Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

разделения тотальных клеточных белков ДСН-ПААГ электрофорезом. Для дополнительной идентификации и препаративной наработки поверхностных белков клетки обрабатывали биотиновым зондом, биотинилированные полипептиды собирали на магнитные частицы, покрытые стрептавидином (Karlsen et al., 2005). Масс-спектрометрический анализ полипептидов выполнен к.б.н. Р.А. Зиганшиным (ФГУ Институт биоорганической химии РАН, г. Москва).

Получение инсерционных мутантов по генам 'согА' и 'согВ'. Процедура включала амплификацию нуклеотидных последовательностей двух плеч инактивируемого гена, клонирование полученных ПНР-продуктов в плазмиду pK18mob, содержащую ген устойчивости к канамицину (Schafer, 1994), и клонирование в эту плазмиду гена устойчивости к гентамицину aaCl между клонированными плечами. Для конъюгации со штаммом 20Z использовали штамм-донор Е. coli S17-l/pK18mob:L7-L2.aaC7. Конъюганты отбирали по устойчивости к гентамицину и чувствительности к канамицину.

Цитобиохимические исследования. Ультраструктуру клеток метанотрофов изучали с помощью электронного микроскопа JEOL JEM 100В (Япония). Приготовление ультратонких срезов и просмотр препаратов в электронном микроскопе проводили в лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН совместно с к.б.н. Сузиной Н.Е.

Клонирование и экспрессия генов. Ген 'согВ' амплифицировали из геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z, клонировали в вектор рЕТ22Ь и экспрессировали в клетках Е. coli BL21(DE3). Рекомбинантный 'CorB'-His6-tag выделяли и очищали из клеток Е. coli с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni -NTA-агарозой, согласно протоколу фирмы "Quiagen" (Германия). Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу белка определяли электрофорезом в ДСН-ПААГ (Laemmli, 1970).

Включение СН4аа суспензиямиаа клетокаа измерялиаа н жидкостном

сцинтилляционном спектрометре LS-30 Beckman (США) в смеси, содержащей 2,5-дифенилоксазола и 1, 2-бис-(5-фенилоксазолил-2)бензола в 1 л толуола (Sokolov, Trotsenko, 1995).

Выделение и анализ осмопротекторов. Низкомолекулярные органические соединения - потенциальные осмопротекторы, экстрагировали из клеток метанолом. Количество сахарозы оценивали с антроновым реактивом в модификации (Hendel, 1968). Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ (лLKB, Швеция) (Ешинимаев с соавт., 2007).

6

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Детекция и выделение основных поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z

Для идентификации основных поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z клетки обрабатывали флуоресцентным реагентом дансилхлоридом (Walker, 1994). После разрушения клеток нагреванием в денатурирующем буфере проводили ДСН-ПААГ электрофорез тотальных белков. В УФ были выявлены четыре белковые полосы м.м. 27, 59, 67 и 80 кДа (рис. 1а). Окрашивание гелей Кумасси G-250 подтвердило, что эти белки являются мажорными в спектре тотальных клеточных белков (рис. 16).

Дляа выделенияа и идентификации поверхностныха белкова использовалиа метод

биотинилирования.а Клетки обрабатывали биотиновым зондом,а затем белки

Для подтверждения поверхностной локализации 59-кДа белка суспензии клеток обрабатывали трипсином. В течение первых 30 мин после добавления трипсина относительное количество 59-кДа белка значительно снижалось, при этом количество остальных белков не изменялось. Через 2 ч содержание 59-кДа белка достигало исходного уровня (рис. 29). Следовательно 59-кДа белок доминирует в спектре тотальных клеточных белков штамма 20Z и локализован на поверхности клетки, что согласуется с возможным участием данного белка в формировании стенок чашевидных структур.

59кЛа

Рис. 29. Белковые профили клеток штамма 20Z до и после обработки трипсином клеток. Время обработки: 1-контроль, без обработки; 2-30 мин; 3 - 1 ч; 4 - 2 ч.

23

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимой предпосылкой успешного выяснения функций S-слоев у микроорганизмов является идентификация основных поверхностных белков и кодирующих их генов. В данной работе идентификацию и выделение поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z проводили с использованием дансилирования и биотинилирования. Благодаря этим подходам нам удалось определить и наработать в препаративных количествах белки, экспонированные на наружной поверхности клеточной стенки, в числе которых доминируют белки S-слоев. В итоге были обнаружены четыре мажорных, ассоциированных с клеточной поверхностью белка: 27, 59, 67 и 80 кДа.

Нами установлено, что поверхностный 27-кДа белок полностью идентичный белку 'СогА', ранее обнаруженному у нейтрофильного негалофильного метанотрофа Mm. album BG8, кодируется у Mm. alcaliphilum 20Z геном MEALZv4_2831. Методами иммунно-цитобиохимии с использованием антител к очищенному белку впервые продемонстрировано, что 'СогА' локализован в основании чашевидных структур S-слоев и ответственен за связывание S-слоев с наружной мембраной метанотрофа. С помощью полученного инсерционного мутанта доказана необходимость белка 'СогА' для роста клеток на метане, но не на метаноле, что, наряду с экспрессией этого белка при понижении содержания меди в среде, указывает на его важную роль в процессе окисления СН4 с участием медь-зависимой ММО. Проведенный нами Blast анализ выявил уникальность белка 'СогА' для метанотрофов, образующих S-слои, что косвенно подтверждает гипотезу о возможной функции 'СогА' в качестве элемента специфической транспортной системы ионов меди, например, в случае экранирования S-слоями доставки и транспортировки этого катиона посредством других переносчиков (например, сидерофором - метанобактином).

80-кДа белок (ОРС MEALZv4_2832), обладающий перекись-разлагающей активностью, идентифицирован нами как дигемовая цитохром с пероксидаза нового класса. Наибольшую гомологию этот белок проявлял с поверхностным белком 'СогВ' Mm. album BG8(Karlsen et al., 2010). Нами доказана периплазматическая локализация дигемовой цитохром с пероксидазы у Mm. alcaliphilum 20Z. Пространственная близость 'СогА' и 'СогВ' на клеточной поверхности, наряду с коэкспрессией данного тандема белков, подразумевает их совместное участие в гомеостазе ионов меди у Mm. alcaliphilum 20Z. Не исключено, что цитохром с пероксидаза окисляет ключевую аминокислоту белка 'СогА' (триптофан), от модификации которой зависит связывание ионов меди, как в случае гомолога этого белка (МорЕ) из Мс. capsulatus Bath (Karlsen et al., 2011). Данное предположение основано на присутствии в 'СогА' Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. album BG8 консервативных аминокислот - аналогов, формирующих сайты связывания меди (гистидин-132, гистидин-203 и триптофан-130) у Мс. capsulatus Bath.

24

Кроме того, постулировано, что в формировании S-слоев Mm. alcaliphilum 20Z участвует 59-кДа белок, доминирующий в спектре поверхностных белков. В геноме Mm. alcaliphilum 20Z идентифицирован ген данного белка, который предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны (outer membrane protein, ОМР) I типа, гомологичный представителям семейства TolC. Белки этого семейства участвуют в адаптации бактерий к различным стрессам и неблагоприятным условиям. В частности, о возможном участии TolC в формировании S-слоев косвенно свидетельствует присутствие соответствующего гомолога у Mm. album BG8 (ZP08486741.1).

Таким образом, определение у метанотрофов первичной аминокислотной последовательности интегральных поверхностных белков, а также белковые компоненты S-слоев, идентификация соответствующих генов и выяснение условий их экспрессии позволит уточнить представление о белковом комплексе наружной клеточной мембраны - сурфацеоме (Karlsen et al., 2011). Дальнейшие исследования белков сурфацеома метанотрофов представляют несомненный интерес для конструирования новых систем гетерологичной экспрессии целевых пептидов, экспонируемых на поверхности рекомбинантных бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Из клеточных оболочек галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z впервые выделены поверхностные белки с молекулярными массами 27, 59, 67 и 80 кДа, определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Установлено, что белок с м.м. 67 кДа является большой субъединицей метанолдегидрогеназы. Поверхностный белок с м.м. 59-кДа предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны I типа.
2. Иммуноцитохимическими и электронно-микроскопическими методами доказана локализация белка 'СогА' с м.м. 27 кДа в основании чашевидных структур S-слоёв. Показано, что 80-кДа белок локализован в периплазме и идентифицирован как дигемовая цитохром с пероксидаза нового семейства 'СогВ'.
3. Впервые получен мутант с инактивированным геном 'согА', не способный расти на метане и лишенный S-слоёв при росте на метаноле. Мутация в гене 'согВ', кодирующем цитохром с пероксидазу, сопровождалась повышенной скоростью роста клеток на метане и высокими активностями ферментов С- окисления.
4. Обнаружена котранскрипция генов, кодирующих 'СогА' и 'СогВ', в виде одной бицистронной мРНК в условиях низкого содержания меди в среде культивирования.

25

Список публикаций по теме диссертации Статьи:

1. Хмеленина В.Н., Щукин В.Н., Решетников А.С., Мустахимов И.П., Сузина Н.Е., Ешинимаев Б.Ц., Троценко Ю.А. Структурно-функциональные особенности метанотрофов гиперсоленых и щелочных водоемов. Микробиология. 2010. Т. 79. № 4. С. 498-508.
2. Щукин В.Н., Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Первичная характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Микробиология. 2011. Т. 80. №5. С. 595-605.

Тезисы докладов:

1.а Щукин В.Н. Поверхностные белки гало(алкало)фильного метанотрофа

Methylomicrobium alcaliphilum20Z: выделение и характеристика. I

Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-

биологов "Симбиоз Россия 2008". 6-10 июля 2008 г., Казань.

1. Щукин В.Н., Ешинимаев Б.Ц. Мутант гало(алкало)фильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектный по синтезу поверхностного перекись-разлагающего белка. V Молодежная школа-конференция с международным участием Актуальные аспекты современной микробиологии. Москва, ИНМИ РАН, 26-27 октября 2009г.
2. Щукин В.Н. Первичная характеристика мутанта по синтезу поверхностного перекись-разлагающего белка у гало(алкало)фильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. 14 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущине 2010г.
3. Щукин В.Н. Первичная характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. VII Молодежная школа-конференция с международным участием Актуальные аспекты современной микробиологии. Москва, ИНМИ РАН, 24-26 октября 2011г.

26