Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
ШУШКОВА Ирина Геннадьевна
АНАЛИТИЧЕСКАЯ ВАЛИДАЦИЯ И ОЦЕНКА ПРИМЕНИМОСТИ ОПТИМИЗИРОВАННОГО ПРОТОКОЛА ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ
14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Саратов - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Островский Олег Владимирович.
Официальные оппоненты:
уцевич Игорь Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гигиены медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздравсоцразвития России;
Бондарь Татьяна Петровна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный университет.
Ведущая организация - Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Защита диссертации состоится л_______________ 2012 г. в ___часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.04 при ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздравсоцразвития Росcии по адресу: 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, 112.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздравсоцразвития России.
Автореферат диссертации разослан л_____________2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Музурова Л.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Выяснение важнейшей роли соотношения активации свободно-радикальных процессов и ограничивающей функции антиоксидантной системы в развитии клеточного повреждения привело к многочисленным, но не всегда успешным, попыткам применения специальных терапевтических приемов (Ланкин В.З., 2001;
Qureshi G. A., 2007; Меньщикова Е.Б., 2008; Miwa S.,2008; Moussa S.A., 2008;
Sfrent-Cornateanu R., 2008; Bondy S., 2010). Наиболее часто для коррекции подобных состояний используют лекарственные препараты с антиоксидантным действием (аскорбиновая кислота, мексидол, витамины А, Е и др.). При этом одной из наиболее вероятных причин неэффективности антиоксидантной терапии эксперты называют отсутствие четких методических подходов для определения показаний к назначению препаратов, мониторингу эффективности лечения, общепринятой методологии титрования дозы (Beckman A.J., 2003; Sagar S.M., 2005; Lawenda B.D., 2008; Monfared S.,2009; Bansal D., 2011; Showell M.G., 2011).
Учитывая, что антиоксидантная терапия является разновидностью метаболической терапии, очевидна необходимость лабораторного теста для принятия решения о назначении препарата и достаточности интервенции. А.А.
Кишкун (2007) предложил использовать для этого анализ общей антиоксидантной активности (ОАОА) сыворотки крови. К тому же, в отечественных нормативных документах (Приказ МЗ РФ № 64 от 21 февраля 2000 г.) рекомендовано определять антиокислительную способность крови (п. 4.15.4.) и общую антиоксидантную активность сыворотки, плазмы крови (п. 6.3.3.).
Однако несмотря на это, в клинической лабораторной практике анализ антиоксидантной активности сыворотки крови не получил широкого распространения. Это, прежде всего, связано с отсутствием рекомендованных к клиническому применению надежных методик и коммерчески доступных реагентов, поэтому разработка нового метода анализа ОАОА в биологических объектах является актуальной задачей клинической лабораторной диагностики.
В соответствии с требованиями лабораторной аналитики этот метод должен иметь понятный молекулярный механизм, быть валидированным для определенных биологических объектов, иметь аналитические и экономические характеристики, пригодные для практического применения (Долгов В.В.,2009;
Малахов В.Н., 2010; Меньшиков В.В.,2010). За основу для разработки нового метода определения антиоксидантной активности в биологических жидкостях может быть выбрана процедура, описанная Пиллигрини с соавт. (1997) для анализа продуктов питания и фармацевтического сырья. Этот метод основан на способности различных веществ взаимодействовать с АБТС-катион-радикалом (AБТСХ+). Согласно требованиям надлежащей лабораторной практики при внедрении нового метода, он должен быть всесторонне изучен в строгом соответствии с отечественными и международными стандартами (USP 23, ICH, NCCLS, FDA, ISO, CLSI, EURACHEM, IUPAC, ГОСТ-ИСО-5725 и ГОСТ-ИСО11843). Другим важным направлением исследований при внедрении нового метода в клиническую практику является изучение интерпретируемости результатов измерения ОАОА в биологических объектах. Для этого в первую очередь требуется изучение внутри и межиндивидуальной биологической вариабельности результатов лабораторного теста и его способности реагировать на изменение измеряемого показателя (Долгов В.В.,1995; Меньшиков В.В.,1997;
Фрейзер К.Г., 2010).
На основании вышеизложенного можно заключить, что на данный момент лабораторная диагностика нуждается в лабораторном тесте для определения антиоксидантной активности в биологических жидкостях, отвечающего современным требованиям лабораторной аналитики и обладающего достаточной интерпретируемостью, получаемых результатов.
Диссертация подготовлена и выполнена по плану НИР ВолгГМУ на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии. Научное сотрудничество осуществлялось с НУЗ Железнодорожная поликлиника №1 и ФГБУЗ "Волгоградский медицинский клинический центр ФМБА". Тема диссертации утверждена на заседании ученого совета ВолгГМУ. Работа выполнялась в рамках общего направления работы кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии.
Цель исследования Целью исследования являлось проведение аналитической валидации и оценки применимости методов анализа общей антиоксидантной активности сыворотки крови и мочи в экспериментальной медицине и клинической лабораторной практике.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Оптимизировать протокол фотометрического определения ОАОА сыворотки крови и мочи.
2. Провести кросс-валидацию двух методов анализа ОАОА - АБТС-теста и метода обесцвечивания AБТСХ+ и оценить влияние веществ - компонентов биологических проб на результаты анализа ОАОА.
3. Оценить экономические и аналитические преимущества использования предлагаемого метода анализа ОАОА по сравнению с другими тестами, применяемыми для этой цели в клинической лабораторной диагностике.
4. Оценить возможность использования метода определения ОАОА для анализа образцов сыворотки крови лабораторных животных при моделировании процесса, сопровождающегося окислительным стрессом.
5. Определить применимость метода анализа ОАОА в клинической лабораторной практике для мониторинга состояния антиоксидантной системы у пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа в стадии декомпенсации.
6. Изучить возможность проведения мониторинга эффективности антиоксидантной терапии с использованием метода обесцвечивания AБТСХ+.
Научная новизна работы В результате проведенной работы был разработан оптимизированный протокол фотометрического определения ОАОА сыворотки крови и мочи с помощью метода обесцвечивания AБТСХ+ и проведена процедура его валидации.
Впервые изучена популяционная вариабельность показателей ОАОА в сыворотке крови и моче. При этом выявлен двухмодальный характер распределения показателя в популяции условно здоровых людей.
Впервые изучена индивидуальная вариабельность. Показано, что она в моче в 3 раза выше, чем в сыворотке крови.
Впервые был проведен корреляционный анализ взаимосвязи результатов определения ОАОА методом обесцвечивания AБТСХ+ с возрастом, полом, а также содержанием веществ, вносящих основной вклад в результаты анализа.
На группе здоровых добровольцев впервые показано, что ОАОА может быть повышена в результате действия антиоксидантного комплексного препарата Лютеин Форте.
Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования:
На основании международных и отечественных правил, руководств, рекомендаций проведена кросс-валидация методов анализа ОАОА, в ходе которой разработан оптимизированный протокол фотометрического определения антиоксидантной активности биологических проб с помощью метода обесцвечивания AБТСХ+. Новый метод анализа ОАОА превосходит уже имеющиеся коммерчески доступные аналоги по своим аналитическим характеристикам, он не требует дорогостоящего оборудования, с его использованием можно достаточно быстро и с минимальными трудовыми затратами оценить антиоксидантный статус пациента.
Определены границы референтных интервалов ОАОА в сыворотке крови и моче у условно здоровых лиц, проживающих на территории Волгоградской области.
В соответствии с ГОСТом Р 53022.2-2008 были рассчитаны биологически обоснованные критерии точности метода обесцвечивания AБТСХ+. Показана возможность проведения рутинного внутрилабораторного контроля качества измерений.
Установлено референтное значение различий (RCV), необходимое для использования метода в мониторинговых обследованиях при проведении терапии антиоксидантами в клинической практике.
На основании предложенного протокола метода обесцвечивания AБТСХ+ могут быть созданы коммерческие наборы реагентов для определения ОАОА сыворотки крови и мочи.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод обесцвечивания AБТСХ+ превосходит традиционно используемый АБТС-тест по своим аналитическими характеристикам: коэффициент чувствительности выше в 1,4 раза; предел обнаружения и определения ниже в 3 и 2,5 раза соответственно; воспоризводимость и сходимость лучше в 1,9-2,5 и 2-3,раза. Применение метода обесцвечивания AБТСХ+ в клинической лабораторной практике позволяет снизить экономические затраты в 14,3 раза по сравнению с АБТС-тестом.
2. Установлено, что AБТСХ+ в основном взаимодействует с низкомолекулярными компонентами биологических жидкостей - мочевой кислотой, цистеином, аскорбиновой кислотой, глутатионом и триптофаном. Их вклад составил около 70% при анализе сыворотки крови здоровых лиц.
3. Метод обесцвечивания AБТСХ+ может быть использован в экспериментальной медицине для мониторинга развития окислительного стресса при моделировании хронической эндотоксемии у крыс наравне с классическим АБТС-тестом, а также анализом продуктов перекисного окисления липидов.
4. Применение метода обесцвечивания AБТСХ+ позволяет оценить состояние антиоксидантной системы у больных СД 2-го типа в стадии декомпенсации и выявить лиц со сниженной ОАОА, а также рекомендовать и мониторировать антиоксидантную терапию.
Внедрение в практику Отдельные положения и выводы нашли применение в учебном процессе для подготовки врачей клинической лабораторной диагностики на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ГБОУ ВПО ВолгГМУ; на кафедре клинической лабораторной диагностики ФПДО ГБОУ ВПО СтГМА; на кафедре клинической лабораторной диагностики с курсом медицинской техники и метрологии ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П.Павлова; в исследовательской работе НИИ фармакологии ГБОУ ВПО ВолгГМУ и НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН.
ичный вклад автора в научное исследование Автором непосредственно проведены все указанные в работе анализы с использованием метода обесцвечивания AБТСХ+, АБТС-теста, метода анализа железовосстанавливающей способности (FRAP), метода определения продуктов перекисного окисления липидов и других исследований; статистическая обработка и анализ полученного материала.
Апробация работы Апробация диссертации состоялась на базе Волгоградского государственного медицинского университета 13 декабря 2011г. Материалы диссертации доложены на 64-й, 67-й и 68-й научных конференциях студентов и молодых ученых ВоГМУ Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины (Волгоград, 2006, 2009, 2010); конференции Молодежь и наука: итоги и перспективы YSRP 2007 (Саратов, 2007); 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2008); Молодежном научно-практическом симпозиуме Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия (Волгоград, 2010); 56-й региональной конференции Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области (Волгоград, 2009); III Всероссийской конференции с международным участием Аналитика России (Краснодар, 2009); конференции Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия (Санкт-Петербург, 2010); VIII Международной конференции Биоантиоксидант (Москва, 2010).
Публикации По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 - в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав (обзор литературы; материалы и методы, 5 глав, описывающих результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций и приложения. Список литературы включает отечественных и 182 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована таблицами и 18 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Дизайн исследования В работе предложен новый метод клинической лабораторной диагностики антиоксидантного статуса человекаЦметод обесцвечивания AБТСХ+. Так как данный тест ранее не использовался в клинической практике, то необходимо было провести его валидацию. Был разработан следующий протокол валидации:
1. Аналитическая валидация. На этом этапе были установлены основные аналитические характеристики метода обесцвечивания AБТСХ+ и решен вопрос о преимуществах нового диагностического подхода по сравнению с уже существующими.
2. Оценка интерпретируемости результатов анализа ОАОА выполнена в два этапа:
Доклинический этап. В экспериментальной модели хронического воспаления, сопровождающегося развитием окислительного стресса, показана адекватность метода обесцвечивания AБТСХ+ для мониторинга ОАОА при развитии патологического процесса.
Клинический этап. Этот раздел необходим для оценки применимости метода обесцвечивания AБТСХ+ в клинической практике для решения вопроса о необходимости назначения антиоксидантных препаратов и мониторинга эффективности данной терапии. Здесь проведено обследование пациентов с заболеванием, сопровождающимся развитием окислительного стресса (сахарный диабет 2-го типа), и доказана применимость метода обесцвечивания AБТСХ+ для мониторинга ОАОА при применении комплексного антиоксидантного препарата Лютеин Форте.
Материалы и методы исследования ОАОА оценивали с помощью классического АБТС-теста и нового метода обесцвечивания AБТСХ+. АБТС-тест, предложенный Райс-Эванс с соавт. [RiceEvans C., 1994], основан на способности метгемоглобина катализировать окисление АБТС в присутствии пероксида водорода с образованием катионрадикала АБТСХ+ В отличие от АБТС-теста при оценке ОАОА методом.
обесцвечивания AБТСХ+ вещества взаимодействуют с уже окисленным АБТСХ+. На основании методики Пиллигрини с соавт. (1997) был разработан собственный оптимизированный протокол определения ОАОА с использованием метода обесцвечивания AБТСХ+.
В исследовании была проведена оценка следующих аналитических характеристик:
1. Определение веществ, влияющих на ОАОА биологических проб человека.
2. Исследование линейности и определение диапазона метода.
3. Установление воспроизводимости и сходимости метода.
4. Установление предела обнаружения и предела количественного определения.
5. Изучение стабильности реактива.
Изучение влияния естественных метаболитов на результаты анализа ОАОА проводили, используя растворы веществ - компонентов биопроб, взятых в физиологически значимых концентрациях.
Для оценки сходимости и воспроизводимости руководствовались рекомендациями CLSI document EP17, ISO 11843Ц2Ц2000.
При исследовании линейности метода и рабочего диапазона концентрации.
руководствовались рекомендациями ICH Q2B Guidelines, 1996; IUPAC Technical Reports, 2002; CLSI document EP6-P, 2004. Для этого использовали растворы стандартного образца (галловая кислота) в 5 различных концентрациях.
Оценку пределов обнаружения проводили в соответствии с ГОСТ-Р-ИСО11843-2-2007 для случая линейной калибровки и ISO 11843-3-2000.
Для определения величины предела надежного обнаружения использовали эмпирический подход, описанный в рекомендациях EURACHEM Guidance document, 1998.
Мы проанализировали стабильность рабочего реактива для метода обесцвечивания AБТСХ+. Рабочий реактив хранили в защищенном от света месте при температуре +4 С в течение 1 недели. Реагенты для проведения АБТС-теста хранили в защищенном от света месте при температуре +4 С в течение 6 месяцев.
Стабильность реактивов изучали, анализируя спектральные характеристики растворов реагентов.
Методика анализа ОАОА апробирована в экспериментальной модели хронической эндотоксемии у крыс. Работа выполнена на 15 крысах (8 крыс в контрольной группе и 7 в экспериментальной). Индукция хронической эндотоксемии у крыс проводилась липополисахаридом Salmonella typhimurium (LPS) согласно протоколу, предложенному K. Kawai (1993). Развитие воспалительного процесса определяли по СОЭ. Изменение окислительновосстановительного баланса контролировали по содержанию маркеров окислительного повреждения макромолекул (содержание гидро- и липоперекисей методом с кселиноловым оранжевым (Ramos-Vasconcelos G.R., 2002), МДА по методу Л.И. Андреевой (1988), и оценивая функциональную активность антиоксидантной системы с помощью анализа ОАОА, измеренную двумя методами - АБТС-тестом и методом обесцвечивания AБТСХ+.
Для определения границ референтного интервала ОАОА были исследованы 157 образцов сыворотки условно здоровых добровольцев (79 мужчин в возрасте 18-54 года и 78 женщин - 18-72 года). Все участники исследования прошли плановое профилактическое медицинское обследование, на основании которого были признаны здоровыми. Любое острое и хроническое заболевание являлось критерием для исключения из группы.
При исследовании внутрииндивидуальной вариабельности обследовали условно здоровых добровольцев. Образцы крови забирали с интервалом в неделю в течение 3 недель.
В работе были исследованы 50 образцов сыворотки крови больных СД 2-го типа (15 мужчин и 35 женщин в возрасте 45-85 лет) у которых был ранее верифицирован диагноз согласно критериям ВОЗ в течение 1-12 лет от начала заболевания. Среди обследованных у 13 пациентов был выявлен неосложненный СД 2-го, а у 37 - течение заболевания сопровождалось развитием сопутствующих патологий: диабетической нефропатией (7 человек); диабетической ретинопатией (9 человек); одновременно нефропатией и нейропатией (8 человек); нефропатией и ретинопатией (8 человек); нейропатией и ретинопатией (2 человека). Забор крови осуществляли при поступлении в стационар до проведения лечебных мероприятий, направленных на компенсацию СД 2-го.
Для оценки влияния антиоксидантного препарата на результаты анализа ОАОА сыворотки крови у здоровых добровольцев (n=7), все обследованные получали 2 раза в день, в течение 1 недели, по одной капсуле препарата Лютеин Форте (производитель В-МИН, ТУ 9197-006-43298286-04), в состав которого входили следующие антиоксиданты: каротиноиды (лютеин, зеаксантин), витамины (А, Е, С), таурин, флавоноиды гинкго билоба. Забор крови осуществляли до и спустя 1 неделю после приема препарата.
Обработку результатов исследования проводили с использованием встроенных функций программы МС Excel (среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка, 95%-ный доверительный интервал, медиана, перцентили) и программы Stastitica 6,0 (StatSoft). Количественные показатели описывали в терминах медианы и 95%-ного доверительного интервала (95% ДИ).
Достоверность различий между выборками несвязанных между собой данных оценивали по критерию Манна-Уитни. Гипотезу о существовании различий между выборками принимали при уровне р<0,05. При анализе выборок связанных данных использовали критерий Вилкоксона.
Результаты исследования 1.Оптимизированный протокол проведения метода обесцвечивания АБТСХ+. АБТСХ+ получали инкубацией 5 мл 7 мМ АБТС с 1 мл 14,7 мМ (NH4)2S2O8 при комнатной температуре в течение суток. Далее перед проведением анализа концентрированный раствор АБТСХ+ разводили дистиллированной водой до оптической плотности А734=0,7000,02 о.е. Осадок удаляли фильтрацией. Затем к 900 мкл разбавленного раствора АБТСХ+ добавляли 50 мкл раствора образца.
Реакционную смесь инкубировали в течение 4 минут при комнатной температуре.
Оптическую плотность измеряли при длине волны 734 нм. При исследовании ОАОА сыворотку крови и образец мочи разводили физиологическим раствором в 10 и 25 раз соответственно. Полученные результаты представлены в эквивалентных концентрациях стандартного вещества - галловой кислоты (GAE).
Этот подход является общепринятым при исследовании ОАОА биологических проб другими методами (Wang C.C., 2004; Prior R.L., 2005; Apak R., 2008).
2. Вклад различных веществ в результаты анализа ОАОА. Было проведено разделение низко- и высокомолекулярных компонентов сыворотки крови условно здоровых лиц с помощью системы Микрокон 30 (производитель Millipore, Франция). Установлено, что наибольшее влияние на величину ОАОА сыворотки крови оказывают низкомолекулярные вещества (около 70% от величины ОАОА образца).
Анализ влияния отдельных компонентов биопроб человека показал, что AБТСХ+ в основном взаимодействует с мочевой кислотой, цистеином, аскорбиновой кислотой, глутатионом и триптофаном. Аналогичные результаты были получены при изучении АБТС-теста.
Таким образом, метод обесцвечивания AБТСХ+, также как и классический АБТС-тест, чувствителен к основным антиоксидантам сыворотки крови.
Интерферирующими веществами при анализе образцов биологических проб являются мочевая кислота и белки сыворотки крови. По всей видимости, их вклад необходимо учитывать только при патологических состояниях, сопровождающихся гиперурикемией, гипо- и гиперпротеинемией.
3. Аналитические характеристики методов анализа ОАОА Линейность. Оценку линейности проводили с помощью стандартного образца галловой кислоты (рис.1).
А) Б) Рисунок 1. Диаграммы рассеяния и регрессионные прямые для зависимости степени обесцвечивания от концентрации галловой кислоты при анализе методом обесцвечивания AБТСХ+ (А) и АБТС-тестом (Б).
Примечание: Регрессионные прямые приведены с указанием границ 95%-ного доверительного интервала (ДИ).
Для метода обесцвечивания AБТСХ+ (рис.1А) в диапазоне концентраций от 0,005 до 0,07 мМ GAE не было выявлено существенных отклонений от линейности калибровочного графика (R2=0,9923). АБТС-тест (рис.1Б) был линеен в диапазоне от 0,04 до 0,1 мМ GAE (R2=0,9807). Наличие линейной зависимости подтверждает равномерное распределение отклонения Y между положительными и отрицательными значениями для всех исследованных концентраций стандартного образца. Указанный диапазон концентраций гораздо ниже, чем референтные пределы ОАОА в сыворотке крови здоровых людей, поэтому перед анализом образцы сыворотки следует разбавлять в 10 раз для работы в линейном диапазоне концентраций.
Согласно уравнениям линейной регрессии, представленным на рисунке 1А и 1Б, можно заключить, что средний коэффициент чувствительности был выше у метода обесцвечивания AБТСХ+ по сравнению с АБТС-тестом.
Сходимость и воспроизводимость. Анализ воспроизводимости/сходимости проводили, используя образцы эталонного вещества с высоким и низким уровнями ОАОА и образца биологической пробы человека (мочи), стабильного при хранении. Коэффициент внутрисерийной вариации (CVintra assay) для метода обесцвечивания AБТСХ+ составил 1,9-2,8% и для АБСТ-тестаЦ4,6-8,8%.
Воспроизводимость была также выше у метода обесцвечивания AБТСХ+ по сравнению с АБТС-тестом (CVtotal был равен 3,4-6,1% и 8-13,4%, соответственно).
Предел обнаружения и предел количественного определения. В соответствии ГОСТ-Р-ИСО-11843-2-2007 предел обнаружения для метода обесцвечивания AБТСХ+ составил 1,40 мкМ эквивалентных концентраций галловой кислоты (GAE), в то время как для АБТС-теста - 9,14 мкМ GAE. Минимальная надежно обнаруживаемая концентрация оказалась равной 12 мкМ GAE и 30 мкМ GAE для метода обесцвечивания AБТСХ+ и АБТС-теста соответственно.
Стабильность рабочего реактива. Анализ стабильности реактивов для методов изучения ОАОА показал, что все реактивы для проведения АБТС-теста стабильны в течение 2-6 месяцев, в то время как рабочий раствор AБТСХ+, необходимый для метода обесцвечивания, рекомендуется использовать в течение одной рабочей смены. С другой стороны, его приготовление требует минимальных трудовых затрат, по сравнению с реактивами для АБТС-теста.
4. Себестоимость методов анализа ОАОА Расчет величин себестоимости одного анализа каждым из методов исследования ОАОА проводили в соответствии с приложением 13-го приказа № 380 Минздрава России. Полученные результаты расчетов для методов анализа ОАОА, используемых в научных публикациях, представлены в таблиц 1. Было установлено, что наиболее экономически обоснованным является метод обесцвечивания AБТСХ+.
Таблица Величины себестоимости анализов ОАОА различными методами Доступность Себестоимость одного Метод готовых наборов в анализа, руб.
России АБТС-тест 375,498 + ORACFL 169,759 - FRAP 59,341 - CUPRAC 407,62 + Метод обесцвечивания AБТСХ+ 27,881 - Примечание: ORACFL - оценка способности абсорбировать радикалы кислорода с флуоресцеином; CUPRAC- анализ антиоксидантной способности по восстановлению меди.
5.Проведение внутрилабораторного контроля качества Для проведения внутрилабораторного контроля качества анализа ОАОА в соответствии с приказом МЗ РФ от 26.05.2003 г., № 220, и ГОСТом Р 53022.3-20были установлены биологически обоснованные критерии точности методов анализа (табл.2).
На полученые результаты расчетов необходимо ориентироваться при проведении внутрилабораторного контроля качества результатов измерений ОАОА.
Оценка параметров точности метода обесцвечивания AБТСХ+ и АБТС-теста, полученных в нашей лаборатории, показала, что результаты анализа ОАОА, полученные двумя методами, отвечают установленым выше критериям. При этом, большей правильностью обладает метод обесцвечивания AБТСХ+, для которого значение смещения составило 3,7-4,9%, в то время как для АБТС-теста величина отклонения от истиного значения была несколько выше - 7,4-8,5%.
Анализ карт Леви-Дженнингса показал, что отклонений результатов измерений за контрольный передел обнаружено не было.
Таблица Биологически обоснованные критерии точности методов анализа ОАОА Предельно допустимые Целевые значения, % значения, % Метод анализа ОАОА СV В СV10 В10 СV20 ВМетод обесцвечивания 7,1 3,6 9,7 8,0 9,0 6,AБТСХ+ АБТС-тест 13,7 7,0 18,8 15,4 17,2 13,6. Оценка применимости метода анализа ОАОА в экспериментальной медицине. При хронической эндотоксемии у крыс типичные проявления воспалительного процесса (СОЭ) развивались медленно, в течение месяца. Более выраженные изменения наблюдались при исследовании маркеров окислительного стресса. Все лабораторные показатели изменялись достоверно к концу 4-й недели по сравнению с их исходным значением (р0,05 по Вилкоксону). Содержание гидро- и липоперекисей, первичных продуктов окислительной модификации липидов достоверно увеличивалось к 4-й неделе на 60,8% по сравнению с контрольной группой. Аналогичным образом изменялась концентрация таких конечных продуктов перекисного окисления липидов, как ТБК-реактивные вещества. Можно заключить, что LPS токсин при длительном введении вызывал типичную воспалительную реакцию, сопровождающуюся выраженной пероксидацией.
Однако наиболее ранним маркером окислительного стресса у крыс с хронической эндотоксемией оказалась ОАОА плазмы крови, измеренная методом обесцвечивания AБТСХ+(рис.2). В отличие от всех остальных показателей, она достоверно снижалась уже к концу второй недели эксперимента. К 4-й неделе ОАОА плазмы крови, определенная методом обесцвечивания AБТСХ+, статистически значимо уменьшалась на 47,92% по сравнению с контрольной группой. Аналогичные достоверные изменения показателя ОАОА, измеренной АБТС-тестом, были обнаружены только к концу 4-й недели после введения эндотоксина. Можно заключить, что способность реагировать на изменения измеряемого параметра (responsiveness) у метода обесцвечивания лучше, чем у АБТС-теста.
Таким образом, при использовании экспериментальной модели хронической эндотоксемии у крыс была показана адекватность применения нового метода обесцвечивания AБТСХ+ для мониторинга состояния антиоксидантной системы при развитии воспалительного процесса. Результаты анализа ОАОА, полученные методом обесцвечивания AБТСХ+, согласуются с данными других лабораторных тестов, которые, по литературным данным, традиционно используются в качестве маркеров окислительного стресса.
Рисунок 2. Динамика изменений величины ОАОА, определенной методом обесцвечивания AБТСХ+, у группы с хронической эндотоксемией по отношению к показателям контрольной группы.
Доклинические исследования метода обесцвечивания AБТСХ+ показали, что новый диагностический подход превосходит существующие лабораторные тесты по своим аналитическим характеристикам, требует минимальных трудовых и экономических затрат, чувствителен к низкомолекулярным антиоксидантам сыворотки крови и способен реагировать на изменения измеряемого параметра.
7. Оценка применимости метода анализа ОАОА в клинической лабораторной практике Определение границ референтных интервалов величины ОАОА у здоровых лиц. При анализе ОАОА образцов сыворотки крови условно здоровых лиц методом обесцвечивания AБТСХ+ были обнаружены отклонения одномодульного распределения от нормального. Статистически значимые различия показателей антирадикальных свойств сыворотки между мужчинами и женщинами обнаружены не были (табл.3).
Было установлено, что величина ОАОА, измеренная методом обесцвечивания AБТСХ+, не коррелирует с возрастом, содержанием общего белка и мочевой кислоты.
Таблица Значение региональных референтных величин показателей ОАОА (мМ GAE), измеренной методом обесцвечивания AБТСХ+ в сыворотке крови условно здоровых лиц Х Ме 2,5% П 97,5% П Мужчины (n=79) 0,476 0,461 0,0987 0,3385 0,68Женщины (n=78) 0,447 0,450 0,0841 0,3120 0,63Все вместе (n=157) 0,462 0,452 0,0926 0,3207 0,64Примечание: Х - среднее значение; Ме - медиана; - стандартное отклонение; П - перцентиль.
Биологическая вариабельность показателей ОАОА сыворотки крови.
Согласно полученным данным, при оценке антиоксидантных свойств сыворотки крови метод обесцвечивания AБТСХ+ характеризовался гораздо более низкой аналитической и внутрииндивидульной вариабельностями, но межиндивидуальная вариабельность показателя была несколько выше, по сравнению с классическим АБТС-тестом (табл.4). Оба метода были приемлемы, так как коэффициент индивидуальности (II) составил больше 0,6 ед.
Таблица Биологическая вариабельность показателей антиоксидантной активности образцов сыворотки крови CVa, % CVви, % CVми, % CVобщая, % II Метод обесцвечивания 2,5 14,2 20,1 14,4 0,AБТСХ+ АБТС-тест 4,9 27,4 15,6 27,8 1,Низкие внутрииндивидуальная и аналитическая вариабельности показателя ОАОА сыворотки крови делают предпочтительным использование метода обесцвечивания AБТСХ+ для проведения мониторинговых исследований по сравнению с АБТС-тестом.
ОАОА образцов мочи, измеренная методом обесцвечивания AБТСХ+ и АБТС-тестом, характеризуется большой биологической вариабельностью (CVви>42%; CVми>140%) по сравнению с сывороткой крови. При этом индекс индивидуальности для образцов мочи был ниже 0,6, что косвенно свидетельствует о низкой диагностической значимости измерения ОАОА мочи, поэтому применение неинвазивной диагностики состояния антиоксидантного статуса организма, по всей видимости, на данный момент не представляется возможным.
Изменение ОАОА у пациентов, страдающих СД 2-го типа в стадии декомпенсации. Нами были протестированы образцы сыворотки от 50 пациентов, страдающих СД 2-го типа, полученных на момент госпитализации этих лиц в связи с декомпенсацией СД 2-го. При анализе образцов сывороток больных СД 2го типа ОАОА оказалась достоверно ниже по сравнению со здоровыми (р=0,000015, по Манну-Уитни) и составила 0,226-0,493 мМ GAE. Действительно, анализируя частоту встречаемости величин показателя ОАОА сыворотки у больных СД 2-го типа, мы обнаружили, что величина ОАОА смещена в сторону более низких значений показателя по сравнению со здоровыми (рис.3).
Рисунок 3. Распределение обследованных лиц по величине ОАОА.
Зависимость значения ОАОА от частоты ее встречаемости в выборке показана в следующем уравнении:
, где р1, р2 - доля лиц со значением ОАОА 112 и 222 соответственно;
, 1, 2 - максимум кривой плотности распределения;
12, 22 - дисперсия.
Анализ уравнений регрессий показал, что у здоровых лиц и больных СД 2го можно выделить две отдельные группы обследованных, внутри которых распределение показателя ОАОА соответствует Гаусову распределению. В здоровой популяции у 88,7% значение показателя колеблется в пределах 0,4380,074 мМ GAE; у остальных 11,3% величина ОАОА была существенно выше и составила 0,6170,032 мМ GAE. Анализ распределения пациентов с СД 2го по величине ОАОА показал, что примерно в 50% случаев значение ОАОА близко к величине, установленной для здоровых лиц (0,4380,074 мМ GAE). Но у остальных больных СД 2-го наблюдается низкое значение ОАОА - 0,2810,04 мМ GAE, не характерное для здоровой популяции, поэтому, по всей видимости, при проведении терапии пациентам с СД 2-го необходимо применять дифференцированный подход к назначению антиоксидантных препаратов.
Таким образом, используя новый метод исследования ОАОА мы показали, что, основываясь на результатах анализа ОАОА сыворотки крови методом обесцвечивания AБТСХ+, среди больных СД 2-го типа можно выделить лиц с низким уровнем ОАОА. По-видимому, этим пациентам необходимо проводить фармакологическую коррекцию антиоксидантными препаратами.
Использование ОАОА для мониторинга за эффективностью антиоксидантной терапии. В соответствии с ГОСТом Р 53022.3-2008 для точной оценки значимости различия между результатами двух последовательных измерений аналитов у одного и того же пациента рассчитали коэффициент критической разницы (RCV, референтное различие значений). Для метода обесцвечивания AБТСХ+ он составил 33,7%, а для АБТС-теста 64,9%. Мы оценили возможность использования RCV на конкретном практическом примере.
В течение 1 недели группа здоровых добровольцев получала антиоксидантный комплексный препарат Лютеин Форте (ТУ 9197-006-43298286-04). Дозировка и способ применения соответствовали рекомендациям производителя. Мы оценили ОАОА образцов сыворотки крови методом обесцвечивания AБТСХ+, полученных до приема препарата и после одной недели его применения (рис.4).
При использовании метода обесцвечивания AБТСХ+ ОАОА повышалась у всех обследованных (р=0,018, по критерию Вилкоксона), но изменение показателя превосходило значение RCV для данного метода лишь в 29% случаев. Возможно, это связано с недостаточной продолжительностью приема препарата. В рекомендациях производителя длительность проведения терапии составляет месяц. Применение АБТС-теста при анализе этих же образцов не позволило выявить статистически значимых различий величины ОАОА сыворотки крови до и после приема препарата Лютеин Форте (р=1, по критерию Вилкоксона). Это может быть объяснено худшей способностью АБТС-теста реагировать на изменения измеряемого параметра, которая уже была обнаружена в экспериментах на животных.
Рисунок 4. Влияние препарата Лютеин Форте на ОАОА, измеренную методом обесцвечивания AБТСХ+ и АБТС-тестом.
Тот факт, что препарат в наибольшей степени влиял на ОАОА у обследуемых добровольцев с более низкими исходными показателями, позволяет предположить существование зависимости эффективности антиоксидантной терапии от исходной величины ОАОА. Корреляционный анализ выявил статистически значимую отрицательную взаимосвязь между индексом RCV и исходным значением ОАОА (рис.5).
Рисунок 5. Зависимость эффекта препарата Лютеин Форте от исходного уровня ОАОА.
Таким образом, метод обесцвечивания AБТСХ+ оказался предпочтительнее как при выявлении пациентов с недостаточностью антиоксидантной системы, так и при проведении мониторинга эффективности антиоксидантной терапии по сравнению с АБТС-тестом. Необходимо отметить, что обнаружена отрицательная взаимосвязь между эффектом антиоксидантного препарата и величиной исходного значения ОАОА.
Выводы 1. Обоснован метод анализа ОАОА, основанный на способности взаимодействовать с AБТСХ+, который превосходит по своим аналитическим характеристикам классический АБТС-тест и может быть использован в клинической и экспериментальной медицине.
2. Метод обесцвечивания AБТСХ+, так же как и АБТС-тест, оказался чувствителен к воздействию низкомолекулярных компонентов биологической пробы: их вклад при анализе сыворотки крови методом обесцвечивания AБТСХ+ составляет 58,63%-77,35%; АБТС-тестом 72,02%-87,02%. Установлено, что основными низкомолекулярными компонентами, влияющими на величину ОАОА, являются мочевая кислота, цистеин, аскорбиновая кислота, глутатион, триптофан.
3. Метод обесцвечивания AБТСХ+ оказался лучше по своим аналитическим характеристикам по сравнению с АБТС-тестом: коэффициент чувствительности - 843,6564315,53536 мМ и 603,8413217,67079 мМ галловой кислоты соответственно; диапазон линейной зависимости оптической плотности от концентрации галловой кислоты 0,005-0,07 мМ и 0,04-0,1 мМ;
воспроизводимость - 3,44-4,5% и 8-13,35%; сходимость 1,91-2,84% и 4,55-7,32%;
минимальная обнаруживаемая концентрация - 0,001399 мМ и 0,009135 мМ галловой кислоты.
4. Доказана адекватность метода обесцвечивания AБТСХ+ для мониторинга за состоянием антиоксидантной системы при развитии окислительного стресса у крыс в модели хронической LPS-индуцированной эндотоксемии. Использование метода обесцвечивания AБТСХ+ позволило выявить наиболее ранние изменения состояния антиоксидантной системы при данной патологии.
5. У больных СД 2-го типа в стадии декомпенсации в 48% случаев ОАОА, измеренная методом обесцвечивания AБТСХ+, была ниже референтных значений.
6. ОАОА сыворотки крови, оцениваемая методом обесцвечивания AБТСХ+, корректируется антиоксидантным препаратом Лютеин Форте.
7. Метод обесцвечивания AБТСХ+ не трудоемок, хорошо воспроизводим, чувствителен, требует меньших экономических затрат по сравнению с другими методами анализа ОАОА и может быть использован в клинической лабораторной практике для мониторинга эффективности антиоксидантной терапии.
Практические рекомендации 1. Для оценки ОАОА сыворотки крови в лабораторной практике рекомендуется применять метод, основанный на определении обесцвечивания AБТСХ+; в качестве стандартного образца можно использовать образцы галловой кислоты.
2. На основании предложенного протокола метода обесцвечивания AБТСХ+ целесообразно создание коммерческого набора для определения ОАОА сыворотки крови и мочи.
3. Разработанный протокол, включающий исследования по лабораторной аналитике и клинической интерпретируемости полученных данных, можно использовать для валидации любого нового метода в клинической лабораторной диагностике.
4. Использование метода обесцвечивания AБТСХ+ как более простого, технологичного и чувствительного рекомендуется для применения в целях мониторинга при проведении терапии антиоксидантными препаратами.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Шушкова, И.Г. Влияние низкомолекулярных метаболитов на общую антиоксидантную активность биологических проб/ И.Г. Шушкова, А.В.
Коваленко// Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2007.ЦС.85-86.
2. Время-зависимые эффекты веществ различной химической природы в модельной системе окисления ABTS/ И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, О.В.
Островский, А.В. Коваленко // Материалы 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии.ЦПятигорск, 2008.ЦС.238.
3. Применение ABTS-теста для оценки антиоксидантной активности крови/ А.А. Пилипко, И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, О.В. Островский // Клиническая лабораторная диагностика.Ц2008.Ц№ 9.ЦС.66.
4. Современные подходы к оценке антиоксидантного статуса в клинико-лабораторной диагностике/ Н.В. Дегтярева, И.Г. Шушкова, В.Г.
Зайцев, О.В. Островский // Клиническая лабораторная диагностика.Ц2008.Ц№ 9.ЦС.59.
5. Антирадикальная активность сыворотки крови человека, измеренная модифицированным тестом обесцвечивания ABTSо-катионрадикала/ И.Г. Шушкова, Л.Г. Синицина, В.Г. Зайцев, О.В. Островский// Кубанский научный медицинский вестник.Ц2009.Ц№ 9.ЦС.159-161.
6. Подбор оптимальных условий для определения общей антиоксидантной активности в сыворотке и плазме человека с помощью ABTS - теста/ А.А. Пилипко, Н.В. Дегтярева, М.А. Верченко, И.Г. Шушкова// Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины:
Материалы 67-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием.ЦВолгоград: Изд-во ВоГМУ, 2009.ЦС.52.
7. Шушкова, И.Г. Оптимизация одновременного определения антиоксидантной и антирадикальной активности веществ/ И.Г. Шушкова, О.Н.
иненко, В.Г. Зайцев// Аналитика России: Материалы III Всероссийской конференции по аналитической химии. - Краснодар, 2009.ЦС.174.
8. Шушкова, И.Г. Перспективы определения антиоксидантной активности биологических проб человека в клинической лабораторной практике/ И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, А.В. Коваленко // Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области: Сб. науч. трудов/ под ред. В.И.
Петрова. - Волгоград, 2009.ЦС.253-256.
9. Шушкова, И.Г. Безалкогольные растительные напитки как источники фенольных антиоксидантов в питании человека/ Е.А. Няхина, И.Г. Шушкова, В.Г.
Зайцев // Биоантиоксидант: Материалы VIII Международной конференции. М.:
РУДН, 2010.ЦС.340-341.
10. Шушкова, И.Г. Выбор метода анализа антиоксидантной активности сыворотки крови, перспективного для дальнейшего внедрения в клиническую лабораторную практику/ И.Г. Шушкова // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 68-й открытой научнопрактической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, посвященной 75-летию ВоГМУ. - Волгоград, 2010.ЦС.33.
11. Шушкова, И.Г. Выбор перспективного метода анализа общей антиоксидантной активности в сыворотке крови человека/ И.Г. Шушкова// Mедицинский академический журнал.Ц2010.ЦТом10, №5.ЦС.113.
12. Шушкова, И.Г. Проблемы валидации методов определения общей антиоксидантной активности в биологических жидкостях человека/ И.Г.
Шушкова, В.Г. Зайцев, О.В. Островский// Кислород и антиоксиданты.Ц2010.Ц№2. - С.105-106.
13. Определение общей антиоксидантной активности в крови больных сахарным диабетом/ И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, Г.П. Дудченко, О.В.
Островский// Клиническая лабораторная диагностика.Ц2011.Ц№ 10.ЦС.42.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ AБТСХ+ - АБТС-катион-радикал ОАОА - общая антиоксидантная активность СД - сахарный диабет В - смещение, относительное отклонение от истинного значения CLSI - Clinical laboratory and standards institute CV - коэффициент вариации CUPRAC - анализ антиоксидантной способности по восстановлению меди FRAP - анализ железовосстанавливающей способности GAE - эквивалентные концентрации галловой кислоты ICH - International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use IFCC - International federation of clinical chemistry and laboratory medicine ISO - International organization for standardization IUPAC - International union of pure and applied chemistry NCCLS - National committee of clinical laboratory standards LPS - липополисахарид Salmonella typhimurium ORAC - оценка способности абсорбировать радикалы кислорода RCV - референтное различие значений USP - United States pharmacopoeia Подписано в печать 15.02.12 г. Объем - 1 печ.л.
Тираж 100. Заказ №Е..
Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства Перемена 400131, г.Волгоград, пр.им.В.И.Ленина, 27.