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера; 1-4 июля 2008 г. Второй Санкт-Петербургский международный экологический форум Окружающая среда и здоровье человека; 03-07 November 2008. Larnaca.Cyprus. Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELGWD; 7-9 October 2009. Ryga. Eleventh International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD; 16-17 декабря 2009 г. Вологда. Пленум, посвященный 65-летию Российской академии медицинских наук и 130-летию со дня рождения академика АМН СССР А.Н. Сысина; 18-20 mai 2010 г. Saint-Petersburg. Recherches scietifiques et surveillance epidemiologique des maladies infectieuses. Conference internationale Saint-Petersburg; 08 июня 2010 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 15 сентября 2010 г. Вологда. Научно-практическая конференции ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области; 6-8 октября 2010 г. Судак. Украина. XXXIV Международная научно-практическая конференция Применение лазеров в медицине и биологии.
ичный вклад автора
Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов C. diphtheriae, сбор сывороток от больных и здоровых лиц проведен в Центрах эпидемиологии и гигиены в Вологодской, Ленинградской областях, г. Санкт- Петербурге, а также лично автором.
Приборы лазерного излучения были предоставлены НИИ Лазерной биологии и лазерной медицины, Харьков, Украина.
Микробиологические, серологические, иммунохимические, экспериментальные исследования, компьютерный и статистический анализ данных были проведены автором в лаборатории бактериальных капельных инфекций ФГУН Санкт - Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Структура и объем диссертации:
Основной текст диссертации изложен на 235 страницах машинописного текста и состоящий из введения, аналитического обзора литературы, характеристически материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений.
Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 43 рисунками. Список литературы содержит 114 источников отечественных авторов и 269 источников зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований
В соответствии с целью и задачами исследования был использован следующий материал и применены методы, представленные в таблице 1.
Таблица 1.
Объем проведенных исследований различными методами
Методы | Объем |
| 650 штаммов 132 шт. 304 шт. 116 шт. 60 шт. 80 шт. Всего 1342 штамма |
| 350 образцов сыворотки крови (ОСК) 3 012 ОСК 216 ОСК 189 ОСК. 130 ОСК 185 ОСК 450 ОСК 50 ОСК Всего 4а582 ОСК |
| 30 штаммов ( в 3-х повторностях) |
| 304 штамма |
5.1. РН в культуре клеток Vero, 5.2. Изучение адгезивности на эритроцитах человека 0 (Ι) группы Rh (+). | 350 ОСК 9 ОСК |
| 185 историй болезни |
Методы культивирования штаммов.
Для выполнения исследований использованы штаммы C.diphtheriae, выделенные автором и полученные из Санкт-Петербурга, Ленинградской и Вологодской областей за период 1995-2009 гг.
Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с Методическими указаниями Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции (МУ 4.2.698-98), Определителем бактерий Берджи (1997), учебным пособием Микробиология под редакцией В.И.Покровского (1999), руководством по лабораторной диагностике ВОЗ Дифтерия (1994 г., 2009 г.), учебным пособием для врачей Дифтерия. Лабораторная диагностика (2009 г.), схемами идентификации коринебактерий, предложенные Guido Funke et al. (1997) и Manual of Clinical Microbiology (2 Volume Set), Patrick R. Murray (2007).
В работе использованы референс-штаммы C.diphtheriae № 10356 (tox-), № 10648 (tox+) и № 3984 (tox+/-) из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK).
Изучение основных патогенных свойств и антибиотикорезистентности коринебактерий.
Степень адгезии микроорганизмов определяли пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу В.И. Брилис (1986) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+.
Для определения токсигенности C.diphtheriae использованы 5 тестов: полимеразная цепня реакция (ПЦР), иммунохроматографический тест (ICS), иммунопреципитация в агаре (Elek-тест), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция агглютинации латекса (РАЛ).
Постановку ПЦР со специфическими праймерами проводили в режиме амплификации, описанном в инструкции по применению тест - системы для выявления участка ДНК 360 пар нуклеотидов гена токсина коринебактерии дифтерии производства АмплиСенс, г. Москва.
Для постановки ICS-теста использовали диагностический набор, полученный из Diphtheriae Reference Laboratory (CPHL), London, UK.
Elek-тест проводили по общепринятой методике, согласно МУ 4.2.698-98 с использованием среды ОТДМ для определения токсигенности дифтерийных микробов производства НПО Питательные среды г. Махачкала, Россия. Для приготовления бумажных дисков применяли Антитоксин диагностический дифтерийный очищенный ферментолизом и специфической сорбцией, сухой производства НПО Биомед, г. Пермь.
Для постановки РНГА использовали диагностический набор с эритроцитарным диагностикумом (производства НИИЭМ им. Пастера, С-Петербург).
Для проведения РАЛ использовали диагностический набор ID-PaGIA Diphtheria Toxin Test и оборудование (центрифуга, пластиковые карты, включающие 6 микропробирок с гелем Sephadex) СП Германия - Россия, ГРМИ № 94/256.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили методом серийных разведений и диско-диффузионным методом согласно МУК 4.12.1890-04 (Москва, 2004), УBasic laboratory procedures in clinical bacteriologyФ (WHO, Geneva, 1991, раздел УОпределение чувствительности к антимикробным препаратамФ) и руководства ВОЗ "Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии" (1994). В качестве среды для постановки теста использовали бульон и агар Мюллера-Хинтона с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для контроля качества сред использовали стандартные штаммы: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). В качестве контрольных штаммов для оценки чувствительности использовали Corynebacterium diphtheriae var. gravis (tox+) (NCTC 10648) и Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
Иммунологические методы
РН (реакция нейтрализации) в культуре клеток Vero
В реакции использовали токсин 0,0002 Lf/мл и антитоксин 0,032 МЕ/мл, полученные из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). При постановке реакций применяли культуру клеток Vero, полученную из лаборатории детских вирусных инфекций НИИЭМ им. Пастера, в концентрации 2,5105 клеток/мл. Содержание антитоксических антител определяли от 0,000125 МЕ/мл и выше.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)
В работе использовали эритроцитарный дифтерийный антигенный жидкий диагностикум производства Биомед им. И.И.Мечникова (Московская обл., Красногорский район, с. Петрово-Дальнее) активностью 1:6 400.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Тест-система для ИФА представляет собой набор, предназначенный для определения суммарных антитоксических антител на основе конъюгата - иммуноглобулинов (F(ab')2-фрагментов) диагностических против IgG человека, аффинноочищенных, меченных пероксидазой (производства НПО Биомед, г. Пермь). Специальная компьютерная программа, прилагаемая к набору, дает возможность производить перерасчет показателей оптической плотности в показатели антитоксических международных единиц.
Для определения авидности антител использовали эту же тест-систему, которую модифицировали путем введения дополнительных 2-х контролей: контрольный положительный образец (К+) - сыворотка крови человека с индексом авидности 95% и контрольный отрицательный образец (К-) - сыворотка крови человека с индексом авидности 5%, а также других ингредиентов и разработанных условий проведения реакции.
Экспресс-способ выявления дифтерийного токсина на основе микротехнологий
Способ разрабатывался с использованием 7 контрольных (положительных и отрицательных) референс-штаммов и токсинов, полученных из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK), ГИСК им. Л.А.Тарасевича и НИИЭМ имени Пастера (Россия). Апробацию способа осуществляли на 30 известных музейных штаммах C.diphtheriae в трех повторностях.
Экспресс-способ выявления потенциальной токсигенности у штаммов C.diphtheriae
При разработке способа применяли лазерный прибор для микробиологических исследований Барва ЛПМИ - 01 производства Харьковского НИИ лазерной биологии и лазерной медицины.
В экспериментальной части использованы референс-штаммы C.diphtheriae № 10356 (tox-), № 10648 (tox+) и № 3984 (tox+/-) из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). Апробация способа осуществлялась на 80 штаммах музейных культур C.diphtheriae.
Эпидемиологические методы
Эпидемиологические методы использовали при изучении заболеваемости населения Санкт-Петербурга, Ленинградской и Вологодской областей за период с 2000 по 2009 гг. Данные о заболеваемости были предоставлены центрами Государственного санитарно-эпидемиологического надзора на изучаемых территориях. Показатели привитости населения от дифтерии, данные о циркуляции выделенных штаммов C.diphtheriae были получены из бактериологических лабораторий вышеуказанных территорий.
При определении групп риска среди населения по восприимчивости к дифтерийной инфекции также были использованы эпидемиологические методы. Учитывали группы населения по возрасту, профессии, наличию или отсутствию хронического заболевания.
Методы математической обработки данных
В работе использованы интенсивные, экстенсивные показатели и показатели наглядности. Математическая обработка включала следующие методы: расчет первичных статистических показателей; выявление отличий между группами по статистическим признакам; установление взаимосвязи между переменными с помощью параметрического и непараметрического корреляционного анализа; установление вида зависимостей (показателей от изучаемых факторов) с помощью регрессионного анализа.
Часть простейшей математической обработки выполняли на калькуляторах. В основном математическую обработку выполняли на ПК с использованием стандартных статистических пакетов Statgraphics, STATISTICA, SPSS. Для первичной подготовки таблиц и промежуточных расчетов использовали пакет Excel.
Метод картографического анализа и компьютерной обработки данных
Для выполнения работы использованы материалы отделов медицинской статистики, данные и документы эпидемиологических отделов городского и областного центров Государственного санитарно-эпидемиологического надзора, лаборатории бактериальных капельных инфекций НИИЭМ имени Пастера. Далее были разработаны и заполнены базы данных по разным видам исследования, которые объединяли в одну целостную систему - геоинформационную систему (ГИС). В качестве базовой была использована ГИС MapInfo.
Результаты исследований и их обсуждение
Оценка невосприимчивости привитых к дифтерии
По данным центров госсанэпиднадзора в Северо-Западном регионе РФ в постэпидемические годы до 50% лиц, заболевших дифтерией, содержали в крови защитные уровни антитоксических противодифтерийных антител, выявляемые с помощью регламентированного метода в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
В связи с этим были проведены параллельные исследования образцов сыворотки крови от 350 лиц в трех используемых в нашей стране методах: в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero, в РПГА с помощью стандартного диагностического набора и в иммуноферментном анализе (ИФА).
Полученные результаты показали, что коэффициент корреляции между результатами исследования сывороток в РПГА и классической РН в культуре клеток Vero составил r = 0,5. Между тем, этот показатель для ИФА и РН (Vero) составил 0,95 с уровнем достоверности p < 0,05. Результаты ИФА выражали в международных единицах, что соответствует международным критериям. Поэтому в дальнейших исследованиях для оценки уровня суммарных антитоксических антител (АТ-АТ) использовали ИФА.
Анализ данных по определению уровней АТ-АТ у населения изучаемых территорий выявил различия в защите от дифтерийной инфекции некоторых социальных и профессиональных групп, а использование знаний о морфофункциональных основах взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем позволило выделить дополнительные категории риска по восприимчивости к дифтерии среди населения:
- по возрасту - лица старше 50 лет (36% из них слабо защищены от дифтерии (р<0,05) в отличие от лиц 20-29 лет, среди которых 10% лиц защищены слабо (р<0,05));
- по профессиональной принадлежности - медицинские работники (11% восприимчивы к дифтерии (р<0,01)), рабочие промышленных предприятий, особенно занятые на вредном производстве (6% восприимчивы к дифтерии (р<0,01));
- лица, страдающие хроническими заболеваниями соматической и инфекционной этиологии (рис.1).
Рис. 1. Показатели антитоксических антител (МЕ/мл) и доля лиц (%), незащищенных от дифтерии.
Полученные данные аргументируют необходимость дифференцированного подхода к отбору лиц для серологического мониторинга и коррекции защищенности от дифтерийной инфекции.
В результате исследования образцов сывороток крови заболевших дифтерией лиц с помощью ИФА было установлено, что 29% из них содержали АТ-АТ в количестве >0,1МЕ/мл1
, которые по международным и национальным критериям защищенности рассматриваются как обеспечивающие невосприимчивость к дифтерии. Поэтому дальнейшие исследования были посвящены изучению качества антитоксических антител и их роли в защите от дифтерии.
Для исследования были выбраны две панели из 185 образцов сывороток крови, полученных от больных дифтерией (на 3-5 день заболевания, не получавших в этот период лечебной противодифтерийной сыворотки) и контактных лиц, кровь от которых была взята на 1-й - 2-й неделе после контакта с заболевшим дифтерией. Сравнивали не только уровни суммарных антитоксических антител, но и их авидность.
С целью подбора химического вещества для диссоциации комплексов, состоящих из низкоавидных антител и антигена, были использованы следующие химические соединения: мочевина различной концентрации (1М, 2М, 3М, 4М, 5М, 6М, 7М, 8М, 9М, 10М); тиоцианат (1М, 2М, 3М, 4М, 5М, 6М, 7М); калий роданистый (1М, 2М, 3М, 4М, 5М, 6М). Для этого выполняли все процедуры по инструкции, прилагаемой к набору, но на первом этапе изучаемые сыворотки раскапывали в двух повторностях.
После инкубации в термостате согласно инструкции лунки освобождали от реакционной смеси и вносили в лунки с I повторностью сывороток буферный промывочный раствор из набора для ИФА, а в лунки со II повторностью сывороток - раствор детергента. После 30 секунд экспозиции лунки снова освобождали от растворов. Так повторяли 4 раза, после чего все лунки промывали буферным промывочным раствором, прилагаемым к набору. Далее все процедуры выполняли строго по инструкции к набору. Индекс авидности (ИА) рассчитывали по формуле, используемой при подобных исследованиях:
ИА = 100%, (1)
где ОП (Е) - оптическая плотность в лунке, обработанной детергентом, ОП (А) - оптическая плотность в лунке, обработанной обычным промывочным раствором, используемым в тест-системе.
В результате попарного сравнения индексов авидности, полученных во всех 23-х вариантах опытов, были выбрана оптимальная концентрация детергента, при которой определялась наиболее достоверная разница между двумя выделенными группами сывороток. Таким веществом оказался калий роданистый в концентрации 3М (р<0,001) (рис. 2). При этом среднее значение индекса авидности в группе заболевших дифтерией составило 17,5%, а в группе не заболевших дифтерией - 64%.
Рис. 2. Результаты определения индексов авидности антитоксических антител в двух группах сывороток.
На основании полученных данных установлено, что индекс авидности более 30% соответствует вероятности защиты от заболевания дифтерией на 95 %, а индекс авидности 10 % является показателем критического уровня, ниже которого вероятность заболевания возрастает до 99% (р<0,001).
Из полученных данных также следует, что определение индекса авидности антител имеет наибольшую достоверность при определении защищенности от дифтерийной инфекции (99%), чем уровень суммарных антитоксических антител (71%), о чем было сказано ранее. Этот факт объясняет, почему отмечались случаи заболевания дифтерией среди лиц, имеющих в крови защитные уровни суммарных антител.
По индексу авидности антитоксических противодифтерийных антител выделены группы риска среди населения: лица старше 50 лет (рис. 3), рабочие промышленных предприятий, особенно занятые на вредном производстве (рис. 4), лица, страдающие туберкулезом, гепатитом С, СПИД, наркоманией и алкоголизмом (рис. 5).
Рис. 3. Индексы авидности (%) антитоксических антител у различных возрастных групп здоровых лиц.
Рис. 4. Индексы авидности (%) антитоксических противодифтерийных антител в крови лиц различных профессиональных групп.
Рис. 5. Индексы авидности (%) антитоксических противодифтерийных антител у лиц с различными заболеваниями.
Результаты исследования показали, что в отличие от здорового населения у лиц, имеющих хроническое инфекционное заболевание, наблюдается значительное снижение не только количественного показателя защищенности, но и качественного (авидности). Так, у лиц, страдающих туберкулезом, гепатитом С, СПИД, отмечаются низкие индексы авидности антител (около 30%) наряду с низким содержанием общего количества антител. Очевидно, патогенез развития этих заболеваний, связанный как с возможными генетическими особенностями формирования иммунной системы у заболевших, так и угнетением клеточного и гуморального звеньев иммунитета возбудителем дифтерии, оказывает неблагоприятное влияние на иммунный ответ и тормозит выработку специфических противодифтерийных антител в достаточном количестве и высокого качества в ответ на вакцинные препараты.
Полученные данные об антитоксическом иммунном ответе у лиц, страдающих наркоманией и алкоголизмом, показали, что наряду с низким содержанием антител и высокой долей среди них лиц, восприимчивых к дифтерии по количеству антител, эта группа имеет в крови антитела со средним индексом авидности 31%. Данный факт во многом объясняет причину высокой заболеваемости дифтерией во время последней эпидемии среди лиц с указанными заболеваниями.
Комплексная оценка противодифтерийного поствакцинального иммунитета
В результате проведенных исследований было установлено, что группа лиц, заболевших дифтерией, в среднем содержала в крови 0,27 МЕ/мл антитоксических противодифтерийных антител, а средний индекс авидности составил 17,5%. Каждый из этих отдельно взятых показателей является защитным. Однако регистрация заболеваний в данной группе подтвердила вывод о необходимости использования двух показателей для оценки защищенности от дифтерии: количества антител и индекса их авидности (рис. 6).
Рис. 6. Распределение показателей количества и качества противодифтерийных антитоксических антител у лиц из разных групп обследования.
Комплексный показатель (КП), полученный на основании данных о количестве АТ-АТ и ИА, указывает на вероятность заболевания дифтерией у данного обследуемого в случае его контакта с дифтерийным больным. При этом коэффициент Стьюдента (t) = 16,4; достоверность (р) < 0,001. А коэффициент Фишера (F) = 83,7, р < 0,001.
Наиболее достоверные результаты, подтверждающие данный вывод, получены при использовании дискриминантного анализа. При этом степень достоверности выведенных формул была наивысшей (р=5,64E-26). В результате примененного статистического анализа были выведена формула расчета вероятности заболевания человека дифтерией по двум известным показателям: АТ-АТ и ИА путем использования их производной - КП. Для этого сначала рассчитываем функцию для лиц, не заболевших дифтерией:
yo= -3,805 + 0,49 Х КП, (2)
где КП = АТ-АТ Х ИА (3)
Затем рассчитываем функцию для лиц, заболевших дифтерией:
y1=-0,713 + 0,017Х КП (4)
Если значение y1 > yo , то вероятность заболеть дифтерией выше, чем не заболеть. Для расчета вероятности заболевания дифтерией (ВЗд) получена следующая формула:
ВЗд = 0,82 - 0,05Х КП (5)
Показатель вероятности заболевания может варьировать от 0 до1: чем выше показатель, тем выше вероятность заболевания.
Таким образом, с помощью полученных формул оказалось возможным рассчитать вероятность заболевания дифтерией для любого лица из очага инфекции после исследования его сыворотки крови с учетом двух показателей: АТ-АТ и ИА.
Поскольку авидность антител имеет определяющее значение при оценке защищенности от дифтерии, необходимо было установить: какова динамика их накопления и утраты. Для этого использовали образцы сывороток крови взрослых здоровых лиц на каждый срок после ревакцинации через определенные промежутки времени: через 1 месяц, через 3 месяца и так далее - до 6 лет, после этого - с интервалом 6 месяцев до 10 лет после очередной ревакцинации. У всех обследованных в сыворотке крови определяли два показателя: АТ-АТ и ИА. В результате была получена динамика накопления и созревания высокоавидных антител, а затем- их снижение по количественному и качественному показателям.
Так, созревание высокоавидных антител достигает максимума в среднем через год после ревакцинации, в то время как наибольшее количество суммарных антитоксических антител образуется через 6-9 месяцев. Период регрессии для суммарных антител более длителен, чем для высокоавидных: через 5 лет после очередной ревакцинации индекс авидности антител достигает минимального (критического) уровня (10%), в то время как количественное содержание антитоксических антител остается в пределах защитных уровней (0,1-0,5 МЕ/мл) и снижается до критических значений (0,01 МЕ/мл) к 7-8-му году после ревакцинации (рис. 7).
Рис. 7. Динамика формирования и снижения уровней антитоксических антител и индекса их авидности после ревакцинации.
Поскольку авидность антител, защищающая от заболевания дифтерией, снижается быстрее, чем количественный показатель суммарных антител, то в прогнозе необходимо ориентироваться на индекс авидности антител. Для этого на графике, представляющем собой математическую модель из исходных данных о динамике индексов авидности после ревакцинации, (рис. 8.) находим значение, наиболее приближенное к полученному индексу авидности антител (с учетом прошлой вакцинации, если она была проведена в ближайший год) и определяем по графику: через сколько месяцев индекс авидности снизится до критической отметки (10%). Очередную ревакцинацию (или повторное исследование) рекомендуется пройти до этой даты.
Примечания: IND_AVID (%) - индексы авидности (%), Т (мес) - время после ревакцинации (месяцы). Средняя погрешность модели = 5%.
Рис. 8. Математическая модель динамики индексов авидности после ревакцинации.
Таким образом, на основании двух показателей антитоксических антител возможно с вероятностью, приближенной к 100%, (при показателе достоверности (р < 1Х10-5)) определить срок, когда произойдет снижение показателей до критически нижнего значения (10%).
Известно, что в клинической практике большую трудность представляет дифференциальная диагностика легких и стертых форм от бактерионосительства C.diphtheriae. Нами изучены образцы крови носителей C.diphtheriae и больных дифтерией, у которых кровь взята на 2-3 день от начала заболевания и исследована по двум показателям: АТ-АТ и ИА (рис. 9).
Рис. 9. Распределение показателей антитоксических антител (АТ-АТ) и индексов авидности (ИА) у больных дифтерией и носителей C.diphtheriae.
При статистической обработке попарно данных, характеризующих уровни АТ-АТ в двух группах было выявлено, что разница в этих показателях между двумя группами недостоверна (t=1,14; р=0,25). Поэтому ранее не удавалось с помощью одного показателя (уровня антитоксических антител) дифференцировать случаи заболеваний и бактерионосительства. При сравнении попарно показателей ИА в двух группах, разница между ними оказалась достоверной (t=4; р<0,05). Средний ИА в группе носителей C.diphtheriae составил 57% в то время, как в группе больных дифтерией был равен 13%.
Полученный ранее критический уровень ИА антител, равный 10%, и уровень повышенной вероятности заболевания дифтерией, равный 30%, применим в диагностической практике. Дифференциальная диагностика заболевания и носительства становится возможной благодаря исследованию сывороток в модифицированном варианте ИФА с определением индекса авидности антитоксических противодифтерийных антител.
Характиристика основных биологических свойств штаммов C.diphtheriae, выделенных в постэпидемический период
По данным центров Госсанэпиднадзора среди выделенных в 2000-2009 гг. штаммов C. diphtheriae в Санкт-Петербурге, Ленинградской и Вологодской областях, наблюдается четко выраженная тенденция: снижение общего количества выделенных штаммов, ремиттирующее уменьшение среди них доли варианта gravis (с 45% в 2000 г. до 10% в 2009 г.) и значительное снижение доли токсигенных штаммов (с 24% в 2000 г. до 2% в 2009 г.).
В последние годы постэпидемического периода (2006-2008 гг.) у 169 изученных штаммов заметно возросла адгезивная активность. С 2003-2004 гг. доля высокоагезивных штаммов увеличилась в 2 раза. Следует отметить, что 66% высокоадгезивных штаммов C. diphtheriae выделены от лиц, обследованных с профилактической целью. Как показали проведенные нами исследования, высокой степенью адгезивной активности обладали штаммы, изолированные от бактерионосителей, которые, надо полагать, поддерживают скрытую циркуляцию эпидемически значимых штаммов C. diphtheriae. Увеличение среди них доли высокоадгезивных штаммов создает в настоящее время благоприятные условия для более широкой циркуляции их среди населения.
Изучение токсигенных свойств штаммов проводили с использованием нескольких методов: Elek-тест, ICS и РНГА под контролем ПЦР. Установлено, что в последние годы произошло изменение степени токсигенности штаммов C. diphtheriae. Так, если в 1994-1995 гг. слаботоксигенные штаммы (Т1) составляли около 40% от общего числа изолированных токсигенных культур (173), в 2003-2004 гг. их доля составила 30% от 308 штаммов, в 2006-2008 гг. - около 25% от 169 штаммов. В то же время доля средне- и высокотоксигенных штаммов (Т2 и Т3) возросла и к 2006-2008 гг. составила 75%.
Кроме того, установлено, что доля штаммов с молчащим геном, циркулирующих в Санкт-Петербурге, Ленинградской и Вологодской областях возрастает. Так, в коллекции штаммов, изолированных в 2003-2004 гг. доля штаммов с молчащим геном составляла 23%, а к 2006 -2008 гг. она возросла до 40%.
В результате проведенных исследований по определению чувствительности штаммов C.diphtheriae к антибиотикам установлено, что уровни минимальной подавляющей концентрации (МПК) наиболее эффективного в отношении C. diphtheriae антибиотика, рифампицина, увеличились на 23% с 1994 до 2009 г. МПК второго по эффективности препарата, эритромицина, за этот же период возросла на 18%, пенициллина - на 20%, кларитромицина - на 21%, азитромицина - на 17%. МПК тетрациклина для штаммов, выделенных в 2008-2009 гг., осталась на уровне чувствительности штаммов, выделенных в 1994 - 1995 гг. (таблица 2).
Таблица 2.
Изменение МПК антибиотиков к штаммам C.diphtheriae в динамике
Годы выде-ления штамма | Значения МПК (мкг/мл) + m следующих антибиотиков | |||||
Рифам пицин | Эритро мицин | Пеницил ин | Тетра циклин | Кларитромицин | Азитро мицин | |
1994-1995 n=22 | 1,0+0,5 | 2,0+0,1 | 0,1+0,01 | 0,15+0,01 | 4,0+0,2 | 4,0+0,5 |
2003-2004 n=27 | 2,0+0,1 | 4,0+0,5 | 0,25+0,02 | 0,15+0,01 | 4,0+0,2 | 4,0+0,4 |
2008-2009 n=18 | 4,0+0,2 | 4,0+0,4 | 0,5+0,025 | 0,15+0,01 | 8,0+0,5 | 8,0+0,4 |
Следует отметить, что устойчивость штаммов C. diphtheriae var. mitis к рифампицину, эритромицину и пенициллину в среднем на 15% выше, чем у штаммов C. diphtheriae var. gravis за указанный период наблюдения. Учитывая, что в настоящее время среди циркулирующих в Санкт-Петербурге и Ленинградской области большинство штаммов C. diphtheriae составляют микроорганизмы варианта mitis, возникает проблема с выбором адекватного препарата для антибактериального лечения дифтерии.
Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения и вращающихся магнитных полей на адгезивность, токсигенность и чувствительность к антибиотикам штаммов C. diphtheriae in vitro.
Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на штаммы C.diphtheriae выражалось в общей тенденции - снижении адгезивной активности у изучаемых штаммов. Время облучения играло при этом большую роль: чем большее время микроорганизмы облучались НИЛИ (от 5 до 15 минут), тем больший эффект был достигнут в конце эксперимента.
После воздейстивя на колонии C.diphtheriae вращающихся магнитных полей (ВМП) наблюдали повышение адгезивной активности; при этом на различия показателей оказывали влияние все составляющие эксперимента: направление вращения вектора поляризации, ориентация полюса магнита, экспозиция.
Наибольшее влияние на адгезивную активность C.diphtheriae оказывало левовращающееся магнитное поле южной ориентации. Уже через 5 минут от начала воздействия на штаммы ВМП 40% из них усилили свою адгезивную активность, а через 15 минут воздействия - 60% штаммов (рис. 10).
Рис. 10. Увеличение адгезивной активности штаммов C.diphtheriae под влиянием ВМП (в %).
Установлено также, что НИЛИ влияет на изменение уровней токсинопродукции штаммов C.diphtheriae и, что особенно важно, на восстановление токсинопродукции у штаммов, несущих молчащий (tox+) ген. Поэтому это свойство использовали пи разработке экспресс-способа выявления токсигенных штаммов C.diphtheriae.
Разработка экспресс-способа для выявления штаммов C.diphtheriae с молчащим геном и слабой токсинопродукцией.
При разработке экспресс-способа применяли лазерный прибор для микробиологических исследований Барва ЛПМИ - 01 производства Харьковского НИИ лазерной биологии и лазерной медицины.
До начала эксперимента все нетоксигенные штаммы C.diphtheriae были изучены в ПЦР на наличие (tox+) гена, токсигенные - в РНГА на определение уровня токсинопродукции, а также в Elek- тесте, регламентированном нормативными документами. На выросшую в чашке Петри культуру воздействовали НИЛИ. После этого штаммы повторно изучали в Elek-тесте и РНГА.
Выбор наиболее информативных показателей лазерного излучения, при которых достигался максимальный эффект индукции токсигенности у штаммов определялся опытным путем. Оптимальными параметрами являются: время воздействия - 5 минут, мощность плотности излучения на поверхности колоний 3 мВт/см2, длина волны источника излучения - 660 нм.
После воздействия НИЛИ на штаммы C. diphtheriae с молчащим геном, у 45% из 80 штаммов наступало восстановление токсинопродукции, регистрируемое в РНГА и Elek-тесте. По сравнению с другими методами (in vivо и in vitro), восстанавливающими токсинопродукцию у C. diphtheriae с молчащим геном, воздействие НИЛИ позволило получить положительные ответы на 10% больше и в короткий срок (рис. 11).
Рис. 11. Сравнение эффективности методик по частоте и продолжительности восстановления токсинопродукции у штаммов С. diphtheriae, несущих молчащий ген.
О стимулирующем действии НИЛИ на токсинопродукцию можно было судить на основании данных, полученных при его воздействии на токсигенные штаммы с различной степенью токсигенности (рис. 12).
Усл.ед.
Примечания:
исходный уровень токсинопродукции, принятый за 1;
уровень токсинопродукции после воздействия НИЛИ.
Рис. 12. Изменение токсинопродукции у штаммов после воздействия лазером
Если условно исходную токсигенность принять за 1 (светлые столбики), то в результате воздействия НИЛИ в течение 5 мин на штаммы со слабой токсинопродукцией (Т1) ее уровень возрастал в среднем в 2 раза, у штаммов со средним уровнем токсинопродукции (Т2) - в 1,8 раза, у штаммов с высокой токсинопродукцией (Т3) - в 1,4 раза. Таким образом, полученные данные указывают на целесообразность дополнительного контроля токсигенности с использованием НИЛИ у штаммов с молчащим геном, а также при сомнительных результатах, полученных при определении токсигенности стандартными фенотипическими методами, что позволяет повысить диагностическую эффективность определения токсигенности у C. diphtheriae.
Новые биомикротехнологии для повышения эффективности выявления токсинообразования штаммами C. diphtheriae in vitro
Аналитическая система для реализации экспресс-способа диагностики токсигенных штаммов состоит из двух составляющих: иммунно-биологической (латексный диагностикум) и приборной части (микроридер со сменными чипами).
В основу создания диагностикума положена реакция взаимодействия антигена и антитела, где в качестве антигена представлен дифтерийный токсин (анатоксин), а в качестве антитела - фракция высокоавидных антител, полученных в результате последовательного фракционирования антитоксических сывороток крови. Полученные высокоактивные (не менее 2,5 МЕ/мл) и высокоавидные антитела с индексом авидности не менее 90% сенсибилизировали путем химической сорбции на поверхности полиакриламидных латексных частиц диаметром 0,81 мкм для получения дифтерийного антительного диагностикума.
Таким образом, создание оптимальных характеристик способа достигалось, с одной стороны, созданием наиболее чувствительных компонентов диагностикума (высокоавидная фракция высокоактивных антител), использованием современных технологий получения полиакриламидного латекса и сорбции на них антител, с другой стороны - за счет совершенствования приборной части.
Микроридер с подсветкой и микрокамерой имеет рабочие размеры 4х5х6 см, биочипы размером 16х16 мм с различным количеством (от 1 до 96) лунок. Результаты реакции могут фиксироваться в заданном или произвольном режиме оператором в памяти компьютера в виде фотоизображений или видеоролика. В процессе апробации способа создана база данных визуальных образов положительных и отрицательных контролей, а также проб с известным содержанием токсина. При определении содержания токсина в пробе с помощью базы данных достигается получение достоверного ответа о наличии в пробе дифтерийного токсина. Автоматизация процесса считывания результата позволяет повысить объективность разработанного способа.
Разработанный экспресс-способ обладает высокой диагностической эффективностью. При количественной оценке чувствительность способа составила 0,001 Lf/ml дифтерийного токсина, что выше показателей любого имеющегося в настоящее время метода детекции дифтерийного токсина.
Из всех фенотипических методов разработанный способ обладает наилучшими показателями по скорости пробоподготовки, проведения реакции, а также возможности одновременной постановки большого количества проб (рис. 13, таблица 3).
Рис. 13. Сравнение диагностической эффективности различных методов определения токсигенности у штаммов C.diphtheriae.
Таблица 3
Сравнение экспресс- способа определения дифтерийного токсина с другими фенотипическими методами
Методы | Время подготовки теста | Время проведения реакции | Возможность одновременной постановки проб |
Elek-тест | 18-24 часа | 18-48 часов | До 16 на одну чашку Петри |
РНГА | 18-24 часа | 2 часа | До 9 проб на один планшет |
ICS-тест | 18-24 + 3 часа | 15 мин | До 50 за один поход |
Биочиповый тест | 6 часов | 2-3 мин | До 94 проб на одном чипе |
Таким образом, в условиях ослабления внимания к дифтерийной инфекции, частого применения антибиотиков без установления этиологического фактора, разработка экспресс-способа определения токсигенных штаммов C. diphtheriae позволяет повысить качество лабораторной диагностики за счет высокой чувствительности способа, специфичности, удобства постановки, мобильности, портативности, быстроты проведения и учета реакции, возможности одновременной постановки на одном чипе до 94 проб, а значит, возможности применения данного метода не только в единичных лабораторных исследованиях, но и при массовых обследованиях населения. Автоматизация процесса считывания информации делает результаты реакции объективными.
Наличие факторов патогенности не только у C. diphtheriae, но и других представителей рода Corynebacterium, их изменчивость под влиянием внешних факторов предопределили исследования данных микроорганизмов. Для улучшения дифференциальной диагностики при выделении от больного коринеформных палочек были предложены ряд описательных текстов, схем и таблиц биохимического и морфологического типирования, прописи питательных сред в виде методических рекомендаций.
С целью оперативного получения комплексной информации о заболеваемости дифтерией, состоянии защищенности населения от инфекции, циркуляции штаммов C. diphtheriae, их характеристики созданы соответствующие базы данных, которые включены в геоинформационную систему локального уровня (Санкт-Петербург). Получение пространственно-временной характеристики любого компонента, представленного в базе данных, является инструментом для мониторинга и позволяет корректно оценивать полученную информацию и составлять план дальнейших действий для предотвращения заболеваний и улучшения лабораторной диагностики.
ВЫВОДЫ
- Высокоавидные антитоксические антитела играют ведущую роль в формировании иммунитета против дифтерии. Для оценки защищенности привитых разработан количественный показатель - индекс авидности (ИА) антитоксических антител. ИА 30 % свидетельствует о защищенности от заболевания дифтерией (р<0,05); ИА = 10 % является показателем критического уровня, ниже которого вероятность заболевания возрастает до 99% (р<0,001). ИА противодифтерийных антитоксических антител различаются у больных легкими формами дифтерии и здоровых носителей C. diphtheriae (р<0,05) и могут служить дифференциально-диагностическим признаком различий между этими формами.
- После ревакцинации показатели количественного содержания антитоксических антител и индекс их авидности постепенно снижаются и достигают критических уровней 0,01 МЕ/мл и 10 % через 8-9 и 5 лет, соответственно. Для оценки противодифтерийного индивидуального и коллективного (в группах риска) иммунитета, риска заболевания ревакцинированных и планирования срока очередной ревакцинации целесообразно использовать оба показателя.
- Выявлено изменение биологических свойств (адгезивность и продукция токсина) C. diphtheriae, выделенных в постэпидемический период (2000-2009 гг.). Адгезивность штаммов C. diphtheriae (особенно выделенных от контингентов закрытых учреждений, обследованных с профилактической целью) возросла в 2 раза. Доля штаммов C. diphtheriae, несущих tox-ген, возросла до 40% среди нетоксигенных в Elek-тесте штаммов. В среднем, на 20% снизилась доля штаммов, чувствительных к антибиотикам, используемым для лечения больных дифтерией и санации носителей C. diphtheriae.
- Воздействие in vitro низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 660 нм, плотностью мощности излучения 3,0 мВт/см2 на поверхности колоний бактерий в течение 5 минут повышала продукцию дифтерийного токсина токсигенными штаммами C. diphtheriae в 2 раза и стимулировала выработку токсина у 45 % штаммов, содержащих молчащий tox-ген.
- Воздействие вращающихся магнитных полей повышает адгезивность штаммов C. diphtheriae in vitro. Под влиянием левовращающегося магнитного поля южной ориентации в зависимости от экспозиции, 5 и 15 мин, возрастала адгезивность 40% и 60% штаммов, соответственно.
- На основе новых биомикротехнологий с использованием противодифтерийныех антитоксических высокоавидных антител человеческой иммунной сыворотки (чувствительность 0,001 Lf/ml дифтерийного токсина) разработан автоматизированный экспресс-способ выявления токсигенных C. diphtheriae in vitro.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
На основании всех проведенных расчетов предложен алгоритм контроля иммунитета населения и оценка невосприимчивости к дифтерии как отдельных лиц, так и коллективов:
- Отбор крови, заполнение анкеты в БД (возраст, прививочный статус, профессия, хроническое заболевание, дата заболевания)
- Определение АТ-АТ и ИА
- Определение вероятности заболевания по формулам
- Определение сроков ревакцинации или повторного контроля иммунитета
Разработка способа усиления токсинопродукции штаммами C.diphtheriae и высокочувствительного экспресс-способа выявления дифтерийного токсина позволили разработать алгоритм микробиологического исследования клинического материала на поиск C.diphtheriae:
- Выделение из клинического материала коринебактерий.
Определение вида и биохимического варианта
- Определение токсигенности с помощью Elek-теста.
Определение токсигенности в ПЦР
- В ПЦР (tox-) Elek-тест - 3. В ПЦР (tox+), Elek-тест -
4. C.diphtheriae(tox-) 4. - НИЛИ
- Микрочиповый тест
C.diphtheriae(tox+)/ (tox-)
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Kraeva L.A. Ways of optimization of monitoring and prophylaxis of diphtheria infection. / L.A. Kraeva, S.B. Krayev, G.Ya. Tseneva. // Eighth International Meeting of ELWG on Diphtheria. Copenhagen. 2004. Abstr. Book A 5.9. P. 55.
- Краева Л.А. Качественные показатели антитоксических антител в оценке противодифтерийного иммунитета / Краева Л.А., Носков Ф.С., Ценева Г.Я. // Ж. мед. иммунол. - СПб. - 2005. т. 7. № 2-3. C. 274.
- Ценева Г.Я. Влияние физических факторов (лазерное и радиоволновое воздействие нетепловой интенсивности) на токсинопродукцию Corynebacterium diphtheriae / Г.Я. Ценева [и др.] // Мат-лы XXIII Межд. научно-практ. конф. Применение лазеров в медицине и биологии. - Николаев. - 2005. - C. 96-97.
- Ценева Г.Я. Методы определения токсигенности у штаммов C.diphtheriae / Г.Я.Ценева, Л.А.Краева, С.А.Габриелян, Е.Е.Щедеркина // Бюллетень ВСН - СО РАМН. Ц Иркутск. Ц 2005. - №7. Ц C.182-186.
- Ценева Г.Я. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на биологические свойства Corynebacterium diphtheriae / Г.Я. Ценева, В.А. Грабина, Л.А. Краева // Мат-лы XXIV Межд. научно-практ. конф. Применение лазеров в медицине и биологии. - Николаев. - 2005. - C. 145-146.
- Ценева Г.Я. Экспериментальное изучение специфической активности противодифтерийных препаратов Кодивак и АД-М-анатоксин / Г.Я.Ценева [и др.] // Ж-л Эпидемиология и вакцинопрофилактика. Ц 2005. Ц № 6 (25). Ц С. 25-27.
- Краева Л.А. Чувствительность C.diphtheriae к антибактериальным препаратам и эффективность их клинического применения / Л.А.Краева, Г.Я.Ценева, Н.В.Сабадаш, Г.И.Беспалова // Мат-лы научно-практич. конф. Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины - СПб. - 2006. - С. 170.
- Краева Л.А. Влияние факторов физико-химической природы на чувствительность к антибиотикам микроорганизмов рода C.diphtheriae / Краева Л.А. // Мат-лы Всеросс. научно-практич. конф. Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия. Ц Махачкала. - 2006. - С. 96-98.
- Ценева Г.Я. Перспективы использования лазерного излучения низкой интенсивности в диагностике и лечении дифтерийной инфекции / Г.Я.Ценева, В.А.Грабина, Л.А.Краева. // Мат-лы XXV Международной научно-практической конференции Применение лазеров в медицине и биологии. - Луцк. - 2006. - С. 86-87.
- Краева Л.А. Использование геоинформационных систем для мониторинга инфекционных заболеваний / Краева Л.А., Краев С.Б., Ценева Г.Я. // Материалы VII Межгосударственной научно-
практической конференции государств-участников СНГ. - Оболенск. Ц 2006. - С. 260-261.
- Tseneva G.J. Definition high-avidity antidiphtherial anti-bodies and their value in protection against of diphtheria / G.J.Tseneva, A.M.Nikolaeva, L.A.Kraeva // Ninth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELGWD and Diphtheria Surveillance Network (DIPNET). - Vouliagmeni, Greece. - 2006. - Р. 56.
- Kraeva L.A. Some performances of adhesive and toxicogenic properties C. diphtheriae, isolated in Saint Petersburg in the postepidemic period / Kraeva L.A. // Ninth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELGWD and Diphtheria Surveillance Network (DIPNET). ЦVouliagmeni, Greece. - 2006. - Р. 51.
- Патент на изобретение Способ контроля биологической пробы в реакции латекс-агглютинации и аналитическая система для его осуществления. - № 2298798 от 10.05.2007. - Авторы: Зимина Т.М., Лучинин В.В., Мигунова В.Е., Краева Л.А., Ценева Г.Я., Меньшикова А.Ю., Шабсельс Б.М., Дулатова М.В., Шпилюк Г.Ф.
- Ценева Г.Я. Влияние последовательного воздействия вихревых магнитных полей и лазерного излучения низкой интенсивности на биологические свойства коринебактерий дифтерии / Г.Я.Ценева, Л.А.Краева, В.А.Грабина // Материалы XXVII Международной научно-практической конференции Применение лазеров в биологии и медицине. - Харьков. - 2007. - С. 131- 133.
- Краева Л.А. Определение токсигенности у штаммов C. diphtheriaе, циркулирующих в постэпидемический период в Северо-Западном округе РФ / Л.А.Краева [и др.] // Материалы всероссийской научной конференции Современные проблемы медицинской микробиологии. - СПб. - 2007. - С. 82-87.
- Tseneva G. Laboratoire des infections bacteriennes respiratories / G.Tseneva, E.Voskresenskaya, N.Kurova, L.Kraeva // Rapport dТactevite des departments de recherch en 2006-2007. - 2007. - Р.13-15.
- Краева Л.А. К вопросу об этиологическом значении Corynebacterium non diphtheriae у больных с различной патологией / Л.А.Краева, Ж.Н.Манина, Г.Я.Ценева, А.Г.Радченко // Ж-л микробиол. и эпидемиол. Ц 2007. Ц №5. Ц С.3-7.
- Ценева Г.Я. Использование лазерного излучения низкой интенсивности в диагностике и лечении заболеваний, вызванных коринебактериями / Г.Я.Ценева, Л.А.Краева, В.А.Грабина // Материалы XXVIII Международной научно-практической конференции Применение лазеров в биологии и медицине. - Ялта. - 2007. - С. 113- 116.
- Пунченко О.Е. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций / Пунченко О.Е., Беспалова Г.И., Рыбальченко О.В., Краева Л.А. // Учебное пособие / под ред. Бадикова В.Д. - СПб. - 2007. - 70 с.
- Краева Л.А. К вопросу о протективных противодифтерийных антителах и методика их определения / Краева Л.А. // Материалы всеросс. научно-практич. конф. Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов. - Пермь. - 2008. Ц С. 58-59.
- Краева Л.А. Новые подходы к оценке защищенности от дифтерийной инфекции / Краева Л.А., Ценева Г.Я., Николаева А.М., Алексеева Е.А. // Материалы 4-ой международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. - СПб. - 2008. - С. 15.
- Kraeva L. Way the express diagnostics of toxin Цpositiv strains C.diphtheriae / L. Kraeva, G.Tseneva, T.Zimina // Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD. - Larnaca, Cyprus. - 2008. - P.26.
- Tseneva G. Influence of factors of an environment on biological properties Corynebacterium / G.Tseneva, L. Kraeva, V.Grabina, A.Korobov // Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD. - Larnaca, Cyprus. - 2008. - P.34.
- Ценева Г.Я. Влияние факторов химической и физической природы на биологические свойства коринебактерий / Ценева Г.Я., Краева Л.А., Грабина В.А. // Второй Санкт-Петербургский международный экологический форум Окружающая среда и здоровье человека. - СПб. - 2008. - С. 13.
- Патент на изобретение Способ определения токсигенности бактерий Corynebacterium diphtheriae № 2370539 от 20.10.2009. - Авторы: Краева Л.А., Ценева Г.Я., Коробов А.М., Грабина В.А.
- Беспалова Г.И. Дифтерия (современные методы лабораторной диагностики): руководство для врачей / Беспалова Г.И., Краева Л.А., Ценева Г.Я., Пунченко О.Е. - СПб. - 2009. - 44 с.
- Краева Л.А. Особенности биологических свойств С.diphtheriae, циркулирующих в постэпидемический период / Л.А.Краева, Г.Я.Ценева // Ж-л микробиол. и эпидемиол. Ц 2009. Ц №3. Ц С.3-6.
- Tseneva G.Ya. Way of the accelerated definition toxin production C.diphtheriae / G.Ya.Tseneva, L.A.Kraeva, V.A.Grabina, A.M.Korobov // Eleventh International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD. - Riga, Latvia. - 2009. - P.28.
- Алексеева Е.А. Изучение эффективности различных методов диагностики в определении токсигенности у штаммов C. diphtheria / Е.А. Алексеева, Л.А. Краева // Мат-лы Пленума Научн. совета, посвящ. 65-летию Росс. акад. мед. наук и 130-летию со дня рождения академика АМН СССР А.Н. Сысина. - 2009. - с. 113-114.
- Tseneva G. Laboratorie des infections bacteriennes respiratoires / G.Tseneva, E.Voskresenskaya, N.Kurova, L.Kraeva // Rapport dТactivite des departments de recherch EN 2008-2009. - Saint-Petersburg. - 2009. - P. 12-14.
- Краева Л.А. Влияние факторов физической и химической природы на биологические свойства коринебактерий / Краева Л.А. [и др.] // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2009 Ц № 4 (28). Ц C. 146-147.
- Ценева Г.Я. Скрининговые исследований иммунитета к дифтерии и коклюшу в Санкт-Петербурге и проблемы контроля невосприимчивости / Ценева Г.Я., Краева Л.А., Курова Н.Н. // Мат-лы междунар. конф. Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями. - СПб. Ц2010. - С. 82.
- Ценева Г.Я. Фенотипическая идентификация бактерий рода Corynebacterium / Ценева Г.Я. [и др.] // Методические рекомендации. ЦМосква. - 2010. - 76 с.
- Краева Л.А. Способ ускоренного определения токсигенности C. diphtheriae / Краева Л.А., Ценева Г.Я., Сбойчаков В.Б., Беспалова Г.И. // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2010 Ц № 4 (32).- С. 144-147.
- Ценева Г.Я. Уровень антитоксического противодифтерийного иммунитета у населения Северо-Западного Округа РФ и пути оптимизации мониторинга инфекции / Ценева Г.Я., Краева Л.А., Щедеркина Е.Е. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. Ц 2010. Ц № 5 (54). Ц С. 51-54.
- Краева Л.А. Изменение чувствительности к антибиотикам у микроорганизмов рода Corynebacterium в Санкт-Петербурге и Ленинградской области / Краева Л.А. // Здоровье населения и среда обитания. Ц 2011. Ц № 2.
- Краева Л.А. Микротехнологии в экпресс-диагностике токсигенных штаммов С.diphtheriae / Краева Л.А., Зимина Т.М., Ценева Г.Я., Соловьев А.В. // Ж-л микробиол. и эпидемиол. Ц 2011. Ц № 3. Ц С. 62-66.
- Афонина И.А. Бактерицидная активность коллоидного серебра в отношении представителей грамположительных и грамотрицательных бактерий / Афонина И.А., Краева Л.А., Ценева Г.Я. // Антибиотики и химиотерапия. Ц 2010. Ц № 9-10. Ц С. 11-13.
- Краева Л.А. Роль высокоавидных антитоксических антител в оценке невосприимчивости к дифтерийной инфекции / Краева Л.А., Ценева Г.Я., Николаева А.М., Алексеева Е.А. // Эпидемиология и инфекционные болезни. Ц 2011. Ц № 3.
- Краева Л.А. Микробиологическая характеристика клинически значимых бактерий рода Сorynebacterium (обзор) / Краева Л.А. // Сибирский Медицинский Журнал. Ц 2011. Ц № 2.
Список сокращений:
АТ-АТ | Антитоксические антитела |
ВА АТ-АТ | Высокоавидные антитоксические антитела |
ВМП | Вращающиеся магнитные поля |
ГИС | Геоинформационная система |
ИА | Индекс авидности |
ИФА | Иммуноферментный анализ |
КП | Комплексный показатель |
МЕ | Международные единицы |
МПК | Минимальная подавляющая концентрация |
НИЛИ | Низкоинтенсивное лазерное излучение |
ОСК | Образцы сыворотки крови |
ПЦР | Полимеразная цепная реакция |
РАЛ | Реакция агглютинации латекса |
РН | Реакция нейтрализации |
РНГА | Реакция непрямой гемагглютинации |
РПГА | Реакция пассивной гемагглютинации |
СИБ | Система индикаторных бумажек |
СПА | Средний показатель адгезии |
D-ВМП | Правовращающее магнитное поле |
ICS | Иммунохроматографический тест |
IgG | Иммуноглобулины класса G |
L-ВМП | евовращающее магнитное поле |
N-ориентация | Северная ориентация |
S- ориентация | Южная ориентация |
1 < 0,01 МЕ/мл - обследуемый восприимчив к дифтерии,
0,01 МЕ/мл - минимальная степень защиты,
0,01-0,09 МЕ/мл - некоторая степень защиты,
0,1-0,9 МЕ/мл - защитный уровень антител,
1,0 и > МЕ/мл - стойкая длительная невосприимчивость к дифтерии.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии