Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи УДК 578.832
ГАМБАРЯН АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА
Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев
03.00.06 - вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2007 г.
Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова.
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор,
Альтштейн Анатолий Давидович
Доктор биологических наук,
Народицкий Борис Савельевич
Доктор биологических наук, с.н.с.
НовиковаБорисаВалентинович.
Ведущая организация:
ГУ Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН
Защита состоится 21 декабря 2007г. в 1000 на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН (142782, Московская обл., Ленинский р-н, п/о Институт полиомиелита).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.
Автореферат разослан ________ноября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук О.А.Медведкина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Природным резервуаром вирусов гриппа (ВГ) являются дикие утки, у которых ВГ вызывают бессимптомную инфекцию в нижнем отделе кишечника. Эпизодически вирусы уток могут инфицировать других хозяев и иногда дают начало новым эволюционным ветвям ВГ. Важнейшим элементом адаптации вируса к новому хозяину является настройка на новые рецепторные детерминанты в новом хозяине и, возможно, на новых клетках мишенях. Инфицирование вирусом гриппа начинается с прикрепления вириона к сиалосодержащим рецепторам на поверхности клетки. Вирусы адаптированы к рецепторам на клетках мишенях своего хозяина, следовательно, вирусы разных хозяев могут иметь разную рецепторную специфичность.
В работе была поставлена задача углубления существующих представлений о зависимости рецепторной специфичности вирусов гриппа от хозяйской принадлежности. Для оценки потенциальной опасности вирусов гриппа птиц с точки зрения возможности их перехода к человеку сравнивались вирусы гриппа разных хозяев: птиц, человека и домашних животных.
Актуальность проблемы
Проблемы, связанные со сменой хозяев вирусами гриппа в настоящее время особенно актуальны учитывая риск возникновения нового пандемического варианта из высокопатогенного птичьего вируса гриппа.
Во всем мире очень интенсивно ведется изучение птичьих вирусов гриппа и разработка вакцин против них. Реальная угроза новой пандемии вывела проблему на государственный уровень.
Во многих лабораториях проводятся испытания эффективности известных лекарственных препаратов. Большую проблему составляет появление штаммов вируса, устойчивых к классическим антивирусным препаратам - ремантадину и амантадину. Широко исследуется и применяется новые препараты, действующие как ингибиторы нейраминидазы. Однако появляются штаммы устойчивые и к этим препаратам. Поэтому идет интенсивная разработка новых препаратов, в том числе - ингибиторов связывания вируса с клеткой.
Параллельно ведутся фундаментальные исследования птичьих вирусов гриппа, для лучшего понимания механизма возникновения пандемических вариантов.
Цели и задачи исследования
1) Выяснение детальной молекулярной структуры рецепторов вирусов гриппа.
2) Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа разных хозяев, с целью выявления круга вирусов с наибольшим потенциалом перехода к людям.
3) Изучение состава сиалосахаров - рецепторов вируса гриппа на клетках мишенях разных хозяев.
Научная новизна
Впервые показано, что рецепторная специфичность вирусов гриппа разных птиц различна.
Для изучения различий в рецепторной специфичности мы использовали панель синтетических сиалогликополимеров на основе полиакриламида с терминальным Neu5Ac2-3/6Gal фрагментом, синтезированных нашими коллегами из лаборатории химии углеводов Института биоорганической химии.
Показали, что H5N1 вирусы кур, (включая выделенные от людей штаммы) обладают исключительно высоким сродством к Neu5Ac2-3Galβ1-4(6-HSO3)GlcNAcβ (6-Su-3`SLN) группировке. Связывание вирусов кур и млекопитающих с клетками трахеи зеленой мартышки ослабевает, после обработки последней глюкозамин-6-сульфатазой, что указывает на наличие 6- Su-3`SLN групп на соответствующем субстрате. Высказано предположение, что наличие таких группировок на клетках дыхательного эпителия человека способствует заражению людей H5N1 вирусами.
Показано, что один из человеческих изолятов H5N1 вирусов, распознает человеческий рецептор. Это лишний раз напоминает о риске возникновения пандемического варианта этих вирусов.
Показано, что адаптация исходных вирусов гриппа самых разных эволюционных линий к курам приводит к изменению рецепторной специфичности вируса. Вирусы перенацеливаются на рецепторы с лактозаминовым кором (Таким же как у человеческого рецептора -6` сиалилактозамина). У H5N1, H9N2 и H7N7 вирусов повышено сродство к сульфатированному рецептору с лактозаминовым кором. Многие из этих вирусов приобретают также частичное сродство к человеческому рецептору.
Впервые показано, что эволюция вирусов гриппа в свиньях идет в том же направлении с теми же самыми аминокислотными заменами, что и эволюция вирусов в людях. Вирусы гриппа, лишь недавно перешедшие от птиц к свиньям (так называемые avian-like), адаптированы к таким же рецепторам, что и куриные вирусы. Однако вирусы специализированной свиной линии - H1N1 адаптированы строго к 6` сиалилактозамину, так же как и человеческие вирусы. Высказана гипотеза, что адаптация к 6` сиалилактозамину у вирусов гриппа свиней, также как и у человеческих вирусов, обеспечивает более эффективный механизм воздушно-капельной передачи вируса.
Впервые в мире изучали способность вирусов гриппа разных хозяев связываться с клетками кишечного эпителия птиц, принадлежащих к отрядам Anseriformes (Утиные), Galliformes (Куриные), Charadriiformes (Кулики и чайки), Ciconiiformes (Аистообразные), Podicipediformes (Поганкообразные) и Gruiformes (Журавлеобразные). Состав сиалосодержащих рецепторов на этих же клетках изучали с помощью лектинов.
Полученные результаты указывают на то, что состав природных сиалозидов у разных птиц различен. Рецепторная специфичность ВГ разных хозяев отражает эти отличия. Можно предположить, что вследствие этого ВГ разных птиц могут отличаться по способности преодолевать межвидовой барьер, и в частности, заражать млекопитающих и человека.
Практическая значимость
В настоящее время для оценки опасности вирусов все чаще пользуются молекулярными маркерами. Для таких оценок нужно точное знание о зависимости какого-то свойства вируса от наличия той или другой аминокислоты в определенной позиции вирусного белка. В частности, до начала наших исследований было обнаружено две (226 и 228) аминокислотных замены, ответственные за способность вируса гриппа вызвать пандемию среди людей. Наши исследования выявили дополнительные замены, приводящие к такому же результату (190, 225 и 227).
Исследование рецепторной специфичности вирусов гриппа разных хозяев, в частности разных птиц, показало, что вирусы гриппа кур обладают резко повышенным, по сравнению с исходными утиными вирусами, потенциалом перехода к людям.
Обнаружение полной аналогии эволюции вирусов гриппа в свиньях и в людях позволяет рассматривать грипп свиней как модельную систему для изучения человеческого гриппа.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на:
- Пятом интернациональном симпозиуме по птичьему гриппу. США, Джорджия, апрель 2002.
- Первой Европейской конференции по гриппу. Мальта, Октябрь, 2002
- 12-ой международной конференции по вирусам с негативным геномом. Италия, Пиза, июнь 2003.
- Второй Европейской конференции по гриппу. Мальта, 11-14 сентября, 2005
- Восьмом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.
- Девятом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изучение рецепторной специфичности вирусов гриппа с помощью полимеров, несущих рецепторные аналоги.
Изучение рецепторной специфичности вирусов гриппа (ВГ) до недавнего времени рассматривалось в основном в свете распознавания разных производных нейраминовой кислоты и типа связи между сиаловой кислотой и галактозой (Paulson, 1985; Suzuki, 1994; Connor et al., 1994; Naeve et al., 1984; Matrosovich et al.,1991, 1992, 1993, 1998; Tuzikov et al., 1997) . Роль сахаридных звеньев, последующих за галактозой, была исследована только в одном случае - а именно для человеческих вирусов, распознающих 6`SLN лучше, чем 6`SL (Matrosovich et al., 1993, 1997, 2000; Gambaryan et al., 1995, 1997, 1999; Mochalova et al., 2003). Для сиалил2-3галактозных рецепторов таких исследований вообще не проводилось.
Изучение вирусов разных хозяев
Первоначальной целью исследования была детализация рецепторной специфичности вирусов гриппа разных хозяев. Для этого мы исследовали связывание вирусов с 17 типами соединений с идентичной концевой Sia2-3- сахаридной группировкой, но отличающихся строением последующих сахаридных звеньев, а так же с оптимальным человеческим рецептором 6`SLN . Полимер, несущий асиаловый сульфосахарид 3'-O-Su-Gal1-3GlcNAcβ использовали как контрольный. Сахаридная группировка всех тестированных соединений была присоединена к полиакриловому полимеру через одинаковый спейсер. Структуры использованных сахаров и их краткие обозначения приведены в таблице 1. Они отличаются типом связи (1-3 или 1-4) между галактозой и последующим звеном, типом третьего звена (глюкоза, глюкозамин либо галактозамин), наличием или отсутствием фукозного заместителя, сульфогруппировки или второй сиаловой кислоты при третьем звене.
Таблица 1. Структуры использованных в данной работе сиалосахаридов и их условные обозначения
Сахариды | Усл. обозначение |
Биотинилированные полимеры (1000 kD) | |
Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ (biot) | 3`SL |
Neu5Acα2-6Galβ1-4Glcβ (biot) | 6`SL |
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (biot) | 6`SLN |
Neu5Gcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (biot) | 6`SLN(Gc) |
Немеченные полимеры (30 kD) | |
3'-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-sp | 3'-Su-Lec |
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc | 6`SLN |
Neu5Acα2-6Galβ1-4-(6-Su)GlcNAc | Su-6`SLN |
Neu5Gcα-sp | Neu5Gc |
Neu5Acα2-3Galβ-sp | SG |
Neu5Acα2-3GalNAcα-sp | STn |
Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ-sp | SL |
Neu5Gcα2-3Galβ1-4GlcNAc | 3`SLN(Gc) |
Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ | 3`SLN |
Neu5Acα2-3Galβ1-4-(6-Su)GlcNAcβ | Su-3`SLN |
(Neu5Acα2-3Galβ1-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ | SLex |
(Neu5Acα2-3Galβ1-4)(Fucα1-3)(6-O-Su)GlcNAcβ | Su-SLex |
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ | SLec |
Neu5Acα2-3Galβ1-3-(6-Su)GlcNAcβ | Su-SLec |
Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα | STF |
Neu5Acα2-3Galβ1-3-(6-Su)GalNAcα-sp | Su-STF |
(Neu5Acα2-3Galβ1-3)(Fucα1-4)GlcNAcβ | SLea |
Neu5Acα2-3Galβ1-3 GalNAcα-sp Neu5Acα2-6 | 3,6-STF |
Neu5Acα2-3 GalNAcα-sp Neu5Acα2-6 | 3,6-STn |
(Neu5Acα2-8)-sp3 | (Sia)3 |
Ганглиозиды | |
Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4Glc-cer Neu5Acα2-3 | GM1a |
Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-cer | GM1b |
Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4Glc-cer Neu5Acα2-3 | GD1a |
Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4Glc-cer Neu5Acα2-8 Neu5Acα2-3 | GD1b |
Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4Glc-cer Neu5Acα2-8 Neu5Acα2-3 | GT1b |
Все исследованные сахара, кроме STn и 3,6-STn - природные соединения.
Контрольный асиаловый полимер, а так же полимеры, несущие группировки Neu5Gc, 3,6-STn и (Sia)3 не связывались ни с какими из вирусов. Сродство к 3`SLN- и 3`SL-группировкам было, в пределах точности измерения, равным для всех испытанных вирусов.
Проведенное исследование показало, что рецепторная специфичность разных вирусов гриппа птиц не совпадает. Общность птичьих вирусов ограничивается только распознаванием 2-3 связи между сиаловой кислотой и последующей галактозой. Разные вирусы нацелены на разные природные сиалосодержащие группировки. Причем можно отметить как отличия, связанные с хозяйской принадлежностью вируса, так и особенности, присущие субтипам.
Способность вирусов связывать гликолильную форму сиаловой кислоты изучали с помощью полимеров 3`SLN и 3`SLN(Gc). Все исследованные Н3 и Н7 вирусы связываются с 3`SLN(Gc) почти так же хорошо, как и с 3`SLN. Это свойство не коррелирует с хозяйской принадлежностью вирусов, так 3`SLN(Gc)-группировку хорошо связывают вирусы уток, свиней, лошади, кур и тюленя Н3 и Н7 субтипов. В то же время вирусы других субтипов 3`SLN(Gc) не связывали.
Ни один из вирусов не связывался с р(Sia)3, в котором сиаловая кислота присоединена не к галактозе, а к восьмому кислороду другой CK. Этот результат лишний раз доказывают, что минимальной рецепторной группировкой вирусов гриппа птиц является не просто сиаловая кислота, а сиалил2-3 галактоза.
Т2Роль третьего сахаридного звена в связывании рецептора с вирусом видна из сравнения сродства к SG, 3`SL,3`SLN, SLec и STF. Большинство вирусов примерно одинаково хорошо связывается с SG, 3`SL и SLN. Это свидетельствует о том, что сахаридное кольцо, присоединенное к галактозе 1-4 связью, направлено в раствор и не принимает активного участия в связывании. В SLec и STF третье звено присоединено к галактозе 1-3 связью. Сродство к этим группировкам у всех вирусов близкое, следовательно, направление гидроксильного остатка при четвертом углероде третьего сахаридного звена не принципиально для связывания.
Сродство к STF у вирусов уток, как правило, выше чем к SLN, то есть эти вирусы адаптированы к 1-3 связи между вторым и третьим звеном сахаридной цепочки. Вирусы цыплят, напротив, лучше связывают 3`SLN чем STF, то есть они адаптированы к 1-4 связи между галактозой и последующим звеном.
У вирусов чаек соотношение сродства к 3`SLN и STF зависит от субтипа. У ВГ субтипа Н13 выше сродство к 3`SLN, а у Н4, H6 и Н14 вирусов, которые недолго циркулировали в чайках, как и у близкородственных вирусов уток, выше сродство к STF.
Заместители при третьем звене сахаридной цепочки влияют на связывание разных вирусов по разному, и могут как понижать, так и повышать сродство к рецептору.
Фукозилирование третьего от конца глюкозамина резко понижает сродство рецептора к большинству утиных вирусов. В отличие от вирусов уток, у всех исследованных нами вирусов чаек, относящихся к пяти субтипам, сродство к фукозилированному SLex не ниже, чем к исходному 3`SLN. Для специализированных к чайкам вирусов субтипа Н13 SLex является одной из оптимальных рецепторных группировок.
Столь же резкие отличия, связанные с хозяйской принадлежностью вирусов, наблюдаются и в отношении к сульфатированным по шестому положению третьего звена рецепторам. Для большинства тестированных нами утиных вирусов наличие этой группировки не сказывается на связывании. Но для вирусов цыплят, свиней, вируса лошади и вируса тюленя сульфатирование повышает сродство к определенным типам рецепторов. Так, резко повышено сродство к Su-3`SLN у Н5 вирусов кур и у Н3 вируса лошади, а у всех свиных вирусов и у Н7 вирусов кур и тюленя резко повышено сродство к Su-SLex.
Полученные результаты свидетельствуют, что, несмотря на то, что птичьи вирусы гриппа, как правило, распознают Sia2-3Gal, они могут отличаться по способности распознавать последующие сахаридные звенья рецептора. Из этого следует, что разные виды птиц могут отличаться по способности генерировать вирусы, потенциально опасные для человека.
Рецепторная специфичность вирусов гриппа чаек
До наших исследований вирусы гриппа уток и чаек характеризовались как единая группа, которую было принято называть вирусами диких водоплавающих птиц (wild aquatic birds) (Alexander, 2000; Webster and Bean, 1998). В 1997 году было показано, что Н13 вирусы чаек отличаются от вирусов уток других субтипов тем, что их сродство к 3`сиалиллактозе не выше, чем сродство к свободной к -нейраминовой кислоте (Neu5Ac). Иными словами, если для утиных вирусов минимальной рецепторной детерминантой является Sia2-3Gal, то для Н13 вирусов вклад галактозы в связывание не существенен (Matrosovich et al., 1997). Для более детального сравнения вирусов чаек с типичными представителями вирусов уток мы определили сродство этих вирусов к Neu5Ac, к 3`сиалиллактозе, и к полимерным гликоконьюгатам, несущим группировки: 6`SLN, 3`SLN, SLex, SLea и SLec.
Все исследованные вирусы гриппа чаек, так же как и вирусы уток, адаптированы к 2-3-связанной сиаловой кислоте. Однако структура оптимального рецептора для вирусов уток и чаек различается. Общим свойством всех тестированных вирусов чаек, с гемагглютининами H4, H5, H6, H13, H14 и H16 субтипов является высокое сродство к фукозилированным рецепторам.
Для вирусов чаек 4, 5, 6 и 14 субтипа оптимальным рецептором является SLea, то есть у них сохраняется характерное для утиных вирусов предпочтение рецепторов, основанных на дисахариде Gal1-3GlcNAc. У вирусов субтипов Н13 и Н16 сродство к 3`SLN выше чем к Sleс, а сродство к Sleх выше чем к Sleа. Т.е. они лучше распознают рецепторы, основанные на дисахариде второго типа (Gal1-4GlcNAc).
Повышенное сродство к фукозилированным рецепторам у вирусов чаек сопровождается перестройкой 222-228 петли гемагглютинина (Табл. 2). У Н13 вирусов заменены консервативные Val223 и Gly228; крупная аминокислота в 222 позиции заменена на мелкую, и мелкая в 227 позиции - на крупную.
Таблица 2. Сравнение строения 222-228 петли гемагглютинина утиных вирусов и вирусов чаек субтипов Н13, Н16, Н6 вирусов и вируса А/Чайка/ Москва/3100/2006 (Ч/Moсква) (H6N2)
№ аминокислот | 222 | 223 | 224 | 225 | 226 | 227 | 228 |
Консенсус HA вирусов уток | Lys, Pro, Аrg, Leu, Gln, Trp | Val | Asn Arg | Gly | Gln | Ala, Gly, Ser | Gly |
HA H13 | Gly | Tyr | Asp | Gly | Gln | Arg, Lys | Ser |
HA H16 | Gly | - | Asp | Gly | Gln | Arg | Ser |
Консенсус HA Н6 | Ala | Val | Asn | Gly | Gln | Arg | Gly |
HA Ч/Москва | Ala | Val | Ser | Gly | Gln | Arg | Gly |
Гемагглютинин 16 субтипа без сомнения происходит от 13 субтипа, так как в нем сохранены все замены, характерные для 13 субтипа. Однако там возникли новые, еще более радикальные замены (Tyr98/Phe, Ala138/Ser, Glu190/Tre и делеция 223 аминокислоты). В результате рецепторный фенотип вирусов 16 субтипа оказался совершенно необычным. Интересно, что к ним вернулась утраченная у Н13 вирусов способность связывать 3`SL с более высоким сродством, чем Neu5Ac что указывает на существенный вклад галактозы в связывание. Сродство к мономерной 3`SL высокое, но при этом сродство к заякоренным на полимере рецепторам низкое. Максимальное сродство - к SLex. Возможно оптимальная рецепторная группировка для Н16 вирусов в ее природном контексте нами еще не найдена.
H6N2 вирус А/Чайка/ Москва/3100/2006, выделенный нами из фекалий чайки осенью 2006 на Московском пруду в Тропарёво, связывает фукозилированные Slex и Slea значительно лучше, чем исходные соединения.
По сравнению с консенсусом утиных вирусов, у Чайка/ Москва/3100, как и у всех Н6 вирусов в 222 позиции вместо массивной аминокислоты стоит Ala; помимо этого по сравнению с консенсусом Н6 вирусов имеется еще одна замена Asn224/Ser (табл. 2). Сочетание этих замен как раз там, куда направлена группа фукозы, создает, вероятно, особо благоприятные условия для связывания фукозилированных рецепторов.
На примере Н4 вирусов видно, что характерная способность распознавать SLex не хуже, чем 3`SLN появляется немедленно после переход утиных вирусов к чайкам. Так, в верхушечной части гемагглютинин вируса Крачка/Бурятия/1901/00 (H4N6) отличается от вируса Утка/Бурятия /1905/00 (H4N6) единственной аминокислотной заменой Ser205/Pro, однако измененный чаячий рецепторный фенотип у него уже сформирован. Ser205 тесно зажат между несколькими участками цепей гемагглютинина. С одной стороны он прижимается к гидрофобному "узлу" составленному из Val204, Leu243, Ile245 и Trp180 Trp. Важно подчеркнуть, что 204 и 180 аминокислоты константны для всех субтипов, а в 204 и 243 позиции постоянна гидрофобная аминокислота.
С другой стороны Ser205 вклинивается между Arg220 и Pro221 соседней субъединицы гемагглютинина. Обе эти аминокислоты константны для всех субтипов. Это позволяет нам утверждать, что структура данного участка консервативна. Замена маленького серина на более крупный пролин, который, к тому же, вносит излом в белковую цепь, должна сильно нарушить локальную структуру гемагглютинина. Подвижки 220 и 221 аминокислот неизбежно вызовут смещения контактирующих с ними 222, 229, 228 и 226 аминокислот. 222 аминокислота, как следует из данных приведенных ниже, играет ключевую роль во взаимодействии с фукозой. Очевидно, именно вследствие этой перестройки фукоза в группировках Slex и Slea перестает препятствовать связыванию.
Вирусы чаек 14-го субтипа по рецепторным свойствам напоминают вирусы чаек четвертого и шестого субтипов - максимальное, причем высокое сродство к SLeа. Этот рецепторный фенотип характерен для ВГ чаек тех эволюционных ветвей, которые совсем недавно отделились от утиных вирусов и, возможно, сохраняющих способность инфицировать уток. Имеются и утиные изоляты с таким же рецепторным фенотипом - Шилохвость/Приморье/695/76 (H2N3), Кряква/Гурьев/244/82 (H14N6). Возможно - это вирусы смешанных очагов, где утки и чайки живут в близком соседстве и обмениваются вирусами.
Подводя итог, можно сказать, что самым общим и самым постоянным свойством вирусов чаек является их способность связывать фукозилированные рецепторы. Такое свойство не могло возникнуть случайно и независимо в большом числе эволюционных линий, и оно явно свидетельствует о том, что при переходе от уток к чайкам вирус адаптируется к новому, фукозилированному рецептору.
Рецепторная специфичность вирусов гриппа свиней
Сравнительное сродство вирусов свиней к клеткам мишеням утки, свиньи и мартышки
Изменение рецепторной специфичности вирусов гриппа при смене хозяина по всей вероятности должна повышать сродство вирионов к новой хозяйской клетке, то есть при переходах вируса от уток к свиньям и к людям можно ожидать соответствующих изменений рецепторных фенотипов. Для проверки этого положения, мы сравнили способность вирусов связываться с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки, трахеи свиньи и трахеи зеленой мартышки. Вирусы уток хорошо связываются со всеми тремя субстратами. Вирусы свиней связываются с мембранами клеток кишечника утки хуже, чем утиные вирусы. Для них падает доля подходящих рецепторов на клетках кишечника утки. H1N1 вирусы человека практически перестают связываться с клетками кишечника утки. Вирусы свиней лучше всего связываются с мембранами из трахеи свиньи, а вирусы человека - с мембранами из трахеи мартышки. Это указывает на то, что состав сиалосахаридов на этих трех типах клеток не совпадает и вирусы приспособлены к рецепторам своих хозяйских клеток. Для детализации рецепторного фенотипа ВГ свиней мы воспользовались полимерами, несущими разные рецепторные аналоги.
Распознавание типа связи между сиаловой кислотой и галактозой(2-3 vs. 2-6).
Исследование проводили с помощью рецепторных аналогов 3`SL, 6`SL, 6`SLN и 6`SLN(Gc), пришитых к полимеру, меченному биотином. На рис.1 представлен пример подобного опыта. Полученные данные представлены в виде графиков Скетчарда. Вирус A/Sw/Saskatchewan/18789/02 (H1N1) по всем генам соответствует птичьим вирусам гриппа (Уavian-likeФ вирус), хотя и выделен из свиньи (Karasin et al., 2004) A/Sw/Wisconsin/H03H04/03 (H1N2) несет гемагглютинин классических свиных вирусов, ведущих свое начало со времен пандемии Испанки в 1918 году, а A/Sw/Wisconsin/R7C/01 несет поверхностные белки от современных человеческих H3N2 вирусов.
Рис. 1. Графики Скетчарда связывания биотинилированных полимеров, несущих группировки 6`SLN-, 6`SL- и 3`SL- со свиными вирусами: с классическим свиным гемагглютинином, с л человеческим Н3 гемагглютинином и с лаvian-like гемагглютинином.
Из рисунка видно, что Уavian-likeФ вирус связывает все три типа рецепторов (3`SL, 6`SL, 6`SLN), причем лучше всего - первый из них, отличаясь от птичьих вирусов только принципиальной возможностью связывать 6`SL и 6`SLN рецепторы. Два других вируса связывают только рецепторы с сиалил2-6галактозной связью, причем 6`SLN существенно лучше, чем 6`SL.
Такой характер связывания типичен для современных ВГ человека (Gambaryan et al., 1997 and 1999; Mochalova et al., 2003), но до сих пор не был описан для свиных вирусов. Во всех предыдущих исследованиях у свиных вирусов регистрировали двойную рецепторная специфичность (Rogers and D`Souza, 1989; Gambaryan et al., 1997; Matrosovich et al., 1997, 2000; Маринина и др., 2004). Однако во всех этих исследованиях работали со свиными вирусами, изолированными на куриных эмбрионах, в отличие от вирусов, использованных в этом исследовании.
Для прояснения картины мы протестировали с помощью пяти вышеупомянутых меченных рецепторных аналогов четыре группы свиных вирусов, а именно:
- Изолированные на клетках МДСК вирусы с классическим свиным ГА
- Изолированные в куриных эмбрионах вирусы с классическим свиным ГА
- Изолированные на клетках МДСК вирусы с Н3 ГА человека.
- Изолированные на клетках МДСК Уavian-likeФ вирусы с Н1 и Н3 ГА.
Для сравнения использовали два типичных птичьих вируса A/Duck/Hong Kong/717/79 (H1N3) и A/Duck/Alberta/35/76 (H1N1).
Из таблицы 3 видно, что
- Никакие из вирусов, кроме Уavian-likeФ Н3, не распознают 6`SLN(Gc) - рецептор. Это противоречит гипотезе Ito (1998), что свиные вирусы адаптируются в гликолильной форме сиаловой кислоты - доминирующей на сиалохаридах дыхательного тракта свиньи.
- Утиные вирусы распознают только 3`SL рецепторы - в составе фетуина и полимера.
- Вирусы, выделенные на куриных эмбрионах, хорошо связываются с фетуином и распознают как человеческий так и птичий рецепторы, в полном согласии с ранее опубликованными данными (Rogers and D`Souza, 1989; Gambaryan et al., 1997; Matrosovich et al., 1997, 2000; Маринина и др., 2004).
- Такой же рецепторной специфичностью обладают и Уavian-likeФ вирусы с Н1 и Н3 ГА изолированные на клетках МДСК.
Таблица 3. Константы диссоциации комплексов вирусов с фетуин-пероксидазой и с биотинилированными полимерами (1000 kD), несущими сиалосахаридные остатки.
Вирусы | Субтип | Фетуин | Сахаридные остатки: | |||
3`SL | 6`SL | 6`SLN | 6`(Neu5Gc)LN | |||
С классическим свиным НА, изолированные на МДЦК | ||||||
Sw/Wisconsin/HO3HS5/03 | H1N1 | 0.5 | >5 | 0.03 | 0.01 | >5 |
Sw/Wisconsin/HO3G1/03 | H1N1 | 0.5 | >5 | 0.1 | 0.05 | >5 |
Sw/Wisconsin/R33F/01 | H1N2 | 0.5 | >5 | 0.2 | 0.04 | >5 |
Sw/Wisconsin/R36C/01 | H1N2 | 1 | >5 | 0.2 | 0.02 | >5 |
Sw/Wisconsin/R46F/01 | H1N2 | 0.5 | >5 | 0.2 | 0.05 | >5 |
Sw/North Carolina/93523/01 | H1N2 | 1 | >5 | 0.05 | 0.01 | >5 |
Sw/North Carolina/98225/01 | H1N2 | 1 | >5 | 0.2 | 0.05 | >5 |
Sw/Wisconsin/H03H04/03 | H1N2 | 1 | >5 | 0.06 | 0.01 | >5 |
Sw/Iowa/930/01 | H1N2 | 1 | >5 | 0.1 | 0.05 | >5 |
С классическим свиным НА, изолированные на куриных эмбрионах | ||||||
Sw/Iowa/1976/31 | H1N1 | 0.03 | 0.03 | 0.2 | 0.05 | >5 |
Sw/Indiana/1726/88 | H1N1 | 0.05 | 0.05 | 0.15 | 0.05 | >5 |
Turkey/Kansas/4880/80 | H1N1 | 0.03 | 0.1 | 0.4 | 0.2 | >5 |
человеческие, выделенные от свиней, изолированные на МДЦК | ||||||
Sw/Wisconsin/HO3HB4/03 | H3N2 | >1 | >5 | 0.04 | 0.01 | >5 |
Sw/Wisconsin/R5E/01 | H3N2 | >1 | >5 | 0.1 | 0.02 | >5 |
Sw/Wisconsin/R5I/01 | H3N2 | >1 | >5 | 0.3 | 0.04 | >5 |
Sw/Wisconsin/R6H/01 | H3N2 | >1 | >5 | 0.5 | 0.1 | >5 |
Sw/Wisconsin/R7C/01 | H3N2 | >1 | >5 | 0.3 | 0.03 | >5 |
Sw/Wisconsin/RP5G/01 | H3N2 | >1 | >5 | 0.5 | 0.1 | >5 |
Avian-like, выделенные от свиней, изолированные на МДЦК | ||||||
Sw/Saskatchewan/18789/02 | H1N1 | 0.01 | 0.02 | 0.1 | 0.05 | >5 |
Sw/Ontario/K0477/01 | H3N3 | 0.03 | 0.01 | 0.1 | 0.1 | 1 |
Sw/Ontario/42729/01 | H3N3 | 0.03 | 0.01 | 0.1 | 0.1 | 1 |
Утиные вирусы, изолированные на куриных эмбрионах | ||||||
Dk/Hong Kong/717/79 | H1N3 | 0.03 | 0.02 | >1 | >1 | >5 |
Dk/Alberta/35/76 | H1N1 | 0.05 | 0.03 | >1 | >1 | >5 |
*Для вирусов гриппа А обозначение А/ в названии опущено.
Sw - swine, Dk - duck, Ch - Chicken
** мкМ по сиаловой кислоте
Приводятся усредненные данные трех опытов; стандартная ошибка не превышает 50% от представленных величин
- Все вирусы первой и третьей группы, обладают рецепторной специфичностью, типичной для человеческих ВГ. Они совершенно не распознают 3`SL рецептор. H3N2 вирусы, как и современные человеческие H3N2, не связывают фетуин; H1N1 и H1N2 сохранили небольшую способность связывать фетуин, что, опять же, характерно для человеческих H1N1 вирусов.
Чтобы понять, с чем связано расхождение результатов данного исследования, проведенного в основном на вирусах, изолированных на культуре клеток МДСК, от результатов полученных ранее на свиных вирусах, выделенных на куриных эмбрионах, мы проанализировали последовательности H1 HА депонированные в Лос-Аламосовской базе данных. Все Н1 вирусы, выделенные от свиней и индюшек имеют замену Glu190/Asp(Asn) по сравнению с консенсусом вирусов уток. У вирусов выделенных позднее 2000 года, как правило, заменена также 225 аминокислота: Gly225/Asp. Отметим, что именно эти две замены ответственны за рецепторный фенотип человеческих H1N1 вирусов. Причем, при адаптации человеческих ВГ к куриным эмбрионам очень часто возникает реверсия Asp225/Gly, возвращающая вирусу способность связывать птичий сиалил2-3галактозный рецептор (Gambaryan et al., 1999; Matrosovich et al., 2000).
Мы предполагаем, что наличие Asp225 в свиных ВГ после 2000 года связано не с реальным изменением вирусов, а с изменением способа выделения. После того, как были открыты вторичные линии свиных вирусов, происходящие из человеческих ВГ, стал практиковаться метод выделения свиных вирусов на клеточной культуре, так как современные человеческие вирусы плохо выделяются в куриных эмбрионах.
При выделении на культуре, содержащей сиалил2-6галактозные рецепторы, вирусу нет необходимости настраиваться на птичий рецептор и он сохраняет свой исходный генотип и фенотип. Таким образом, мы наблюдаем глубокий параллелизм в формировании рецепторной специфичности человеческих и свиных H1N1 вирусов.
Распознавание Sia2-3Gal рецепторов с разным сахаридным кором.
Первичная замена Glu190/Asp дает вирусу возможность связывать 6`SLN Црецепторы, однако сохраняет возможность связывать и 3`SL-рецепторы. Такой двойной рецепторной специфичностью обладали некоторые изоляты вируса лиспанки и Уavian-likeФ вирусы свиней, недавно перешедшие от птиц к свиньям.
Мы исследовали рецепторную специфичность ряда ВГ H1N1, изолированных от свиней и индеек с сочетанием Asp190 и Gly225 с помощью полимеров, несущих группировки 6`SLN, SLec, Su-SLec, 3`SLN, Su-3`SLN, SLex и Su-SLex. Все вирусы связывали 6`SLN, однако все они с максимальным сродством связывали Su-SLex.
Поводя итог, можно сказать, что адаптация птичьего вируса к свиньям проходит через две фазы. Вирусы, попавшие в свиней недавно (Уavian-likeФ) обладают смешанным рецепторным фенотипом, распознавая как 2-3, так и 2-6 связь между сиаловой кислотой и галактозой, и с тенденцией к увеличению сродства к сульфатированным рецепторам. Однако специализированные к свиньям вирусы, так же как и человеческие, перестают распознавать Sia2-3Gal рецепторы, и настроены на 6`SLN.
Для Уavian-likeФ вирусов оптимальными являются сульфатированные формы Sia2-3Gal рецепторов, в первую очередь Su-SLex. Как было показано выше, именно к этой форме рецептора адаптируются ВГ домашней птицы. Вирусы, классической линии начинают с высоким сродством распознавать этот же рецептор в результате одной реверсии Asp/Gly225, при этом вирус сохраняет способность инфицировать свиней.
Многие исследователи (Lipkind et al., 1984, Altmuller et al., 1992; Wright et al. 1992; Suarez et al., 2002; Choi et al., 2004) описывали межвидовую трансмиссию ВГ между свиньями и индейками. Можно высказать гипотезу, что способность распознавать куриный рецептор облегчает такую трансмиссию. Регулярная трансмиссия между свиньями и птицами (в особенности, если в ней участвуют и дикие синантропные птицы, например голуби и воробьи) может давать эволюционные преимущества вирусу, облегчая его распространение.
Рецепторная специфичность H5 вирусов
Повышенный интерес к H5N1 вирусам и необычная рецепторная специфичность тех образцов, который были тестированы в первоначальном исследовании стимулировали нас обследовать рецепторную специфичность широкого набора Н5 вирусов из коллекций США (Department of Virology and Molecular Biology, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee, и CDC, Atlanta, Georgia). Непатогенные утиные вирусы использовались для сравнения. Мы обследовали представителей нескольких эволюционных ветвей, включавших непатогенные утиные евроазиатские вирусы, американскую линию, включающую вирусы как диких уток так и домашней птицы, и высоко патогенную южноазиатскую линию H5N1 вирусов. Для сравнения, в этих же опытах проставляли ряд других вирусов: ВГ диких уток и человека.
Использовали 9 типов полимеров. Асиаловый 3'-O-Su-Lec, - для контроля; 6`SLN, SLec, Su-SLec, 3`SLN, Su-3`SLN, SLex, Su-SLex и Slea. Ни один из испытанных вирусов не связывал асиаловый сахарид 3'-O-Su-Lec, что доказывает адекватность использованной методики. Как и следовало ожидать, два, взятых для сравнения, человеческих вируса, не связывали ни один из 3`-сиалозидов и хорошо связывали 6`SLN.
Рецепторные фенотипы первичных утиных вирусов американской, дальневосточной и юговосточной линий близок к типичному рецепторному фенотипу утиных вирусов прочих субтипов, а именно: сульфатирование не сказывается на связывании рецептора с вирусом, а фукозилирование резко понижает сродство. В эволюционных линиях, адаптирующихся к домашней птице, рецепторная специфичность меняется - возрастает сродство к сульфатированному 3`SLN. Это свойство независимо появляется как в американской, так и Южно-азиатской линии вирусов, и особенно ярко выражено у высоко патогенных H5N1 вирусов.
Вирусы линии, доминирующей в Индонезии, Камбоджи, по-прежнему циркулируют среди домашних птиц. Они приобрели особо высокую патогенность как для кур, так и для млекопитающих, включая человека. У этих вирусов продолжается возрастание сродства к сульфатированным рецепторам, в частности выросло сродство к сульфатированному и фукозилированному рецептору Su-SLex. Напомним, что это же соединение является оптимальным рецептором вируса куриной чумы - FPV/Rostok/34 (H7N1). Другая, китайская линия H5N1 вирусов характеризуется активным возвратом к диким природным хозяевам: - уткам, гусям и т.д. В этой группе наблюдаются возврат рецепторного фенотипа к исходному. У ряда вирусов сульфатирование не повышает, а понижает сродство к рецептору.
К этой же группе относятся весьма интересные изоляты: Hong Kong/212/2003 и Hong Kong/213/2003. Эти вирусы были выделены от отца и сына, входящих в семейную группу заболевших людей (От других заболевших и умерших не было взято материала для исследования) (Guan et al., 2004). У обоих изолятов резко сдвинутая рецепторная специфичность - они приобрели способность распознавать человеческий рецептор 6`SLN, в то время как сродство к птичьим рецепторам у них упало (Shinya et al., 2005; Gambaryan et al., 2006). Сравнение аминокислотных последовательностей рецепторного участка Н5 вирусов выявляет у изолятов Hong Kong/212/2003 и Hong Kong/213/2003, замену Ser227/Asn по сравнению с близкородственными вирусами. Важно отметить, что замена Ser227/Asn не встречается в вирусах, выделеных от птиц, и ее наличие в обоих человеческих изолятах резко усиливает подозрение, что эта мутация произошла в больном человеке, и что дальнейшая передача вируса уже происходила внутри данной семейной группы, от человека к человеку. Такая сцепка между сдвигом рецепторной специфичности в сторону распознавания человеческого рецептора и способностью вируса передаваться от человека к человеку может быть рассмотрена как модель формирования пандемического штамма.
Молекулярные механизмы распознавания Su-3`SLN у Н5 вирусов.
Анализ аминокислотных замен у Н5 вирусов помогает понять механизм повышенного сродства к сульфатированным рецепторам. Большинство Н5 вирусов в 193 позиции несут лизин или аргинин - то есть положительно заряженные аминокислоты. Исключениями являются Turkey/Wisconsin/68 и Goose/Vietnam/113/2001, у которых лизин заменен на отрицательно заряженную глютаминовую кислоту. В обоих случаях сродство к сульфатированному рецептору резко падает и становится существенно ниже, чем у несульфатированного аналога (Табл 4).
Таблица. 4 Константы диссоциации Н5 вирусов отличающихся по 193 аминокислоте к сульфатированным и исходным рецепторам.
193 а.о. | 3`SLN | Su- 3`SLN | SLex | Su- SLex | SLec | Su- SLec | ||
Turkey/California/6878/79 | H5N3 | Lys | 5* | 1 | >50 | 10 | 4 | 4 |
Turkey/Wisconsin/68 | H5N8 | Asp | 5 | 50 | >50 | >100 | 3 | 10 |
Goose/Vietnam/324/2001 | H5N1 | Lys | 5 | 5 | 50 | 30 | 5 | 5 |
Goose/Vietnam/113/2001 | H5N1 | Asp | 5 | 40 | 40 | >100 | 3 | 5 |
*См подпись под табл. 3.
Повышенным сродством к Su-3`SLN обладают также H3N8 вирусы лошадей с Lys193 в HA (Gambaryan et al., 2004, 2005, 2007). Н7 вирусы, которые также обладают повышенным сродством к сульфатированным рецепторам, тоже содержат Lys в 193 позиции гемагглютинина.
Все эти данные согласуются с нашей гипотезой, что электростатические взаимодействия положительно заряженной аминогруппы лизина или аргинина 193 с отрицательно заряженной сульфогруппой обеспечивают высокое сродство вирусов с Su-3`SLN. (Gambaryan и др., 2004).
Молекулярное моделирование вмещения рецепторов в рецептор-связывающий участок (РСУ) иллюстрирует, почему повышено сродство именно к Su-3`SLN а не к Su-SLec (Рис. 2). Сульфа-группа Su -3`SLN направлена в сторону лизина 193, а у Su-SLec она направлена в свободное пространство.
Рис. 2. Расположение сульфатированных рецепторов Su-SLec и Su-3`SLN в РСУ Н5 вируса. Рецептор вмещен в РСУ гемагглютинина закристализованного в присутствии рецептора LSTa (1JSN, Brookhaven Protein Databank, Ha et al., 2001) путем наложения галактозы Su-SLec или Su-3`SLN на галактозу LSTa. Основная часть рецептора представлена в формате УstickФ, за исключением сульфа-группы. Лизин 193 помечен.
Рецепторная специфичность вирусов других субтипов, адаптирующихся к домашней птице.
Сходство рецепторной специфичности высокопатагенных H5N1 вирусов и куриного вируса FPV/Rostok/34 стимулировали нас обследовать рецепторную специфичность вирусов других субтипов, адаптирующихся к домашней птице, в первую очередь тех, среди которых отмечались случаи инфицирования людей.
Результаты анализа вирусов разных хозяев других субтипов представлены в таблице 5.
Из таблицы видно, что разнообразие рецепторных фенотипов у разных птичьих вирусов крайне велико, начиная от типично лутиных фенотипов, и кончая способностью связывать человеческий рецептор, не хуже, чем птичий. Видно, также, что рецепторные фенотипы зависят скорее от хозяйской принадлежности, чем от субтипа вирусов. Вирусы диких уток 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го, 9-го и 10-го субтипов как и утиные вирусы описанные выше, лучше всего связывают нефукозилированные рецепторы с 1-3 связью между галактозой и последующим звеном: SLeс и STF; не реагируют на сульфатирование рецептора, а фукозилированные рецепторы SLea и SLeх связывают значительно хуже, чем исходные сахариды. Сродство к человеческому рецептору 6`SLN у них исключительно низко.
Близким рецепторным фенотипом обладают вирусы Chicken/14/76, Turkey/England/69, Goose/VN/324/01, Goose/VN/113/01, Turkey/WI/01/1996. В случае Chicken/14/76, Turkey/England/69 и Turkey/WI/01/1996 это может объясняться эволюционной близостью с утиными вирусами. H5N1 вирусы Goose/VN/324/01и Goose/VN/113/01 относятся к группе, безусловно отошедшей от эволюционной ветви, предварительно глубоко адаптированной к курам. Их рецепторный фенотип иллюстрирует повторную адаптацию к птицам отряда Anseriformes. Вирусы шестого субтипа отличаются от утиных вирусов толерантностью к фукозилированию рецептора - сродство к SLeх у них не ниже, чем к 3`SLN. В этом отношении они напоминают вирусы чаек разных субтипов (H4, H5, H6, H13 и H14).
Таблица. 5 Рецепторная специфичность вирусов гриппа домашней птицы
вирусы | Субтип | 6`SLN | 3`SLN | Su- 3ТSLN | SLex | Su- SLex | SLec | Su- SLec | STF | SLea |
Duck/Hong Kong/193/77 | H1N2 | >5000 | 10 | 10 | >100 | >100 | 10 | 10 | 10 | >100 |
Duck/Hong Kong/717/79 | H1N3 | >5000 | 10 | 10 | >100 | >100 | 10 | 10 | 10 | >100 |
Duck /Hong Kong/278/78 | H2N9 | >5000 | 20 | 10 | >50 | >50 | 10 | 10 | 10 | >50 |
Duck/Nanchang/2-0485/00 | H2N9 | >5000 | 20 | 10 | >50 | >50 | 10 | 10 | 10 | >50 |
Duck/Buryatia/652/88 | H3N8 | >5000 | 10 | 10 | 50 | 50 | 5 | 5 | 5 | 50 |
Mallard/New York/670/78 | H4N6 | >5000 | 4 | 8 | 100 | >200 | 2 | 4 | 8 | 100 |
Duck/Primorie/3/82 | H9N2 | >5000 | 10 | 8 | 100 | 30 | 8 | 5 | 5 | 100 |
Mallard/Netherlands/02/00 | H10N4 | >5000 | 20 | 7 | >50 | 30 | 5 | 5 | - | - |
Chicken/Hong Kong/14/76 | H1N1 | >5000 | 10 | 10 | >100 | >100 | 20 | 20 | 5 | >100 |
Turkey/England/69 | H3N2 | >5000 | 2 | 8 | 40 | 50 | 3 | 5 | 5 | 50 |
Goose/Vietnam/324/01 | H5N1 | >5000 | 5 | 5 | 50 | 30 | 5 | 5 | - | - |
Goose/Vietnam/113/01 | H5N1 | >5000 | 5 | 40 | 40 | >100 | 3 | 5 | - | - |
Shearwater/Australia/1/72 | H6N5 | >5000 | 20 | 30 | 10 | 30 | 15 | 15 | 15 | 10 |
Teal/Hong Kong/W312/97 | H6N1 | >5000 | 50 | >50 | 20 | >50 | 20 | >50 | ||
Turkey/Massachussetts/65 | H6N2 | >5000 | 20 | 30 | 20 | 30 | 10 | 20 | 20 | 50 |
Chicken/New York/13237-6/98 | H6N8 | >5000 | 7 | 10 | 7 | 20 | 5 | 10 | 5 | 10 |
A/Turkey/Virginia/4529/02 | H7N2 | 200 | 2 | 1 | 20 | 4 | 10 | 10 | 5 | >100 |
Avian/ New York /273874/03 | H7N2 | 500 | 10 | 2 | 30 | 8 | 20 | 15 | - | - |
Ch/New Jersey/294598-12/04 | H7N2 | 200 | 5 | 1 | 20 | 5 | 5 | 2 | - | - |
Chicken/Delaware/296763-2/04 | H7N2 | 200 | 15 | 5 | 30 | 15 | 20 | 15 | - | - |
New York/107/03 | H7N2 | 200 | 10 | 2 | >100 | 15 | 20 | >100 | - | - |
Netherlands/219/03 | H7N7 | 500 | 4 | 1 | 5 | 0.5 | 5 | 5 | 5 | 50 |
Netherlands/230/03 | H7N7 | 500 | 4 | 1 | 5 | 0.5 | 5 | 5 | 5 | 50 |
Netherlands/231/03 | H7N7 | 500 | 4 | 1 | 5 | 0.5 | 5 | 5 | 5 | 50 |
Goose/Minnesota/5773/80 | H9N2 | >5000 | 20 | 10 | 50 | 20 | 10 | 10 | 20 | 50 |
Turkey/Wisconsin/1/96 | H9N2 | >5000 | 5 | 5 | 20 | 30 | 2 | 2 | 20 | 10 |
Turkey/Minnesota/38391-6/95 | H9N2 | >5000 | 10 | 10 | 10 | 20 | 5 | 5 | 10 | 5 |
Chicken/New Jersey/12220/97 | H9N2 | >5000 | 5 | 5 | 0.5 | 0.5 | 5 | 5 | 7 | 2 |
Pheasant/Wisconsin/1780/88 | H9N2 | >5000 | 10 | 3 | 2 | 1 | 10 | 10 | - | - |
Chicken/Korea/96323/96 | H9N2 | >5000 | 10 | 3 | 30 | 10 | 10 | 3 | - | - |
Turkey/Kandeijoni/73 | H9N2 | 200 | 20 | 5 | 20 | 3 | 20 | 5 | - | - |
Chicken /Hong Kong/FY20/99 | H9N2 | 50 | >100 | 3 | >100 | 5 | >100 | >100 | - | - |
Chicken /Hong Kong/G9/97 | H9N2 | 50 | >100 | 5 | >100 | 10 | >100 | >100 | - | - |
Chicken /Hong Kong /SF3/99 | H9N2 | 50 | >100 | 3 | >100 | 5 | >100 | >100 | - | - |
Hong Kong/2/08/03 | H9N2 | 50 | >100 | 10 | >100 | 10 | >100 | >100 | - | - |
Chicken/Pakistan/02/99 | H9N2 | 10 | >100 | 0.1 | >100 | 1 | >100 | >100 | - | - |
Quail/Hong Kong/SSP10/99 | H9N2 | 50 | >100 | 5 | >100 | 10 | >100 | >100 | - | - |
Quail/Hong Kong/G1/97 | H9N2 | 10 | >100 | >100 | 20 | 20 | >100 | >100 | - | - |
Hong Kong/1073/99 | H9N2 | 5 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | - | - |
Swine/Hong Kong/9/98 | H9N2 | 50 | >100 | 1 | >100 | 2 | >100 | >100 | - | - |
Equine/Kentucky/5/02 | H3N8 | >5000 | 3 | 1 | 10 | 1 | 4 | 2 | - | - |
Equine/Ohio/1/03 | H3N8 | >5000 | 3 | 0.5 | 5 | 0.4 | 4 | 1.5 | - | - |
Canine/Florida/43/04 | H3N8 | >5000 | 3 | 0.5 | 5 | 0.4 | 4 | 1.5 | - | - |
*См подпись под табл. 3.
H7 вирусы можно квалифицировать, как вирусы, адаптированные к курам. Наподобие куриных Н5 они адаптированы к сульфатированным рецепторам на базе дисахарида второго типа: Gal1-4GlcNAc. Американсткие изоляты, включая человеческий А/New York/107/03 (H7N2) с максимальным сродством связываются с Su-3`SLN, а H7N7 вирусы, изолированные от людей в 2003 в Нидерландах - с Su-SLex. Отличительной чертой этих вирусов является умеренная способность связывать 6`SLN-рецептор.
Среди Н9 вирусов встречается все мыслимое разнообразие рецепторных фенотипов. Некоторые из Американских вирусов (Goose/Minnesota/73, Turkey/WI/01/1996, Turkey/MN38391-6/1995) как и российские Н9 вирусы уток, обладают типичным лутиным рецепторным фенотипом.
Вирусы Chicken/NJ/12220/97 и Pheasant/Wisc/1780/88 лучше всего связываются с фукозилированными сиалосахарами Slex and Su-Slex. Вирус Ck/Korea/96323/96 предпочитает сульфатированные рецепторы; к фукозилированным сахарам - сродство понижено. Эти вирусы, как и все американские Н9 совершенно не связывают 6`SLN.
Все исследованные южноазиатские Н9N2 вирусы, как и было показано ранее М.Н.Матросовичем, (Matrosovich et al., 2001) утратили способность связывать рецепторы 3`SLN, SLec, Su-SLec , SLex. Все они, в той, или другой степени, связывают 6`SLN. Однако для большинства из них сродство к сульфатированным Sia2-3Gal рецепторам на базе дисахарида второго типа Gal1-4GlcNAc (Su-3`SLN и Su-Slex) выше, чем к 6`SLN. Важно подчеркнуть, что к сульфатированному Sleс сродство совершенно не повышено - это указывает на то, что позиция сульфогруппы, приводящая к резкому (более чем в 100 раз) повышению сродства строго определена. Вирусы лошадей (Н3N8), включая родственный им вирус, выделенный от собаки (Crawford et al., 2005), строго адаптированы к Sia2-3Gal - рецепторам и предпочитают сульфатированные формы: Su-3`SLN или Su-SLex.
Механизм распознавания фукозилированного и сульфатированного рецептора Su-SLex .
Рис.3 Расположение фукозилированного рецептора Su-SLex в РСУ утиного Н3 вируса. Рецептор вмещен в РСУ гемагглютинина закристализованного в присутствии рецептора LSTa (1MQM, Brookhaven Protein Databank, Ha и др., 2003) путем наложения галактозы Su-SLex (2KMB, Brookhaven Protein Databank, Ng and Weis 1997) на галактозу LSTa. Основная часть рецептора представлена в формате УstickФ, за исключением фукозы и сульфогруппы (формат CPK). 222, 190 и 193 аминокислоты помечены.
Молекулярный механизм распознавания рецептора у вирусов гриппа уток разных субтипов одинаков. Их рецептор-связывающий участок эволюционно крайне стабилен и формируется рядом консервативных аминокислот (97, 98, 99, 134, 138, 139, 153, 183, 184, 190, 194, 195, 225, 226 и 228; нумерация по H3 здесь и далее). На рисунке 3 показано вмещение рецептора Su-SLex в РСУ утиного Н3 вируса. Видно, что фукоза рецептора Su-SLex перекрывается с крупной 222 аминокислотой (Trp222) гемагглютинина. Сульфагруппа, напротив, отдалена от поверхности гемагглютиниа и направлена в раствор (На рисунке - вперед).
Высокое сродство к Su-SLex у вирусов субтипов H1 и H9 сопровождается реконструкцией 222-228 петли и 190-194 -спирального участка гемагглютинина.
У всех H1N1 вирусов свиней, которые хорошо связывают Su-SLex заменена 190 аминокислота.
H9N2 вирусы Юговосточной Азии связывают Su-3`SLN и Su-SLex с равным сродством, что указывает на то, что перекрывание фукозы с кромкой РСУ, характерное для большинства утиных вирусов, отсутствует. Связывание с сульфатированными рецепторами Su-3`SLN и Su-SLex более чем в 100 раз сильнее, чем с исходными 3`SLN и SLex. В то же время сродство к Su-Sleс остается очень низким. Это указывает на то, что сульфогруппа рецептора, расположенная в конкретном положении, вступает в выгодные энергетические взаимодействия с гемагглютинином. У данных вирусов Gln226 заменен на Leu, а Glu190 на Ala, Tre или Val. На рис. 4 приведена модель расположения Su-SLex в РСУ H9N2 вируса A/Swine/Hong Kong/9/98, полученная путем наложения галактозы Su-SLex на галактозу рецептора LSTa, в составе комплекса с данным гемагглютинином (структура 1MQM, Brookhaven Protein Databank, Ha и др., 2001).
У данного вируса вследствие замены Gln226/Leu торcионный угол между сиаловой кислотой и галактозой отличается от этого угла в комплексах рецептора с гемагглютининами H3 и H5 птичьих вирусов, (Ha и др., 2001).
Вследствие этого изменения угла расположение фукозы и сульфо-группы меняется. Фукоза рецептора свободно возвышается над 222 и 227 аминокислотами, а сульфо-группа идеально входит в углубление между аминокислотами 186, 187 и 190, появившееся в этом месте гемагглютинина в результате замены Glu190 на Val. Таким образом замена Gln226/Leu, ответственная за повышение сродства к Sia2-6Gal рецепторам (Vines и др, 1998), в случае H9N2 обеспечивает, помимо этого, еще более высокое сродство к сульфатированным Sia2-3Gal рецепторам (Gambaryan и др., 2007).
Рис. 4 Расположение сульфатированного и фукозилированного рецептора Su-Sleх в РСУ вируса A/Swine/Hong Kong/9/98, полученная путем наложения галактозы Su-SLex на галактозу рецептора LSTa, в составе комплекса с данным гемагглютинином (структура 1JSD, Brookhaven Protein Databank, Ha и др., 2001). Основная часть рецептора представлена в формате УstickФ, за исключением сульфа-группы и фукозы (формат CPK). Помечены ключевые аминокислоты.
Связь между изменениями рецепторной специфичности вирусов гриппа при переходе к новым хозяевам и составом рецепторов на клетках мишенях разных хозяев.
Связывание вирусов с ганглиозидами, отличающимися длиной сахаридной ножки
В 1999 г. М.Н.Матросовичем было отмечено, что в разных эволюционных ветвях ВГ кур регулярно возникают такие признаки, как делеция в стеблевом участке нейраминидазы и появление дополнительных сайтов гликозилирования в области рецепторного кармана гемагглютинина (Matrosovich et al., 1999). Поскольку эти изменения заглубляют активные центры обоих оболочечных белков относительно внешней поверхности вириона, можно предположить, что вирус приспосабливается к рецепторам с более длинной углеводной цепью.
Для изучения влияния дополнительных сайтов гликозилирования на способность связываться с рецепторами мы исследовали связывание вирусов с ганглиозидными препаратами, различающимися числом сахаридных звеньев.
Для получения таких препаратов мы проводили двуступенчатую элюцию ганглиозидов из клеточных мембран и получали легкую фракцию, с 3-7 звенными ганглиозидами, и тяжелую фракцию, содержащую ганглиозиды с более длиной ножкой.
В таблице 6 приводятся значения относительного сродства ряда вирусов к двум препаратам "легких" ганглиозидов: из мозга быка и из эпителиальных клеток кишечника утки и к трем препаратам "тяжелых" ганглиозидов: из эпителиальных клеток кишечников утки, кишечника курицы и легких мартышки. (С "легкими" фракциями ганглиозидов из кишечника цыпленка и из легких мартышки ни один из испытанных вирусов гриппа не связывался)
Из таблицы видно, что вирусы уток примерно с равным сродством связываются со всеми препаратами ганглиозидов. Из этого следует, что ганглиозиды с короткой ножкой (легкая фракция) являются для них вполне хорошими субстратами.
ВГ человека совершенно не связываются с легкими фракциями ганглиозидов, кроме того, они не связываются и с тяжелыми ганглиозидами из кишечника утки. Эти результаты хорошо согласуются с данными Miller-Podraza et al., (2000).
Связывание вирусов кур с легкими фракциями ганглиозидов строго коррелирует с отсутствием сайта гликозилирования 158 аминокислоты. Ни один из вирусов с этим сайтом не связывается с легкими фракциями, в то время, как вирусы без сайта (включая вирус Тюленя Seal/Massachuset/1/80, родственный вирусу FPV/Rostok/34) - связывают. Однако картина связывания не так однородна, как для утиных вирусов. Вирусы кур связывают тяжелые фракции ганглиозидов кишечника курицы и трахеи мартышки с большим сродством, чем ганглиозиды кишечника утки. Очевидно, в этих препаратах есть более подходящая рецепторная детерминанта для этих вирусов.
Табл. 6. Относительное сродство вирусов гриппа уток, кур и людей к легкой (л) и тяжёлой (т) фракциям ганглиозидов из мозга быка (ГМБл), кишечника утки (ГКУл и ГКУт), кишечника курицы (ГККт) и трахеи мартышки (ГТМт)
ГМБл | ГКУл | ГКУт | ГККт | ГТМт | ||
Вирусы уток | ||||||
Duck/France/46/82 | H1N1 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
Duck/Alberta/35 | H1N1 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
Duck/New Jersey/1580/78 | H2N3 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
Pintail/Primorie/695/76 | H2N2 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
Duck/Buryatia/652/88 | H3N8 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
Duck/Buryatia/664/88 | H3N8 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
Duck/Czechoslovakia/56 | H4N6 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
Duck/Hong Kong/205/77 | H5N3 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
Duck/ Minnesota /1525/81 | H5N1 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
Duck/Hong Kong/308/78 | H5N3 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
Duck/Alberta/60/76 | H12N5 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
Вирусы кур | ||||||
Ch/Hong Kong/728/97 | H5N1 | 30 | 30 | 40 | 60 | 60 |
Ch/Hong Kong/220/97 * | H5N1 | <5 | <5 | 40 | 50 | 60 |
Ch/Hong Kong/786/97 * | H5N1 | <5 | <5 | 40 | 50 | 60 |
FPV/Rostok/34 * | H7N1 | <5 | <5 | 30 | 50 | 50 |
Вирус тюленя | ||||||
Seal/Massachuset/1/80 | H7N7 | 40 | 40 | 40 | 40 | 50 |
Изоляты H5N1 от людей | ||||||
Hong Kong/156/97 | H5N1 | 30 | 30 | 40 | 60 | 60 |
Hong Kong/481/97 | H5N1 | 30 | 30 | 40 | 50 | 60 |
Hong Kong/485/97 * | H5N1 | <5 | <5 | 50 | 60 | 70 |
Вирусы гриппа человека | ||||||
A/Chr/157/83 M * | H1N1 | <2 | <2 | <5 | 80 | 80 |
A/Singapore/1/57 | H2N2 | <2 | <2 | <5 | 50 | 80 |
A/NIB/26/90 M | H3N2 | <2 | <2 | <5 | 70 | 70 |
B/NIB/48/90 M | Type B | <2 | <2 | <5 | 80 | 80 |
- * Наличие сайта гликозилирования 158 аминокислоты
Относительное сродство - выраженное в процентах отношение сродства данного вируса к субстрату в условиях эксперимента и сродства в условиях максимально благоприятствующих связыванию (Отсутсвие всех блокаторов в реакционной смеси). Чем выше цифра в таблице - тем выше сродство вируса к субстрату.
Сравнение состава ганглиозидов в кишечниках курицы и утки
Полученные результаты побудили нас сравнить состав ганглиозидов на эпителиальных клетках кишечников курицы и утки (ЭККК и ЭККУ). На рис. 5 приведена хроматограмма разделения тотальных ганглиозидов из этих двух источников. Для сравнения использованы ГМБ. Видны существенные отличия в составе ганглиозидов ЭККК и ЭККУ. Доминирующий ганглиозид ЭККК совпадает по подвижности с GM1а. В ЭККУ соответствующего ганглиозида нет, а есть другой, с меньшей хроматографической подвижностью, и еще один, близкий по подвижности с GD1a. На дорожке 2 внизу хорошо заметно пятно, соответствующее примерно 10-15-звенному ганглиозиду кишечника курицы, а в кишечнике утки в этой зоне материала так мало, что он не виден на хроматограмме. Для анализа фракций ганглиозиды элюировали с хроматограммы и исследовали их способность связывать разные ВГ.
Результаты связывания ВГ с фракциями ГМБ соответствуют литературным данным. Как было показано Suzuki (1994) вирусы связываются с концевой СК, поэтому GM1а, несущий сиаловую кислоту при третьем от конца звене, не является рецептором ВГ. Хорошими рецепторами для вируса утки являются GD1a и GT1b с концевой структурой Neu5Ac2-3Gal1-3GalNAc.
Ганглиозид кишечника утки близкий, но не совпадающей по подвижности с GM1а хорошо связывает утиный вирус, следовательно содержат концевую СК. Весьма вероятно, что это GM1b с сиаловой кислотой при концевой галактозе. Следующий ганглиозид ЭККУ совпадает по подвижности и по способности связывать вирусы с GD1a. В кишечнике курицы ганглиозид, совпадающий по подвижности с GM1а не связывает вирусы, что наводит на мысль, что это и есть GM1а. На уровне GD1a и GT1b в кишечнике курицы материала мало, поэтому эти зоны тоже плохо связывают вирусы. Зато зона, соответствующая 10-15-звенным ганглиозидам связывает вирусы утки, курицы и человека.
Как мы показали выше, многие вирусы кур, с сайтом гликозилирования 158 аминокислоты, утратили способность связываться с легкими фракциями ганглиозидов. Отсутствие на клетках мишенях кур малозвенных ганглиозидов, поддерживающих связывание вирусов гриппа, вероятно способствовало эволюции вирусов в сторону распознавания рецепторов с длиной ножкой.
Рис. 5. Тонкослойная хроматография ганглиозидов эпителиальных клеток кишечника утки и курицы. Ганглиозиды: 1 - кишечника утки, 2 - кишечника курицы, 3 - мозга быка (указаны справа). Цифрами вдоль хроматограммы указаны номера фракций, использованных для изучения связывания вирусов.
Связывание вирусов с клеточными мембранами ряда клеток мишеней
Далее, мы исследовали связывание вирусов разных хозяев с мембранами эпителиальных клеток кишечников утки и курицы, трахеи курицы и трахеи мартышки (рис. 6 ). ВГ птиц связываются со всеми четырьмя представленными субстратами, но картина связывания для вирусов разных хозяев различается. Все утиные вирусы связываются с клетками кишечника утки сильнее, чем с остальными субстратами. Для вирусов чаек и кур оптимальным субстратом являются клетки кишечника курицы. Этот же субстрат оптимален для вирусов человека, но, в отличие от птичьих вирусов, вирусы человека практически совсем не связываются с клетками кишечника утки.
Рис. 6. Связывание вирусов гриппа разных хозяев с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки, кишечника курицы, трахеи курицы и трахеи мартышки.
Далее, мы исследовали состав рецепторов для вирусов гриппа на плазматических мембранах вышеупомянутых эпителиальных клеток.
Для этого мы воспользовались четырьмя вирусами с ярко выраженной рецепторной специфичностью: A/Duck/Buryatia/1905/00 (dk/Bur), A/Chicken/Vietnam/NCVD11/2003 (ch/VN), A/Chicken/NJ/12220/97 (ch/NJ ), и вирус человека A/NIB/23/89M (NIB/23M).
В таблице 7 приводятся значения констант диссоциации этих вирусов к полимерам несущим ряд ключевых сиалосахаридных детерминант.
Табл. 7. Константы диссоциации вирусов к различным рецепторным детерминантам.
Сахаридные Группировки | Вирусы | |||
dk/Bur | ch/NJ | ch/VN | NIB/23M | |
H4N6 | H9N2 | H5N1 | H1N1 | |
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (6`SLN) | >200 | >200 | >200 | 5 |
Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ (3`SLN) | 20 | 10 | 5 | >200 |
Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ (SLex ) | 200 | 0.5 | 50 | >200 |
Neu5Acα2-3Galβ1-4(6Su)GlcNAcβ (Su-3`SLN) | 20 | 10 | 0.3 | >200 |
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ (SLec) | 10 | 10 | 10 | >200 |
*См подпись под табл. 3.
Из таблицы видно, что только вирус человека связывает 6`SLN; с сиаловой кислотой присоединенной к галактозе 2-3 связью этот вирус не связывается.
Утиный вирус dk/Bur хорошо связывается со SLec - сахаром с 1-3 связью между галактозой и глюкозамином. Добавление сульфогруппы к рецептору безразлично для связывания, а фукозилирование резко снижает сродство к рецептору.
Непатогенный куриный вирус ch/NJ связывается с 3`SLN, SLec и их сульфатированными производными примерно так же как и вирус dk/Bur, но максимальное сродство проявляет к фукозилированым сиалосахарам. Сродство к SLex у ch/NJ в 400 раз выше чем у dk/Bur, что позволяет выявлять наличие фукозилированных рецепторов с помощью этой пары вирусов.
Высоко патогенный H5N1 вирус ch/VN с максимальным сродством связывается с сульфатированным Su-SLN.
Далее мы провели количественный анализ сродства этих вирусов к клеточным мембранам. Для этого данные по связыванию вирусов с субстратами представляли в виде графиков Скетчарда, наклон которых отражает сродство ВГ к субстрату, а точка пересечения графика с осью Х - относительное число рецепторов для исследуемого вируса в данном препарате (Рис. 7). Вирус утки dk/Bur лучше всего связывается с клетками кишечника утки - ход графика Скетчарда указывает на максимальное число рецепторов для вируса и на высокое сродство вируса к этим рецепторам. Вирус утки так же неплохо связывается с клетками куриной трахеи и трахеи зеленой мартышки.
Связывание с клетками кишечника курицы слабое - ход графика указывает на низкое сродство к соответствующим рецепторам.
У вируса курицы ch/NJ соотношение сродства к клеткам кишечника утки и клеткам кишечника курицы противоположное - минимальное сродство к клеткам кишечника утки и максимальное - к клеткам куриного кишечника. С клетками трахеи курицы и мартышки вирус связывается с меньшим сродством, хотя число мест связывания на этих субстратах для вируса достаточно велико.
Другой куриный вирус, ch/VN также лучше связывается с клетками кур, чем с клетками утки, но, в отличие от вируса Ch/NJ, с клетками трахеи связывается с большим сродством, чем с клетками кишечника. Сильнее всего данный вирус связывается с клетками трахеи мартышки.
Рис. 7. Графики Скетчарда связывания вирусов A/Duck/Buryatiya /1905/00 (dk/Bur), A/Chicken/NJ/12220/97 ( ch/NJ), A/Chicken /Vietnam/NCVD-11/2003 (ch/VN) и вируса человека A/NIB/23/89M (NIB/23M) с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки (КУ), кишечника и трахеи курицы (КК и ТК) и трахеи зеленой мартышки (ТМ).
И, наконец, вирус человека A/NIB/23/89M совсем не связывается с клетками кишечника утки, а с клетками кишечника и трахеи курицы связывается очень хорошо. С клетками трахеи мартышки вирус связывается с максимальным сродством, хотя число мест связывания (точка пересечения с осью Х) меньше, чем на куриных клетках.
Исходя из рецепторной специфичности этих вирусов можно трактовать данные по их связыванию с различными клетками.
Способность вируса человека NIB/23M связываться с клетками кишечника курицы и трахеи курицы и мартышки указывает на наличие 6`SLN рецепторов на этих клетках.
Резкие отличия в связывании вирусов dk/Bur и ch/NJ к клеткам кишечников утки и курицы вероятно объясняются доминированием фукозилированных рецепторов в кишечнике курицы.
Высокое сродство вируса ch/VN к клеткам трахеи мартышки и курицы, возможно обусловлено наличием сульфатированных рецепторов.
Выявление сульфатированных рецепторов на клетках мишенях
Выявление сиалосодержащих рецепторов сульфатированных по шестому положению глюкозамина мы проводили с помощью фермента 6-глюкозамин сульфатазы.
Препарат клеточных мембран обрабатывали ферментом до полного удаления всех 6-сульфогрупп с глюкозамина, являющегося третьим звеном сиалосахаридного рецептора. Далее сравнивали сродство вирусов к исходному и обработанному препарату.
Для вирусов Duck /Pensylvania/84 и Duck/Minessota/1525/81 обработка субстратов 6-глюкозамин сульфатазой не влияет на сродство к клеткам. Для вирусов Chicken /HK/786/97 и Equine/Maiamy/1/63, обладающих повышенным сродством к сульфатированным рецепторам, сульфатазная обработка резко понижает сродство к клеткам трахеи мартышки. Такой результат доказывает, что высокое сродство вирусов H5N1 к клеткам трахеи мартышки связано с тем, что на этих клетках присутствуют сульфатированные по глюкозамину сиалосодержащие группировки, скорее всего Su-3`SLN, к которому у данных вирусов особо высокое сродство.
Адаптация вирусов гриппа кур к сульфатированным рецепторам видимо отражает наличие таких рецепторов на клетках мишенях кур. По случайному совпадению, эти же сиалосахаридные группировки, очевидно, присутствуют на клетках дыхательного эпителия зеленой мартышки, и, вполне вероятно, человека. Второй тип рецептора, присутствующий как в клетках дыхательного эпителия человека, так и на клетках эпителия кур это 6`SLN - человеческий рецептор. Напомним, что и Su-3`SLN и 6`SLN- это рецепторы на базе одного и того же сахарида второго типа Gal1-4GlcNac.
Наличие рецепторов для человеческих вирусов на эпителиальных клетках кур поставило перед нами задачу провести более широкое исследование птиц из разных систематических групп.
Состав рецепторов для вирусов гриппа на клетках различных птиц.
Изучались птицы, принадлежащие к отрядам:
1) Гусеобразные - Anseriformes:
2) Курообразные - Galliformes:
3) Журавлиные Charadriiformes:
Семейство Бекасовые Scolopacidae:
Семейство Чайковые Laridae
4) Аистообразные Ciconiiformes:
5) Поганкообразные Podicipediformes
6) Журавлеобразные Gruiformes
О составе сиалосодержащих рецепторов на клетках судили по способности этих клеток связывать лектины SNA и MAA, специфически распознающими Neu5Acα2-6Galβ и Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc группировки, а также вирусы dk/Bur, ch/NJ, ch/VN и NIB/23M с хорошо охарактеризованной рецепторной специфичностью.
На рис. 8 приведены профили связывания вирусов и лектинов с эпителиальными клетками кишечников ряда птиц.
Рис. 8. Связывание Maackia amurensis agglutinin (MAA), Sambucus nigra agglutinin (SNA), а так же вирусов утки dk/Bur, курицы ch/NJ и человека NIB/23/89M c клетками кишечников разных птиц.
Клетки уток плохо связывают ВГ курицы и практически не связывают ВГ человека, но очень хорошо связывают утиный вирус. В полном соответствии с работой Ito et al., (1998) клетки уток практически не связывают лектин SNA. Интересно то, что лектин MAA тоже плохо связываются с этими клетками. Очевидно, на клетках уток преобладают такие сиалил2-3галактозные рецепторы, которые не связывают этот лектин. Это могут быть Sia2-3Gal1-3Glc/GalNAc - группировки которые хорошо связывают утиные вирусы, но не связывают МАА (Knibbs и др., 1991). Кишечные эпителии куриных птиц хорошо связывают вирус ch/NJ, что указывает на наличие фукозилированных рецепторов. Лектин МАА связывается с клетками куриных птиц существенно лучше, чем с клетками утиных, что указывает на наличие Sia2-3Gal1-4GlcNAc группировок.
Клетки куриных птиц, а так же куликов и цапли неплохо связывают лектин SNA и человеческий вирус гриппа.
Таким образом, характерные отличия между клетками кишечников утки и курицы, описанные выше, повторяются на изученных нами представителях утиных и куриных птиц.
Клетки кишечника чаек хорошо связывают как утиный вирус так и вирус ch/NJ; очень хорошо связывает лектин MAA и практически не связывают лектин SNA и ВГ человека. Следовательно там обильно представлены 3`SLN и SiaLex группировки, а 6`SLN группировки, по-видимому отсутствуют.
Клетки лысухи, чемги и цапли очень хорошо связывают лектин MAA и очень плохо связывают ВГ. В работе Knibbs (1991) показано, что лектин MAA неплохо связывается с Sia2-3Gal1-4GlcNAc/Glc - группировками, в которых сиаловая кислота модифицирована в области глицеринового остатка, либо присутствует в гликолильной форме. Нельзя исключить, что на клетках вышеупомянутых птиц присутствуют подобные модифицированные по сиаловой кислоте формы 3`-сиалиллактозы.
ектины MAA и SNA часто используют как инструмент для исследования наличия рецепторов для вирусов гриппа на различных клетках мишенях (Couceiro и др., 1993; Ito и др., 1998; Feldmann и др., 2000). Наши данные свидетельствуют, что трактовать результаты, полученные с лектинами, надо с осторожностью, так как рецепторные детерминанты для лектина MAA и для птичьих вирусов могут не совпадать, хотя обе включают сиалил 2-3галактозный остаток.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Мы показали, что различной рецепторной специфичностью обладают не только ВГ человека и ВГ птиц, но что вирусы разных птиц также могут иметь различный рецепторный фенотип. Можно описать несколько типов рецепторов вирусов гриппа. Перед терминальной сиаловой кислотой могут находиться либо дисахариды Gal1-3GalNAc, Gal1-3GlсNAc (дисахариды первого типа), либо Gal1-4GlсNAc (дисихарид второго типа). На базе дисахаридов первого типа построены ганглиозиды ганглио-ряда, дисахариды второго типа более характерны для гликопротеинов, хотя встречаются и в ганглиозидах. Терминированные 3`сиаловой кислотой дисахариды первого типа без дополнительных заместителей при третьем от конца звене (как в STF, SLec и ганглиозидах GM1b и GD1a) лучше всего распознаются утиными вирусами гриппа (Рис 9).
Дисахарид второго типа входит в состав рецептора человеческих вирусов 6`SLN и ряда рецепторов птичьих вирусов на базе 3`SLN. Многие птичьи вирусы адаптированы к 3`SLN с заместителями при глюкозаминовом кольце. Все исследованные нами вирусы чаек адаптированы к фукозилированному 3`SLN - SLex . H5N1 вирусы кур обладают максимальным сродством к сульфатированному 3`SLN - Su-3`SLN. H7 вирусы кур, а так же avian like свиные вирусы адаптированы к 3`SLN с обоими заместителями - Su-SLex. К этим же рецепторам адаптированы и лошадиные вирусы. Все вышеупомянутые сиалосахаридные остатки широко представлены в живой природе.
Изменение рецепторной специфичности вирусов гриппа при переходе от уток к новым хозяевам, очевидно, отражает состав сиалозидов на новых клетках мишенях. По нашим данным клетки кишечников кур обогащены фукозилированными рецепторами, а куриной трахеи сульфатированными сиалосахарами. Возможно не случайно то, что непатогенный куриный вирус ch/NJ адаптирован к фукозилированному SLex, а высокопатогенные H5N1 вирусы кур, которые поражают в первую очередь дыхательные пути птицы, к сульфатированному Su-3`SLN.
Рис. 9. Оптимальные рецепторы для вирусов гриппа разных хозяев - сиалосахара на базе дисахарида первого типа (SLec) и дисахарида второго типа (6`SLN, 3`SLN, SLex , Su-3`SLN).
Р21
Побочным следствием адаптации вируса к новому хозяину может быть повышение сродства к рецепторам, присутствующим в дыхательных путях млекопитающих и, в частности, человека. ВГ таких хозяев могут иметь повышенный потенциал перехода к людям и должны быть предметом постоянного наблюдения.
ВЫВОДЫ
- Впервые в мире показано, что рецепторная специфичность вирусов гриппа разных птиц различна.
- Впервые в мире показано, что адаптация вирусов гриппа разных эволюционных линий к курам приводит к изменению рецепторной специфичности вируса. У них повышается сродство к сульфатированным и фукозилированным рецепторам, в частности к Su-3`SLN и к Su-SLex. Многие из этих вирусов приобретают также частичное сродство к человеческому рецептору.
- Показано, что рецептор Su-3`SLN присутствует в дыхательном эпителии мартышки и, вполне вероятно, в дыхательном эпителии человека. Адаптация к Su-3`SLN возможно способствует заражению человека.
- Показано, что человеческие изоляты H5N1 вирусов, несущие мутацию 227 аминокислоты в гемагглютинине, распознает человеческий рецептор. Это лишний раз напоминает о риске возникновения пандемического варианта этих вирусов
- Впервые в мире показано, что эволюция рецепторной специфичность вирусов гриппа в людях и в свиньях идет параллельно - поначалу вирусы распознают как Siaα2-3Gal, так и Siaα2-6Gal рецепторы, а затем только 6`SLN.
- Впервые в мире показано, что состав сиалосахаридных рецепторов на клетках мишенях разных птиц существенно отличается и вследствие этого рецепторная специфичность вирусов при переходе от первичных хозяев (диких уток) к чайкам и к курам меняется
- Впервые в мире показано, что 6`SLN-остатки присутствуют на эпителиальных клетках не только у млекопитающих, но также и многих птиц, в частности куриных.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Гамбарян А.С., Ямникова С.С., Львов Д.К., Робертсон Дж., Вебстер Р., Матросович М.Н.. (2002) Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа А, выделенных от уток, кур и человека. Молекулярная Биология, 36, 542-549.
- Маринина В. П., А. С. Гамбарян, Н. В. Бовин, А. Б.Тузиков, А. А. Шилов, Б. В. Синицын, М. Н. Матросович. (2003), Влияние утраты сайтов гликозилирования, расположенных вблизи рецептор-связывающего участка, на рецепторные характеристики вируса гриппа человека субтипа H1N1. Молекулярнаяя биология, 37, 1-6.
- Маринина В.П., А.С. Гамбарян, А.Б.Тузиков, Г.В.Позынина, Н.В. Бовин, И.T.Федякина, С.С.Ямникова, Д.К. Львов, М.Н. Матросович. (2004) Эволюция рецепторной специфичности гемагглютинина вирусов гриппа при переходе от уток к свиньям и к людям. Вопросы вирусологии 4, 25-30.
- Гамбарян А.С, Маринина В. П., Солодарь Т.А., Бовин Н. В., Тузиков А. Б., Ямникова С.С., Львов Д.К., Климов А.И., Матросович М.Н.. (2006) Различная рецепторная специфичность вирусов гриппа уток и кур отражает отличия в составе сиалозидов на хозяйских клетках и муцинах. Вопросы вирусологии 6, 135-143.
- Gambaryan, A.S. and Matrosovich M.N., 1992. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J. Virology. Methods 39, 111-123.
- Gambaryan, A.S., Piskarev, V.E., Yamskov, I.A., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Nifant`ev, N.E., and M.N.Matrosovich. (1995). Human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides. FEBS Letters 366, 5760
- Gambaryan, A.S., Tuzikov, A. B., Piskarev, V.E., Yamnikova, S.S., Lvov, D.K., Robertson, J.S., Bovin, N.V., Matrosovich, M.N. (1997). Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology 232, 345-350.
- Gambaryan A.S., M.N.Matrosovich, C.A.Bender, and E.D.Kilbourne. (1998) Differences in the biological phenotype of low-yielding (L) and high-yielding (H) variants of swine influenza virus A/NJ/11/76 are associated with their different receptor-binding activity. Virology 247, 223-231.
- Gambaryan, A. S., Robertson, J. S., and Matrosovich, M. N. (1999) Effects of egg-adaptation on the receptor-binding properties of human influenza A and B viruses. Virology 258, 232-239.
- Gambaryan, A., Webster, R., and Matrosovich, M. (2002). Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken. Arch. Virol. 147, 1197-2008.
- Gambaryan, A.S., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Yamnikova, S.S., Lvov, D.K., Webster, RG and Matrosovich, M.N. (2003). Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken and receptor specificity of the 1997 H5N1 chicken and human influenza viruses from Hong Kong. Avian Dis. 47 (3 Suppl), 1154-1160.
- Gambaryan, A.S, Tuzikov, A.B, Pazynina , G.V, Webster, R.G, Matrosovich M.N and Bovin N.V., 2004. H5N1 chicken influenza viruses display a high binding affinity for Neu5Acα2-3Galβ1-4(6-HSO3)GlcNAc Цcontaining receptors. Virology 326, 310-316.
- Gambaryan AS, Karasin AI, Tuzikov AB, Chinarev AA, Pazynina GV, Bovin NV, Matrosovich MN, Olsen CW, Klimov AI. (2005). Receptor-binding properties of swine influenza viruses isolated and propagated in MDCK cells. Virus Res. 114. 15-22.
- Gambaryan, A., Yamnikova, S., Lvov, D., Tuzikov, A., Chinarev, A., Pazynina, G., Webster, R., Matrosovich, M. and Bovin, N. (2005). Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology 334, 276-283.
- Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin N, Balish A, Klimov A. (2006) Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology, 344, 432-448.
- Yamnikova, S.S., Gambaryan, A.S., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Matrosovich, M.N., Fedyakina, I.T., Grinev, A.A., Blinov, V.M., Lvov, D.K., Suarez, D.L.and Swayne, D.E. (2003). Differences between HA Receptor-Binding Sites of Avian Influenza Viruses Isolated from Laridae and Anatidae. Avian Diseases 47, (3 suppl.), 1164-116.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии