На правах рукописи

Пономаренко Наталья Александровна КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА - ПРОТЕАЗЫ Специальность 03.00.03 - "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев Сергей Михайлович Доктор биологических наук, профессор Георгиева София Георгиевна

Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 200_ года, в на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан _ 2008 года.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук В.А. Олейников 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы. В последние два десятилетия представление о биокатализе существенно расширилось в связи с обнаружением каталитической активности молекул РНК и антител, альтернативных эволюционно совершенным ферментам. Каталитические антитела (абзимы) представляют интерес как с точки зрения механизма их возникновения и роли в функционировании иммунной системы организма, так и как потенциальные терапевтические агенты. К настоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих более 30 химических реакций, для многих из которых не описано природных ферментов.

Существует несколько различных подходов для поиска каталитических антител. Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и, в основном, ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.

Ковалентный катализ является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов. Способность ферментов образовывать ковалентные комплексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное участие в ковалентном катализе. Для получения абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными свойствами, механизм-зависимые ингибиторы сериновых гидролаз на основе фосфонатов могут быть использованы в двух направлениях: реакционная иммунизация и реакционная селекция. Использование метода фагового дисплея, в свою очередь, открывает широчайшие возможности по дизайну новых биокатализаторов и улучшению их каталитических свойств.

Другим возможным способом создания протеолитических антител является получение антиидиотипических антител к протеазам, т.е. антител, направленных к области связывания антигена у антител, узнающих, в свою очередь, участок активного центра протеаз. Эффективность этого метода была ранее продемонстрирована на примерах получения каталитически активных анти идиотипических антител к ацетилхолинэстеразе и -лактамазе.

Необходимо отметить, что к настоящему моменту накоплено достаточно данных о спонтанном образовании каталитических антител в организме человека и животных при аутоиммунных патологиях. Одним из таких заболеваний является рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к разрушению миелиновой оболочки нервных волокон. Традиционно ведущая роль в патогенезе рассеянного склероза отводилась аутореактивным CD4+ Th1 клеткам, специфичным к компонентам миелиновой оболочки, в первую очередь - основному белку миелина (ОБМ). Однако в последнее время значительное внимание было уделено роли гуморального ответа в патогенезе РС, и сейчас непосредственное участие аутоантител к ОБМ и миелин олигодендроцит гликопротеину (МОГ) в демиелинизации не вызывает сомнений и подтверждено экспериментально. Таким образом, вместе со связывающей компонентой иммунноглобулинового ответа, особый фундаментальный и практический научный интерес представляет изучение роли каталитических аутоантител к ОБМ в развитии РС. Структурно-функциональные исследования патогенных аутоантител могут оказаться весьма перспективными как с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностики, так и для решения фундаментальных вопросов иммунологии.

Очевидной областью потенциального медицинского применения абзимов является избирательное расщепление биополимеров и, в частности, белков. Высокая вероятность спонтанного образования абзимов в ходе развития аутоиммунного процесса, а также возможность индукции каталитического ответа на различные антигены у модельных животных с аутоиммунными патологиями дают основания для определенного оптимизма в области дизайна новых биокатализаторов - протеаз на основе антител.

Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания лэволюционно совершенного биокатализатора. А конструирование на их основе каталитических вакцин, способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению лекарств будущего.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью данной работы было получение протеолитических антител определенной специфичности и их струк турно-функциональный анализ. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Поиск протеолитических антител при различных аутоиммунных патологиях человека и модельных животных и характеристика их ферментативных свойств.

2. Индукция протеолитических антител, расщепляющих поверхностный антиген вируса ВИЧ-1 gp120, с использованием двух различных подходов: реакционной иммунизации и иммунизации на фоне аутоиммунного процесса.

3. Получение антиидиотипических антител с протеолитической активностью к участку активного центра эндопротеиназы - субтилизина Карлсберг.

4. Селекция из полусинтетической фаг-дисплейной библиотеки абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными свойствами, с использованием механизм-зависимых ингибиторов сериновых гидролаз на основе фосфонатов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены данные о наличии природных антител с различной каталитической активностью у мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями, что делает эти линии перспективной моделью для направленного получения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.

В ходе исследований впервые продемонстрирована антигенспецифическая каталитическая активность аутоантител к ОБМ у больных РС и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности аутоантител, изолированных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных животных.

Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-103. Обнаруженная связывающая и сайтспецифическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволяет вплотную подойти к разработке новых дифференциальных методов диагностики и эффективного лечения данной патологии.

Исследования антиидиотипического антитела 6B8E12 к субтилизину Карлсберг показали, что данное антитело способно расщеплять эфирную, а также пептидную связь, как в составе п-нитроанилидных производных пептидов, так и белков. Эксперименты по определению специфичности протеолити ческого антитела показали общее сходство со специфичностью исходного фермента. Экспрессия рекомбинантного антиидиотипического антитела в виде одноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности явилась наиболее убедительным доказательством лабзиматической природы обнаруженной активности.

Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммунизации пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos) поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту реакционного гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.

Кроме того, было продемонстрировано, что иммунизация мышей линии SJL гибридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ-1 gp120 и фрагмента ОБМ, приводит к появлению протеолитических антител, избирательно расщепляющих антиген. Было показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gp120, и установлен преимущественный сайт гидролиза gp120 Pro493-Leu494, находящийся в константной области белка.

При селекции полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната получены рекомбинантные одноцепочечные антитела, ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в ковалентном катализе. Показано, что отобранные рекомбинантные антитела способны гидролизовать амидную связь.

Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию путей получения искусственных биокатализаторов. Разработанные подходы могут быть использованы для индукции протеолитических антител, расщепляющих различные белковые субстраты. Оригинальные методы анализа ферментативной активности протеолитических антител могут быть использованы для изучения различных биокатализатиров.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано статьи и патент. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: Third Al-Ain International Immunology Meeting: Immunoregulation in Chronic Inflammatory Disorders, (2008, Al-Ain, United Arab Emirates); XX зимняя международная молодежная научная школа Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, (2008 г., Москва); Biology of B-Cells in Health and Disease, (2007, Banff, Alberta);

Международная конференция Biocatalysis 2007: Fundamentals & Applications, (2007, Moscow - St. Petersburg, Russian Federation); VI симпозиум Химия протеолитических ферментов (Москва, 2007); 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress (2006, Kyoto, Japan); научная конференция VIII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова, (2006, Москва); 1st Mediterranean workshop on Clinical Immunology, (2006, Evora, Portugal); Международная конференция Biocatalysis 2005: Fundamentals & Applications (2005, St. Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation); 6-ая международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (СанктПетербург - Москва, 2003 г.).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (369 наименований). Диссертация изложена на 279 страницах и содержит 69 рисунков и 13 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

1. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ РЕАКЦИОННОЙ СЕЛЕКЦИИ 1.1. Реакционная селекция антител из синтетической библиотеки генов иммуноглобулинов человека.

Механизм-зависимая селекция комбинаторных библиотек является эффективным инструментом для получения новых биокатализаторов. Использование необратимых ингибиторов позволяет проводить селекцию по способности активных биокатализаторов образовывать с ними ковалентные комплексы. На сегодняшний день примеры химической селекции в применении к фаговому дисплею антител были в основном сфокусированы на нековалентном связывании с аналогами переходного состояния реакции или на ковалентной реакционной способности суицидальных субстратов.

В работе была использована полусинтетическая библиотека сегментов вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека Griffin.1 (MRC, Center for proteing engineering, UK). Библиотека была построена на основе зародышевых линий 49 сегментов вариабельных регионов тяжелых цепей, а также 26 и 21 сегмента вариабельных регионов и легких цепей, соответственно.

Третий гипервариабельный участок как тяжелых, так и легких цепей был рандомизирован методом ПЦР (Griffiths, Williams et al. 1994). Гены вырожденных одноцепочечных антител (ScFv) были проклонированы в фагемидный вектор pHEN2. Представительность библиотеки составила 1,2х10. Схематически библиотека Griffin.1 представлена на рисунке 1.

Для проведения химической селекции и скрининга были использованы пРис. 1. А - создание синтетического репертуара тяжелых и легких цепей (Griffiths, Williams et al. 1994). Б - карта библиотеки, построенной на основе вектора pHEN2 и синтетического репертуара сегментов генов иммуноглобулинов человека.

нитрофенил 8метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат (Х) и его биотинилированный аналог (Bt-X) (рис. 2).

Рис. 2. Структура п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната (А) и его биотинилированного аналога (Б).

Данный фосфонат был разработан как ингибитор сериновых гидролаз (Tramontano, Ivanov et al. 2000), и ранее был использован для детекции протеолитической активности у природных антител при различных аутоиммунных на рушениях (Paul, Tramontano et al. 2001). В отличие от фторпроизводных фосфонатов, данное соединение устойчиво в водных растворах и не проявляет неспецифической активности по отношению к инертным белкам.