Авторефераты по темам >> Разные специальности - [часть 1] [часть 2]

Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

Автореферат кандидатской диссертации

На правах рукописи

Рыбакова Елена Юрьевна

МЕМБРАНОТРОПНЫЕТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ

БИОРЕГУЛЯТОРЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ И

КОСТНОЙ ТКАНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.01.02 биофизика 03.01.06. биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Виктория Петровна Ямскова

доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Мальцева Елена Львовна

доктор биологических наук, профессор Максимов Георгий Владимирович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 27 июня 2012г. в 12.00 часов

на заседании Диссертационного совета Д002.039.01 при Федеральном государственном

бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

РАН по адресу:

119334, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН.

Автореферат разослан "____ "__________________ 20_

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наука Мазалецкая Л.И.

Введение

Актуальность работы. Реализация физиологических и биохимических процессов в различных тканях обусловлена действием множества регуляторных молекул. Регуляция происходит как внутри клетки с участием цитоплазматических белков, так и со стороны межклеточного пространства посредством взаимодействия различных лигандов с рецепторами клеточной поверхности. Изучению биорегуляторов в науке вообще и в биофизике и биотехнологии в частности уделяется большое внимание. Это связано с тем, что, полученные о структуре и механизме действия биорегуляторов, знания являются основой для понимания сущности процессов, происходящих в живых системах. В биотехнологии различные биорегуляторы широко используются, прежде всего, в качестве лекарственных средств.

Настоящее исследование посвящено изучению эндогенных биорегуляторов, которые на основании своеобразия их свойств и активности, выделены в отдельную группу мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ).

В качестве объектов исследования были выбраны МГТБ сыворотки крови и костной ткани млекопитающих. Несмотря на то, что сывороточный биорегулятор ранее был выделен, были изучены некоторые его свойства и на его основе разработаны два фармакологических препарата имеющиеся сведения о его структуре и свойствах, оказались недостаточными. Поэтому в настоящей работе продолжено исследование его свойств и, особенно, его специфической биологической активности. Биорегулятор, выделенный из костной ткани, в настоящей работе изучен впервые.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось исследование биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих.

В отдельные задачи исследования входило:

Выделить биорегулятор из костной ткани млекопитающих и изучить некоторые физико-химические свойства биорегулятора, выделенного из костной ткани (вторичная структура, наноразмерное состояние, а также значение мол. массы).
Выделить МГТБ из сыворотки крови млекопитающих и исследовать ряд его физико-химических свойств.
Изучить условия инактивации сывороточного биорегулятора.
Разработать новые экспериментальные модели для изучения специфической активности биорегуляторов, выделенных из костной ткани и сыворотки крови мл екопитаю щих.

Новизна работы. Впервые из костной ткани крыс был выделен МГТБ, который проявляет физико-химические свойства и активность, характерные для всех биорегуляторов данной группы. Впервые показано, что в состав МГТБ сыворотки крови входят биологически активные пептиды и белок, модулирующий их активность, который представляет собой ранее неизученную изоформу преальбумина сыворотки крови. Определены фрагменты первичных структур пептида и белка-модулятора, входящих в состав МГТБ сыворотки крови.

Для исследования специфической биологической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, были разработаны новые модели роллерного органотипического культивирования кожи и регенерата хвоста тритона Pleurodeles waltl. Впервые показано, что оба биорегулятора оказывают протекторное действие на ткани кожи и хряща, которое выражается в поддержании жизнеспособности клеток и структуры этих тканей.

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании ранозаживляющего действия биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, указывают на перспективность разработки на его основе новых препаратов для применения в травматологии и хирургии, особенно, челюстно-лицевой. Эти препараты следует использовать при травмах, ожогах кожи как высокоэффективные ранозаживляющие средства, которые будут способствовать восстановлению структуры кожи. Кроме того, представляется актуальной разработка препаратов на основе биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани, для применения в ортопедии и травматологии при лечении переломов, заболеваний суставов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на конференции Эндогенные соединения в морфогенезе и восстановительных процессах -интегрирующие и регуляторные системы: теория и практика Москва, 1-2 декабря 1999 г.; на XIII зимней международной молодежной научной школе Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва. 7-9 февраля 2001 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 8 декабря, 2004 г.; на XIV Школе Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии Звенигород, 28 февраля - 4 марта 2005 г.; на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе Химия и медицина Уфа, 5-8 сентября 2005 г.; на конференции Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты, Москва, 17 - 18 ноября 2005 г.; на V ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы Биохимическая физика, Москва, 14-16 декабря 2005 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова

5 РАН, Москва, 21 декабря 2005 г.; на IV Международном конгрессе Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, Санкт-Петербург, 3-7 июля 2006 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 29 ноября 2006 г.; на симпозиуме с международным участием Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза, Москва, 9-11 октября 2007; на VII Ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы Биохимическая физика. Москва, 12 - 14 ноября 2007 г.; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 12 - 13 декабря, 2007; на IV Международном симпозиуме Механизмы действия сверхмалых доз Москва, 28-29 октября 2008; на XV Школе Актуальные проблемы биологии развития. Звенигород. 20-24 октября 2008; на V Международном конгрессе Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, Санкт-Петербург, 29 июня - 3 июля, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них 6 статей в журналах, входящих в Перечень ВАК РФ, 3 статьи в книгах и сборнике, 16 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах и включает следующие главы:

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Обзор литературы посвящен описанию и систематизации результатов исследования группы мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ).

Экспериментальная часть посвящена описанию материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены результаты, полученные при идентификации МГТБ в сыворотке крови и в костной ткани млекопитающих, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучении мембранотропной и специфической активности, проявляемой в сверхмалых дозах (СМД), а также заключение, содержащее анализ полученных данных.

Выводы.

Диссертация содержит 6 таблиц, 38 рисунков, 136 итературных ссылок.

Результаты и их обсуждение Выделение из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих МГТБ и их

очистка

МГТБ выделяли из сыворотки крови крупного рогатого скота (50 л) - стерильный, инактивированный коммерческий препарат, используемый в качестве добавки в ростовую среду клеточных культур, производства ФГУП Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МП. Чумакова РАМН.

МГТБ выделяли из бедренных и больших берцовых костей крыс после удаления эпифизов и костного мозга путём экстракции ткани в физиологическом растворе в течение 3-4 часов при +4С.

Высаливание сыворотки крови и экстракта костной ткани осуществляли в насыщенном растворе сернокислого аммония. Фракции надосадочных жидкостей -супернатанты разделяли изоэлектрофокусированием (ИЭФ) в градиенте рН 3,5 - 10,0 (рис. 1). Все фракции собирали и исследовали методом биотестирования, основу которого составляет оценка мембранотропной активности биорегуляторов данной группы. В сыворотке крови были обнаружены 2 биологически активные фракции, а в экстракте костной ткани - 1. Основные характеристики этих фракций представлены в таблице 1

О А----------------------- I----------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I---------------- I----------------- I----------------- \---------------- \- О

ап1 ап2аа 1аа 2а 3 4а 5 6а 7а 8 9а 10аа 1 1 12аа 13аа 14аа 15аа 16аа 17аа 18аа 19аа 20аа 21 22аа 23аа 24аа 25аа 26аа 27

номера фракций

Рис.1. Изоэлектрофокусирование фракции супернатанта экстракта костной ткани крыс Wistar. По абсциссе - номер фракций; по ординате 1 - значения рН, соответствующие номерам фракций; по ординате 2 - значения оптической плотности соответствующие номерам фракций.

Далее были изучены некоторые физико-химические свойства, а также биологическое действие данных фракций.

Таблица 1. Характеристики ИЭФ-фракций супернатантов, выделенных из сыворотки крови КРС и костной ткани крыс

Название фракции	Интервал значений рН, в котором собирали фракцию	Концентрация белка, мг/мл	Степень разведения фракции, при которой обнаружена мембранотропная активность (Ma)
Фракции, выделенные из сыворотки крови
БРС1	до 3,0	0,420,07	IO5;IO7; IO9-IO13; IO20
БРС2	4,5-5,1	0,480,1	IO4 -IO5; IO9; IO12 - IO17
Фракция, выделенная из экстракта костной ткани
БРК	до 3,0	1,00,01	IO13; IO15-IO17

Изучение состава биорегуляторов и их физико-химических свойств

Исследование состава ИЭФ-фракций биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови, методом ядерного магнитного резонанса показало, что в их состав входят аминокислоты, которые идентифицируются по различным пикам (3.0 - 3.8 м.д.), кроме того, обнаруживаются углеводные составляющие: это пики из области 2.4 - 2.6 м.д., а также липидные: пики - 1.25 и 2.7 м.д. Полученные результаты указывают на сложный состав биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови КРС.

Методом электрофореза в ПААГ было показано, что ИЭФ-фракций биорегуляторов содержат компоненты с высокой электрофоретической подвижностью (Rf 0,920,05) (рис.3). Поскольку низкомолекулярные компоненты окрашивались Кумасси, можно заключить, что в состав изучаемых фракций входят пептиды. Действительно, при исследовании данных фракций сывороточного МГТБ ранее было показано, что в их состав входят пептиды с мол. массой 1222,1 Да и 1338,7 Да, соответственно, (методы идентификации - MALDI-TOF и Electrospray масс-спектрометрия) [Ямское и др., 2001; Yamskova, Rybakova at al, 2007]. Более того в этих работах было показано, что именно пептиды ответственны за биологическое действие МГТБ, выделенного из сыворотки крови. Полученные результаты полностью согласуются с результатами исследования состава МГТБ, выделенных из других тканей млекопитающих: за их биологическое действие отвечает, именно, белковая компонента. Следует отметить, что, кроме низкомолекулярного компонента во всех изучаемых фракциях, особенно, в БРС2 присутствовал белок с молекулярной массой около 60000 Да.

94,6кДа 66,2 кДа

45,0 кДа 36,0 кДа 29,0 кДа 24,0 кДа

20,0кДа

14,2 кДа 6,5 кДа

а)

6М

94,6кДа 66,2 кДа 45,0 кДа 36,0 кДа 29,0 кДа 24,0 кДа 20,0кДа

14,2 кДа 6,5 кДа

Рис.3. Электрофорез в ПААГ ИЭФ-фракций биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани: а), б) 1 - маркерные белки: апротинин из легкого быка - 6,5 кДа ; ?-лактальбумин -14,2 кДа; соевый ингибитор трипсина - 20,0 кДа; трипсиноген из поджелудочной железы быка -24,0 кДа; карбоангидраза- 29,0 кДа; глицеральдегид-3-фосфатгидрогеназа- 36,0 кДа; овальбумин - 45,0 кДа; бычий сывороточный альбумин - 66,2 кДа; фосфорилаза b - 94,6 кДа; 2а - БРС2; За -БРС1;2б-БРК

Для изучения биологической активности отдельных компонентов, входящих в состав

изучаемых фракций биорегуляторов, был проведен электрофорез в ПААГ в отсутствии

детергента. Полученные фракции элюировали из геля, исследование их мембранотропной

активности показало, что низкомолекулярные фракции являются биологически

активными.

Методомаа круговогоаа дихроизм былоаа показано, чтоаа ваа раствореаа белковые

компоненты фракций обоих биорегуляторов содержат преимущественно ?-структуры, а

такжеа участкиа са неупорядоченныма состояниема -а статистическийа клубок,аа (табл.аа 2),

аналогично тому, как это было обнаружено для фракций МГТБ, выделенных из других

тканей.

Таблица 2. Характеристика вторичной структуры пептид-белковых компонентов, входящих в состав ИЭФ-фракций биорегуляторов.

Количество структур, определенных вс фракции	Название структуры
	а - спирали	?- структуры			статистический клубок
	а - спирали	антипараллельные	параллельные	изгибы	статистический клубок
БРК	6,3 0,5	40,8 0,5	3,6 0,5	17,2 0,5	32,7 0,5
БРС1	8,0 0,5	40,0 0,5	2,0 0,5	18,0 0,5	33,0 0,5
БРС2	10,0 0,5	38,0 0,5	2,0 0,5	17,0 0,5	32,0 0,5

9 Данные литературы указывают на тенденцию молекул белков, вторичная структура

которыха содержит преимущественноа ?-структуры,а ва водных раствораха образовывать

межмолекулярные ассоциаты [Ross, Poirier, 2004; Рамис, 2005; Рамис, 2006].

Приа исследованииа водныха раствороваа фракцийа БРС1,а БРС2а иа БРКа методом

динамическогоаа лазерногоаа светорассеянияаа былоаа установлено,аа чтоаа ваа ихаа растворах

содержатся крупные наноразмерные частицы (табл. 3).

Таблица 3. Кажущиеся величины гидродинамических радиусов (Rh) частиц,

обнаруженных водных в растворах ИЭФ-фракций биорегуляторов.___________________

БРС1

БРС2

БРК

62,053,0 нм

55,81,3 нм

87,74,4 нм

Исследование фракций БРС1, БРС2 и БРК методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрил - вода на колонке С 8 показано, что БРС1, БРС2 и БРК разделяются на гидрофильную, характеризующуюся временем удерживания 3-5 мин., и гидрофобную с временем удерживания 11-14 мин. фракции. Методом биотестирования было установлено, что обе ВЭЖХ-фракции оказались активными в СМД: для БРС1 со временем удержания 3,3 и 13,40 мин; для БРС2 с временем удержания 3,6 и 11,6 мин, выделенных из сыворотки крови, а также для БРК, с временем удержания 3,85 и 13,95 мин.

Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии в супернатантах сыворотки крови и экстракта костной ткани были обнаружены пептиды с молекулярными массами: для супернатанта сыворотки - 16662, 18123, 19152, 20162 Да; для супернатанта экстракта костной ткани - 43 01 2 Да.

Таким образом, суммируя полученные данные при изучении фракций БРС1, БРС2 и БРК, можно заключить, что проявляемые ими физико-химические свойства характерны для аналогично полученных фракций МГТБ, выделенных из других тканей млекопитающих, и изученных ранее.

Белок, модулирующий активность сывороточного биорегулятора (белок-модулятор)

Ранее было показано, что биорегулятор присутствует в сыворотке крови взрослых особей и эмбрионов млекопитающих в различном состоянии: во всём постнатальном периоде он находится в неактивном состоянии, а в первые две трети эмбрионального развития биорегулятор присутствует в сыворотке крови в активном состоянии. Было показано, что инактивация сывороточного биорегулятора в последней трети эмбриогенеза происходит постепенно: в течение этого периода наблюдалось снижение его активности

10 до полной инактивации к моменту рождения особи [Ямскова, Резникова 1991~\. Можно было предположить, что инактивация биорегулятора связана с образованием комплекса с каким-то компонентом сыворотки.

Активность биорегулятора появлялась во фракции супернатанта после высаливания основной массы сывороточных белков. Модулятор был выделен из осадка при дробном высаливании белков: он присутствовал во фракции, соответствующей 70-90%-ного насыщения соли и флотирующей после центрифугирования на 105000 g. Активность белка-модулятора оценивали по исчезновению мембранотропной активности БРС1 и БРС2 после инкубации с соответствующей белковой фракцией осадка.

Для исследования механизма, лежащего в основе процесса инактивации сывороточного биорегулятора, был применён метод аффинной хроматографии. Применение данного метода было связано с тем обстоятельством, что по данным углеводного анализа МГТБ содержал маннозу и ]ЧГ-ацетил-0-глюкозамин. Поэтому для связывания маннозосодержащей компоненты была применена СопА-сефароза 4В, а для связывания лектиноподобной компоненты - сорбент, содержащий D-маннозу , связанную с сефарозой 4В через дивинилсульфон (man-сефарозе 4В). На ConA-сефарозе 4В проводили аффинную хроматографию фракций БРС1 или БРС2. На man-сефарозе 4В хроматографировали фракцию осадка, полученную после центрифугирования при 105000 g. Оба компонента сывороточного биорегулятора после взаимодействия с указанными сорбентами элюировали раствором, содержащим ?-метилманнозид и исследовали мембранотропную активность элюатов. В результате проведённого исследования было показано, что компонент биорегулятора, который взаимодействовал с ConA-сефарозой 4В проявлял мембранотропную активность в СМД, а после дегликозилирования трифторметансульфокислотой представлял собой пептид с мол. массой 1338,7 Да [Ямское и др., 2001]. Он получил название регуляторного пептида. Компонент биорегулятора, взаимодействующий с man-сефарозой 4В, представлял собой белок, который проявлял способность обратимо ингибировать мембранотропную активность гликопептида, элюированного с сорбента СопА-сефароза 4В. Были изучены физико-химические свойства этого белка.

Методами обращённо-фазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрил-вода и SDS -фореза в ПААГ было показано присутствие одного белка, кажущееся значение молекулярной массы которого составляло 66000 - 67000 Да (рис. 6), а методом ИЭФ было определено значение его pi, которое находится в интервале рН 3,90-3,93. Масс-спектрометрией было определено значение мол. массой, которое составило 67854 Да.

Аминокислотный состав белка-модулятора представлен в табл. 4. Использование алгоритма PROPSEARCH (база данных SwissProt) проведён поиск структурно-функциональных гомологов среди известных белков, который показал, что белок-модулятор относится к группе преальбуминов сыворотки крови млекопитающих (табл. 4).

Определение ?-концевой последовательности путём секвенирования по Эдману показало, что данный белок представляет собой не изученную форму преальбумина сыворотки крови быка [Ямскова, Рыбакова и др., 2004].

Таким образом, установлено, что ИЭФ-фракции биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих имеют сложное строение, в их состав входит пептид (гликопептид для сывороточного биорегулятора) и высокомолекулярный белок, модулирующий активность пептида (белок-модулятор).

Отдельное исследование было посвящено изучению условий образования комплекса между регуляторным пептидом и белком-модулятором. В этом аспекте следует отметить, что сыворотка крови КРС не проявляет мембранотропную активность. После проведения

12 ИЭФ сыворотки крови мембранотропная активность была обнаружена во фракции, собранной в области рН <3,0.

Известно, что одним кислых белков сыворотки является AGP, или оросомукоид, который представляет собой гликопротеин, углеводная компонента которого содержит ?-гликаны [Schmid, 1950; Schmid, 1953; Schmid, 1977; Yoshima et al, 1981]. Следует отметить тот факт, что мол. масса AGP составляет 45000 Да (рис. 7).

Gaipi-4GlcNAcpi \. 6

Manal ч

Gaipi-4GlcNAcpi ^26

Мапр 1 -4GlcNAcP 1 -4GlcNAc-OH

Gaipi-4GlcNAcpi ^-4аа 3

Manal '

Gaip 1 -4GlcNAcP 1а ^ 2 Рис. 7. Асиалированный ?-гликан AGP.

Можно было предположить, что мембранотропная активность фракции кислых белков сыворотки крови связана с присутствием в ней AGP, поскольку давно была показана принципиальная роль остатков маннозы и галактозы в адгезии гепатоцитов млекопитающих [Weigel Р.Н. et al, 1978; Weigel Р.Н. et al, 1979; Weigel, 1980] и который, в принципе, может взаимодействовать с ConA-сефарозой. Однако проведённые исследованияа показалиа отсутствиеа мембранотропнойа активностиа AGP,а неа проявляла

активности и его олигосахаридная цепь (рис. 8).

Рис.8. Мембранотропная активность (а)

оросомукоида (AGP) и (б) ?-гликана,

выделенного из оросомукоида. По

абциссе - х - показатель степени

последовательногоа 10-тикратного

разведения исходного препарата; по

ординате - Ma, % - величина параметра,

отражающегоаа мембранотропную

активность. Исходная концентрация оросомукоида- 1,0 мг белка/мл; N-гликана - 3,0 мг/мл.

13 ИЭФ-фракция сыворотки крови, собранная в интервале рН 4,5-5,1, не проявляла мембранотропной активности; она появлялась в супернатанте данной фракции только после высаливания (табл. 5).

Таблица 5. Исследование мембранотропног		[ активности ИЭФ-	фракций, выделенных из
сыворотки крови К	PC.
		Концентрация	Степень разведения
		белка в	фракции, при которой
Название фракции	Условия получения фракции	исходном препарате, мг/мл	обнаружена мембранотропная активность (Ma)
ИЭФ-фракция	До высаливания	1,0	IO7 - IO8; 10??
сыворотки
крови КРС	После высаливания	0,5	IO7 - IO12; IO17
(рН<3,0)
Супернатант
сыворотки		0,4	IO5; IO7; IO9 - IO13; IO20
крови (БРС1)
ИЭФ-фракция	До высаливания	1Д	He обнаружена
сыворотки
крови КРС	После высаливания	0,5	IO2 - IO6
(рН 4,5-5,1)
Супернатант сыворотки		0,5	IO4 -IO5; IO9; IO12 - IO17
крови (БРС2)

В то же время, высаливание белков сернокислым аммонием не оказывало влияния на проявление активности ИЭФ-фракции сыворотки крови КРС (рН<3,0). Здесь следует отметить, что метод оценки мембранотропной активности является скорее качественным, чем количественным. Из-за полимодального характера дозовой зависимости мембранотропной активности биорегуляторов данной группы не представляется возможным введения единицы активности МГТБ. В данном случае метод биотестирования позволяет сделать заключение о присутствии биорегуляторов изучаемой группы в той или иной фракции. Тем не менее, очевидно, изменение степени разведения фракции, при которой обнаруживается её мембранотропное действие, позволяет сделать вывод об увеличении или об уменьшении биологической активности в процессе очистки. Для выяснения влияния условий образования комплекса гликопептида с белком-модулятором его мембранотропную активность, было проведено отдельное исследование.

Его результаты приведены в табл. 6, которые показывают, что важнейшими условиями

образования неактивной формы сывороточного биорегулятора являются определённое

соотношение пептида и модулятора, а именно последний должен быть в значительном

избыткеа поа сравнениюаа са пептидом,аа а такжеа присутствиеа ионова кальция;аа значение

температуры не оказывало влияние на образование комплекса. На основании полученных

данных можно предположить, что две исследуемые фракции сывороточного

биорегулятора различаются по составу: ИЭФ-фракция сыворотки крови КРС (рН<3,0)

содержит, в основном, гликопептиды, а ИЭФ-фракция сыворотки крови, собранная в

интервалеаа рНаа 4,5-5,1 -аа представляетаа собойаа частичноаа неразрушенныйаа комплекс

гликопептида -а белок-модулятор.аа Согласноа данныма биотестирования,аа обеа фракции

проявляютаа сходнуюаа мембранотропнуюаа активность.аа Представлялаа отдельныйаа интерес

изучить их специфическую активность.

Таблиц 6.аа Исследованиеаа условийаа образованияаа комплекс гликопептидаа -аа белок-

моду лятог^^^и^^эшю^______________________________________________________

Условия образования комплекса	Дополнительные условия	Наличие мембранотропной активности*
гликопептид+белок- модулятор (соотношение 1:1)	102Мр-рСаС12,20С, 20 часов	есть
гликопептид+белок- модулятор (соотношение 1:10) 10 2М р-р СаС12	20С, 20 часов	нет
	4С, 20 часов	нет
	20С, 2 часа	есть
	4С, 2 часа	есть
гликопептид+белок- модулятор (соотношение 1:10) без!0"2Мр-рСаС12	20С, 20 часов	есть

- наличие мембранотропной активности указывает на то, что комплекс не образовался.

Изучение специфической активности МГТБ, выделенных из сыворотки крови и

костной ткани млекопитающих

При разработке экспериментальных моделей для изучения специфического действия биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих принималось во внимание следующее. Во-первых, действие МГТБ проявляется только при сохранении целостности организации межклеточного пространства тканей и характеризуется отсутствием видовой,а но наличием тканевой

15 специфичности. Во-вторых, биорегуляторы данной группы оказывали протекторное действие на ткани при культивировании in vitro, особенно при роллерном культивировании. Было показано, что в этих условиях (при устранении адгезивного сигнала со стороны подложки) происходит активация клеточных источников регенерации в ткани, а биорегуляторы дополнительно активируют стволовой отдел тканей. В-третьих, активность биорегуляторов характеризуется проявлением в СМД и наличием полимодальной дозовой зависимости.

В качестве объектов исследования были взяты тритоны Pleurodeleswait! -хвостатые амфибии, т.к. многие ткани этих животных обладают высокой способностью к регенерации в течение всего онтогенеза.

Исследование влияния сывороточного биорегулятора на состояние колеи тритона при роллерном культивировании in vitro

В данном исследовании изучали действие ИЭФ-фракций биорегулятора, выделенного из сыворотки крови КРС. Были поставлены следующие опытные серии:

серия №1 (контрольная) - без добавления в питательную среду биорегулятора;

серия №2 (опытная) - добавляли БРС1, доза -4x10"аа мг;

1 о

серия №3 (опытная) - добавляли БРС2, доза -4x10"аа мг;

На 7-е сутки культивирования в коже контрольной серии можно наблюдать развитие деструктивных процессов: деградация клеток эпидермиса и кориума, в железах содержится немного слизистого секрета (рис 96).

На этом сроке культивирования в культурах всех опытных серий наблюдалась совершенно иная картина состояния ткани: многослойный эпителий в составе активно секретируемой слизи покрывал поверхность фрагмента кожи. На границе эпителия и кориума отмечалось большое количество пигментированных клеток, число которых увеличивается при неблагоприятных условиях в качестве защитной реакции организма. В кориуме были идентифицированы фибробласты ((здесь и далее указано их количество) -фрагмент нативной кожи тритона - 48,5612,74; №1 контрольная серия - 40,119,85; №2 опытная серия - 79,56 19,83; №3 опытная серия - 71,4415,29; р<0,05) (рис. 9вг).

К 14-му дню культивирования протекторное действие всех изучаемых фракций биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, оказалось ещё более выраженным. На рис. 10а представлен гистологический препарат культуры контрольной серии, на котором отмечается значительная деградация ткани кожи тритона. Покровный эпителий и железы деструктированы, наблюдается тотальная гибель клеток в кориуме. На данном сроке в культурах опытных серий наблюдали сохранение желёз, которые продолжали секретировать слизь, на поверхности кожи виден многослойный эпителий, погруженный в

16 большое количество слизи. В кориуме процессы клеточной деградации выражены менее, чем в контроле, между кориумом и поверхностью фрагмента кожи пигментированные клетки образовали плотный слой (рис.Юбв). Обе фракции способствовали поддержанию жизнеспособности фибробластов (фрагмент нативной кожи тритона - 48,5612,74; №1 контрольная серия - 43,4412,86; №2 опытная серия - 82,8919,83; №3 опытная серия -71,8916,74; р<0,05) и кожных желёз. Полученные данные показывают, что фракции сывороточного биорегулятора в СМД проявляют протекторное действие на кожу тритона in vitro.

Рис.9. Влияние ИЭФ - фракций сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона на 7-е сутки роллерного культивирования in vitro, а) гистологический срез интактной кожи тритона; б) №1 контрольная серия; в) №2 опытная серия; г) №3 опытная серия. Увеличение ок. ? 10, об. х20.

Рис. 10. Влияние ИЭФ-фракций сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона на 14-е сутки роллерного культивирования in vitro, а) №1 контрольная серия; б) №2 опытная серия; в) №3 опытная серия. Увеличение ок. ???, об. ?20

17 Исследование влияния МГТБ, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, н состояниеаа регенерат хвост тритон приаа роллерном культивировании in vitro

У взрослых тритонов Pleurodeles waltl обоего пола под наркозом ампутировали хвосты на расстоянии 2,0 см от кончика (весеннее-летний период). Через 40 дней после операции у тритонов в образовавшихся регенератах хвостов (рис. Паб) были обнаружены следующие элементы: хорошо выраженная хрящевая ткань, спинной мозг, мышечные волокна, сосуды, формируются подкожные железы, пигментированные клетки звездчатой формы, расположенные под многослойным эпителием кожи, а также множество недифференцированных мезенхимных клеток. На данном сроке у тритонов хирургически удаляли регенераты хвостов на стадиях IV-V, которые далее культивировали в течение 14 дней при 22С в питательной среде для амфибий, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, используя роллер (Assistant RM5, Германия) со скоростью вращения 35 об/мин. Смену питательной среды производили каждые 72 часа, при этом во флаконы опытных серий в среду культивирования добавляли ИЭФ-фракции биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих в соответствующих концентрациях, а в контроле - в питательную среду ничего не добавляли.

Были поставлены следующие опытные серии:

серия №1 (контрольная) - без добавления в питательную среду биорегуляторов;

1 о

серия №2 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС2, доза -4x10" мг; серия №3 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС1, доза -4x10" мг;

серия №4 (опытная) - в питательную среду добавляли БРК, доза -4x10" мг.

Рис.аа 11.аа Регенератаа хвост тритон н 40-йаа деньаа послеаа ампутации,аа а)аа общийаа вид;аа б) гистологический срез. Увеличение ок. х10, об. х10.

После культивирования состояние регенератов в контроле существенно отличалось от состояния регенератов хвостов, развившихся у тритонов на 40-й день после ампутации (интактный регенерат) (рис. 116; рис. 12а). Можно отметить выраженные процессы деградацииа хрящевойа ткани:аа клеткиа хрящаа апоптирующие,аа недифференцированные,

18 хондроциты отсутствуют. Идёт дифференцировка мышечных волокон. Под эпителием расположено много пигментированных клеток (граница с дермой). В кориуме выявлены малодифференцированные клетки. По сравнению с интактными регенератами, в кориуме культивируемых регенератов (рис. 12в-д) под многослойным эпителием кожи наблюдаются зрелые подкожные железы, наполненные секретом, пигментные клетки образуют плотные скопления, хорошо представлены мышечные волокна. Следует отметить тканеспецифический характер действия биорегулятора, выделенного из костной ткани (рис. 12е), проявляющийся в поддержании целостности хрящевой ткани. Обе фракции сывороточного биорегулятора оказывали влияние на состояние тканей регенерата хвоста в целом, сохраняя гистоструктуру и их жизнеспособность, (рис.12в-д).

Исследование действие разных доз биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

Исследование было проведено на модели роллерного культивирования 40-дневных регенератов хвостов тритонов Pleurodeles waltl in vitro] условия проведения эксперимента были аналогичны условиям предыдущего опыта. Приготавливали следующие опытные серии:

серия №1 (контрольная) - без добавления в питательную среду биорегуляторов;

серия №2 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС1, доза -4x10" мг;

серия №3 (опытная) - в питательную среду добавляли БРС1, доза -4x10" мг;

серия №4 (опытная) - в питательную среду добавляли БРК, доза -4x10" мг;

серия №5 (опытная) - в питательную среду добавляли БРК, доза -4x10" мг.

Исследование гистологических срезов культур регенератов после 14 дней культивирования показало, что биологическое действие биорегуляторов во всех сериях опытов различалось (рис. 12г-ж).

При воздействии сывороточного биорегулятора в СМД (рис. 12г) наблюдали в целом сохранение структуры хряща, однако, в некоторых его областях имела место частичная деградация данной ткани, выражавшаяся в гибели хондроцитов, сегментация хряща плохо выражена. Как в контрольной серии, элементы нервной трубки плохо выражены, пигментные клетки образуют плотные тяжи под эпителием, а эпителиальный пласт кожи отходит, как при линьке, железы в кориуме не сильно выражены, представлены мышечные волокна и скопления малодифференцированных клеток. При воздействии сывороточного биорегулятора в концентрации 4x10" мг (рис. 12д) не наблюдали гибели хондроцитов, структура хряща полностью сохранялась, наблюдали сегментацию хряща характерную для данной стадии, элементы спинного мозга и мышечные волокна хорошо выражены, зрелые железы вырабатывают много секрета, в

19 кориуме много малодифференцированных клеток, пигментные клетки образуют небольшие скопления. Таким образом, биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, в высокой концентрации оказал протекторное действие на регенерат хвоста тритонов, выраженное в сохранении хрящевой, мышечной тканей, а также структуры кожи и подкожных желёз. В СМД протекторный эффект этого биорегулятора на ткани регенерата

хвостов тритонов сохранялся, но был значительно менее выражен, чем в высокой дозе.

Рис. 12. Влияние ИЭФ-фракций биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани, н состояниеаа регенерат хвост тритон на 14-е суткиаа роллерного органного культивирования in vitro: а) интактный регенерат; б) №1 контрольная серия; в) БРС2, доза -4x10" мг; г) БРС1, доза - 4х10"п мг; д) БРС1, доза - 4х10"4 мг; е) БРК, доза - 4x10"14 мг; ж) БРК, доза -4х Ю-8 мг. Ув. ок. х10, об. х20.

20 Биорегулятор, выделенный из костной ткани, в СМД (рис. 12е) проявлял тканеспецифическое протекторное действие: поддерживал жизнеспособность клеток хрящевой ткани, способствовал сохранению её структуры, наблюдали начало сегментации хряща, характерное для данной стадии. Под многослойным эпителием в кориуме видны зрелые железы с секретом, а пигментированные клетки, в отличие от контроля, образуют небольшие скопления, а не протяженные структуры. Хорошо выражены мышечные волокна, присутствуют малодифференцированные клетки.

При действии высокой дозы (рис. 12ж) данного биорегулятора в хрящевой ткани наблюдали развитие процессов деградации: хондроциты практически отсутствовали, на их месте присутствовали скопления клеток с пикнотическими ядрами. В отличие от контроля, хорошо были выражены структура и клетки спинного мозга, а также подкожные железы, наполненные секретом. Пигментные клетки присутствовали в виде скоплений под эпителием. Мышечные волокна хорошо развиты. Таким образом, действие биорегулятора, выделенного из костной ткани, в двух концентрациях различалось: только в СМД он проявлял тканеспецифическое протекторное действие, поддерживая жизнеспособность клеток и структуру хряща. В обеих концентрациях этот биорегулятор оказывал сходный протекторный эффект на другие ткани регенерата, отличный от контроля. Таким образом, в настоящем исследовании было показано, что действие биорегуляторов в СМД и в высоких дозах принципиально различается.

Исследование ранозаживляющего действия сывороточного биорегулятора

Исследование проводили на модели кожной раны у мышей in vivo. Животные, которым под наркозом стандартно были нанесены раны в область спины, разделяли на 4-е группы: 1-я группа (контрольная) - рану после нанесения ничем не обрабатывали; 2-я группа (контрольная) - рану после нанесения обрабатывали физ. раствором; 3-я группа (опытная) - рану обрабатывали раствором БРС1, доза - 10" мг; 4-я группа (опытная) -рану обрабатывали раствором БРС2, доза - 10"аа мг.

Раны животных в группах 2-4 обрабатывали растворами ежедневно. Состояние раны оценивали визуально и гистологически на 11-е сутки после травмы.

В 1-ой группе животных (необработанная рана) наблюдали практически полную реэпителизацию, незначительное воспаление (рис. 136). В дерме много мелких капилляров, волокна коллагена расположены плотными тяжами параллельно эпидермису, т.е. наблюдали формирование фиброзного рубца. В подкожной ткани присутствовали жировые клетки, которые имели неправильную форму и разделялись участками соединительной ткани. Наблюдали небольшое количество восстанавливающихся

21 протоков желез. В подкожной ткани также происходило формирование рубца, волокна коллагена более рыхлые, чем в дерме, но почти отсутствовали жировые клетки.

У мышей 2-ой группы, в центральной части раны наблюдали образование очага хронического воспаления и формирование соединительнотканного рубца в дерме, отмечали отсутствие полной реэпитализации (рис. 13в)

В 3-ей и 4-ой группах наблюдали совершенно иную картину репарации кожи: сильное стягивание краев раны и практически полную ее реэпителизацию, более выраженную, чем у животных обеих контрольных групп (восстанавливались все слои многослойного эпителия). Отмечали отсутствие очагов воспаления. Структура дермы почти восстановлена. В дерме (особенно под раной) и в подкожной ткани отмечено восстановление многочисленных протоков желез и волосяных фолликулов. Жировая ткань сильно развита. В отдельных участках под раной отмечено частичное восстановление мышечных элементов (рис. 13ж-к). Здесь следует отметить, что действие двух фракций сывороточного биорегулятора различаются: в отличие от БРС2 БРС1 стимулировала образование сальных желёз и волосяных фолликулов в области раны (рис. 13жз). Отмечаются также эпителиальные структуры волосяных фолликулов, которые мигрируют к эпидермису и встраиваться в него. При этом эпителиальные клетки пролиферируют, мигрируют, наползают друг на друга, в результате чего поверхность эпидермиса становится бугристой. Создаётся впечатление, что при действии БРС2 репаративные процессы протекают более упоряд оченно: отмечается образование многослойного эпителия на поверхности раны, очевидно, за счет влияния этой фракции на клетки базального слоя, которые мигрируют, пролиферируют и затягивают поверхность раны. В этой серии наблюдается восстановление потовых желёз и формирование волосяных фолликулов, но можно отметить отсутствие образования большого количества сальных желёз. Эти различия в действии двух фракций сывороточного биорегулятора предполагают, что мишенью для них являются разные ниши стволовых клеток кожи. Полученные данные указывают на исключительно высокую эффективность биорегулятора сыворотки крови в заживлении кожных ран у млекопитающих in vivo. Данный биорегулятор не только стимулировал регенерацию в кожной ране, но и способствовал формированию в области раны морфологически полностью восстановленной ткани.

Рис. 13 Модель экспериментальной кожной раны у мышей in vivo: а), б) - интактная кожа мыши; в), г) - 1-я группа - рану ничем не обрабатывали; д), е) - 2-я группа-рану обрабатывали физ. раствором; ж), з) - 3-я группа-рану обрабатывали БРС1, доза - 10"10 мг; и), к) - 4-я группа-рану обрабатывали БРС2 доза - 10"12 мг. Ув. ок. *10, об. х20; ок. *10, об. х40.

23 Выводы

Из костной ткани млекопитающих впервые был выделен и очищен биорегулятор, в составе которого были обнаружены пептид с мол. массой 43012 Да и белок с мол. массой 66000-67000 Да.
С помощью КД-спектроскопии показано, что вторичные структуры белковых компонент биорегуляторов, выделенных из костной ткани и сыворотки крови, в растворе сходны и характеризуются преимущественным содержанием ?-структур (57 - 61,6%) и участков статистического клубка (32 - 33%). По данным лазерного динамического светорассеяния, изучаемые МГТБ, присутствуют в растворах в виде наноразмерных частиц (55,8 - 87,7 нм).
Показано, что белковая компонента сывороточного биорегулятора, ответственная за проявление им биологической активности, содержит гликопептиды и ранее не изученный белок, гомологичный преальбумину быка, взаимодействие с которым приводит к образованию неактивного комплекса по механизму углевод-белкового узнавания.
Впервые разработана новая экспериментальная модель роллерного культивирования кожи тритона in vitro, при использовании которой было изучено биологическое действие двух фракций сывороточного биорегулятора, различающихся по составу. Обе фракции сывороточного биорегулятора способствовали сохранению структуры ткани, а также увеличению жизнеспособности соединительнотканных элементов кожи.
На экспериментальной модели кожной раны у мыши in vivo показано, что обе фракции сывороточного биорегулятора стимулировали репаративные процессы в ране, способствовали восстановлению структуры ткани.
Впервые разработана новая экспериментальная модель роллерного культивирования регенератов хвостов амфибий in vitro, при использовании которой была изучена специфичность биологического действия двух фракций сывороточного биорегулятора, а также фракции биорегулятора, выделенного из кости крыс.
Н даннойаа экспериментальной аамодели былоаа показано, что обеаа фракции

11 1 ^

сывороточного биорегулятора в СМД (соответствующей 10" - 10" мг белка) способствовали сохранению структуры всех тканей регенерата, а фракция биорегулятора, выделенного из костной ткани, в СМД (соответствующей 10" мг белка) оказывала протекторное действие на хрящевую ткань, т.е. проявляла тканеспецифическую активность.

8.аа Показано, что действие исследуемых биорегуляторов в более высоких дозах (10"а -

10" мг белка) принципиально различаются, а именно: сывороточный биорегулятор, оказывал морфогенетическое действие на состояние всех тканей регенерата хвоста тритона; биорегулятор, выделенный из костной ткани, проявлял протекторное свойство в отношении тканей регенерата, но не оказывал влияния на хрящевую ткань.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Ямское И.А., Ямскова В.П., Даниленко А.Н., Клеменкова З.С., Антипов Б.Г., Черников Ф.Р., Гусынина М.М., Рыбакова Е.Ю. Экспериментальные доказательства роли физико-химических факторов в механизме биологического действия сверхмалых доз. //Российский химический журнал (ЖРХО им. Д.И. Менделеева), 1999. т.43, №5, с.34-39.
Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Ямскова В.П., Ямское И.А. Белок-инактиватор сывороточного адгезивного гликопротеина.// Онтогенез. 2000. т.31, №4, с.278-279.
Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П., Ямское И.А. Новый адгезивный гликопротеин и его инактиватор, выделенные из сыворотки крови млекопитающих.// Тезисы докладов XIII зимней международной молодежной научной школы л Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва, 7-9 февраля 2001 г., с. 12.
Ямское И.А., Виноградов А.А., Даниленко А.Н., Маслова Л.А., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства.// Прикладная биохимия и микробиология. 2001. т.37, №1,с. 36-42.
Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Вечёркин В.В., Ямское И.А. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. 2004. т.40, №4, с.407-413.
Е.Ю. Рыбакова. О возможном механизме, лежащем в основе метода биотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах // Онтогенез. 2005 т.36. № 3. с.234. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. 8 декабря 2004 г. Москва.
М.С. Краснов, А.В. Качалина, А.В. Беляева, Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин, В.П. Ямскова Изучение влияния фармакологического препарата Адгелон, основанного на сывороточном регуляторном белке, на заживление кожных ран у мышей in vivo. Il Онтогенез. 2005. т. 36. № 5. С. 378 - 379. Тезисы докладов XIV школы Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии.
Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин. Исследование адгезивных белков сыворотки крови млекопитающих, биологически активных в сверхмалых дозах // Онтогенез. 2005. т. 36. № 5. с. 392. Тезисы докладов XIV школы Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии.
В.В Вечёркин, Е.Ю. Рыбакова Изучение физико-химических свойств сывороточных регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах // V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа Химия и медицина. 5-8 сентября 2005 г. Уфа. Тезисы (сборник тезисов Новые лекарственные средства. Успехи и перспективы с. 112-113).
Е.Ю. Рыбакова Изучение регуляторного белка, выделенного из костной ткани млекопитающих // V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа Химия и медицина. 5-8 сентября 2005 г. Уфа. Тезисы (сборник тезисов Новые лекарственные средства. Успехи и перспективы с. 119-120).

Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин, В.П. Ямскова, И.А. Ямское Регуляторные белки сыворотки крови млекопитающих, биологически активные в сверхмалых дозах. // V Ежегодная международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы Биохимическая физика. 14-16 декабря 2005 г. Москва. Тезисы (сборник тезисов Труды V Ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы Биохимическая физика с. 88).
Е.Ю. Рыбакова, В.В Вечёркин Регуляторные белки, идентифицированные в сыворотке крови крупного рогатого скота: изучение молекулярной структуры, биологической активности // Онтогенез. 2006 т.37. № 4. с.317. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва. 21 декабря 2005 г.

В.П. Ямскова, Е.Ю. Рыбакова, В.В. Вечёркин, В.Е. Пискарёв, И.А. Ямское Исследование мембранотропной активности сверхнизких концентраций маннозсодержащих олигосахаридов // Материалы IV Международного Конгресса Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006 г. с.82.
V.P. Yamskova, E.Yu. Rybakova, V.V. Vecherkin, В.В. Berezin, A.G. Filatova, I.V. BlagodatskikhandLA. Yamskov "Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 1. Isolation, purification and physicochemical properties.", pp. 61-70 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research", Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. 2007.
V.P. Yamskova, M.S. Krasnov, E.Yu. Rybakova, V.V. Vecherkin, A.V. Borisenko, L.A. Yamskov "Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 2. Tissue localization and role in wound healing", pp. 71-78 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research", Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. 2007.
Рыбакова Е.Ю. Исследование влияния ряда регуляторных белков на репаративные процессы в коже и кости позвоночных in vitro и in vivo. IIОнтогенез, 2007, т. 38, №4, с. 317-318. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. 29 ноября 2006 г. Москва
Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Борисенко А.В., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Роль факторов адгезии в регуляции поведения клеток при органотипическом культивировании in vitro. // Тезисы симпозиума с международным участием Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза, Москва, 9-11 октября 2007., с. 95-97.
Е.Ю. Рыбакова, М.С. Краснов, В.П. Ямскова, И.А. Ямское. Биологически активный в сверхмалых дозах регуляторный белок, выделенный из костной ткани млекопитающих, и его влияние на хрящевую ткань in vitro. Il VII Ежегодная международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы Биохимическая физика. Москва, 12.11. - 14.11.2007. Тезисы (сборник тезисов Труды VII Ежегодной международной молодёжной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы Биохимическая физика, с. 242-246).
Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С, Ямскова В.П., Ямское И.А. Действие разных доз биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, на состояние регенератов хвостов тритонов Pleurodeles waltl in vitro.IIТезисы IV Международного симпозиума Механизмы действия сверхмалых доз. Москва. 2008. С. 95-96.

20. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С, Ямскова В.П., Ямское И.А. Изучение влияния

регуляторного белка, выделенного из сыворотки крови быка, на состояние регенератов

хвостов тритонов PI. waltl при роллерном культивировании in vitro. IIТезисы XV Школы

Актуальные проблемы биологии развития. Звенигород. 2008. С. 86-88.

Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Изучение влияния регуляторного белка, выделенного из кости крысы, на состояние регенератов хвостов тритонов PI. waltl при роллерном культивировании in vitro. IIТезисы XV Школы Актуальные проблемы биологии развития. Звенигород. 2008. С. 88-90.
Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Исследование действия разных доз биорегуляторов на состояние регенератов хвостов тритонов Pleurodeles waltl при роллерном культивировании in vitro IIТезисы V Международного конгресса Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, Санкт-Петербург, 29 июня - 3 июля, 2009, с. 118.

23.аа И.А. Ямское, И.В. Благодатских, М.С. Краснов, А.В. Борисенко, Д.В. Маргасюк, В.В.

Вечёркин, B.C. Скрипникоеа, П.А. Назарова, С.А. Битко, Б.Б. Березин, ИВ. Яминский, Г.Б.

Мешков, С.А. Грачев, М.В. Серебрякова, Е.Ю. Рыбакова, В.П. Ямскова Физико-химические

свойства биологически активных в микродозах регуляторных белков, выделенных из

различных тканей млекопитающих // Изв.АН Сер. Хим. 2009. № 3. С. 623-628.

Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С, Ямскова В.П., Маргасюк Д.В., Битко С.А., Ямское И.А. Новый биорегулятор, выделенный из костной ткани крыс: физико-химические свойства, влияние на хрящевую ткань in vitro IIДоклады Академии наук. 2009. т. 427. №1. С. 136-138.
Ильина А.П., Куликова О.Г., Мальцев Д.И., Краснов М.С, Рыбаков Е.Ю., Скрипникоеа B.C., Кузнецова E.C., Буряк А.К, Ямскова В.П., Ямское И.А. Идентификация новых пептидов из межклеточного пространства методом MALDI-TOF масс-спектрометрии //Прикладная биохимия и микробиология, 2011, Т. 47, №2, С. 135-140.

Авторефераты по темам

часть 1

часть 2

Blog

Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих