Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3

Актуальность проблемы

Неизбежным результатом технологического прогресса является поступление в окружающую среду различных типов ксенобиотиков. К их числу относятся фосфонаты, содержащие прямую ковалентную связь углерод-фосфор (С-Р). Такая связь чрезвычайно устойчива к химическим и физическим воздействиям, вследствие чего фосфонаты способны накапливаться в окружающей среде. Синтетические фосфонаты входят в состав многих пестицидов, могут поступать в среду как отходы химической индустрии и продукты де-токсикации фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ).

Глифосат (ГФ) является одним из наиболее распространенных синтетических фосфонатов и применяется как действующий компонент популярных гербицидов (Roundup, Ground-Bio и др.). К 2010 г. объемы поступления ГФ в среду превысили 800 тыс. тонн в год. По данным независимых исследований, ГФ способен сохраняться в почвах в течение многих лет, изменяя состав почвенной микрофлоры, проникая в культурные растения и просачиваясь в водоемы. У животных ГФ может вызывать поражения печени, иммунной системы и нарушения эмбрионального развития.

Метилфосфоновая кислота (МФК) Ч один из основных продуктов переработки ФОВ и побочный продукт ряда промышленных процессов, крайне стабильна в окружающей среде и может сохраняться в почве в течение десятков лет, проявляя фитотоксические свойства.

В связи с этим актуален поиск способов ремедиации почв и водоемов, загрязненных фосфонатами. Из-за высокой стойкости подобных соединений единственный рациональный подход к решению данной проблемы предполагает применение микроорганизмов-деструкторов. Однако разработка подобных технологий затрудняется недостатком сведений об организации путей метаболизма фосфонатов.

Считается, что С-Р связь большинства фосфонатов, в том числе МФК, неспецифически расщепляется ферментным комплексом С-Р лиаза, необратимо инактивирующимся при дезинтеграции клеток. Известно единствен-

1

ное сообщение о возможном существовании разновидности С-Р лиазы, специфически разлагающей ГФ (в настоящей работе обозначенной как С-Р лиа-за II). Существует предположение об альтернативном пути разложения ГФ, где начальную реакцию расщепления ГФ может катализировать фермент глифосат-оксидоредуктаза с образованием аминометилфосфоновой кислоты (АМФК). Однако ГФ-оксидоредуктаза не была очищена и охарактеризована. Путь дальнейшего метаболизма АМФК, связанный с разрывом С-Р связи, также неясен.

Дефицит знаний о метаболизме фосфонатов во многом объясняется отсутствием доступных и достоверных методов идентификации активности соответствующих ферментов, а также анализа их метаболитов. Разработка подобных методов и исследование метаболизма синтетических фосфонатов бактериями-деструкторами является одной из приоритетных задач современной биохимии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение путей катаболизма глифосата и метилфосфоновой кислоты у почвенных бактерий-деструкторов фосфонатов. Для достижения цели работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработка методов количественного и качественного анализа исследуемых фосфонатов и их метаболитов, а также методик измерения активности ферментов их деструкции.
2. Подбор объектов исследования - штаммов, обладающих наибольшей эффективностью деструкции в отношении изучаемых фосфонатов.
3. Изучение возможности адаптации штамма, выделенного под селективным давлением метилфосфоновой кислоты к утилизации глифосата.
4. Выявление путей метаболизма фосфонатов у отобранных штаммов-деструкторов.
5. Очистка нового фермента первичной атаки глифосата - глифосат-оксидоредуктазы.
6. Характеристика глифосат-оксидоредуктазы.

2

Научная новизна

Разработаны новые методы идентификации и измерения активности ферментов метаболизма ГФ и МФК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спек-трофотометрического определения, отличающиеся высокой достоверностью.

Впервые показана возможность адаптации штамма-деструктора МФК {Achromobactersp. MPS 12), первоначально не способного утилизировать ГФ, к использованию этого соединения как единственного источника фосфора. Адаптированный штамм Achromobactersp. MPS 12А по показателям деструкции ГФ был близок к О. anthropiGPK 3.

Доказано существование двух С-Р лиазных систем с различающейся субстратной специфичностью: С-Р лиаза I разлагала МФК, С-Р лиаза II - ГФ.

Впервые выявлено различие в путях метаболизма ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением двух разных фосфонатов: Achromobactersp. MPS 12А разлагал этот фосфонат с помощью ГФ-специфичной С-Р лиазы II с образованием саркозина. Ферментом первичной атаки ГФ у О. anthropiGPK 3 была ГФ-оксидоредуктаза; продуктами этой реакции были АМФК и глиоксилат.

У О. anthropiGPK 3 был идентифицирован ранее не описанный путь метаболизма АМФК, который включал стадии переаминирования и разрыва С-Р связи при вероятном участии фермента фосфоноацетальдегидгидролазы (фосфонатазы).

ГФ-оксидоредуктаза О. anthropiGPK 3 была впервые очищена до элек-трофоретически гомогенного состояния. Изучены ее основные характеристики, определен кофактор, выявлены параметры, способствующие повышению выхода фермента.

Практическая значимость

Разработанные высокоточные методы анализа фосфонатов и продуктов их метаболизма отличаются универсальностью и могут применяться для обнаружения фосфонатов в природных образцах почвы и грунтовых вод, сточ-

3

ных водах, а также в лабораторных исследованиях при анализе гомогенатов клеток и культуральной жидкости.

Изученные физиологические и биохимические особенности отобранных штаммов-деструктров ГФ и МФК позволяют давать точную оценку деструктивного потенциала таких микроорганизмов. Обнаруженный эффект адаптации изучаемых бактерий к утилизации фосфонатов разных типов открывает новые возможности селекции универсальных и высокоэффективных деструкторов, активных в отношении широкого диапазона этих соединений.

Данные о различиях в путях деструкции ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением разных фосфонатов, позволяют осуществлять более эффективный скрининг и отбор микроорганизмов, пригодных для последующего дальнейшего применения их в технологиях очистки природных сред от загрязнения фосфонатами. Сведения о факторах, способствующих индукции ГФ-оксидоредуктазы у О. anthropiGPK 3, дают возможность подобрать условия, способствующие наибольшей экспрессии данного фермента.

Впервые полученные сведения об организации и распределении ферментных систем катаболизма фосфонатов у бактерий являются основой для разработки биотехнологий очистки и восстановления природных сред, загрязненных фосфонатами.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из 7 разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 10 таблиц и 42 рисунка. Библиографический указатель содержит 294 источника литературы.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: 10th International UFZ-Deltares/TNO conference on soil-water systems ConSoil 2008 (Milan, Italy, 2008), 12-я международная школа-конференция молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2008),

4

5-я международная конференция Наука и образование для целей биобезопасности (Пущино, 2008), Международная школа-конференция Генетика микроорганизмов и биотехнология (Пущино, 2008), Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии (Пущино-Тула, 2009), 3rd International conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology BioMicroWorld 2009 (Lisbon, Portugal, 2009), Пущинская научно-практическая конференция Системная биология (Пущино, 2009), Международный молодежный научный форум Ломоносов-2010 (Москва, 2010), 14-я международная школа-конференция молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2010), 2-й международный конкресс-партнеринг и выставка по биотехнологии и биоэнергетике EurasiaBio (Москва, 2010), VI Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2011). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в изданиях из списка, рекомендованного ВАК и 10 тезисов в сборниках отечественных и зарубежных конференций.

Исследования поддерживались грантом Российского фонда фундаментальных исследований 09-04-00320 Глифосат-оксидоредуктаза бактерии OchrobactrumanthropiGPK 3 и в рамках проекта РНП 2.1.1.9227 Создание ассоциаций грибов и бактерий для биодеструкции устойчивых гетероциклических соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Среды для культивирования бактерий. Для культивирования бактерий использовали минеральную среду MS1 (Ермакова с сотр., 2008). Источниками фосфора служили МФК в концентрации 0,3 г/л, ГФ в концентрации 0,05-20 г/л в составе гербицида Roundup, 2-аминоэтилфосфоновая кислота (2-АЭФ) и АМФК в концентрации 0,2 г/л, неорганический фосфат (Pi) в концентрации 0,3 г/л. Источниками углерода служили глутамат натрия, сукцинат натрия, глицерин и глюкоза в концентрации 10 г/л.

5

Микроорганизмы. Использовали два штамма бактерий-деструкторов фосфонатов: OchrobactrumanthropiGPK 3 (ВКМ B-2554D), выделенный из почв, загрязненных ГФ, и Achromobactersp. MPS 12 (ВКМ В-2694), выделенный из сайтов загрязнения метилфосфоновой кислотой (МФК). При адаптации последнего к росту на средах с ГФ был получен деструктор МФК и ГФ Achromobactersp. MPS 12А.

Условия культивирования. Выращивание культур проводили 1) в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды на качалке при температуре 28 С; 2) в ферментерах АНКУМ-2 (ИБП РАН, Россия) объемом 10 л при температуре 28 С и интенсивности аэрации 50 % от насыщения; 3) в герметически закрытых 15-мл пробирках с 5 мл среды.

Субклеточное фракционирование. Клетки фракционировали по методе Nossal и Heppel (1966) с модификациями: биомассу ресуспендировали в 40 мл 33 мМ Трис-HCl рН 7,65, добавляли 40 мл 33 мМ Трис-HCl рН 7,65, содержавшего 40% сахарозу и 100 мМ ЭДТА. После 10 мин инкубации при 22 С клетки осаждали (18000 g х 5 мин) и отбирали фракцию периплазмы. Сферопласты разрушали с помощью ИБФМ-пресса при рабочем давлении 0,9 МПа. Гомогенат помещали в ледяную баню, вносили 100 Ед ДНКазы I, осаждали центрифугированием (120000 g х 1 ч, 4 С). Отделяли супернатант с водорастворимыми белками цитоплазмы. Осадок ресуспендировали в 10 мл буфера 100 мМ Трис-HCl рН 7,65, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 20% глицерин, 0,001 мМ фенилметилсульфонилфторид с 2% Тритон Х-100 и инкубировали 30 мин при 22 С. Суспензию осаждали (120000 g х 1 ч, 22С), отбирали надосадочную жидкость.

Аналитические методы. Хроматографический анализ ГФ и его метаболитов в культуральных жидкостях, бесклеточных экстрактах и реакционных смесях проводили методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), получая ацильные, бен-зоильные и дансильные производные (Свиридов с сотр., 2011). Концентрацию фосфонатов и Pi измеряли спектрофотометрическим методом с малахи-

6

товым зеленым (Hess and Derr, 1975) после гидролиза С-Р связи персульфатом аммония (Schowanek and Verstraete, 1990а).

Определение активности ферментов. Активность С-Р лиазы в интакт-ных клетках I определяли: 1) по выделению метана при культивировании бактерий на среде с МФК в герметичных пробирках (концентрацию метана измеряли методом газовой хроматографии с помощью калибровочной кривой); 2) по убыли МФК и накоплению Pi (определяли спектрофотометриче-ски по цветной реакции Pi с молибдатом аммония в присутствии малахитового зеленого) (Sviridov etal., 2012).

Активность С-Р лиазы II в интактных клетках идентифицировали по присутствию в бесклеточных экстрактах саркозина, который обнаруживали методом ВЭЖХ в виде ацильных, дансильных и бензоильных производных (Свиридов с сотр., 2011).

Определение активности ГФ-оксидоредуктазы в субклеточных фракциях О. anthropiGPK 3 проводили 1) спектрофотометрическим методом по образованию окрашенного комплекса продукта реакции (глиоксилата) с фенил-гидразином (Свиридов с сотр., 2011); 2) методом ВЭЖХ, определяя концентрацию глиоксилата и АМФК (в виде производных) в реакционных смесях (Sviridov etal., 2012).

Убыль АМФК, образующейся при расщеплении ГФ глифосат-оксидоредуктазой, обнаруживали методом ВЭЖХ в реакционной смеси, содержавшей ГФ, бесклеточный экстракт, пиридоксаль-5'-фосфат и пируват натрия.

Активность фосфонатазы определяли по окислению НАДН в сопряженной реакции с алкогольдегидрогеназой, восстанавливавшей один из продуктов фосфонатазной реакции - ацетальдегид.

Очистка ГФ-оксидоредуктазы. Белки бесклеточного экстракта осаждали сульфатом аммония до 80% насыщения, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в буфере 50 мМ Трис-HCl рН 7,65, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 0,05 мМ ЭДТА и подвергали гель-фильтрации на колонке

7

Superdex 200 (2,6 x 60 см). Активные фракции наносили на колонку Octyl-Sepharose (1x6 см), элюировали буфером, содержавшим 1 М сульфата аммония. Препарат затем подвергали гель-фильтрации на колонке Toyopearl HW-60 (1,6 х 100 см).

Характеристика ГФ-оксидоредуктазы. Денатурирующий электрофорез проводили по Laemmli (1970), белковые полосы проявляли по Fairbanks (1971). Нативный электрофорез проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) с градиентом концентрации 4-10% в системе для кислых белков. Окрашивание белков проводили 0,2% раствором нитратом серебра в 0,4% растворе формальдегида.

Молекулярную массу (ММ) фермента определяли по электрофоретиче-ской подвижности и с помощью гель-фильтрации на колонке Superdex 200, предварительно калиброванной с помощью набора Gel Filtration Molecular Weight Markers (Sigma, США).

Изоэлектрофокусировку проводили в 5% ПААГ в градиенте рН 3,0-10,0 с амфолинами фирмы Pharmacia (pharmalytes). Белковые полосы проявляли последовательной инкубацией геля в смеси уксусной кислоты, этанола и воды (19 : 25 : 65), содержащей 0,1% CuS04 и 0,05% кумасси R-250. Изоэлектриче-скую точку определяли с помощью набора Calibration Kit for pi Determinations using Isoelectric Focusing Broad Range pi (pH 3-10) (GE Healthcare, США).

Определение зависимости активности ГФ-оксидоредуктазы от рН среды проводили спектрофотометрически в буфере Britton и Robinson (1931) в интервале рН 6,8-9,6.

Температурный оптимум фермента определяли спектрофотометрически в диапазоне 20-60 С при термостатировании измерительной кюветы.

Термостабильность определяли путем инкубирования ферментного препарата при температурах 22, 25, 30, 40, 45, и 50 С в течение часа; измерения остаточной активности проводили через 5, 10, 15, 30 и 60 мин после начала инкубации.

8

Спектры поглощения препаратов ГФ-оксидоредуктазы и реакционных смесей в диапазоне 300-560 нм записывали на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC (Япония). Апофермент отделяли от кофактора после инкубации в буфере 33 мМ Трис-HCl рН 8,05 с помощью ультрафильтрации.

Свободный кофактор получали кипячением препарата ГФ-оксидоредуктазы и анализировали методом ВЭЖХ на колонке Lichrospher 100 RP18 250 х 4 мм (Dr. Maisch, Германия) в подвижной фазе метанол : 5 мМ ацетат аммония рН 6,0 (20 : 80 ) с детектором оптического поглощения при 450 нм.

Значения Кт и Vmax определяли с линеаризацией данных в координатах Хейнса-Вольф. Влияние ионов металлов изучали в реакционных смесях, содержавших очищенный ферментный препарат, 2 мМ ГФ и соли: MgCl2 в концентрации 1-20 мМ; NiCl2, CuS04, MnCl2, ZnCl2, FeS04, СоС12 в концентрации 10 мМ.

Ингибиторный анализ ГФ-оксидоредуктазы проводили в реакционных смесях, содержавших очищенный фермент, 2 мМ ГФ и глицин, саркозин, AgN03, ФМСФ, /?-хлормеркурийбензойную кислоту (рХМБ), MnCl2, CuS04 в концентрации 0,1-4 мМ.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли с помощью реактива Брэдфорд (Sigma) в соответствии с рекомендациями производителя.

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в трех повторностях. На основании полученных выборок определяли стандартное отклонение и доверительный интервал при уровне значимости 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методов анализа ГФ и его метаболитов. Были предложены новые методы обнаружения и количественного определения ГФ и соединений, образующихся при его деструкции с помощью ВЭЖХ (табл. 1) и ТСХ (табл. 2). Получение ацильных, бензоильных и дансильных дериватов проб позволяло значительно снизить предел обнаружения, и достичь высокой дос-

9

товерности анализа. В рутинных экспериментах использовалось ацилирова-ние проб, требовавшее наименьших временных затрат. Бензилирование и дансилирование применялось для верификации полученных данных.

Отбор и характеристика штаммов-деструкторов фосфонатов. По результатам скринига лабораторной коллекции микроорганизмов были отобраны: 1) штамм Achromobactersp. MPS 12, отличавшийся наибольшей эффективностью утилизации МФК (табл. 3); 2) штамм OchrobactrumanthropiGPK 3 -лучший деструктор ГФ (табл. 3).

Таблица 1.

Анализ производных ГФ и его метаболитов методом ВЭЖХ

* н/о - не определяли

Таблица 2.

Хроматографическая подвижность и пределы обнаружения ГФ и его мета-

болитов методом ТСХ в немодифицированном виде и в виде дансилпроизводных

* Определение саркозина проводили методом двумерной ТСХ

Адаптация штамма Achromobacter sp. MPS 12 к утилизации ГФ. В отличие от прочих изученных деструкторов МФК, не способных расти на средах с ГФ, у Achromobactersp. MPS 12 был обнаружен крайне слабый рост на среде с этим фосфонатом (табл. 3), в связи с чем данный штамм был подвергнут адап-

10

Таблица 6.

Таблица очистки ГФ-оксидоредуктазы

Очищенный препарат ГФ-оксидоредуктазы имел максимумы оптического поглощения, характерные для флавоферментов (рис. 7, 1). Кофермент реакции (рис. 7, 2) был идентифицирован как ФАД методом ВЭЖХ. Связывание ФАД с молекулой фермента имело нековалентный характер: кофермент десорбировался в относительно мягких условиях (кипячение, денатурация мочевиной, инкубирование в буферах с низкой ионной силой) без проведения реакций пептидолиза, необходимых для выделения ковалентно связанного ФАД (Mewies, 1998). Восстановления активности после инкубации апофер-мента в буферах, содержавших различные концентрации ФАД, не происходило. Причиной этого, по-видимому, была характерная для многих флаво-ферментов крайне низкая стабильность апофермента, лишенного кофактора, приводящая к необратимому изменению структуры активного центра (Hefti еа/.,2003).

16

кДа М1аа 1

97 66

45 30

20,1 14,4

Рисунок 5. ПААГ-электрофорез очищенного препарата ГФ-оксидоредуктазы. А -Денатурирующий электрофорез в 10% ПААГ; Ml - белки-маркеры: фосфорилаза В (97 кДа), БСА (66 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20 кДа), а-лактоальбумин (14,4 кДа); окрашивание кумасси. Б - Нативный электрофорез в ПААГ с градиентом концентрации 4-10%; М2 - белки-маркеры: тироглобулин (669 кДа), ферритин (440 кДа), каталаза (232 кДа), лактатдегидрогеназа (140 кДа); Окрашивание нитратом серебра. 1, 2 - Очищенный препарат ГФ-оксидоредуктазы.

pi М

Рисунок 6. Изоэлектрофокусировка ГФ-оксидоредуктазы. М - белковые маркеры (pi): амилогликозидаза (3,50), соевый ингибитор трипсина (4,55), Р-лактоголобулин А (5,20), бычья карбоангидраза В (5,85), карбоангидраза В человека (6,55), кислая цепь миоглобина лошади (6,85), щелочная цепь миоглобина лошади (7,35), кислая цепь лектина чечевицы (8,15), средняя цепь лектина чечевицы (8,45), щелочная цепь лектина чечевицы (8,65), трипсиноген (9,30); 1 - ферментный препарат

Участие ФАД в реакции расщепления ГФ было продемонстрировано при инкубации фермента в присутствии субстрата без доступа кислорода. При этом наблюдали изменение максимумов поглощения, что указывало на восстановление ФАД (рис. 7, 4) (Pedotti etal., 2009). Данный эффект нивелировался в присутствии убихинона Q-10.

17

0,06

ф 0,05 4

0,04

Е 0,03 о

Рисунок 7. Спектры оптического поглощения ГФ-оксидоредуктазы и ее кофактора: 1 - холофермент; 2 - кофактор (ФАД); 3 - после инкубации холофер-мента в анаэробных условиях в присутствии субстрата; 4 - апофермент

ГФ-оксидоредуктаза обладала относительно узким диапазоном оптимальных значений рН (рис. 8); максимальная активность наблюдалась при значении рН 8,05

Рисунок 8. Зависимость активности ГФ-оксидоредуктазы от рН среды в буфере Britton-Robinson

7,8а 8,8

РН

Помимо ГФ, фермент проявлял активность в отношении иминодиацета-та (ИДА) и фосфонометилиминодиацетата (ФИА). Для ГФ, ИДА и ФИА были определены основные кинетические константы (табл. 7). ИДА был лучшим субстратом и обладал наибольшим сродством к ферменту. Высокое значение Кт для ФИА могло объясняться наличием у этого соединения третичного азота и дополнительной фосфонометильной цепью, в отличие от ИДА, что могло затруднять узнавание ФИА активным центром ГФ-оксидоредуктазы.

18

Таблица 7.

Кинетические характеристики ГФ-оксидоредуктазы

Температурный оптимум активности ГФ-оксидоредуктазы был равен 40 С (рис. 9, А); время полуинактивации в этих условиях составляло около 60 мин (рис. 9, Б).

о о

X

ш

< 

30 50

Температура, С

70

о о

X

ш

к:

Рисунок 9. А. Температурный оптимум глифосат-оксидоредуктазы. Б. Термостабильность фермента: ж - 30 С; ж - 40 С; ^ - 45 С; Х - 50 С; х- 60 С.

Ингибиторами ГФ-оксидоредуктазы были ионы Ag+, Cu2+, Mn2+, а также /?-хлормеркурийбензоат (рХМБ), атакующий прежде всего тиоловые группы белков. Весьма слабыми конкурентными ингибиторами являлись глицин и саркозин. Впервые описано субстратное ингибирование фермента при больших концентрациях ГФ (табл. 8).

Ионы металлов (Mg2+, Zn2+, Ni2+) могли оказывать не только ингиби-рующее, но и активирующее действие на ГФ-оксидоредуктазу (рис. 10). Процесс расщепления ГФ шел быстрее всего в присутствии MgCl2, оптимальное значение концентрации которого составляло 10-15 мМ. Реакция ускорялась в меньшей степени в присутствии МС12 и ZnCl2 (рис. 10). Ионы Fe2+ и Со2+ заметного влияния на скорость реакции не оказывали (данные не приведены).

19

Таблица 8.

Значения 1С5о для различных ингибиторов ГФ-оксидоредуктазы

Учитывая данные о способности ГФ связываться с активным центром алкогольдегидрогеназы через атом цинка (Жемчужин и Горобец, 1989), можно предположить, что различия во влиянии металлов на активность ГФ-оксидоредуктазы зависят от константы устойчивости возникающих комплексов ГФ-металл-фермент, которые могут как облегчать связывание субстрата в активном центре, так и препятствовать катализу. Так, в присутствии ионов

94-аа 94-

Си и Мл , ингибирующих ГФ-оксидоредуктазу, ГФ образует устойчивые комплексы с рядом органических функциональных групп (Barrett and McBride, 2005).

Рисунок 10. Активирующее действие ионов некоторых металлов на процесс расщепления глифосата ГФ-оксидоредуктазой. 1 - контроль; 2 - 10 мМ ZnCl2; 3 - 10 мМ NiCl2; 4 - 1 мМ MgCl2; 5 - 5 мМ MgCl2; 6 -10 мМ MgCl2; 7 - 15 мМ MgCl2; 8 -30 мМ MgCl2; 9 - 10 мМ MgCl2 + 10 мМ NiCl2; 10 - 10 мМ MgCl2 + 10 мМ ZnCl2.

20

выводы

1. Разработаны качественные и количественные методики ВЭЖХ- и ТСХ-анализа глифосата и его метаболитов, включая их ацил-, бензоил-, дан-силпроизводные. Предложен новый спектрофотометрический экспресс-метод измерения активности глифосат-оксидоредуктазы, основанный на образовании фенилгидразона глиоксилата как продукта реакции.
2. Деструктор метилфосфоновой кислоты Achromobactersp. MPS 12 был впервые адаптирован к потреблению глифосата как источника фосфора; биодеструктивные характеристики адаптированного штамма MPS 12А были близки к таковым у О. anthropiGPK 3.
3. Доказано существование у бактерий двух С-Р лиазных систем, специфичных для разных субстратов: С-Р лиаза I (расщепление метилфосфоновой кислоты) и С-Р лиаза II (расщепление глифосата).
4. Изучение путей катаболизма фосфонатов у бактерий показало, что метил фосфоновая кислота и глифосат у Achromobactersp. MPS 12А расщеплялись, соответственно, С-Р лиазой I и С-Р лиазой II, а у О. anthropiGPK 3 - С-Р лиазой I и глифосат-оксидоредуктазой.
5. Впервые идентифицирован путь катаболизма глифосата с участием глифосат-оксидоредуктазы, продукт которой - аминометилфосфоновая кислота, минерализовался по ранее не описанному метаболическому пути с участием аминометилфосфонат-специфичной аминотрансферазы и фосфонатазы.
6. Впервые очищен до гомогенного состояния и охарактеризован фермент первичной атаки глифосата - глифосат-оксидоредуктаза. В нативной форме фермент являлся гомодекамером (ММ 620 кДа); ММ субъединицы 61,4 кДа; кофактор ФАД; оптимум рН 8,05, температуры - 40 С; pi 6,85; ингибиторы/?ХМБ, Ag+, Cu2+, Mn2+.

21

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам ИБФМ РАН Винокуровой Н. Г. и к.х.н. Зеленковой Н. Ф. за помощь в создании методов анализа орга-нофосфонатов и синтез фосфоноацетальдегида, а также д.б.н. Моргунова И. Г. за помощь в разработке метода измерения активности фосфонатазы. Автор глубоко признателен к.б.н. Ермаковой И. Т. и д.б.н. Леонтьевскому А. А. за помощь в подготовке настоящей работы и плодотворное обсуждение ее этапов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Свиридов А. В., Зеленкова Н. Ф., Винокурова Н. Г., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Новые подходы к идентификации и определению активности ферментов деградации глифосата. Биохимия. 2011. № 6. С. 880-887.
2. Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Биодеструкция глифосата почвенными бактериями: оптимизация процесса культивирования и способ сохранения активной биомассы. Микробиология. 2012. № 1. С. 48-55.
3. Sviridov, А. V., Shushkova, Т. V., Zelenkova, N. F., Vinokurova, N. G., Morgunov, I. G., Ermakova, I. Т., Leontievsky, A. A. Distribution of Glyphosate and Methylphosphonate Ca-tabolism Systems in Soil Bacteria Ochrobactrum anthropi and Achromobacter sp. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. V. 97. P. 787-796.

Тезисы

1. Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Обнаружение и очистка нового фермента первичной атаки органофосфонатов - глифосат-оксидоредуктазы. Сб. тез. 12-й международной школа-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века. 2008. Пущино. С. 104-105.
2. Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Ремедиация загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных биопрепаратов. Материалы 5-й международной конференции Наука и образование для целей биобезопасности. 2008. Пущино. С. 108-109.
3. Свиридов А. В., Шушкова, Т. В., Ермакова, И. Т., Леотьевский, А. А. Разработка научных основ для создания методов ремедиации загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных препаратов. Сб. тез. международной школы-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология. 2008. Пущино. С. 78.

22

• Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Метаболические пути деструкции глифосата у почвенных бактерий. Сб. статей всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии. 2009. Пущино-Тула. С. 84-85.
• Sviridov А. V., Leontievsky A. A. Enzymes of phosphonates metabolism in soil bacteria. Abstr. 3 International conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology BioMicroWorld 2009.а 2009.аа Lisbon.
• Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Биохимические основы разработки микробных препаратов для ремедиации загрязненных органо-фосфонатами почв. Сб. тез. Пущинской научно-практической конференции Системная биология. 2009. Пущино. С. 34-35.
• Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Характеристика нового фермента первичной атаки органофосфонатов - глифосат-оксидоредуктазы. Сб. тез. 14-й международной школы-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века. 2010. Пущино. Т. 1. С. 59-60.
• Свиридов А. В. Глифосат-оксидоредуктаза Ч новый фермент первичной атаки органофосфонатов. Материалы международного молодежного научного форума Ломоно-сов-2010. 2010. Москва. С. 62-63.
• Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Глифосат-оксидоредуктаза: новый фермент деструкции органофосфонатов у бактерий. Сб. тез. 2-го международного конгресс-партнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетике EurasiaBio. 2010. Москва. С. 161-162.
• Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Пути утилизации глифосата почвенными штаммами-деструкторами OchrobactrumanthropiGPK 3 и Achromobactersp. MPS 12A. Материалы VI Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. 2011. Москва. С. 59-60.
     Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]