Geum.ru
   Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

Системы направленной визуализации глиом на основе наночастиц железа

Автореферат кандидатской диссертации

 

 

На правах рукописи

Абакумов

Максим Артёмович

 

Системы направленной визуализации глиом на основе наночастиц железа

03.01.04 - Биохимия

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

 

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

 

 

 

Москва - 2012


Работа выполнена на кафедре медицинских нанобиотехнологий Медико-биологического факультета государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России.

Научные руководители:

академик РАМН, д.м.н., профессора Чехонин В.П.

д.х.н., профессор Кабанов А.В.

Официальные оппоненты:а

Курочкин Илья Николаевич, доктор химических наук, профессор кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Ипатова Ольга Михайловна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией фосфолипидных нанолекарств и транспортных систем федерального государственного бюджетного учереждения Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича Российской академии медицинских наук.

аа Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук

Защита состоитсяа лаа _________2012 года ва 15 часов на заседании диссертационного совета Да 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университетеа имениа М.В.а Ломоносоваа поа адресу:а 119991а Москва,а Ленинские Горы,а МГУ,а Химическийа факультет,а кафедраа химическойа энзимологии, аудитория 202.а

Са диссертациейа можноа ознакомитьсяа ва библиотекеа Химическогоа факультета

МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан лаа ________ 2012 г.а

Учёный секретарьа

диссертационного совета,а

кандидат химических наука аИ.К. Сакодынскаяа


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

аа Низкодифференцированные глиомы занимают лидирующее место в структуре нейроонкологических заболеваний [1]. Быстрое прогрессирование и инвазивный характер роста приводит к тому, что хирургическое лечение проводится на стадии, когда опухоль уже глубоко инфильтрирует окружающую ткань. На этом этапе полностью удалить глиому практически невозможно, что приводит практически к 100% рецидиву [2]. При этом такие глиомы, как правило, высоко резистентны к химио- и лучевой терапии, а медиана выживаемости составляет шесть месяцев [3]. Прежде всего, это связано с отсутствием способов ранней диагностики, когда размер опухоли ещё мал и ее удаление в полном объеме не привело бы к нарушениям, не сопоставимым с поддержанием жизненно важных функций головного мозга.

Основным методом прижизненной диагностики опухолей головного мозга является магнитно-резонансная томография (МРТ) с использованием контрастных агентов [4]. Магнитные наночастицы оксида железа (МНЧ) вследствие высокой удельной намагниченности и большого разнообразия возможных покрытий являются перспективным материалом для разработки как опухоль селективных МРТ-контрастов [5], так и различных конструкций на основе МНЧ для адресной доставки лекарственных средств [6] или противоопухолевой терапии методом локальной гипертермии [7]. Кроме того, значения Т2 релаксивности для магнитных наночатсиц на порядок выше, чем соответствующие значения Т1 релаксации для используемых повсеместно в клинике контрастных агентов на основе хелатных комплексов гадолиния, что позволяет существенно снизить дозировку диагностического препарата. Коллоидные растворы наночастиц чистого железа крайне нестабильны, окисляются на воздухе и в сухом виде пирофорны, поэтому чаще всего используют наночастицы оксида железа Fe3O4 или ?-Fe2O3, обладающие схожими магнитными свойствами. В связи с невысокой стабильностью коллоидных растворов наночастиц оксида железа большинство методов синтеза предполагает модификацию их поверхности веществами, препятствующими агрегации. Среди них как высокомолекулярные - декстран [8], хитозан [9], полиэтиленгликоль (ПЭГ) [10], так и низкомолекулярные соединения - фосфатидилхолин, цитрат натрия [11]. Поскольку адсорбция молекул происходит за счёт ионных и электростатических взаимодействий, сильно зависящих от рН и ионной силы раствора, эти покрытия в большинстве случаев не могут обеспечить достаточной устойчивости в физиологических средах. Кроме того, ковалентное присоединение векторных или транспортируемых молекул к подобным лигандам зачастую оказывается затруднительным из-за отсутствия легкодоступных активных химических групп в их структуре (карбоксильной, аминогруппы и т.д.), тогда как стратегия адресной доставки диагностического препарата в орган-мишень позволяет проводить более точную верификацию степени и размера патологического процесса в исследуемой ткани.

Суммируя выше сказанное, следует отметить, что перспективы ранней диагностики опухолей головного мозга требуют создания Т2-контрастных агентов, которые было бы возможно конъюгировать с векторными лигандами, и среди наилучших кандидатов на эту роль могут быть рекомендованы магнитные наночастицы железа и его оксидов.

Цель работы

Разработать способ получения векторного Т2 -контрастного препарата для МРТ на основе магнитных наночастиц оксида железа и антител к антигенам клеток глиомы, оценить его биораспределение в организме и биосовместимость, а также изучить перспективы его применения для МРT- диагностики опухолей головного мозга.

Задачи исследования

  • Адаптировать метод синтеза магнитных наночастиц оксида железа, для соответствия предъявляемым требованиям к контрастирующим агентам для МРТ- диагностики.
  • Разработать метод модификации поверхности наночастиц с целью получения стабильных водных коллоидных растворов магнитных наночастиц.
  • Провести физико-химическую характеристику магнитных наночастиц с помощью просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния и оценить уровень цитотоксичности их водных коллоидных растворов.
  • Разработать способ конъюгации магнитных наночастиц с моноклональными антителами к опухоль-ассоциированным белкам и иммуноцитохимически доказать иммунохимическую специфичность полученных конъюгатов антигенам клеток глиомы С6.
  • Определить среднее время циркуляции в крови и биораспределение в организме крыс с экспериментальной глиомой С6 конъюгатов наночастиц с антителами к глиома-ассоциированным белкам после внутривенного введения.
  • Исследовать влияние внутривенного введения конъюгатов магнитных наночастиц с моноклональными антителами к опухоль ассоциированным белкам на интенсивность сигнала от опухолевой и здоровой ткани в SWI режиме МРТ и определить перспективы их клинического применения.

Научная новизна

аа Разработан способ стабилизации водных коллоидных растворов магнитных наночастиц водорастворимыми биосовместимыми полимерами, таким как полиглутаминовая кислота-15000 (ПГК), блок-сополимер полиглутаминовой кислоты-15000 и полиэтиленгликоля-5000 (ПГК-ПЭГ), полиаспарагиновая-14000 кислота (ПАспК), блок-сополимер полиаспарагиновой кислоты-14000 и полиэтиленгликоля-5000 (ПАспК-ПЭГ), полилизин-16000 (ПЛ), блок-сополимер полилизина-16000 и полиэтиленгликоля-5000 (ПЛ-ПЭГ), бычий сывороточный альбумин (БСА), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА).

Впервые получены и физико-химически охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии и метода динамического светорассеяния биосовместимые водные суспензии наночастиц оксида железа, покрытых БСА.

Впервые получены конъюгаты магнитных наночастиц оксида железа с моноклональными антителами к коннексину 43 (Сх43) и фактору роста эндотелия сосудов (VEGF), сохраняющие свою специфичность к клеткам глиомы С6 крысы.

Проведено исследование распределения конъюгатов магнитных наночастиц оксида железа с моноклональными антителами к опухоль-ассоциированным антигенам в организме крыс с экспериментальной глиомой С6, а также рассчитано время их полувыведения из кровотока после внутривенного введения.

Продемонстрирована специфическая МРТ-визуализация, в режиме SWI, экспериментальной глиомы С6 крысы с помощью конъюгатов магнитных наночастиц оксида железа и моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов через 24 часа после внутривенного введения.

Теоретическая значимость работы

  • Обобщён обширный литературный материал, касающийся способов синтеза, стабилизации, векторизации и применения магнитных наночастиц в медицине, а также выделены основные проблемы возникающие на каждом этапе получения диагностического препарата для биомедицинского применения.
  • Произведено сравнение физико-химических характеристик магнитных наночастиц, полученных различными способами и показано, что введение органических стабилизаторов, содержащих хелатирующие агенты, негативно влияет на растворимость и стабильность водных суспензий и релаксивность магнитных наночастиц.
  • аРадиоизотопный и MРT анализ распределения конъюгатов магнитных наночастиц, с моноклональными антителами к опухоль ассоциированным антигенам, в организме крыс с экспериментальной глиомой С6 показал его высокую специфичность при визуализации клеток глиомы С6.

Научно-практическое значение работы

  • Предложен метод синтеза магнитных наночастиц разложением ацетилацетоната в бензиловом спирте, позволяющий получать наночастицы легко суспендирующиеся в воде при рН 11 в отсутствии каких либо стабилизаторов.
  • Предложен способ иммобилизации белковых молекул на поверхности магнитных наночастиц с целью создания низкотоксичного биодеградируемого покрытия.
  • Разработан способ МРТ-визуализации в режиме SWI глиом головного мозга с использованием Т2-контрастных агентов, на основе конъюгатов магнитных наночастиц и моноклональных анти-VEGF антител.

Основные положения, выносимые на защиту

  • Наночастицы оксида железа, полученные термическим разложением ацетилацетоната железа (III) и покрытые БСА, проявляют высокую Т2 релаксивность, высокую кристалличность и низкую токсичность, что обуславливает перспективность их применения в медицине.
  • Использование глутарового альдегида для стабилизации БСА на поверхности магнитных наночастиц позволяет получить стабильные водные коллоидные растворы магнитных наночастиц.
  • Время полувыведения магнитных наночастиц, покрытых БСА из крови составляет 201,5 минут, что обеспечивает их полное выведение из организма через сутки, а данные о низком накоплении магнитных наночастиц в остальных органах свидетельствуют об их деградации и последующем выведении из организма.
  • Имеются значимые достоверные различия в накоплении в опухолевой ткани магнитных наночастиц, конъюгированных с моноклональными антителами к опухоль-ассоциированным белкам по сравнению с их неспецифическими аналогами.
  • Использование конъюгатов магнитных наночастиц с моноклональными анти-VEGF антителами в качестве Т2-контрастных агентов для МРТ позволяет диагностировать наличие экспериментальной глиомы С6 у животных, а также более точно установить границы её инвазии и степень васкуляризации.

Аппробация работы.

Основные результаты работы были представлены на международных конференциях Nano DDS (Омаха, США, 2010), Роснанофорум (Москва, 2010), Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва 2012), Bionanotox (Ираклион, Крит, 2012), а также на 2-ой Международной школе - Нано 2011. Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина (Пансионат Заря, 2011).

Апробация работы проведена на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры и Отдела медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета ГБОУ ВПО Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета им. Н.И. Пирогова  Минздравсоцразвития России и сотрудников кафедры химической энзимологии аХимического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (протокол № 5-12 от 18 мая 2012 г).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 8 тезисов докладов международных конференций.

Объём и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения; выводов и списка цитируемой литературы, включающего 203 ссылки. Работа изложена на 121 странице, включает в себя 30 рисунков и 2 таблицы.

аа Материалы и методы.

аа Синтез магнитных наночастиц. Синтез магнитных наночастиц, покрытых олеиновой кислотой проводили из пентакарбонила железа и ацетилацетоната железа. Синтез из пентакарбонила железа проводили согласно протоколу [12]. Синтез из ацетилацетоната проводили согласно протоколу [13].

Синтез магнитных наночастиц разложением ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте проводили в трёхгорлой тщательно высушенной и заполненной азотом колбе с обратным водяным холодильником, термометром и газовым инжектором. В колбу помещали 45 мл бензилового спирта и 2,18 г ацетилацетоната железа (III). Затем, при постоянном перемешивании, реакционную смесь продували азотом и медленно нагревали до температуры 383 К, после чего выдерживали 1 ч при данной температуре для выпаривания воды из раствора. Затем температуру реакционной смеси со скоростью 25 градусов в час поднимали до 473 К, и выдерживали при данной температуре 40 часов. Через 40 часов реакционную смесь медленно охлаждали до комнатной температуры, добавляли 90 мл безводного ацетона и отделяли наночастицы центрифугированием при 2000 g в течении 10 минут Полученный осадок дважды промывали избытком ацетона после чего высушивали на роторном испарителе до полного удаления ацетона.

аа Стабилизация водных суспензий магнитных наночастиц. Синтез графт сополимера поли(малеинового ангидрида-альт-1-октадекана) и ПЭГа проводили в соответствии с методикой [14].

Для стабилизации водных суспензий магнитных наночастиц, покрытых олеиновой кислотой, были использованы графт сополимер поли(малеинового ангидрида-альт-1-октадекана) и ПЭГа (PMAO-PEG), а также полиэтиленгликоль-2000-1,2-дистеароил-3-sn-фосфатидилэтаноламин (DSPE-PEG).

Для стабилизации водных суспензий магнитных наночастиц, полученных разложением ацетилацетоната железа (III)  в бензиловом спирте были использованы полиглутаминовая кислота-15000 (ПГК), блок-сополимер полиглутаминовой кислоты-15000 и полиэтиленгликоля-5000 (ПГК-ПЭК), полиаспарагиновая-14000 кислота (ПАспК), блок-сополимер полиаспарагиновой кислоты-14000 и полиэтиленгликоля-5000(ПАспК-ПЭГ), полилизин-16000 (ПЛ), блок-сополимер полилизина-16000 и полиэтиленгликоля-5000 (ПЛ-ПЭГ) и бычий сывороточный альбумин (БСА).

Для стабилизации водных суспензий наночастиц оксида железа, покрытых БСА к 20 мл раствора с концентрацией белка и НЧ оксида железа 4мг/мл и 2 мг/мл соответственно добавляли 500 мкл 1М NaOH, а затем по каплям при перемешивании 2,3 мл 25% водного раствора глутарового альдегида. Полученную смесь инкубировали при перемешивании 15 минут, а затем добавляли 500 мкл 3М глицина с рН 9,2 для связывания непрореагировавших альдегидных групп. К полученному раствору добавляли 1 мл раствора боргидрида натрия в фосфатно-солевом буфере (PBS) концентрацией 2мг/мл. Затем инкубировали 60 минут.

аа Конъюгация моноклональных антител с магнитными наночастицами. Конъюгацию моноклональных антител с магнитными наночастицами проводили с использованием карбодиимида для активации карбоксильных групп на поверхности магнитных наночастиц и последующей реакцией активированных карбоксильных групп с ?-аминогруппами аминокислотных остатков лизина антитела, модифицированных гетеробифункциональным линкером амино-(ПЭГ7500)-малеимид.

Иммунохимическую активность полученных конъюгатов моноклональных антител с магнитными наночастицами подтверждали методами иммуноферментногоа анализа и иммунофлуоресцентного анализа срезов мозжечка в случае магнитных наночастиц, покрытых PMAO-PEG и клеток глиомы С6 в случае магнитных наночастиц, покрытых БСА.

Биораспределение конъюгатов магнитных наночастиц с моноклональными антителами к опухоль-ассоциированным антигенам.

Для изучения биораспределения магнитных наночастиц, покрытых БСА, после внутривенного введения, аминокислотные остатки тирозина БСА, иммобилизованного на НЧ, модифицировали радиоактивным изотопом 125I. Введение радиоактивной метки осуществлялиа с помощью хлорамина. Для этого к 1,2 мл раствора НЧ в РВS с концентрацией 25 мг/мл добавляли 40 мкл раствора Na125I с удельной активностью 1 ГБк. Затем добавляли 100 мкл (10мг/мл) раствора хлорамина и инкубировали 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл (10 мг/мл) тиосульфата натрия.

Стереотаксическое введение клеток C6-глиомы и любые манипуляции с животными выполняли на половозрелых самках крыс в соответствии требованиями предъявляемыми приложением к приказу Министерства высшего и среднего образования СССР от 13.11.1984г. №742 и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003, а также международным правилам Guide for the care and use of Laboratory Animals. Все манипуляции, причиняющие животным болевую или иную травму, выполняли при обезболивании, животных наркотизирули интраперитонеальным введением Кетамина (50 мг/кг) и Седуксена (5 мг/кг), через 2-3 минуты вводят 0.1 мл атропина подкожно.

аа МРТ визуализация глиомы С6 invivo. Для моделирования глиомы С6 производили срединный надрез вдоль черепа, кости отделяли от соединительной ткани. За точку отсчета принамали Bregma, образованная пересечением сагитального (sagittalsuture) и венечного (coronalsuture) швов. Трепанацию черепа производили с помощью краниотома по следующим координатам: Ар -1; L 3,0; V 4,5, TBS -5 мм (SwansonL.W. BrainMaps). Далее клетки глиомы C6 ресуспендировали и отбирали в микрошприц. 4?105 клеток имплантировали с помощью стереотаксического аппарата Narishige через гамильтоновский микрошприц, соединенный с инфузоматом, в правый стриатум со скоростью 5 мкл/мин в объеме 15 мкл. По окончании введения иглу не извлекали и оставляли в том же положении на 5 минут, после чего медленно извлекали со скоростью 2,5 мм/мин.

МРТ исследование эффективности визуализации опухолей головного мозга проводили на животных с экспериментальной моделью глиомы С6. Для визуализации глиомы животным вводили внутривенно раствор наночастиц, конъюгированных с антителами к VEGF (МНЧ-БСА-VEGF), а также с антителами к Сх43 (МНЧ-БСА-Сх43). В качестве контроля использовали МНЧ-БСА, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами мыши IgG (МНЧ-БСА-IgG), а также коммерческий препарат Feridex (Guerbet, Advanced Magnetics). Введённая доза МНЧ в пересчёте на концентрацию железа составляла 10 мг/кг. МРТ-сканирование проводили на томографе Clinscan 7Т фирмы Bruker в режиме SWI с параметрами, перечисленными в Таблица 1.

Время повтора импульса

Время эхо

Кол-во повторов

Тип

Толщина среза

Параметры матрицы

Параметры поля снимка

Время исследования

33 мс

19 мс

1

3D

0,5 мм

320*230 пикселей

45*32 мм

2:58

Таблица 1 . Параметры режима SWI, используемого для диагностики глиомы С6 с помощью МНЧ-БСА.

Последующую обработку изображений проводили с помощью пакета программ Syngo Siemens для обработки МР-снимков.

Результаты и их обсуждение.

В результате синтеза термическим разложением пентакарбонила железа были получены сферические наночастицы, при этом их размер составил 80,6 нм. Полученные НЧ легко растворялись в органических неполярных растворителях (гексане, хлорформе), образуя стабильные магнитные суспензии (Рисунок 1).

Рисунок 1 . Электронная микрофотография наночастиц оксида железа, полученных термическим разложением пентакарбонила железа.

Наночастицы, полученные разложением ацетилацетоната железа (III), несмотря на наличие отдельных наночастиц (6,54 нм), образовывали агрегаты, которые были нерастворимы даже в органических растворителях и дальнейшее их использование было невозможно (Рисунок 2).

Рисунок 2 . Электронная микрофотография наночастиц оксида железа, полученных термическим разложением ацетилацетоната железа в дибензиловом эфире.

Для получения наночастиц, не содержащих гидрофобных стабилизаторов был использован способ разложения ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте. Получаемые этим методом наночастицы также имеют близкую к сферической форму, но размер их больше, чем в случае наночастиц, полученных разложением пентакарбонила (12,51,5 нм). Разброс размеров наночастиц также больше (Рисунок 3).

Рисунок 3 . Электронная микрофотография наночастиц оксида железа, полученных термическим разложением ацетилацетоната железа в бензиловом спирте.

Для перевода гидрофобных МНЧ в водорастворимое состояние необходимо было экранировать гидрофобную оболочку НЧ от полярных молекул воды. В нашем случае мы использовали НЧ, полученные термическим разложениема пентакарбонила железа и два типа покрытия на основе амфифильных молекул: низкомолекулярный DSPE-PEG и графт сополимер PMAO-PEG. После процедуры стабилизации были получены растворы тёмно коричневого оттенка. Средний размер частиц, измеренный методом динамического светорассеяния, составил 10810 нм в случае DSPE-PEG (МНЧ-DSPE-PEG) и 13110 нм для PMAO-PEG (МНЧ-PMAO-PEG). Просвечивающая электронная микроскопия водных суспензий показала, что наночастицы оксида железа заключены в центр мицелл, образованных молекулами амфифильного покрытия (Рисунок 4, А). Гидродинамический диаметр и ?-потенциал МНЧ, покрытых БСА, составили 535 нм и -41 4 мВ соотвественно. . Просвечивающая электронная микроскопия показала, что наночастицы покрытые БСА не образуют агрегатов (Рисунок 4, Б).

Рисунок 4 . Электронные микрофотографии водной суспензии наночастиц оксида железа, покрытых PMAO-PEG (А) и покрытых БСА (Б).

Чтобы предотвратить десорбцию молекул БСА с поверхности наночастиц их необходимо было стабилизировать, что было достигнуто с помощью межмолекулярной сшивки глутаровым альдегидом. После очистки от несвязанных с поверхностью молекул белка размер наночастиц, покрытых БСА и сшитых глутаровым альдегидом (МНЧ-БСА), составил 905 нм , а ?-потенциал был равен -35 мВ.

Измерение Т2 релаксивности показало, что релаксивность МНЧ-DSPE-PEG составила 82,8812 мМ-1с-1, релаксивность МНЧ-PMAO-PEG - 76,7213 мМ-1с-1,а релаксивность МНЧ-БСА - 27010 мМ-1с-1 (Рисунок 5).

В случае МНЧ-PMAO-PEG, МНЧ-DSPE-PEG величина релаксивности в 3 раза ниже, чем в случае МНЧ-БСА, что может быть объяснено негативным влиянием стабилизаторов, содержащих карбоксильные группы на упорядоченность кристаллической структуры магнитного ядра [15].

Рисунок 5 . Зависимость Т2 релаксации (R2) протонов воды от концентрации магнитных центров.

. Оценить упорядоченность, степень кристалличности и тип кристаллической решётки наночастиц полученных разложением пентакарбонилом железа не представляется возможным, так как невозможно отделить наночастицы от олеиновой кислоты и получить препарат, содержащий только оксид железа. МНЧ полученные разложением ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте представляют собой порошок, спектр дифракции рентгеновских лучей с которого показан на рисунке 6 .

Расположение максимумов дифракции свидетельствует о наличии одной кристаллической фазы высокой степени упорядоченности со структурой шпинели, а структуру шпинели имеет двойной оксид железа FeOХFe2O3 (маггемит).

Рисунок 6 . Спектр порошковой рентгеновской дифракции магнитных наночастиц, полученных термическим разложением ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте.

Для оценки специфичности конъюгатов моноклональных антител с МНЧ-БСА использовали метод иммунофлуоресцентного анализа, который проводили на фиксированной культуре клеток глиомы С6. МНЧ-БСА, конъюгированные с моноколональными антителами к экстраклеточному фрагменту Е2 коннексина 43 (МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43) проявляли высокую специфичность по отношению к опухолевым клеткам. Они позволяют визуализировать плакоидные структуры, характерные для локализации мембранного Сх43, подобные тем, которые визуализируются с помощью первичных анти-Cx43 антител. Важно отметить, что МНЧ-БСА, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами мыши (МНЧ-БСА-IgG) не взаимодействовали с поверхностью клеток при любых концентрациях, тогда как взаимодействие МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43 с опухолевыми клетками наблюдалось вплоть до концентрации 2 мкг/мл (Рисунок 7).

Рисунок 7 . Иммунофлюоресцентный анализ наночастиц оксида железа, конъюгированных с моноклональными антителами к Сх43 (А) и с неспецифическими иммуноглобулинами мыши (Б) на фиксированной культуре клеток глиомы С6. В качестве флуоресцентного красителя использовали иммуноглобулины козы специфичные к иммуноглобулинам мыши, меченные флуоресцентным красителем Alexa fluor 488. Увеличение ?1000, масляная иммерсия.

На основе данных по удельной радиоактивности в крови было рассчитано значение времени полувыведения наночастиц из крови, которое составило 201,5 минуты и было равно как для МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43, так и для МНЧ-БСА-IgG (Рисунок 8).

Рисунок 8 . Оценка среднего времени циркуляции наночастиц в крови.

Исследование распределения радиоактивной метки по органам через 24 часа после введения показало, что наибольшее накопление наблюдается в щитовидной железе (19%), печени (5%) и почках (1%), тогда как уровень радиоактивности в остальных органах составлял менее 0,1 % от введённой дозы (Рисунок 9). Как и в случае значений времени полувыведения из крови значения остаточной радиоактивности в органах были одинаковы для МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43 и МНЧ-БСА-IgG. Столь высокий уровень радиоактивности в щитовидной железе вызван высоким уровнем интенсивности захвата йодсодержащих остатков тирозина её клетками.

Рисунок 9 . Распределение МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43 и МНЧ-БСА-IgG по организмуа через 24 часа после внутривенного введения

Отдельно было изучено накопление МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43 и МНЧ-БСА-IgG в здоровом и поражённом глиомой полушарии мозга. В случае здорового полушария ни один тип наночастиц не продемонстрировал высокого накопления, что объясняется наличием интактного гематоэнцефалического барьера. В поражённом глиомой полушарии крыс получавших МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43 наблюдалось более высокое накопление наночастиц (Рисунок 10).

Рисунок 10 . Накопление меченных 125I МНЧ-IgG И МНЧ-Mab-anti-Сх43 в здоровой ткани и глиоме.

Исследование эффективности визуализации глиомы МНЧ-БСА-Mab-anti-Сх43 и МНЧ-БСА-Mab-аnti-VEGF in vivo.

Основываясь на данных полученных при МРТ исследованиях можно сделать вывод о том, что все используемые в работе магнитные НЧ сразу после введения преимущественно находятся в кровеносной системе. Кроме того, на МР-томограммах через 10 минут после введения отчётливо визуализируетсяа структура кровеносных сосудов опухоли, которая позволяет определить очаг опухолевого процесса, тогда, как до введения магнитных наночастиц точно установить границы и локализацию опухоли не представляется возможным (Рисунок 11).

При исследовании влияния МНЧ-БСА-Mab-аnti-VEGF на интенсивность сигнала в опухоли отличий от МНЧ-БСА-IgG и МНЧ-БСА-Mab-аnti-Cx43 через 10 минут после введения обнаружено не было. Тем не менее, важно отметить, что все используемые нами препараты на основе МНЧ-БСА показали заметно лучшую визуализацию, чем коммерческий препарат Feridex, который практически не накапливался в опухоли даже непосредственно после внутривенного введения.

Рисунок 11 . МРТ снимки головного мозга крысы до внутривенного введения препарат магнитных наночастиц (А, В, Д, Ж) и через 10 минут после внутривенного введения (Б, Г, Е, З)

А, Б - Feridex аа В, Г - МНЧ-БСА-IgG

Д, Е - МНЧ-БСА- Mab аnti-VEGF а Ж, З - МНЧ-БСА- Mab аnti-Cx43

МРТ-исследование, проведённое через 2 часа после внутривенного введения, показывает, что интенсивность сигнала постепенно возвращается к прежнему уровню, что связано с понижением концентрации наночастиц в крови, согласно экспериментам по биораспределению, проведёнными с меченными 125I наночастицами. Через 24 часа интенсивность сигнала от опухолевой ткани возвращается к уровню, характерному для нормальной ткани до введения контрастного агента в случае всех препаратов векторных магнитных наночастиц, кроме МНЧ-БСА-Mab-аnti-VEGF, которые показывают накопление в опухоли, в области, где наиболее активно проходит неоангиогенез, за счёт специфического захвата анти-VEGF-антител на поверхности эндотелиоцитов опухолевых сосудов. МНЧ-БСА-Mabаnti-Cx43, чьё связывание было показано в экспериментах с радиоактивной меткой, подобного захвата не продемонстрировали, что объясняется более низким уровнем экспрессии этого белка клетками глиомы, и, следовательно, относительно малым количеством наночастиц, связанных с опухолью, которого недостаточно для эффективного влияния на сигнал.

Рисунок 12 . МРТ снимки головного мозга крысы до внутривенного введения препарат магнитных наночастиц (А, Г, Ж, К), через 2 (Б, Д, З, Л) и через 24 часа (В, Е, И, М) после внутривенного введения

А, Б, В - Feridexа Г, Д, Е - МНЧ-БСА-IgG

Ж, З, И - МНЧ-БСА- Mab-аnti-VEGF а Л, М, К - МНЧ-БСА-Mab аnti-Cx43

Таким образом, нами было показано, что МНЧ вне зависимости от типа антител позволяют визуализировать опухоли головного мозга с развитой сосудистой сетью, что наблюдается на последних стадиях развития опухолевого процесса, а МНЧ-БСА-VEGF способны специфично визуализировать опухолевую ткань, в которой идёт активный синтез проангиогенного фактора роста эндотелия сосудов, что более характерно для ранних стадиях опухолевого неоангиогенеза.


Список литературы.

  1. Holland E. C. // Glioblastoma multiforme: The terminator //Proc Natl Acad Sci USA. 2000, том 97, стр. 6242Ц6244.
  2. Ishii N., Tada M., Hamou M. F., Janzer R. C., Meagher-Villemure K., Weistler O. D., Tribolet N., Van Meier E. G. //Cells with TP53 mutations in low grade astrocytic tumors evolve clonally to malignancy and are an unfavorable prognostic factor. // Oncogene. 1999, том 18, стр. 5870Ц5878.
  3. Rizvi S., Asghar A.H., Mehboob J. // Gliosarcoma: a rare variant of glioblastoma multiforme. // J Pak. Med. Assoc. 2010. том 60, стр. 773-775.
  4. Giannopoulos S., Kyritsis A.P. // Diagnosis and management of multifocal gliomas. // Oncology. 2010. том 79, стр. 306-312.
  5. Pankhurst Q. A., Connolly J., Jones S. K., J Dobson. // Applications of magnetic nanoparticles in biomedicineа J. Phys. D: Appl. Phys. // 2003. том 36.стр. 167.
  6. Dilnawaz F., Singh A., Mohanty C. et al. // Dual drug loaded superparamagnetic iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy // Biomaterials. 2010. том 31, стр. 3694Ц3706.
  7. Gonzales-Weimuller M., Zeisberger M., Krishnan K. M. // Size-dependant heating rates of iron oxide nanoparticles for magnetic fluid hyperthermia // J. Magn. Magn. Mater. 2009. том 321, стр. 1947Ц1950.
  8. Molda R. S., MacKenzie D. // Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells // J. Immunol. Methods. 1982. том 52, стр. 353.
  9. Laurent S., Forge D., Port M. et al // Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization, Physicochemical Characterizations, and Biological Applications // Chem. Rev.2008. том 108, стр. 2064Ц2110
  10. Kim D. K., Zhang Y., Kehr J. et al // Characterization and MRI study of surfactant-coated superparamagnetic nanoparticles administered into the rat brain // J. Magn. Magn. Mater. 2001. том 225, стр. 256-261
  11. Sahoo Y., Goodarzi A., Swihart M. T. et al. // Aqueous Ferrofluid of Magnetite Nanoparticles:? Fluorescence Labeling and Magnetophoretic Controlа // J. Phys. Chem. B. 2005. том 109, стр. 3879-3885.
  12. Park J., Lee E., Hwang N., Kang M., Kim S. C., Hwang Y., Park J.-G., Noh H.-J.,. Kim J.Y, Park J.-H., Hyeon. T. //One-Nanometer-Scale Size-Controlled Synthesis of Monodisperse Magnetic Iron Oxide Nanoparticles. // Angew. Chem. Int. Ed. 2005, том 44, стр. 2872 Ц2877
  13. Zhang et al. // Synthesis of polyacrylamide modified magnetic nanoparticles and radiolabeling with 188Re for magnetically targeted radiotherapy. // J.of Magn. and Magn. Mat. 2005. том 293, стр. 193Ц198.
  14. Yu W.W., Chang E., Sayes C. M., Drezek R., Colvin V. // Aqueous dispersion of monodisperse magnetic iron oxide nanocrystals through phase transfer // Nanotechnology. 2006. том. 17, стр. 4483Ц4487.
  15. Liu C., Huang P. M. // Atomic Force Microscopy and Surface Characteristics of Iron Oxides Formed in Citrate Solutions // Soil Sci. Soc. Am. J. 1999, том 63, стр. 65.

 

Выводы

1) Разложение ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте с дальнейшей стабилизацией магнитных наночастиц БСА позволяет получать стабильные водные коллоидные растворы наночастиц не обладающие токсичностью до концентрации 2,5 мг/мл.

2) Межмолекулярная сшивка магнитных наночастиц БСА глутаровым альдегидом приводит к получению стабильных водных магнитных суспензий с средним гидродинамическим размером наночастиц 95 нм, ?-потенциалом -35 мВ, и значением Т2 релаксивности равному 27010 мМ-1с-1.

3) Конъюгация магнитных наночастиц оксида железа с моноклональными антителами с использованием амино-ПЕГ(7500)-малеимида позволяет сохранить их иммунохимическую активность и повысить специфичность взаимодействия полученных конъюгатов с антигенами на поверхности клеток глиомы.

4) Коньюгаты магнитных наночастиц с моноклональными антителами анти-Сх-43 характеризуются низкой токсичностью (до 2,5 мг/мл), временем их полувыведения из крови равным 20 1,5 минутам, и высокой специфичностью (3,5-4 кратное накопление по сравнению с неспецифическими IgG).

5) Внутривенное введение конъюгатов магнитных наночастиц, с моноклональными анти-VEGF антителами в дозе 10 мг/кг позволяет специфично визуализировать экспериментальную глиому С6 с помощью МРТ-исследования в режиме SWI.

Практические рекомендации

Полученные конъюгаты магнитных наночастиц оксида железа, с моноклональными антителами к VEGF, могут быть использованы для повышения достоверности диагностики опухолей головного мозга на ранней стадии с помощью МРТ-исследования в режиме SWI.

аа Список опубликованных научных работ по теме диссертации

  1. М.А. Абакумов, В.П. Баклаушев, Я.А. Зоркина, А.Е. Чеканова, Е.А. Гудилин, В.П. Чехонин. Система направленной визуализации глиом на основе наночастиц оксида железа. Материалы V Международной (XIV Всероссийская) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, г.Москва, 2010, стр. 488.
  1. Abakumov M.A., Sandalova T.O., Yusubalieva G.M., Grinenko N.F, Baklaushev V.P., Vishvasrao H., Sokolsky-Papkov M., Kabanov A.V., Chekhonin V.P. Magnetic biocompatible iron oxide nanoparticles for MRI-diagnostics. Nano Drug Delivery Symposium, Omaha, Nebraska, Usa, 2010, стр. 85.
  2. Абакумов М.А., Зоркина Я.А., Чеканова А.В., Гудилин Е.А., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Гриненко Н.Ф., Чехонин В.П., Кабанов А.В. Способ получения биосовместимых магнитных нанокапсул для визуализации сосудов методом МРТ, III Международный форум по нанотехнологиям,а Москва, Россия. 2010, стр. 57.
  3. Абакумов М.А., Сандалова Т.О, Юсубалиева Г.М., Гриненко Н.Ф., Баклаушев В.П.,Вишвасрао Х., Сокольски-Папков М., Кабанов А.В., Чехонин В.П. Магнитные биосовместимые наночастицы оксида железа для МРТ-диагностики. VI Международная (XV Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых, Москва, 2011, стр. 227.
  4. Abakumov M.A., Sandalova T.O., Yusubalieva G.M., Grinenko N.F., Baklaushev V.P., Vishvasrao H., Sokolsky-Papkov M., Kabanov A.V., Chekhonin V.P.а Magnetic biocompatible iron oxide nanoparticles for MRI-diagnostics. Материалы 2-ой Международной школы Наноматериалы и нанотехнологиив живых системах. Безопасность и наномедицина, 19-24.09.2011, стр. 162.
  1. Abakumov M.A., , Vishwasrao H., Sokolsky-Papkov M., Nukolova N.,Sandalova T.O., Yusubalieva G.M., Grinenko N.F., Baklaushev V.P., Kabanov A.V., Chekhonin V.P. Magnetic biocompatible iron oxide nanoparticles for MRI-diagnostics. Материалы международной конференции Биотехнология- состояние и перспективы развития, Москва, 20-22.03.2012, стр. 215.
    • Abakumov M.A., Grinenko N.F., Sandalova T.O., Nukolova N.V., Kabanov A.V. Magnetic biocompatible iron oxide nanoparticles for MRI-diagnostics. VII Международная (XVI Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых, 2012, стр. 198
    • Abakumov M.A., Vishwasrao H.,Sandalova T.O., Nukolova N.V.,Yusubalieva G.M., Grinenko N.F., Baklaushev V.P., аSokolsky-Papkov M., Kabanov A.V., Chekhonin V.P. Glioma C6 visualization by MRI with conjugate of magnetic iron oxide nanoparticles and monoclonal antibodies to connexin 43. 3rd Russian-Hellenic simposium with international participation, Heraclion, Greece, 2012, стр. 32.
    • Абакумов М. А., Гольдт А. Е.,Сокольски-Папков М., Зоркина Я. А., Баклаушев В. П., Гудилин Е.А., Кабанов А. В и Чехонин В. П. Векторизованные наночастицы оксида железа для визуализации эндотелиоцитов методом магнитно-резонансной томографии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2011, Том 151, №6, стр. 672-677
    • М.А. Абакумов, Н.Ф. Гриненко, В.П. Баклаушев, Т.О. Сандалова, Н.В. Нуколова, А.В. Семенова, М. Сокольски-Папков, Х. Вишвасрао, А.В. Кабанов, В.П. Чехонин. Опухоль-специфичный контрастный агент на основе суперпарамагнитных наночастиц оксида железа для визуализации глиом методом магнито-резонансной томографии, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2012, Том 153, №1, стр. 101-106.
         Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]