Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

БОТЕЗАТУ ИРИНА ВИКТОРОВНА

АНАЛИЗ ТРАНСРЕНАЛЬНОЙ ДНК КАК НОВЫЙ ПОДХОД К ДИАГНОСТИКЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

Специальность 14.01.12 Ц онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва Ц 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И. Давыдов)

Научный руководитель:

доктор биологических наук  Лихтенштейн Анатолий Владимирович

Официальные оппоненты:

Якубовская Марианна Геннадиевна, доктор медицинских наук, ФГБУ РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН, заведующая отделом химического канцерогенеза

Горбачева Лора Борисовна, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, главный научный сотрудник лаборатории количественной онкологии

Ведущая организация:

ФГБУ Медико-Генетический Научный Центр РАМН

Защита диссертации состоится л    2012 г. в  часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.01 при ФГБУ РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан л    2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор  Шишкин Юрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы

Канцерогенез - длительный многоступенчатый процесс накопления в клетке дефектов генов, ответственных за деление, репарацию ДНК, апоптоз и ряда других функционально значимых генов. Некоторые из этих генетических дефектов можно рассматривать в прикладном аспекте, - не как факторы патогенеза, а как опухолевые маркеры, и использовать их в диагностических целях. Значимость дефекта как маркера определяется не его функциональными последствиями, а такими факторами, как степень ассоциации с онкологической патологией (насколько часто встречается при разных опухолях), простота и надежность выявления. Детекция ДНК-маркеров может служить разным целям: как собственно диагностики, так и мониторинга роста опухоли (т.е., оценки эффективности лечения, своевременного обнаружения рецидива или метастаза), а также, в перспективе, скрининга (выявления процесса на доклинической его стадии, формирования групп риска).

Апоптоз (или программируемая клеточная гибель) - фундаментальный феномен, суть которого заключается в клеточном лсамоубийстве, индуцированном либо различными внешними стимулами, либо неразрешимыми внутренними конфликтами (например, невозможностью репарации поврежденной ДНК). В организме взрослого человека ежесуточно погибает около 1011 клеток, количество высвобождаемой во внеклеточную среду ДНК может достигать 1 г. В случае возникновения в организме опухоли некоторая часть опухолевых клеток также погибает по механизму апоптоза или некроза.

Ключевой момент клеточной гибели, знаменующий необратимость процесса, - деградация ДНК до низкомолекулярных фрагментов. Большая их часть реутилизируется в организме, меньшая - попадает в кровеносное русло (циркулирующие ДНК). Выявление в их составе специфических мутантных аллелей свидетельствует об онкологическом процессе.

Возникает вопрос относительно дальнейшей судьбы внеклеточной ДНК в кровеносном русле. По всей видимости, она подвергается дальнейшей деградации и экскретируется с мочой. В этом случае особое значение имеют размеры экскретируемых продуктов (основания, моно- или олигонуклеотиды, полинуклеотиды). Имеется в виду возможность использования мочи в качестве источника ДНК, происходящей из внутренней среды организма. Благодаря неинвазивности и легкодоступности такая лтрансренальная (т.е., преодолевшая почечный барьер) ДНК могла бы оказаться предпочтительной альтернативой циркулирующей ДНК плазмы при выявлении генетических опухолевых маркеров.

Цели и задачи исследования

Цель работы - исследование возможности использования трансренальной ДНК как нового неинвазивного способа генодиагностики рака.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. На модели экспериментальных животных исследовать:

а)        метаболическую судьбу ДНК гибнущих клеток;

б)        возможность использования трансренальной ДНК для ПЦР-анализа.

2. На модели женщин-лхимер (женщин, вынашивающих плод мужского пола, и женщин-реципиентов мужской донорской крови) оценить:

а)        проницаемость почечного барьера человека для циркулирующих полимерных фрагментов ДНК;

б)        пригодность трансренальной ДНК человека для ПЦР.

3. У онкологических больных определить возможность выявления в трансренальной ДНК опухолевых генетических маркеров.
4. В методических исследованиях:

а)        исследовать различные возможности повышения чувствительности ДНК-диагностики;

б)        разработать метод гибридизации-элонгации полинуклеотидов для вовлечения в ПЦР сверхмалых фрагментов циркулирующей ДНК;

в)        оптимизировать метод плавления ДНК для сканирования мутаций в коротких ампликонах.

Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе впервые обнаружена проницаемость почечного барьера экспериментальных животных и человека для фрагментированной ДНК гибнущих клеток. Показано, что эта ДНК, названная нами трансренальной, т.е. преодолевшей почечный барьер, способна служить матрицей в ПЦР. При исследовании мочи больных с опухолями поджелудочной железы и толстого кишечника обнаружены мутантные последовательности онкогена K-RAS. Впервые показана принципиальная возможность использования трансренальной ДНК для диагностики злокачественных новообразований.

Разработан неинвазивный метод генодиагностики рака посредством анализа трансренальной ДНК. Его премущества по сравнению с анализом ДНК плазмы: неинвазивный характер, возможность получения больших количеств биопробы, отсутствие сильных ингибиторов ПЦР.

Разработан оригинальный метод гибридизации-элонгации фрагментированных ДНК, составляющих основную массу циркулирующей ДНК. По данным ПЦР в реальном времени, этот метод существенно повышает чувствительность генодиагностического анализа.

Оптимизирован лоткрытый формат плавления ДНК. Этот метод позволяет, во-первых, применять для мутационного сканирования стандартные амплификаторы для ПЦР-РВ вместо дорогостоящего высокотехнологичного оборудования, используемого для анализа плавления ДНК с высоким разрешением, и, во-вторых, повысить чувствительность детекции мутанций гена K-RAS, часто обнаруживаемого в опухолевой ткани. Выявление мутаций этого онкогена имеет большое значение, поскольку определяет прогноз заболевания и стратегию лечения больных колоректальным раком и немелкоклеточным раком легких. Чувствительность разработанного метода превышает таковую секвенирования по Сэнгеру, его применение должно способствовать снижению числа ложноотрицательных результатов тестирования мутантного гена K-RAS и повышению эффективности таргетной терапии.

Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована 26 декабря 2011 года на совместной научной конференции лабораторий биохимии опухолей, онкогеномики, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН.

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 12 статей опубликованы в журналах, рекоменованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы и список литературы, который содержит 211 источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Проницаемость почечного барьера животных для циркулирующей ДНК исследовали в экспериментах на мышах линии С3НА и крысах линии Wistar. Животным вводили подкожно [32P]-меченную ДНК или клетки лимфомы человека Raji (меченные [3H]-тимидином или немеченные), предварительно подвергнутые -облучению для индукции апоптоза. Трансренальную ДНК грызунов анализировали методами электрофореза и ПЦР.

Проницаемость почечного барьера человека для циркулирующей ДНК определяли на модели женщин-лхимер, т.е. женщин, в организме которых присутствуют клетки мужчин, содержащие Y хромосому. Методом ПЦР исследовали трансренальную ДНК беременных женщин (55 образцов мочи были получены в родильном отделении Городской больницы № 7, Москва) или реципиентов крови донора-мужчины (9 образцов мочи были получены в абдоминальном отделении НИИ клинической онкологии ФГБУ РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН).

Возможность выявления опухолевых генетических маркеров в трансренальной ДНК онкологических больных исследовали на клиническом материале, полученном в НИИ клинической онкологии ФГБУ РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН. Коллекция состояла из образцов операционного материала (опухолевой и прилежащей к ней нормальной ткани), крови и мочи от 17 больных раком толстой кишки, 20 больных раком яичников, 8 больных раком поджелудочной железы, а также парафиновых блоков от 20 больных раком толстой кишки.

В работе были использованы следующие методы исследования: выделение ДНК из образцов тканей и мочи депротеинизацией фенолом и гуанидинизотиоцианатным методом, электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в гелях агарозы и полиакриламида, получение радиоактивно меченной ДНК, различные варианты ПЦР: стандартная, лгнездная, лобогащенная (реакции проводили на приборе Eppendorf MasterCycler, Германия), ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и плавление ампликонов (приборы Bio-Rad iQ5 и CFX96, США), определение концентрации ДНК спектрофотометрическим и флуориметрическим методами.

Выявление мутаций онкогена K-RAS проводили методами: секвенирования по Сэнгеру, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), HRMA (High Resolution Melting Analysis).

В ходе выполнения диссертационного исследования были разработаны новые методические приемы, повышающие чувствительность ДНК-диагностики: лшаблон-опосредованная ПЦР, гибридизация-элонгация фрагментированной ДНК, лоткрытый формат плавления ампликонов.

Результаты и обсуждение

1. Трансренальная ДНК: обнаружение и использование

1.1. Эксперименты на животных

На первом этапе работы было проведено исследование метаболической судьбы ДНК гибнущих в организме клеток. В экспериментах на лабораторных животных с введением им подкожно радиоактивно меченной ДНК было установлено: преобладающая часть экзогенной ДНК деградирует до мономеров и реутилизируется в тканях организма, небольшая часть избегает полного распада и экскретируется с мочой в виде низкомолекулярных фрагментов. Количественный анализ экскреции экзогенной ДНК показал: небольшая доля введенной радиоактивной метки (0,06%) выводится из организма животного в виде кислотонерастворимых (т.е., относительно полимерных) продуктов (табл. 1).

Таким образом, впервые показана проницаемость почечного барьера животных для низкомолекулярных фрагментов ДНК. Результаты этих экспериментов определили направление дальнейших исследований настоящей работы.

Таблица 1. Экскреция с мочой продуктов распада экзогенной [32P]ДНК

Радиоактивность (% от введенной метки)	1 сут	2 сут	3 сут	Всего
Общая	2,9%	0,3%	0,02%	3,2%
Кислотонерастворимая	0,06%	Н/О	Н/О	0,06%

Крысам вводили [32P]-меченную ДНК фага λ, мочу собирали 3 сут и определяли общую и кислотонерастворимую экскретированную радиоактивность. Н/О - радиоактивность не определяется.

Анализ размеров экскретируемых продуктов электрофорезом в агарозном геле с последующей авторадиографией показал, что основную их долю составляют фрагменты мононуклеосомной величины (примерно 160 п.о.) (рис. 1).

Рис. 1. Электрофорез трансренальной ДНК мыши

Мышам вводили [32P]-меченную ДНК фага λ, мочу собирали 3 сут, ДНК выделяли и анализировали электрофорезом в агарозном геле. Дорожки 1 и 2 - независимые эксперименты. A Цокрашивание бромистым этидием; B - авторадиография.

Тот факт, что трансренальная ДНК имеет относительно большие размеры, делает правомерным вопрос о возможности ее использования в ПЦР с целью генетического анализа. Для получения ответа на поставленный вопрос требовалось установить, сохраняются ли матричные свойства экскретируемой ДНК. Кроме того, в состав ДНК мочи могут входить как трансренальные (преодолевшие почечный барьер) полинуклеотиды, так и фрагменты, происходящие из гибнущих клеток мочевой системы организма (почек, мочеточников, мочевого пузыря). Для выявления методом ПЦР в ДНК мочи трансренальных последовательностей необходимо, чтобы они генетически отличались от ДНК организма. В связи с этим в следующей серии опытов мышам вводили клетки лимфомы человека Raji, предварительно подвергнутые γ-облучению для индукции апоптоза. В ДНК мочи мыши методом ПЦР выявляли специфические для человека (и отсутствующие у грызунов) Alu-последовательности (рис. 2). Последние действительно были обнаружены.

Рис. 2. Выявление методом ПЦР трансренальной ДНК

Облученные клетки лимфомы человека Raji инокулировали мышам, мочу собирали 3 сут, ДНК выделяли и анализировали методом ПЦР с праймерами к специфическим для человека повторяющимся последовательностям (Alu-опосредованная ПЦР). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле. Дорожки: 1 - ДНК мочи контрольной мыши; 2 - ДНК клеток Raji; 3 - ДНК мочи мыши, которой вводили клетки Raji.

Таким образом, впервые было получено свидетельство того, что полимерные ДНК гибнущих клеток способны преодолевать почечный барьер животного, сохраняя при этом свои матричные свойства для ПЦР. Данное наблюдение открывает принципиальную возможность использования трансренальной ДНК для генетического анализа.

1.2. Исследование женщин-лхимер

Целью следующего этапа работы было выяснение того, насколько данные, полученные на экспериментальных животных, применимы для человека. Иными словами, присутствуют ли в моче человека преодолевшие почечный барьер фрагменты ДНК, пригодные для ПЦР.

Поскольку использование радиоизотопного метода применительно к человеку невозможно, о проницаемости его почечного барьера для полимерных ДНК можно было судить косвенным образом. Для выявления методом ПЦР в ДНК мочи трансренальных фрагментов, последние должны генетически отличаться от ДНК клеток мочевой системы. В связи с этим была выбрана модель женщин-лхимер, т.е. женщин, в организме которых присутствуют клетки мужчин, содержащие Y хромосому. Таковыми являются женщины, беременные плодом мужского пола, а также женщины, которым по медицинским показаниям перелили кровь (в том случае, если донором оказался мужчина). Обнаружение в ДНК мочи таких женщин нуклеотидной последовательности, специфической для Y хромосомы, явилось бы свидетельством проницаемости почечного барьера для полимерных ДНК, пригодных для генетического анализа.

На рис. 3 представлены результаты опытов, демонстрирующих присутствие в моче человека трансренальной ДНК. Спустя 10 сут после переливания 9 женщинам 250 мл крови донора-мужчины в моче пяти из них детектировано присутствие Y-специфических последовательностей.

Рис. 3. Выявление методом ПЦР Y-специфической последовательности в ДНК мочи женщин после трансфузии крови донора-мужчины

Дорожки: 1Ц4 - моча женщин (10 сут после трансфузии 250 мл крови); 5 - положительный контроль (1 пг ДНК лимфоцитов мужчины); 6 - отрицательный контроль (солевой раствор, прошедший все этапы выделения и анализа ДНК).

В следующих экспериментах выявляли присутствие Y-специфических последовательностей у беременных женщин. При исследовании 55 образцов ДНК мочи женщин пол ребенка был верно определен в ~80% случаев. Результаты типичного эксперимента представлены на рис. 4.

Рис. 4. Выявление методом ПЦР Y-специфической последовательности в ДНК мочи женщин, беременных плодом мужского пола

Дорожки: 1 - моча женщины, беременной девочкой; 2, 3, 4, 5 - моча беременных мальчиками женщин. А, В и С - три независимых эксперимента, в которых сопоставлены разные способы выделения трансренальной ДНК.

Таким образом, впервые установлена проницаемость почечного барьера человека по отношению к фрагментам ДНК, пригодным для ПЦР.

1.3. Трансренальная ДНК как объект генодиагностики

Определение возможности выявления в трансренальной ДНК онкологических больных опухолевых маркеров проведено на модели онкогена K-RAS (кодон 12 экзона 2). Мутации выявляли методом RFLP (лобогащенная ПЦР), позволяющим детектировать мутантные последовательности в условиях избытка последовательностей дикого типа [Kopreski et al., 1997]. При реализации этого метода создается искусственный сайт рестрикции в ампликоне дикого типа, отсутствующий (из-за нуклеотидной замены) в ампликоне с мутацией. Это создает возможность промежуточного этапа рестрикции, приводящего к снижению содержания нормальных аллелей гена K-RAS и относительному обогащению мутантных аллелей. Обработка продуктов второго раунда ПЦР рестриктазой BstNI позволяет идентифицировать аллели дикого типа и мутантные (по присутствию фрагментов размером 42 п.о. и 71 п.о., соответственно).

Проведено исследование больных раком толстой кишки и поджелудочной железы (в опухолях этих локализаций мутации гена K-RAS встречаются в ~40% и ~90% случаев, соответственно). У больных раком поджелудочной железы (IV стадия) мутации K-RAS обнаружены в ДНК мочи в 5 случаях из 8. Результаты типичного эксперимента приведены на рис. 5.

Рис. 5. Выявление мутаций гена K-RAS в трансренальной ДНК

больных раком поджелудочной железы методом RFLP

Цифрами обозначены больные. Ампликоны, интактные (-) и обработанные рестриктазой BstNI (+), разделяли электрофорезом в ПААГ. Положение интактного ампликона и аллелей мутантного и дикого типа указано стрелками.

Рис. 6. Выявление мутаций гена K-RAS у больных

раком толстой кишки методом RFLP

А и В - два больных раком толстой кишки.1 - ДНК нормальной (окружающей опухоль) ткани; 2 - ДНК опухолевой ткани; 3 - трансренальная ДНК (значки - и + обозначают ампликоны, не обработанные и обработанные рестриктазой BstNI). Положение интактного ампликона, а также аллелей мутантного и дикого типа указано стрелками.

У 7 больных раком толстой кишки мы имели возможность исследовать по 3 образца у каждого пациента: фрагмент опухоли, окружающую ее морфологически не измененную нормальную ткань и мочу (пробу получали за 24 часа до операции). Мутации онкогена обнаружены в опухолевой ткани 5 больных, у 4 из которых мутации присутствовали и в трансренальной ДНК (рис. 6). У здоровых доноров и больных, в опухолевой ткани которых не выявлены мутации, их не было и в трансренальной ДНК.

Таким образом, впервые в ДНК мочи онкологических больных обнаружено присутствие мутантного гена K-RAS, происходящего из опухолевого очага. Тем самым продемонстрирована принципиальная возможность использования трансренальной ДНК для выявления растущей в организме опухоли.

Вместе с тем, анализ данных литературы о диагностической ценности циркулирующих ДНК, а также критическая оценка собственных результатов свидетельствуют о необходимости совершенствования соответствующих методических приемов как первостепенной задаче генодиагностики рака, поскольку недостаточно высокая чувствительность существующих методов детекции имеет следствием большую долю ложноотрицательных результатов.

2. Новые методические подходы

2.1. Шаблон-опосредованная ПЦР

В исследованиях опухолевого роста одной из наиболее трудных проблем является необходимость выявления генных мутаций в условиях избытка аллелей дикого типа. Это обстоятельство затрудняет обнаружение мутантных форм. Объектом такого анализа часто является онкоген K-RAS, мутации которого (кодон 12) обнаружены во многих опухолях. Эффективным способом снижения содержания нормальных аллелей K-RAS является т.н. лобогащенная ПЦР (см. выше). Однако, данный метод проблему конкуренции полностью не решает, поскольку избыток аллелей дикого типа в исходной пробе сохраняется неизменным (рестрикционному расщеплению подвержены лишь продукты самой реакции).

Ранее в нашей лаборатории был разработан способ избирательного расщепления аллелей дикого типа гена K-RAS в исходной пробе ДНК, в значительной степени устраняющий, в сочетании с последующей лобогащенной ПЦР, существующие проблемы. Суть подхода заключается в применении "шаблона", 16-нуклеотидной последовательности дикого типа, включающей последовательность кодона 12 и непосредственно перед ним расположенного сайта рестрикции AluI (рис. 7). Отжиг денатурированной ДНК с "шаблоном" приводит к восстановлению полноценного сайта рестрикции AluI в случае последовательности дикого типа, тогда как в случае мутантного аллеля сайт исчезает из-за неспаренного основания в кодоне 12 (рестриктазы обычно требуют фланкирования сайта узнавания 6 парами оснований с обеих сторон). Двухэтапная обработка ДНК рестриктазой AluI (вначале гибрида шаблона с одной нитью, а затем с другой) при 45oC приводит к преимущественному расщеплению аллелей дикого типа и, соответственно, значительному обогащению мутантных аллелей.

Эффективность этого приема зависит, как было обнаружено, от размера фрагментов ДНК исходной пробы: чем более полимерна ДНК, тем хуже оказывалась дискриминация нормальных и мутантных аллелей. При исследовании этого феномена были получены данные, свидетельствующие о том, что лшаблоны не могут гибридизоваться с денатурированной высокополимерной ДНК из-за ее выраженной вторичной структуры (повышенной способности к внутри- и межмолекулярным взаимодействиям, к образованию лшпилек). Исключение лшаблонов из комплементарных взаимодействий и восстановление сайта рестрикции AluI в ренатурированной ДНК приводило к отсутствию лшаблон-опосредованной дискриминации нормальных и мутантных аллелей. Предварительная обработка образца геномной ДНК рестриктазой HaeIII, фрагментирующей препарат и снижающей тем самым возможность внутри- и межмолекулярных взаимодействий, но не затрагивающей ампликон K-RAS, устраняла это нежелательное явление.

Рис. 7. Схема лшаблон-опосредованного обогащения мутантного K-RAS

А - схематическое представление анализируемого участка, включающего экзон 2 с кодоном 12, сайты рестрикции HaeIII и AluI (последний непосредственно предшествует кодону 12), а также sense и antisense праймеры, используемые для амплификации фрагмента длиной 157 п.о.

В - комплементарное взаимодействие денатурированной ДНК дикого типа (+ нить) с шаблоном длиной 16 нуклеотидов (- нить) восстанавливает сайт рестрикции AluI, благодаря чему становится возможным ферментативное расщепление последовательности дикого типа. Мутация в кодоне 12 создает при гибридизации с шаблоном неспаренное основание в участке связывания фермента, что препятствует расщеплению мутантного аллеля.

В результате лшаблон-опосредованной ПЦР в описанном варианте было достигнуто не только значительное обогащение мутантных аллелей, но и повышение на 10-30% эффективности самой амплификации. Усиление амплификации также обусловлено фрагментацией ДНК и меньшей возможностью внутри- и межмолекулярных взаимодействий, что должно облегчать праймерам доступ к комплементарным участкам матрицы. На рис. 8 представлена количественная оценка лшаблон-опосредованной дискриминации нормальных и мутантных аллелей на примере образцов ДНК, полученных из нормальной (дорожки 1-4) и опухолевой (дорожки 5-8) ткани. Судя по результатам денситометрии (программа TotalLab), предложенным нами способом удаляется ~80% аллелей дикого типа.

Рис. 8. Шаблон-опосредованное обогащение мутантных аллелей

ДНК нормальной (дорожки 1-4) и опухолевой (дорожки 5-8) ткани фрагментировали рестриктазой HaeIII, после чего амплифицировали либо непосредственно (контроль - дорожки 1,2 и 5,6), либо после лшаблон-опосредованного обогащения (дорожки 3,4 и 7,8). Под рисунком - денситограммы дорожек 5 и 8, свидетельствующие о значительном обогащении мутантного аллеля в анализируемой ДНК (пик 1 - мутантная полоса; пик 2 - нормальная полоса).

2.2. Метод гибридизации-элонгации фрагментов ДНК

Другой проблемой, существенно ограничивающей чувствительность анализа циркулирующей ДНК, является ее фрагментация присутствующими в биологических жидкостях нуклеазами. Фрагменты меньшего размера, чем ампликон, не участвуют в ПЦР, и лишь малая доля фрагментов, равных по величине ампликону, может быть матрицей из-за несовпадения с лрамкой, задаваемой праймерами. Матрицами могут служить лишь те молекулы, размер которых в несколько раз превышает размер ампликона. Таких фрагментов в образце циркулирующей ДНК может оказаться немного или не оказаться вовсе.

Один из способов преодоления этой проблемы - синтез максимально коротких ампликонов, что, однако, не всегда возможно. Другой способ, разрабатываемый нами, состоит в удлинении, элонгации 3-концов коротких фрагментов ДНК для вовлечения их в ПЦР.

Рис. 9. Этапы гибридизационной селекции-элонгации фрагментов ДНК

A - конструкция избирательно расщепляемой матрицы, предназначенной лзахватывать специфические последовательности из денатурированного образца циркулирующей ДНК: на магнитной грануле Streptavidin-Dynal иммобилизована однонитевая ДНК (ее 3-конец биотинилирован, а тимидин в ее составе заменен уридином).

B - гибридизация с короткими специфическими последовательностями K-RAS.

C - элонгация коротких фрагментов (перенос магнитных гранул в среду с Taq-полимеразой и дезоксинуклеозидтрифосфатами; инкубация при 43оС).

D - расщепление матрицы (обработка образца урацил ДНК гликозилазой во избежание ложноположительных результатов ПЦР).

E - амплификация элонгированных фрагментов.

При реализации этого подхода была синтезирована избирательно расщепляемая матрица - однонитевая ДНК, представляющая собой (минус)-нить ампликона K-RAS дикого типа, биотинилированная на 3-конце и содержащая в своем составе уридин вместо тимидина. Эту конструкцию иммобилизовали на магнитных гранулах Streptavidin-Dynal и использовали для гибридизационной селекции последовательностей-лмишеней K-RAS, присутствующих в образце исследуемой предварительно денатурированной ДНК. Гибридизованные короткие фрагменты, играющие в данной ситуации роль праймеров при амплификации, элонгировали Taq-полимеразой, а матрицу затем расщепляли урацил ДНК гликозилазой. Модифицированные таким образом специфические последовательности амплифицировали в ПЦР (рис. 9).

Рис. 10. Характеристика методом ПЦР-РВ эффективности

гибридизации-элонгации коротких фрагментов ДНК

Ампликон K-RAS размером 87 п.о. синтезировали в ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green I. Кривые амплификации: 1 и 2 - искусственно синтезированный фрагмент K-RAS размером 25 оснований (положительный контроль) до и после элонгации, соответственно; 3 и 4 - трансренальная ДНК четырех онкологических больных до и после элонгации, соответственно.

Демонстрация эффективности этого подхода применительно к трансренальной ДНК представлена на рис. 10. Судя по результатам ПЦР-РВ, предварительная процедура гибридизации-элонгации во много раз повышает чувствительность анализа (сдвиг порогового цикла Сt на 5 единиц влево соответствует увеличению исходного числа копий последовательностей-лмишеней в образце в ~30 раз).

2.3. Открытый формат плавления ДНК

Одним из наиболее эффективных способов выявления генных полиморфизмов и мутаций является разработанный несколько лет назад физический метод плавления ампликонов HRMA (High Resolution Melting Analysis) [Erali et al., 2010]. Его основой является зависимость температуры плавления (Tm) двойной спирали ДНК от ее длины, содержания GC пар, нуклеотидной последовательности и степени комплементарности нитей. О присутствии неспаренных оснований в гетеродуплексах ДНК, образующихся в ходе ПЦР, и, следовательно, о наличии мутаций в них свидетельствуют характерные изменения кривых плавления (гетеродуплексы, менее стабильные, чем гомодуплексы, плавятся при более низкой температуре). Благодаря появлению в последние годы лнасыщающих флуоресцентных красителей ДНК, не ингибирующих ПЦР даже в высоких концентрациях, а также приборов ПЦР, снабженных модулем плавления ДНК высокого разрешения и соответствующим программным обеспечением, оказалось возможным выявлять полиморфизмы протяженных (до 1000 п.о.) последовательностей ДНК [Montgomery et al., 2007].

Одним из главных преимуществ HRMA является так называемый лзакрытый формат (лclosed tube format), т.е., плавление ДНК происходит непосредственно после ПЦР, без каких-либо дополнительных манипуляций. Закрытый формат обеспечивает высокую производительность метода.

У HRMA есть и недостатки. Во-первых, широкое его применение ограничено высокой стоимостью соответствующего оборудования. Во-вторых, УзакрытыйФ формат делает HRMA лзаложником условий предшествующей ПЦР. По этой причине HRMA, крайне чувствительный к солевому составу среды плавления, почти всегда реализуется в неоптимальных условиях (в среде ПЦР). В-третьих, среда ПЦР содержит Трис-буфер, pH которого зависит от температуры и меняется в процессе анализа, что влияет на стабильность ДНК.

Таким образом, можно заключить, что хотя HRMA весьма эффективен в решении многих экспериментальных и клинических задач, для реализации всего его потенциала (и, в частности, максимальной чувствительности) необходим отказ от лзакрытого формата. Плавление ампликонов следует проводить в лоткрытом формате, предполагающем промежуточную между ПЦР и плавлением процедуру оптимизации условий среды.

Необходимым этапом определения этих условий было исследование факторов, влияющих на плавление ДНК: концентрации красителя, ионного состава среды, величины рН, размера анализируемого ампликона, положения неспаренного основания в ампликоне, величины фона. В качестве объекта исследования был выбран онкоген K-RAS как наиболее часто мутирующий во многих опухолях человека (выявление этих мутаций может определять стратегию лечения больных колоректальным раком и немелкоклеточным раком легких [Deschoolmeester et al., 2010]. Стремясь сделать метод плавления ДНК доступным клиническим лабораториям, мы разрабатывали его лоткрытый формат применительно к стандартному (не имеющему модуля HRMA) прибору ПЦР-РВ Bio-Rad iQ5 и общеупотребительному красителю ДНК SYBR Green I.

В результате этих исследований был разработан протокол лоткрытого формата плавления, состоящий из двух этапов: а) продукты ПЦР, включающие два искусственно созданных сайта рестрикции HaeIII, обрабатывали рестриктазой HaeIII 60 мин при 37оС (цель - укорочение ампликона: чем короче фрагмент ДНК, тем выше вероятность обнаружения мутации); б) инкубационную среду разводили в 4 раза стандартным раствором: 60 мM Na-фосфатный буфер, pH 7 или 8, 4,5 мM Na-ЭДТА, 0,5-кратный SYBR Green I (цель - снизить в растворе концентрацию свободного Mg2+, стабилизировать и довести до оптимального значение рН, повысить до необходимой концентрацию SYBR Green I). В необходимых случаях перед рестрикцией снижали фон иммобилизацией биотинилированных ампликонов на магнитных гранулах. Чувствительность метода оценивали посредством последовательных разведений ДНК клеток SW480 (содержат 1 мутантный аллель K-RAS) в избытке ДНК дикого типа (рис.11). Предел обнаружения мутантных аллелей оказался ~5%, что сопоставимо с аналогичным показателем HRMA [Deschoolmeester et al., 2010].

Рис. 11. Чувствительность лоткрытого формата плавления ДНК

Мутантную ДНК из клеток SW480 серийно разводили в ДНК дикого типа. Содержание мутантной ДНК представлено в процентной концентрации к тотальной ДНК.

Применение метода плавления ДНК в нашей модификации позволяет констатировать наличие или отсутствие мутации кодонов 12 и 13 онкогена K-RAS в образце ДНК, информации о типе мутации метод обычно не дает. О наличии мутации свидетельствует искажение формы пика плавления. Было исследовано 10 образцов ДНК опухолевой ткани больных раком толстой кишки. Присутствие мутаций в 5 образцах было верифицировано методами RFLP и секвенирования по Сэнгеру. Результаты эксперимента представлены на рис. 12.

Рис. 12. Выявление мутаций K-RAS в клинических образцах

Образцы ДНК опухолевой ткани 10 случайно отобранных больных раком толстой кишки исследовали методом плавления ДНК в лоткрытом формате. Дополнительный пик слева от основного свидетельствует о присутствии гетеродуплексов и, следовательно, о наличии мутации в 5 образцах.

Мы тестировали далее мутации K-RAS в 20 образцах ДНК парафиновых срезов опухолей толстой кишки (образцы ДНК были любезно предоставлены проф. А.И. Карселадзе и А.М. Строгановой, лаборатория молекулярной патологии ФГБУ РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН). ДНК  исследовали  тремя  независимыми методами: RFLP, секвенирования по Сэнгеру и плавления ДНК в предложенном нами варианте (табл. 2). Секвенирование по Сэнгеру (общепринятый стандарт в современной генодиагностике) выявило мутации в 13 образцах из 20: кодона 12 - в 10 (методом RFLP подтверждено присутствие мутаций во всех образцах, за исключением #19, где из-за низкого, по-видимому, качества ДНК не прошла амплификация) и кодона 13 - в 3 (RFLP состояние этого кодона не тестирует).

Плавление ДНК не только выявило все образцы с мутациями, идентифицированными другими методами, но и обнаружило дополнительно еще четыре лподозрительных образца (обозначены в табл. 2 вопросительными знаками). У них искажение формы пика плавления было выражено не столь явно, как у лнесомненных мутантов, что, по-видимому, свидетельствует об относительно низком содержании мутантных аллелей в тотальном препарате ДНК. Это предположение подтвердилось в дополнительном углубленном исследовании лподозрительных образцов методом HRMA (прибор CFX96, снабженный модулем HRMA, краситель EvaGreen, укороченный ампликон, удаление фона, применение программного обеспечения HRMA).

Таким образом, наши данные в согласии с данным литературы [Vossen et al., 2009] свидетельствуют о более высокой чувствительности метода плавления ДНК по сравнению с секвенированием по Сэнгеру (стандартным методом в клинических исследованиях). Недостаточная чувствительность последнего (предел обнаружения мутантных аллелей - 20-30%) приводит к высокой доле ложноотрицательных результатов и, как следствие, неверному выбору стратегии лечения больных раком легких и толстой кишки [Querings et al., 2011].

Предлагаемый нами вариант плавления ампликонов: а) повышает чувствительность мутационного сканирования, что способствует снижению доли ложноотрицательных результатов, б) применим в клинических лабораториях, поскольку адаптирован к стандартным приборам ПЦР-РВ (без модуля HRMA), менее дорогим и более широко распространенным.

Открытый формат предложен нами для сканирования мутаций гена K-RAS, но аналогичный подход может найти применение и в других подобных ситуациях. Простота, высокая производительность и чувствительность метода плавления ДНК делают его весьма привлекательным для применения в клинической генодиагностике.

Таблица 2. Сопоставление методов выявления мутаций K-RAS

Образцы ДНК	Патология	Мутации
		Секвенирование	RFLP	Плавление ДНК
1	Рак прямой кишки	C12. GGT>GTT	+	+
2	Рак прямой кишки	-	-	?
3	Рак прямой кишки	C12. GGT>GAT	+	+
4	Рак сигмовидной кишки	C12. GGT>GAT	+	+
5	Рак толстой кишки	-	-	?
6	Рак ободочной кишки	C13. GGC>GAC	-	+
7	Рак сигмовидной кишки	C12. GGT>GCT	+	+
8	Рак прямой кишки	-	-	?
9	Рак прямой кишки	C13. GGC>TGC	-	+
10	Метастаз рака кишки в печень	C12. GGT>GTT	+	+
11	Рак сигмовидной кишки	-	-	-
12	Рак прямой кишки	-	-	?
13	Рак сигмовидной кишки	C12. GGT>GTT	+	+
14	Рак толстой кишки	C13. GGC>GAC	-	+
15	Рак толстой кишки	C12. GGT>GTT	+	+
16	Рак толстой кишки	-	-	-
17	Рак прямой кишки	-	-	-
18	Рак толстой кишки	C12. GGT>GAT	+	+
19	Рак слепой кишки	C12. GGT>GAT	н.о.	+
20	Рак сигмовидной кишки	C12. GGT>TGT	+	+

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что фрагменты циркулирующей ДНК мононуклеосомного размера способны преодолевать почечный барьер экспериментальных животных и человека.
2. Впервые показано, что трансренальная ДНК пригодна для неинвазивного генетического анализа методом ПЦР.
3. Впервые в трансренальной ДНК онкологических больных обнаружены опухолевые генетические маркеры.
4. Разработан метод лшаблон-опосредованной ПЦР, позволяющий избирательно расщеплять аллели дикого типа в клинических пробах ДНК для обогащения мутантного аллеля гена K-RAS. Показано, что предварительная рестриктазная обработка высокополимерной ДНК повышает эффективность ПЦР-амплификации и дискриминации нормальных и мутантных аллелей.
5. Разработан метод гибридизации-элонгации фрагментов циркулирующей ДНК, позволяющий вовлекать в ПЦР-анализ короткие последовательности-мишени, что повышает чувствительность ДНК-диагностики опухолевого роста.
6. Разработан лоткрытый формат плавления ампликонов для сканирования мутаций гена K-RAS. Метод позволяет повысить чувствительность выявления мутантных аллелей, а также использовать для плавления в режиме высокого разрешения (High Resolution Melting Analysis, HRMA) как дорогостоящие приборы с модулем HRMA, так и стандартные приборы ПЦР-РВ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1.        Шелепов, В.П. Возможность использования полимерной ДНК, происходящей из гибнущих в организме клеток и проходящей через почечный барьер, для генетического анализа / В.П. Шелепов, С.Л. Арсенин, И.В. Ботезату, Р.П. Алехина, Г.И. Потапова, О.В. Горбунов, О.С. Мелконян,
С.Р. Уманский, А.В. Лихтенштейн // Вестник ВОН - РАМН. Ч 1997. Ч
№ 4. Ч C. 13-17.

2.        Моляка, Ю.К. Анализ экскретируемой из организма ДНК как подход к выявлению растущей в организме опухоли / Ю.К. Моляка, И.В. Ботезату, Г.И. Потапова, И.С. Косорукова, О.И. Сердюк, Р.П. Алехина, В.П. Шелепов, В.С. Ананьев, Е.В. Огородникова, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, В.И. Кныш, А.В. Лихтенштейн // Вестник РАМН. Ч 2000. Ч № 7. Ч
C. 24-27.

3.        Botezatu, I. Genetic Analysis of DNA Excreted in Urine: A New Approach for Detecting Specific Genomic DNA Sequences from Cells Dying in an Organism / I. Botezatu, O. Serdyuk, G. Potapova, V. Shelepov, R. Alechina, Y. Molyaka, V. AnanТev, I. Bazin, A. Garin, M. Narimanov, V. Knysh, H. Melkonyan,
S. Umansky, A. Lichtenstein // Clinical Chemistry. Ч 2000. Ч Vol. 46, № 8. Ч P. 1078-1084.

4.        Сердюк, О.И. Детекция мутантных последовательностей K-RAS в моче онкологических больных / О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов,
Г.И. Потапова, Р.П. Алехина, Ю.К. Моляка, В.С. Ананьев, В.И. Кныш,
О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, А.В. Лихтенштейн // Бюллетень эксп. биол. мед. Ч 2001. Ч Т. 131, № 3. Ч C. 335-337.

5.        Потапова, Г.И. Анализ трансренальной ДНК: новый подход к диагностике рака / Г.И. Потапова, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов,
Р.П. Алехина, И.С. Базин, М.Н. Нариманов, А.М. Гарин, В.С. Ананьев,
В.И. Кныш, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, А.В. Лихтенштейн // Вопросы биол. мед. фарм. химии. Ч 2002. Ч № 2. Ч C. 24-27.

6.        Ботезату, И.В. Рестриктазное расщепление ДНК усиливает последующую полимеразную цепную реакцию и способствует дискриминации нормальных и мутантных аллелей K-RAS / И.В. Ботезату, О.И. Сердюк, Г.И. Потапова, В.П. Шелепов, А.В. Лихтенштейн // Доклады Академии наук. Ч 2003. Ч Т. 393, № 4. Ч C. 547-550.

7.        Su, Y.-H. Transrenal DNA as a Diagnostic Tool. Important Technical Notes / Y.-H. Su, M. Wang, T. Block, O. Landt, I. Botezatu, O. Serdyuk,
A. Lichtenstein, H. Melkonyan, L.D. Tomei, S. Umansky // Annals New York Academy of Sciences. Ч 2004. Ч Vol. 1022. Ч P. 81-89.

8.        Ботезату, И.В. Детекция генных мутаций в биопробах онкологических больных: сопоставление сканирующих методов NIRCA и SSCP / И.В. Ботезату, В.Н. Кондратова, В.Л. Черкес, Ю.А. Барсуков, В.Э. Алиев,
В.П. Шелепов, А.В. Лихтенштейн // Вопросы онкологии. Ч 2007. Ч Т. 53, №5. Ч C. 549-553.

9.        Кондратова, В.Н. Изотахофорез нуклеиновых кислот в трубках агарозного геля / В.Н. Кондратова, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов, А.В. Лихтенштейн // Биохимия. Ч 2009. Ч Т. 74. Ч C. 1577-1581.

10.        Kondratova, V.N. Tube gel isotachophoresis: a method for quantitative isolation of nucleic acids from diluted solution / V.N. Kondratova, I.V. Botezatu,
V.P. Shelepov, A.V. Lichtenstein // Analytical Biochemistry. Ч 2011. Ч
Vol. 408, № 2. Ч P. 304-308.

11.        Botezatu, I.V. DNA melting analysis: Application of the Уopen tubeФ format for detection of mutant K-Ras / I.V. Botezatu, V.N. Kondratova, V.P. Shelepov,
A.V. Lichtenstein // Analytical Biochemistry. Ч 2011. Ч Vol. 419, N 2. Ч
P. 302-308.

12.        Ботезату, И.В. Сканирование мутаций в коротких ампликонах: оптимизация метода плавления ДНК / И.В. Ботезату, К.И. Жордания,
А.И. Карселадзе, А.М. Строганова, В.Н. Кондратова, В.П. Шелепов,
М.В. Телков, А.В. Лихтенштейн // Молекулярная биология. Ч 2012. Ч
Т. 46, №3. Ч C. 1-8.

Тезисы докладов

1.        Сердюк, О.И. Выявление мутантных последовательностей K-RAS в ДНК мочи онкологических больных / О.И. Сердюк, В.П. Шелепов, И.В. Ботезату, Г.И. Потапова, Р.П. Алехина, В.С. Ананьев, И.С. Базин, М.Н. Нариманов, Ю.К. Моляка, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, В.И. Кныш, А.М. Гарин, А.В. Лихтенштейн // Экспериментальная онкология. Ч 2000. Ч Т. 22. Ч С. 6.

2.        Lichtenstein, A. Genetic Analysis of DNA Excreted from an organism: A New Approach to Cancer Diagnostics / A. Lichtenstein, I. Botezatu, O. Serdyuk,
G. Potapova, V. Shelepov, A. Garin, V. Knysh, V. AnanТev, I. Bazin, M. Narimanov, H. Melkonyan, S. Umansky // 18th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo-Norway. International J. Cancer. Abstract book. Ч 2002. Ч (Suppl. 13) Ч P. 361.

3.        Лихтенштейн, А.В. Специфические дефекты ДНК: новый класс маркеров опухолевого роста / А.В. Лихтенштейн, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату,
Г.И. Потапова, В.П. Шелепов // Сборник трудов VI ежегодной российской онкологической конференции. Москва. Издательская группа РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН. Ч 2002. Ч С. 97-99.

4.        Потапова, Г.И. Обнаружение мутантного аллеля K-RAS в ДНК мочи больных раком поджелудочной железы и толстого кишечника
/ Г.И. Потапова, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов, И.С. Базин,
М.Н. Нариманов, А.М. Гарин, В.С. Ананьев, В.И. Кныш, А.В. Лихтенштейн // Сборник трудов VI ежегодной российской онкологической конференции. Москва. Издательская группа РОН - им. Н.Н.Блохина РАМН. Ч 2002. Ч C. 161.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине