Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
На правах рукописи
Навроцкий Максим Борисович
6-Бензилпиримидин-4(3Н)-оны: химический синтез и анти-ВИЧ активность
02.00.03 - Органическая химия 02.00.16 - Медицинская химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный технический университет Научный консультант доктор химических наук, профессор, академик РАН, И.А. Новаков
Официальные оппоненты:
Бачурин Сергей Олегович, доктор химических наук, профессор, членкорреспондент РАН, Учреждение Российской академии наук, Институт физиологически активных веществ РАН (ИФАВ РАН), директор Злотин Сергей Григорьевич, доктор химических наук, профессор, Учреждение Российской академии наук, Институт органической химии имени Н.Д.
Зелинского, заместитель директора Теренин Владимир Ильич, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", Химический факультет, кафедра Органической химии, лаборатория Органических реагентов, заведующий лабораторией Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения РАН (ИОС УрО РАН)
Защита состоится л26 сентября 2012 г. в 1100 часов на заседании Диссертационного Д 501.001.69 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет МГУ, ауд.
446.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан л____ ____________ 2012 года.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 501.001.69, доктор химических наук, профессор Магдесиева Татьяна Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. С момента идентификации вируса иммунодефицита человека, как основного этиологического фактора развития синдрома приобретенного иммунодефицита, значительные усилия были направлены на создание эффективных средств, способных ингибировать репликацию этого вируса. На сегодняшний день существует несколько классов анти-ВИЧ агентов: ингибиторы ревертазы, протеазы и интегразы ВИЧ, а также - вещества блокирующие адгезию вируса на клетке. Клинический опыт этиотропной терапии ВИЧ-инфекции показал, что применение препарата какого-либо одного из перечисленных классов не является достаточным для эффективного лечения СПИДа. В то же время, сочетание препаратов различных групп в составе, так называемой высокоактивной антиретровирусной терапии, позволяет добиться более значимых результатов.
Вместе с тем, вне зависимости от конкретного состава соответствующих лекарственных коктейлей, их важной составной частью являются ингибиторы обратной транскриптазы (ревертазы) ВИЧ - фермента, ответственного за процесс обратной транскрипции - считывания наследственной информации вируса с ДНК на РНК. В настоящее время известны различные классы химических соединений, способных угнетать активность вирусной обратной транскриптазы. Все они подразделяются на три основных группы: нуклеозидные (НИОТ), нуклеотидные (НкИОТ) и ненуклеозидные ингибиторы (ННИОТ). Особенностью действия первых двух является их конкуренция с естественным субстратом за участок связывания фермента. Ненуклеозидные ингибиторы действуют по иному механизму, связываясь с аллостерическим участком ревертазы. Эти различия в механизме действия, объясняют более низкую токсичность ненуклеозидных препаратов в отношении клеточных структур. Низкие селективные индексы нуклеозидных Настоящая работа выполнена при материально-техническом содействии ООО НПП Новые Технологии (г.
Волгоград), а также - при частичной финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук МК-1351.2011.3 и ФЦП Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы (Государственный контракт №16.512.11.2194).
ингибиторов ревертазы и их выраженная токсичность способствуют незначительному увеличению продолжительности жизни больного СПИДом, существенно снижая её качество. В известном смысле, исключением из этого правила, на сегодняшний день, является отечественный препарат Фосфазид (Никавир) - фосфорилированый аналог азидотимидина, обладающий более выгодным фармакокинетическим профилем.2 В целом же, такие побочные эффекты нуклеозидных ингибиторов ревертазы как угнетение активности ДНК-полимераз человека, панкреатит, митохондриальная миопатия, нейтропения и угнетение кроветворной функции костного мозга, подвергают сомнению необходимость лечения такими препаратами, в принципе. В то же время, хорошо известен тот факт, что к нуклеозидным ингибиторам очень быстро развиваются резистентные штаммы ВИЧ. На основании изложенного становится очевидным тезис об архаичности данного класса препаратов и необходимости поиска новых, более активных, и отличных по механизму действия лекарственных средств, способных угнетать репликацию ВИЧ.
Кроме этого, в структуре нуклеозидных ингибиторов ревертазы содержится значительное количество хиральных центров, конфигурация которых является решающей для их противовирусного действия. В этой связи, нуклеозидные ингибиторы ревертазы, как правило, труднодоступны в плане химического синтеза.
Как известно, в настоящее время в клинике уже начали применяться ненуклеозидные анти-ВИЧ-агенты, такие как вирамун, ифавиренц, делавердин и некоторые другие. Следует отметить, что наряду с чисто синтетическими производными, разрабатываются для практического использования ННИОТ природного происхождения, например - отечественный препарат Бетулавир.3 Ненуклеозидные ингибиторы ревертазы практически лишены всех перечисленных недостатков, присущих нуклеозидным препаратам. Они Галегов Г.А. Никавир (фосфазид) - антиретровирусный агент: анти-ВИЧ активность, токсикология, фармакокинетика и некоторые перспективы клинического использования / Антибиотики и химиотерапия - 2004. - Т. 49, N. 7 - C. 5-8.
Стоник В.А., Толстиков Г.А. Природные соединения и создание отечественных лекарственных препаратов / Вестник РАН. - 2008. - Т. 78, N. 8 - C. 675-687.
обладают выгодным фармакокинетическим профилем действия, однако, к большинству из них достаточно быстро появляются устойчивые штаммы вируса. Этот недостаток присущ практически всем ненуклеозидным ингибиторам ревертазы первого поколения. Также, следует отметить, что в отличие от нуклеозидных препаратов, большинство ненуклеозидных аналогов неактивны в отношении ВИЧ-2. Так или иначе, этот класс анти-ВИЧ агентов остается весьма привлекательным объектом дальнейшей разработки и некоторые новые препараты этого класса, такие как этравирин и каправирин находятся на этапе клинических испытаний. Тем не менее, эти препараты уступают по эффективности ряду производных 6-бензил-4(3Н)-пиримидинона, уже синтезированных и изученных, но ещё не внедренных в клиническую практику. Таким образом, весьма актуально стоит задача разработки новых анти-ВИЧ агентов пиримидиновго ряда, обладающих более выраженной противовирусной активностью, по сравнению с известными представителями.
Эти соединения, занимающие видное место среди прочих классов ненуклеозидных ингибиторов ревертазы, представлены такими дериватами пиримидин-4(3Н)-она, как функционализированные пиримидин-2,4(1Н,3Н)дионы (урацилы), 2-тиоксо-2,3-дигидропиримидин-4(1Н)-оны (2-тиоурацилы) и 2-аминопиримидин-4(3Н)-оны (изоцитозины). Нами было показано,4 что элементами структуры их молекул, эссенциальными для проявления противовирусного действия являются наличие бензильного (или биоизостерического ему) заместителя в положении 6 пирмидинового цикла и алкильного или гетероалкильного фрагмента при атоме N1, S, O2 (для урацилов и 2-тиоурацилов) или N2 (для изоцитозинов). В качестве важной опции может рассматриваться наличие низшего алкильного фрагмента (нормального или изостроения) при атоме С5 пиримидинового цикла. Модераторами 5-Alkyl-6-benzyl-2-(2-oxo-2-phenylethylsulfanyl)pyrimidin-4(3H)-ones, a series of anti-HIV-1 agents of the dihydro-alkoxy-benzyl-oxopyrimidine family with peculiar structure-activity relationship profile / M. B. Nawrozkij [et. al.] // Journal of Medicinal Chemistry. - 2008. - Vol. 51. - P. 4641-4652.
противовирусной активности являются также заместители в бензильном радикале.
Впервые, активность такого рода производных в отношение ВИЧ-1 была показана в 1989 году на примере 1-[(2-гидроксиэтокси)метил]-5-метил-6(фенилсульфанил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона (6-(фенилсульфанил)ациклотимидина), полученного японскими исследователями M. Baba, H. Tanaka, T.
Miyasaka и изученного при участии группы бельгийских ученых E. DeClerq и J. Balsarini.5 Таким образом, открытие анти-ВИЧ-1 активность у этого класса веществ, стало случайностью. Исходной посылкой для их исследования послужила легкость замещения фенилсульфанильной группы по механизму присоединения-отщепления и стремления изучить влияние этой химической особенности in vivo. Дальнейшие исследования показали, что весомым фактором в проявлении противовирусной активности, в данном случае, является пространственное строение заместителя в положении пиримидинового цикла. Различными группами исследователей был синтезирован целый ряд аналогов обозначенного выше прототипа. Первым из производных пиримидин-4(3Н)-она до клинических испытаний дошел эмивирин - 6-бензил-5-изопропил-1-(этоксиметил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)дион (6-бензил-5-изопропил-1-(этоксиметил)урацил), однако, исследования проводившиеся фирмой Triangle Pharmaceuticals, были прерваны. Причиной тому послужила крайне низкая эффективность препарата в случае инфекций, вызванных мутантными штаммами ВИЧ-1.
В то же время, значительно более интересным оказался класс производных 2-алкокси-6-бензилпиримидин-4(3Н)-она (3,4-дигидро-2алкокси-6-бензил-4-оксопиримидина, ДАБО), открытый в 1993 году итальянскими исследователями M. Artico, S. Massa и A. Mai. A novel lead for specific anti-HIV-1 agents : 1-[(2-hydroxyethoxy)methyl]-6-(phenylthio)thymine / T. Miyasaka [et.
al.] // J. Med. Chem. - 1989. - Vol. 32, N. 12. - P. 2507-2509.
3,4-Dihydro-2-alkoxy-6-benzyl-4-oxopyrimidines (DABOs): a new>
На сегодняшний день, работами ряда групп исследователей из Италии (A. Mai, M. Artico, M. Botta, S. Massa, G. Maga), Испании (J.A. Este, M.
Armand-Ugon, I. Clotet-Codina), Дании (E.B. Pedersen, C. Nielsen, K. Danel), Китая (F. Chen, Y.-P. He), Бельгии (E. DeClerq, J. Balsarini), ОАЭ (N. ElBrollosy, D. Imam), США (E. Sudbeck, F. Uckun, R. Vig, R. Buckheit) и России (И.А. Новаков, М.С. Новиков, М.Б. Навроцкий, Б.С. Орлинсон) была показана высокая активность значительного количества производных ряда ДАБО. При этом были получены вещества, одинаково активные в отношении дикого и мутантных штаммов ВИЧ-1. Следует отметить, что некоторые из полученных соединений также проявили активность в отношении ВИЧ-2, наряду со способностью угнетать ревертазы клеточного происхождения. Последнее явление особенно важно, так как открывает путь к направленному конструированию нового поколения средств лечения и профилактики злокачественных заболеваний на основе полученных соединений.
Цель исследования и задачи исследования.7 Цель работы - Создание системы направленного конструирования высокоактивных анти-ВИЧ агентов с выгодным профилем резистентности на основе новых производных 6бензилпиримидин-4(3Н)-она и разработка эффективных подходов к их получению.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Дизайн структур новых потенциальных анти-ВИЧ агентов - производных ряда ДАБО.
2. Разработка оригинальных и эффективных подходов к синтезу заявленных структур.
3. Биологические исследования полученных соединений в остром эксперименте с использованием клеточных и энзиматических моделей.
Автор выражает глубокую признательность академику РАН, профессору Зефирову Н.С. за активное участие в обсуждении результатов диссертационного исследования.
4. Установление закономерностей химическая структура - анти-ВИЧ активность в ряду изученных производных и выявление лидеров для дальнейших исследований.
Научная новизна На основе знания структурных параметров биологической мишени, анализа и модификации структур известных ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 создан комплекс подходов к направленному конструированию производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)-она, использующих принципы биоизостерической замены и трехмерного фармакофорного подобия для оптимизации структуры соединений-лидеров.
Предложенные пути рационального создания новых производных 6бензилпиримидин-4(3Н)-она, основанные на изменении баланса между липофильными (асимметричное замещение экзоциклического гетероатома при С2 пиримидинового гетероцикла) и электростатическими (введение атома азота при и пептидная группа N3HC4O пиримидинонового цикла и фенильный фрагмент, содержащий электроноакцепторные заместители) взаимодействиями с аллостерическим участком изоферментов обратной транскриптазы ВИЧ-1, позволили получить истинные мультитаргетные ННИОТ второго поколения.
Впервые предложенные, в рамках модели индуцированного соответствия, пути направленного изменения конформационной подвижности молекул с предусмотренной системой контролируемых конформационных подгонок (относительно свободно вращающаяся (С2-С3)алкил(метил)аминогруппа при С2 пиримидинового гетероцикла, ,5диметилирование, ограничивающее подвижность бензильного радикала, относительно пиримидинового цикла, и асимметричное/симметричное 2,6дизамещение бензольного кольца) обеспечили полученным веществам эффективное лигирование с ревертазами ВИЧ.
В ходе биологических исследований в условиях острого эксперимента, с использованием энзиматических и клеточных моделей, впервые показана высокая вирусингибирующая и противоревертазная активность полученных соединений, проявляющаяся в наномолярном и пикомолярном диапазоне концентраций.
С использованием фундаментальных методов математической химии, в частности - молекулярного докинга, впервые оценены возможности взаимодействия полученных производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)-она с изоферментами обратной транскриптазы ВИЧ-1 и рационализированы наблюдающиеся связи химической структуры и биологической активности в этом ряду веществ.
Впервые определены и обоснованы способы региоселективной C2функционализации замещенных пиримидин-4(3Н)-онов в основных средах, составляющие основу направленного конструирования высокоактивных антиВИЧ-1 агентов.
Практическая значимость работы. Полученные нами высокоактивные соединения имеют хороший шанс пополнить арсенал инновационных отечественных противовирусных препаратов.
Установлено, что лидерами, с точки зрения вирусингибирующей активности и антиревертазного действия обладают производные 6-[1-(2,6дифторфенил)этил]-5-метил-2-(метиламино)пиримидин-4(3Н)-она, содержащие при экзоциклическом атоме азота этил, пропил или изопропил, угнетающие репликацию дикого штамма ВИЧ-1 в пикомолярном, а мутантных штаммов - в наномолярном диапазоне концентраций, с низкими значениями фактора резистентности.
Для получения новых функциональных производных 6бензилпиримидин-4(3Н)-онов предложены оригинальные и простые синтетические схемы, основанные на последовательном превращении 2арилуксусных кислот и их нитрилов, в соответствующие 3-оксоэфиры с построением и функционализацией производных пиримидин-4(3Н)-она на их основе.
Предложенные схемы синтеза новых производных 6-бензилпиримидин4(3Н)-она заключают в себе возможность масштабирования до уровня промышленного производства. Вариабельность сырьевой базы, пригодной для синтеза ряда целевых веществ также повышает их доступность.
ичный вклад автора. Все результаты данной диссертации получены при непосредственном участии автора. Автору принадлежит формулировка новых идей направленного конструирования новых ненуклеозидных ингибиторов репликации ВИЧ-1 - производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)-она, выбор стратегии работы, постановка задач, обоснование выбранного подхода, планирование и выполнение всех стадий синтеза целевых структур, анализ всех полученных экспериментальных результатов.
Автор выражает глубокую благодарность своему научному консультанту, академику РАН, профессору Новакову И.А. (ВолгГТУ, г. Волгоград), а также - д.х.н., профессору Орлинсону Б.С. (ВолгГТУ, г. Волгоград), д.х.н., профессору Брель А.К. (ВоГМУ, г. Волгоград), PhD D. Rotili (Universita degli studi di Roma УLa SapienzaФ, Рим, Италия), к.х.н. Жоховой Н.И. (МГУ, г. Москва), д.ф.-м.н., к.х.н. Баскину И.И. (МГУ, г. Москва), д.х.н., профессору Леменовскому Д.А. (МГУ, г. Москва), д.х.н. Балакину К.В. (ИФАВ РАН, г.
Черноголовка) и к.х.н. Доценко В.В. (ВНУ, г. Луганск, Украина), за консультативную помощь при подготовке работы. Особая благодарность д.фарм.н., к.х.н. Новикову М.С. (ВоГМУ, г. Волгоград) и профессору Antonello Mai (Universita degli studi di Roma УLa SapienzaФ, Рим, Италия) за многочисленные плодотворные обсуждения всех аспектов работы.
Неоценимый вклад в проведение экспериментальных химических исследований, положенных в основу настоящей работы внесли к.х.н.
Еремийчук А.С. (ООО Ферон), к.х.н. Гордеева Е.А. (ВолгГТУ, г. Волгоград), к.х.н. Брунилина Л.Л. (ВолгГТУ, г. Волгоград), к.х.н. Брунилин Р.В.
(ВолгГТУ, г. Волгоград) и магистр химии и химической технологии Яблоков А.С. (ВолгГТУ, г. Волгоград).
Апробация работы. Основные фрагменты диссертационной работы докладывались и обсуждались на отчетной конференции Химия, химические технологии и химическое машиностроение (Москва, 2002), международной научно-технической конференции Перспективы развития химии и практического применения алициклических соединений. ALICYCLE 2004 (Самара, 2004), VIII молодёжной научной школе - конференции по органической химии (Казань, 2005), международной научно-технической конференции Наукоемкие химические технологии - 2006 (Самара, 2006), международной научно-практической конференции Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании, (Одесса, 2007), XV Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва, 2008), международной научно-технической конференции Перспективы развития химии и практического применения алициклических соединений (Волгоград, 2008), III Meeting-Workshop Nuove Prospettive in Chimica Farmaceutica (NPCF 2009) (Pisa, 2009), Всероссийской конференции по органической химии, посвященной 75-летию со дня основания Института органической химии имени Н.Д.Зелинского (Москва, 2009), 1-st TurkishRussian Joint Meeting on Organic and Medicinal Chemistry (Antalya, 2009), Х международном семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология) (Ростов-на-Дону, 2010), VIII Всероссийской конференции с международным участием Химия и медицина (Уфа, 2010), ), XIV Молодежной научной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2011), International Symposium "Methods and Applications of Computational Chemistry" (Львiв, 2011), International Congress on Organic Chemistry (Казань, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), II Всероссийской конференции с международным участием Успехи синтеза и комплексообразования, посвященной 95-летию со дня рождения профессора Н.С. Простакова (Москва, 2012) и ежегодных научных сессиях Волгоградского государственного технического университета в 2003-2011 гг.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 26 статей в отечественных и зарубежных научных журналах, входящих в перечень ВАК, тезисы научных докладов, получено 9 патентов РФ на изобретения.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав основного текста, выводов, приложения и списка цитированной литературы. Работа изложена на 310 страницах машинописного текста и содержит 26 таблиц (в том числе - 5 в приложении), 12 рисунков, 3литературных ссылок.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснованы актуальность темы диссертационной работы, выбор объектов исследования и сформулированы цели и задачи работы. Освещены научная новизна и практическая значимость.
Глава 1. Обзор литературы. Проанализированы литературные данные по противовирусной активности производных пиримидин-4(3Н)-она и показана важность ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 в качестве основных объектов исследования. Рассмотрены взаимосвязи между химическим строением, противовирусной и антиревертазной активностью известных функциональных производных пиримидин-4(3Н)-она, а также - пути химического синтеза и модификации молекул этих веществ.
Глава 2. Разработка структур новых ненуклеозидных ингибиторов обратной трнаскриптазы ВИЧ - производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)она. В настоящей главе рассмотрены пути разработки новых производных 6бензилпиримидин-4(3Н)-она, содержащих (2-оксо-2-фенилэтил)сульфанильную - фенацил-S-ДАБО (Раздел 2.1.), [(арилсульфанил)метил]сульфанильную и [(метилсульфанил)алкил]сульфанильную - ФТМ-S-ДАБО, МТМ-S-ДАБО и МТЭ-S-ДАБО (Раздел 2.2.) или диалкиламино-группу N,N-ДАБО (Раздел 2.3.) в положении С2 примидин-4(3Н)-онового фрагмента.
2.1. Производные фенацил-S-ДАБО. В основе создания этой серии производных лежала идея синтеза и исследования гибридных структур, на основе классических производных F2-S-ДАБО8 и представителей нового класса антивирусных агентов - производных 6-(2-арилоксиэтил)аденина,обладающих широким спектром противовирусной активности:
O NHO F HN N N HN Me O S N N N S N F Me F F O Me Me Полученные, таким образом, вещества проявили анти-ВИЧ-1 активность на уровне Невирапина.10 Дальнейшая модификация радикала при атоме серы, была направлена на дезэкранирование атома кислорода, который мог бы образовывать дополнительную водородную связь с протоном аминогруппы остатка Lys102 или гидроксигруппы остатка Tyr318 аллостерического участка ревертазы, находящимися на расстоянии 4-7 от атома C2 пиримидинового гетероцикла, с одновременным сохранением положения ароматического ядра в боковой цепи. Таким образом, к синтезу были предложены карбонильные аналоги полученных веществ:
O O F R HN HN Me O O S N S N F Hal Hal R Me 5-Alkyl-2-(alkylthio)-6-(2,6-dihalophenylmethyl)-3,4-dihydropyrimidin-4(3H)-ones : Novel Potent and Selective Dihydro-alkoxy-benzyl-oxopyrimidine Derivatives / A. Mai [et. al.] // Journal of Medicinal Chemistry. - 1999. - Vol.
42. - P. 619-627.
Производные 9-(2-арилоксиэтил)аденина - новый класс ненуклеозидных антивирусных агентов / Петров В.И. и др. // ХГС. - 2003 - Т. 39, № 9. - С. 1218-1226.
Навроцкий, М. Б. Синтез и изучение фармакологической активности новых производных 6-(арилметил)4(3Н)-пиримидинона : дис. Е канд. фарм. наук : 15.00.02 / М. Б. Навроцкий. - Пятигорск, 2002. - 192 с.
Одновременно и независимо, китайскими исследователями были получены и опубликованы соответствующие аналоги фенацил-S-ДАТНО,причем, наибольшую активность этим соединениям сообщали фенацил, 4фтор- и 4-метоксифенацил при атоме серы. Кроме этого, активность полученных веществ возрастала при переходе от 5-метил к 5изопропилзамещенным аналогам.
Таким образом, в дополнение к полученным нами фенацил-замещенным производным, были также синтезированы их 4-фтор- и 4-метоксифенацильные аналоги, содержащие Н, Me, Et, i-Pr при С5 пиримидинового гетероцикла.
Характер замещения ароматического ядра был основан на результатах работ Antonello Mai и соавторов, где 2,6-дифтор и 2,6-дихлорфенильный фрагмент ассоциировались с пиковой активностью.5 Кроме этого, ранее нами было выдвинуто и подтверждено предположение о повышении активности производных ряда S-ДАБО при несимметричном замещении положений 2 и фенильного ядра различными дезактивирующими группами.Предполагалось, что такой вариант замещения будет способствовать изменению торсионного угла связи метиленового фрагмента и бензольного ядра, предрасполагая к обретению веществом активной, бабочкоподобной конформации. В этой связи были также предложены к синтезу 2-фтор-6хлорбензил-замещенные производные.
2.2. Производные ФТМ-S-ДАБО, МТМ-S-ДАБО и МТЭ-S-ДАБО. Новые производные МТМ-S-ДАБО (6-бензил-2-{[(метилсульфанил)метил]сульфанил}пиримидин-4(3Н)-она) были получены с целью дополнительного исследования влияния характера замещения бензольного ядра и положения Спиримидинового гетероцикла на противовирусную активность полученных 5-Alkyl-2-[(aryl and akyloxylcarbonylmethyl)thio]-6-(1-naphthylmethyl) pyrimidin-4(3H)-ones as an unique HIV reverse transcriptase inhibitors of S-DABO series / He Y. [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2004. - Vol. 14. - P.
3173-3176.
Навроцкий, М. Б. Синтез и анти-ВИЧ-1 активность новых производных 6-(арилметил)-2[(циклогексилметил)тио]-4(3Н)-пиримидинона и 6-(арилметил)-2-{[(метилтио)метил]тио}-4(3Н)пиримидинона / М. Б. Навроцкий // Хим. - фарм. ж. - 2004. - Т. 38, № 9. - С. 16-18.
веществ, так как данные литературы на эту тему - противоречивы.13 Гомоаналоги этих веществ - производные МТЭ-S-ДАБО (6-бензил-2-{[2(метилсульфанил)этил]сульфанил}пиримидин-4(3Н)-она) были получены руководствуясь двумя соображениями: с одной стороны, как и в случае производных фенацил-S-ДАБО, предполагалось, что атом серы может выступать донором электронной плотности при образовании водородных связей с протоном аминогруппы остатка Lys102 или гидроксигруппы остатка Tyr318 аллостерического участка ревертазы; с другой стороны, полученные вещества явились региоизомерными аналогами описанного 6-(1нафтилметил)-5-этил-2-{[(этилсульфанил)метил]сульфанил}пиримидин-4(3Н)она, оказавшегося в два раза активнее, чем соответствующий [(этилсульфанил)метил]сульфанил-замещенный аналог:O O O Et Et R HN HN HN MeS EtS S N MeS S N S N R Основной посылкой к синтезу новых производных 6-бензил-2{[(фенилсульфанил)метил]сульфанил}пиримидин-4(3Н)-она явилась биоизостерическая замена метиленовой группы родственных производных фенетил-S-ДАБО на атом серы: предполагалось, что такие вещества смогут выступать как самостоятельные анти-ВИЧ агенты, так и пролекарственные формы для соответствующих сульфоксидов, образующихся при биологическом окислении и являющихся биоизостерами производных фенацил-S-ДАБО. Характер замещения ароматического ядра в боковой цепи был выбран по тому же принципу, что и в случае производных фенацил-SДАБО. Кроме этого, были получены несколько 2-{[(аллилсульфанил)метил] Does the 2-methylthiomethyl substituent really confer high anti-HIV-1 activity to S-DABO / G. Sbardella [et. al.] // Medicinal Chemistry Research. - 2000. - Vol. 10, N. 1. - P. 30-39; 5-Alkyl-2-[(methylthiomethyl)thio]-6-(benzyl)pyrimidin-4(1H)-ones as potent non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors of S-DABO series / R. Vig [et. al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 1998. - Vol. 8, N. 12. - P. 1461-1466.
Danel, K. Anti-HIV active naphthyl analogues of HEPT and DABO / K. Danel, C. Nielsen, E. B. Pedersen // Acta Chemica Scandinavica. - 1997. - Vol. 51. - P. 426-430.
сульфанил}пиримидин-4(3Н)-онов, представляющих собой гибриды MTM-SДАБО и анти-ВИЧ-1 активных производных 1-[(аллилокси)метил]-6бензилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона:
O O O Et H2C R Et HN HN HN EtS S N S S N S N O R Me Me CH Фенильный фрагмент бензильного радикала был замещен по положениям 2 и 6 двумя атомами галогена, по приведенным выше основаниям, а также - двумя метильными группами по положениям 3 и 5.
Последний вариант замещения был заимствован у наиболее активных аналогов эмивирина:15 ряд взаимодействий структура-активность являются общими для них и для производных MTM-S-ДАБО.2.3. Производные N,N-ДАБО. Разработка этого класса веществ стала результатам исследований по молекулярному докингу полученных ранее Antonello Mai и соавторами производных F2-S-ДАБО и F2-NH-ДАБО с использованием пакета Autodock версии 4.0. В результате этих исследований было показано, что наличие в молекуле иминогруппы взамен атома серы приводит к появлению еще одной якорной точки, способной к образованию сильной водородной связи. Это приводит к меньшей потере активности в случае изофермента с заменой остатка Tyr181 на Cys181. В то же время, наличие подвижного протона у иминогруппы дает дополнительную жесткость образу связывания лиганда с аллостерическим участком фермента. В этой связи, были проведены дальнейшие кросс-докинговые исследования производных F2-S-ДАБО и F2-NH-ДАБО, наряду с простейшими производными N,N-ДАБО, показавшие неявную возможность более Synthesis and antiviral activity of 6-benzyl analogues of 1-[(2-hydroxyethoxy)methyl]-6-(phenylthio)thymine (HEPT) as potent and selective anti-HIV-1 agents / H. Tanaka [et. al.] / J. Med. Chem. - 1995. - Vol. 38, N. 15. - P.
2860-2865.
эффективного взаимодействия последних с различными конформациями аллостерического участка связывания фермента. Эффект, в данном случае, достигается за счет удаления подвижного протона, способного образовывать вредные водородные связи, а также - увеличения числа активных конформаций полученного соединения и его способности к репозиционированию внутри кармана связывания биомишени. Исходной посылкой явился принцип трехмерного фармакофорного подобия.
Глава 3. Синтез новых производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)-она.
Настоящая глава имеет следующее построение. Сначала, в Разделе 3.1.
рассмотрено получение ключевых интермедиатов синтеза - этиловых эфиров 3-оксо-4-фенилбутановых кислот (-фенилацетоуксусных эфиров). Далее, приводятся схемы построения 6-бензил-2-тиоксо-2,3-дигидропиримидин4(1Н)-онов (6-бензил-2-тиоурацилов) и 6-бензил-2-(метилсулфанил)пиримдин4(3Н)-онов (6-бензил-S-метил-2-тиоурацилов) на их основе (Раздел 3.2.). В Разделах 3.3. и 3.4. рассмотрены реакции алкилирования 6-бензил-2тиоурацилов 2-бром-1-фенилэтан-1-онами (фенацилбромидами) и - и хлоралкилсульфидами. В заключение, в Разделе 3.5. приводится синтез производных 6-бензил-2-аминопиримидин-4(3Н)-она (6-бензилизоцитозинов).
3.1. Синтез -фенилацетоуксусных эфиров. Для получения целевых веществ были синтезированы замещенные -фенилацетоуксусные эфиры, выбранные из ряда:
1 R R COOEt R O 1-R = 2,6-Cl2 (1-5), 2-Cl-6-F (6-10), 2,6-F2 (11-19), 2-F (20), 3,5-Me2 (21-23); R1 = H (1-4, 6-10, 11-19, 21-23), Me (5, 15, 16, 20), Et (18, 19); R2 = H (1, 6, 11, 15, 18), Me (2, 5, 7, 12, 16, 18-21), Et (3, 8, 13, 17, 22), i-Pr (4, 9, 14, 23), s-Bu (10).
Для синтеза этих соединений были использованы несколько методов:
Метод А.
COOEt R O N R N KO(O)CCHR2C(O)OEt HCl R R O R Et3N / MgCl2 / MeCN H2O 58-99% 1-3, 5-7, 11-13, 15- Метод B.
COOEt R O 3 R R HO(O)CCHR2C(O)OEt HCl R O R R R4MgX / THF H2O 86-100% 2-4, 7-9, 21-R3 = Cl (при синтезе всех веществ, за исключением соединений 2, 7), 1Нимидазол-1-ил (при синтезе веществ 2, 7).
Метод C.
N COOEt N O F O KO(O)CCH2C(O)OEt / (CH3)3SiCl HCl F F DBU / MeCN H2O F 84% Метод D.
O CN COOEt R1CH(Br)C(O)OEt / Zn R HCl R R THF H2O 47-81% 2-4, 6-10, 3.2. Синтез 6-бензил-2-тиоурацилов и 6-бензил-S-метил-2-тиоурацилов.
Основой для получения новых производных ряда 6-бензилпиримидин-4(3Н)она явились соответствующие 6-бензил-2-тиоурацилы:
O R NH R N S H R 24-R = 2,6-Cl2 (24-28), 2-Cl-6-F (29-33), 2,6-F2 (34-39), 3,5-Me2 (40-42); R1 = H (2427, 29-37, 40-42), Me (28, 38, 34); R2 = H (24, 29, 34, 38), Me (25, 28, 30, 35, 39, 40), Et (26, 31, 36, 41), i-Pr (27, 32, 37, 42), s-Bu (33).
которые были получены путем конденсации соответствующих -кетоэфиров с (H2N)2CS в присутствии NaOMe / MeOH при соотношениях -кетоэфир :
NaOMe : (H2N)2CS = 1 : 3 : 2 (метод Е) и в присутствии KOEt / EtOH при соотношениях исходных веществ -кетоэфир : KOEt : (H2N)2CS = 1 : 6 : 2-(метод F):
O O R R NH (H2N)2CS H+ COOEt R 1 2 N S R R AlkO- / AlkOH H2O H R 73-82% (метод Е) 24, 29, 21-81% (метод F) 25-28, 30-33, 35-39, 40-Ключевыми интермедиатами синтеза целевых производных 2-амино-6бензилпиримидин-4(3Н)-она (6-бензилизоцитозина) явились соответствующие 6-бензил-S-метил-2-тиоурацилы, выбранные из ряда:
O R NH R N SMe R 43-R = 2,6-Cl2 (43-46), 2-F-6-Cl (47-50), 2,6-F2 (51-54); R1 = H (43-52), Me (53, 54);
R2 = H (43, 47, 51, 53), Me (44, 48, 52, 54), Et (45, 49), i-Pr (46, 50).
Получение этих веществ осуществлялось тремя различными методами:
S-монометилированием соответствующих 6-бензил-2-тиоурацилов в среде безводного ДМФА с применением двукратного мольного избытка MeI (метод G) или избытком MeI в среде спиртового КОН (метод H):
O O 2 R R NH NH MeI R R N S N SMe 1 H R R 74-95% (метод G) 46, 50, 51-50-66% (метод H) 43-46, 47-а также - конденсацией -кетоэфира с полученной in situ H2NC(NH)SMe (для веществ 43, 47, 51, 52) (метод I):
O R COOEt R NH (H2N)2CS+Me R R O N SMe K2CO3 / EtOH - H2O 32-76% 43, 47, 51, 3.3. S-Алкилирование 6-бензил-2-тиоурацилов фенацилбромидами. Одним из главных рядов вероятных анти-ВИЧ-1 агентов, явились производные 6бензил-2-[(2-фенил-2-оксоэтил)сульфанил]пиримидин-4(3Н)-онов (фенацил-SДАБО), выбранные из ряда:
O 1 R R NH R N S O 55-R = 2,6-Cl2 (55-66), 2-Cl-6-F (67-80), 2,6-F2 (81-89); R1 = H (55-57, 67-69), Me (58-60, 70-72, 81-83), Et (61-63, 73-75, 84-86), i-Pr (64-66, 76-78), s-Bu (79, 80);
R2 = H (55, 58, 61, 64, 67, 71, 74, 76, 81, 84, 87), F (56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 79, 82, 85, 88), MeO (57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 80, 83, 86, 89).
Ключевой стадией синтеза этих веществ, явилась реакция региоселективного S-моноалкилирования соответствующих производных 6бензил-2-тиоурацила с использованием PhC(O)CH2Br, 4-FC6H4C(O)CH2Br и 4MeOC6H4C(O)CH2Br в присутствии NaOMe в безводном MeOH (метод J) или в среде безводного DMF в присутствии K2CO3 (метод K):
Br O 1 1 R O R R R NH O Cl NH N S N NaOMe / MeOH Cl R O H R S или K2CO3 / DMF 70-87% (метод J) 55-70-87% (метод K) 81-3.4. S-Алкилирование 6-бензил-2-тиоурацилов алифатическими и жирноароматическими - и -(хлоралкил)сульфидами. Синтез новых производных рядов ФТМ-S-ДАБО, МТМ-S-ДАБО и МТЭ-S-ДАБО:
O O 1 R R NH NH R R 2 SMe N S SR N S 90-101, 111-137 102-1R = 2,6-Cl2 (90-92, 99, 102-104, 111-113, 120-122, 129-131), 2-Cl-6-F (93-95, 100, 101, 105-107), 3,5-Me2 (96-98, 108-110); R1 = H (99), Me (90, 93, 96, 100, 102, 105, 108), Et (91, 94, 97, 103, 106, 109), i-Pr (92, 95, 98, 101, 104, 107, 110); R2 = Me (90-98), All (100, 101), 4-FC6H4 (111-119), Ph (120-128), 4-MeOC6H4 (129137).
был выполнен посредством S-моноалкилирования соответствующих производных 6-бензил-2-тиоурацила с использованием - и -хлорсульфидов:
AllSCH2Cl и MeSCH2Cl, MeSCH2CH2Cl, а также - 4-FC6H4SCH2Cl, PhSCH2Cl и 4-MeOC6H4SCH2Cl:
O O O R R SMe R NH NH NH R2SCH2Cl MeSCH2CH2Cl N S SR N S N S H R R R 90-101, 111-137 102-1Для этой цели, были применены следующие вариации условий проведения реакции и сочетаний лоснование-растворитель: в среде безводного ДМФА, при комнатной температуре (метод G); в системе KOH - EtOH, сначала при комнатной температуре, а затем - при температуре кипения растворителя (метод H); в системе K2CO3 - ДМФА при комнатной температуре (метод K); в системе K2CO3 - ДМФА при комнатной температуре, за исключением предварительного нагревания смеси исходного 6-бензил-2тиоурацила, K2CO3 и ДМФА при 90-100оС в течение 1 часа (образование калиевой соли исходного 6-бензил-2-тиоурацила) (метод L). При использовании MeSCH2Cl и AllSCH2Cl выход целевых продуктов моноалкилирования составил 26-59% (наилучшие значения по методу G). В случае метода H наблюдался сольволиз алкилирующего агента и регенерация исходного 6-бензил-2-тиоурацила. В случае использования MeSCH2CH2Cl, наибольший выход целевых продуктов достигался при проведении реакции по методу H (74-99%), в то время как метод K и L дали существенно сниженные значения выхода (22-35%). При проведении синтеза по методу G реакция практически не шла. В случае синтеза с арил(хлорметил)сульфидами наибольшего выхода целевых соединений удалось добиться при проведении синтеза по методу H (53-70%), а наименьший выход целевых продуктов был получен при использовании метода L и К (26-58%).
3.5. Синтез N2,N2-дизамещенных производных 2-амино-6бензилпиримидин-4(3Н)-она (N,N-ДАБО). Синтез новых производных 6бензилизоцитозина:
O R HN 4 R R N N R R 138-1R = 2,6-F2 (138-144, 148-164, 166-180, 183-194), 2-F-6-(пирролидин-1-ил) (145, 165), 2,6-Cl2 (181), 2-F (182); R1 = H (138-176), Me (177, 178, 180-182, 184-194), Et (179, 183); R2 = H (138-156, 177-179), Me (156-176, 180-183, 185-194), Et (184); R3NR4 = Me2N (134, 156, 177, 179-184), MeNEt (139, 157, 185), i-PrNMe (140, 158, 186), MeNPr (141, 159, 187), c-HexNMe (160), MeNPh (161), Et2N (142, 162), Pr2N (143, 163), пирролидин-1-ил (144, 145, 164, 165, 188), пиперидин-1-ил (146, 166, 189), 2-метилпиперидин-1-ил (147, 167), 3метилпиперидин-1-ил (148, 168, 190), 4-метилпиперидин-1-ил (149, 169, 191), азепан-1-ил (150, 170, 192), морфолин-4-ил (151, 171, 193), тиоморфолин-4-ил (152, 172, 194), 4-метилпиперазин-1-ил (153, 173), 1,4-диокса-8азаспиро[4.5]декан-8-ил (154, 174), 1Н-пиррол-1-ил (155), 4-(2метоксифенил)пиперидин-1-ил (175), 4-(пиридин-2-ил)пиперидин-1-ил (176).
был выполнен путем аминолиза соответствующих S-метил-6-бензил-2тиоурацилов в присутствии карбитола (метод M) или уксусной кислоты (метод N):
O O 1 R R HN HN R2NHRR R R MeS N N N EtOCH2CH2OCH2CH2OH F F R F F или AcOH 23-87% (метод M) 142-154, 162-176, 188-1 31-81% (метод N) 139-141, 157-159, 185-1Для получения 6-бензил-N2,N2-диметилизоцитозинов была использована конденсация соответствующих -фенилацетоуксусных эфиров с полученным in situ 1,1-диметилгуанидином (выход - 61-85%) (метод O):
O R O [(CH3)2NC(NH)NH2]2*H2SOHN R COOEt R Me2N N NaOEt / EtOH 1 R R R 61-85% 134, 156, 177, 179-1Твердофазный синтез был применен для низкореакционноспособных аминов, позволил получить выход веществ 160 и 161 44 и 39%, соответственно и был выполнен по схеме (метод P):
O O O R R R NH NH NH R R R N S R3NHRN S 1. NaOH / EtOH m-CPBA N SOH Resin THF 2. ResinCH2Cl CH2Cl2 Resin R R R DMF O R NH 1 R R N N R R 39-44% 160, 1Для получения 6-(2,6-дифторбензил)-2-(1Н-пиррол-1-ил)пиримидин4(3Н)-она (155, 43%), была использована реакция Клауссона-Кааса (метод R):
O MeO OMe O O HN HN H2N N N N AcOH F F F F В то время как большинство синтезов проходили относительно региоселективно, в случае аминолиза S-метил-6-(2,6-дифторбензил)-2тиоурацила и 2-тиотимина, происходило также замещение одного из атомов фтора в ароматическом кольце. При этом целевой продукт (144, 164) удается выделить с выходом 8-23%, а побочный (145, 165) - 35-39%.
Глава 4. Исследование биологической активности новых производных 6бензилпиримидин-4(3Н)-она. В Разделах 4.1.-4.2. приводится исследование биологической активности и моделирование способа связывания с биомишенью новых производных фенацил-S-ДАБО, в Разделе 4.3. - изучение биологической активности новых производных ФТМ-S-ДАБО, МТМ-S-ДАБО, МТЭ-S-ДАБО, а в Разделах 4.4.-4.5. - исследование биологической активности и моделирование способа связывания с биомишенью новых производных N,N-ДАБО, соответственно. Проводится анализ установленных взаимосвязей химической структуры и биологической активности полученных веществ.
4.1. Противовирусная активность и цитотоксичность полученных соединений были определены на инфицированной ВИЧ-1 или квази-инфицированной колонии клеток лимфоидной ткани МТ-4. В исследовании использовались как дикий штамм ВИЧ-1 NL4-3, так и клинически значимые мутантные штаммы вируса16. Для этой цели использовался известный метод. В изученном диапазоне концентраций, ни одно из исследованных соединений не проявило выраженных цитотоксических свойств.
Производные фенацил-S-ДАБО оказались эффективными ингибиторами репликации дикого штамма ВИЧ-1, однако существенно теряли активность по противовирусному действию в отношении клинически значимых мутантных штаммов вируса. Активность этих соединений, в отличие от классических производных ряда ДАБО, возрастала при переходе от незамещенных аналогов, к 5-метил, 5-этил и 5-изопропил-замещенным аналогам. Наибольшую активность проявили 2,6-дихлорбензил- и 2-фтор-6-хлорбензил-замещенные Биологические исследования были выполнены в Retrovirology Laboratory IrsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Universitat Autonoma de Barcelona (Испания). Автор выражает глубокую благодарность докторам Jose A. Este, Mercedes Armand-Ugon и Imma Clotet-Codina за проведенные исследования.
The anti-HIV activity of ADS-J1 targets the HIV-1 gp120 / M. Armand-Ugon [et. al.] // Virology. - 2005. - Vol.
343. - P. 141-149.
производные, в то время, как 2,6-дифторбензил-замещенные аналоги оказались менее активными. Влияние заместителя в ароматическом ядре фенацила, как правило, не оказывало значительного влияния на противовирусную активность. В то же время, в большинстве случаев незамещенные и 4-метокси-замещенные производные оказывались несколько активнее 4-фторзамещенных аналогов.
Производные фенацил-S-ДАБО 55-89 были также исследованы на предмет их способности ингибировать активность ревертазы как дикого, так и ряда клинически значимых штаммов ВИЧ-1, устойчивых к большинству ННИОТ (K103N, Y181I, и L100I). В результате была изучена способность этих веществ угнетать активность ревертазы дикого и мутантных штаммов ВИЧ118. Исследования были выполнены в соответствии с МТТ-методикой.Как и в случае клеточных тестов, взаимосвязи химическая структура - биологическая активность, установленные для других производных ряда ДАБО, оказались неприменимы к производным фенацил-S-ДАБО. В экспериментах с использованием ревертазы дикого штамма ВИЧ-1, наиболее высокая активность соответствующих производных ассоциировалась с изопропилом > этилом > водородом > метилом в положении Cпиримидинового цикла, а также с введением 2-хлор-6-фтор- > 2,6-дихлор- > 2,6-дифторбензильным заместителем в положении C6 пиримидинового цикла.
Как в клеточных исследованиях, так и в исследованиях с использованием изолированных ферментов по-разному замещенные цепи в положении Cоказывали слабое влияние на уровень биологической активности полученных соединений. Наиболее мощным ингибитором ревертазы дикого штамма ВИЧ-оказалось соединение 78, показавшее ИД50 (ингибирующая доза 50, доза соединения, необходимая для 50%-ного угнетения активности Энзиматические исследования были выполнены в Istituto di Genetica Molecolare IGM-CNR, Pavia (Италия).
Автор выражает глубокую благодарность докторам Giovanni Maga, Alberta Samuele и Samantha Zanoli за проведение исследований.
Resistance to nevirapine of HIV-1 reverse transcriptase mutants: loss of stabilizing interactions and thermodynamic or steric barriers are induced by different single amino acid substitutions / G. Maga [et al.] // J. Mol. Biol. - 1997. - Vol. 274 - No. 5. - P. 738-47.
рекомбинантной ревертазы ВИЧ-1) = 0.7 нмоль. Оптимальная активность в одноразрядном нанограммовом диапазоне была зарегистрирована для 6-(2хлор-6-фторбензил)-замещенных производных 67, 73, 75, 76, и 80, а также - для 2,6-дифторбензильного аналога 87. Тем не менее, в тестах с использованием мутантных ревертаз, лишь частично сохраняли свою активность, в сочетании с высоким уровнем устойчивости (67, 76, 80 и 87), или же были активны лишь в отношении одной мутантной ревертазы (83 и 85).
Иначе вели себя вещества 61-63, которые показали значения ИД50 в отношении ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 в интервале от 71 до 23 нмоль, проявили активность в низком микромолярном и субмикромолярном диапазоне в отношении мутантных ревертаз K103N, Y181I, и L100I, без существенного падения активности [ИД50K103N (мкмоль) / фактор резистентности: 1.88/26 (61), 1.79/43 (62), 0.48/21 (63); ИД50Y181I (мкмоль) / фактор резистентности: 0.33/(61), 0.24/6 (62), 0.14/6 (63); ИД50L100I (мкмоль) / фактор резистентности:
3.54/50 (61), 1.82/43 (62), 2.42/105 (63)].
4.2. Для рационализации полученных данных по угнетению активности ревертазы вновь синтезированными производными 6-(арилметил)пиримидин4(3Н)-она, нами были выполнены соответствующие исследования вероятного способа связывания этих веществ с ферментом, с использованием компьютерного моделирования с использованием программного пакета Autodock 4.0.1. Для проведения исследований из Банка Данных Белков (PDB) были взяты комплексы соответствующих ревертаз с ингибитором TNK-651.
В случае TNK-651, анализ экспериментальных данных по способу связывания с ферментом показал, что, по существу, на способ связывания в целом не оказывают серьезного влияния мутации Y181C или L100I:
Рис. 1. Конформации TNK-651 в комплексе с ревертазами дикого штамма ВИЧ-1 (углеродный каркас пурпурного цвета) и изоферментов Y181C (углеродный каркас желтого цвета) и L100I (углеродный бирюзового цвета).
Более того, в трех изоформах ревертазы (1rt2, 1jla и 1s1v) возможно установить, как минимум, пять участков связывания, показанных на рисунке:
Рис. 2. Экспериментально установленная модель связывания TNK-651 с ревертазой (аминокислотные фрагменты показаны серым, области связывания обозначены различными цветами).
1. Карман связывания C5-изопропильной группы (красная зона), образованный боковой цепью аминокислотного остатка Val179 и атомов аминокислотных остатков Tyr181, Val189 и Gly190 составляющих пептидную цепь.
2. Гидрофобый участок, обогащенный -электронной плотностью (боковые цепи Leu 100 (Ile100), Tyr181 (Cys181), Tyr188, Phe227, Trp2и Leu234), связывающий C6-бензильный фрагмент TNK-651 (область голубого цвета).
3. Короткий гидрофобный канал (один из входов участка связывания ненуклеозидных ингибиторов ревертазы, область зеленого цвета), в который встраивается фрагмент -CH2-O-CH2- молекулы TNK- 651 N1бензиолксиметильная цепь вступает во взаимодействие, преимущественно, с терминальными фрагментами боковых цепей Val106 и Tyr318.
4. Окончание входного канала участка связывания ненуклеозидных ингибиторов ревертазы (область пурпурного цвета), в котором боковая цепь Pro236 взаимодействует с бензилоксиметильным фрагментом TNK-651.
5. Гидрофильная область образования водородной связи (область синего цвета), в которой кислородный атом Lys101 главной цепи образует водородную связь в большинстве кристаллических комплексов ревертазы RT с ненуклеозидным ингибитором (не показана).
Проверка способов связывания фенацил-S-ДАБО, с помощью пакета Autodock, обнаружила справедливость суперпозиции первых на таковые для TNK-651, как в случае ревертазы дикого штамма вируса WT, так и в случае изофермента Y181C, демонстрируя, тем самым, полную аналогию конформации связанного лиганда:
Рис. 3. Конформация вещества 62 (углеродный каркас бледно пурпурного цвета) в связи с ревертазами дикого штамма ВИЧ-1 (А) и изоферментами Y181C (B) и L100I (C). Для сравнения приведена связанная конформация TNK-651 (углеродный каркас голубого цвета) и обозначены области связывания.
Важно отметить, в случае ревертазы дикого штамма ВИЧ-1, все производные фенацил-S-ДАБО связываются с ферментом практически единообразно (Рис. 4А.). В то же время, в случае изофермента Y181C, несмотря на значительные черты сходства в способе связывания, некоторые соединения проявляют определенную чувствительность к мутации Tyr-Cys (Рис. 4В.). В результате, выровненные по структуре конформации перекрываются в несколько меньшей степени. Мутация Leu - Ile является фатальной для сохранения такого же способа связывания лиганда (Рис. 4.):
А В С Рис. 4. Конформации производных фенацил-S-ДАБО в связи с ревертазами дикого штамма ВИЧ-1 (А) и изоферментами Y181C (B) и L100I (C). Для сравнения приведена связанная конформация МС-920 (углеродный каркас желтого цвета) и обозначены области связывания TNK-651.
На самом деле, конформации производных фенацил-S-ДАБО в комплексе с изоферментом L100I (см. выше) несколько беспорядочны, и в них отсутствует общая модель связывания. Похоже, что мутация Leu - Ile расширяет участок связывания ненуклеозидных ингибиторов, с утратой части взаимодействий, стабилизирующих лиганд в составе комплекса (рис. 5, слева).
С другой стороны, в случае L100I появляется дополнительная метильная группа (принадлежащая втор-бутильному радикалу остатка Ile100), которая, в некоторых случаях, приводит к возникновению отталкивания с пиримидиновым циклом S-ДАБО. В результате производные фенацил-S-ДАБО не сохраняют способ связывания, характерный для комплекса с ревертазой дикого штамма ВИЧ-1 WT или изоферментом Y181C (рис. 5, справа):
Рис. 5. Влияние мутации L100I на аллостерический участок связывания обратной трнаскриптазы ВИЧ-1.
Интересно, что конформации практически всех C5-этил-замещенных производных (61-63, 73-75, 84 и 85) в составе комплекса с ревертазами, подвергаются лишь незначительному влиянию мутации L100I, что, возможно, лишь частично, согласуется с профилем их биологической активности (Рис. 6, 7).
Неким образом, связанные конформации 61-63, 73-75, 84 и 85 занимают плоскость пиримидинового цикла, внося позитивный вклад в расстояние Леннарда-Джонса:
63 64 65 74 75 84 Рис. 6. Конформации производных фенацил-S-ДАБО 61-63, 73-75, 84 и 85 в связи с изоферментом L100I (1s1v) (аминокислотные остатки аллостерического участка обозначены розовым). Для сравнения приведена связанная конформация TNK-651 (углеродный скелет бирюзового цвета).
63 64 65 74 75 84 Рис. 7. Конформации производных фенацил-S-ДАБО 61-63, 73-75, 84 и 85 в связи с изоферментом L100I (1s1v) (аминокислотные остатки аллостерического участка обозначены розовым) с обратной стороны. Для сравнения приведена связанная конформация TNK-651 (углеродный скелет бирюзового цвета).
В результате, они сохраняют способ связывания, характерный для ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 или изофермента Y181C.
Наличие фенацила является определенно важной особенностью производных фенацил-S-ДАБО. Верификация связанных конформаций этих веществ в комплексе с ревертазой дикого штамма ВИЧ-1 или изоферментом Y181C обнаруживает, что карбонильный кислород боковой цепи образует водородную связь с фрагментом NH пептидной группы остатка Lys103. В этом может заключаться объяснение причины снижения активности этих соединений в отношении клинически значимого мутантного штамма вируса K103N. В то же время, образование новой водородной связи, похоже, мешает образованию комплекса с изоферментом Y181C. Это является следствием того, что в последнем есть еще одна якорная точка, которая отвечает за утрату взаимодействия с лигандом, вследствие мутации Tyr - Cys. Похожее явление встречается и у производных NH-ДАБО. Для дополнительного подтверждения важности введения фенацила при экзоциклическом атоме серы, были выполнены эксперименты по молекулярному моделированию связывания F2-SДАБО MC922 в сравнении с производными фенацил-S-ДАБО. Конформация соединения MC922 в комплексе с ферментом ясно показывает, что положение пиримидинового гетероцикла несколько выше области красного цвета, в сравнении с производными фенацил-S-ДАБО, равно как и пиримидиновым кольцом TNK-651 (Рис. 8):
Рис. 8. Конформация вещества 62 (углеродный каркас бледно пурпурного цвета) в связи с ревертазами дикого штамма ВИЧ-1 (А) и изоферментами Y181C (B) и L100I (C). Для сравнения приведена связанная конформация МС922 (углеродный каркас желтого цвета) и обозначены области связывания TNK-651.
Таким образом, C5-метил в молекуле MC922 не перекрывается с C5заместителем в молекулах соединений фенацил-S-ДАБО, а также - с C5изопропилом TNK-651 (область красного цвета). Эти факты согласуются с приведенными выше взаимосвязям химическая структура-биологическая активность, согласно которым, увеличение и разветвление заместителя в положении C5 пиримидинового гетероцикла приводит к более активным производным оксофенетил-S-ДАБО, в отличие от описанных ранее производных F2-S-ДАБО. Более того, прямое сопоставление с конформациями TNK-651 и Делаверидина (применяемый в клинике ННИОТ, код по PDB 1klm) находящимися в связи с ферментом (ревертазой дикого штамма ВИЧ-1), позволяет утверждать, что производные фенацил-S-ДАБО представляют собой переходный TNK-651/Делавердин структурный тип:
Рис. 9. Экспериментальные конформации Делавердина (углеродный каркас оранжевого цвета) и TNK-651 (углеродный каркас бирюзового цвета) в сравнении с рассчитанными конформациями производных фенацил-S-ДАБО (слева) и отдельно - соединением 63 (справа). Аминокислотные остатки аллостерического участка связывания обратной транскриптазы обозначены белым. Углеродный каркас остатков аминокислот Lys101, Lys103 выделен в виде белых стержней.
Последнее наблюдение видится полезным в направленном конструировании химерных структур на основе производных 6(фенилсульфанил)ациклотимидина, ДАБО и 1,4-бис(гетероарил)пиперазинов, являющихся активными анти-ВИЧ-1 агентами.
4.3. В случае противовирусных агентов, полученных с использованием алифатических и жирно-ароматических - и -(хлоралкил)сульфидов, наблюдались неоднозначные взаимосвязи структуры и активности. Во-первых, следует отметить, что эти вещества оказались менее активными анти-ВИЧ агентами, чем оба класса производных, рассмотренных выше. Во-вторых, вне зависимости от изученных вариантов замещения бензильного радикала (2,6дихлор, 2-фтор-6-хлор, 3,5-диметил), все изученные вещества проявили относительно невысокий уровень активности. В случае 6-(3,5-диметилбензил)замещенных производных максимум активности обладали соединения с изопропилом в положении 5 пиримидинового цикла, менее активными были 5метил-замещенные аналоги, а наименее активными - 5-этил-замещенные производные. Для 2,6-дигалогенбензильных производных, наоборот, максимум активности пришелся на 5-метил-замещенные производные, с убыванием активности по мере увеличения и разветвления радикала.
Исключение составили лишь производные МТМ-S-ДАБО.
Влияние радикала при экзоциклическом атоме серы также оказалось неожиданным: биоизостерические аналоги фенацил-S-ДАБО, содержащие атом серы, взамен карбонила, оказались значительно менее эффективными противовирусными агентами. В то же время, гомо-аналоги полученных ранее МТМ-S-ДАБО, оказались активнее прототипов.
4.4. Выполненные биологические исследования позволили установить, что максимальная, среди изученных рядов соединений, противовирусная активность наблюдается производных ряда N,N-ДАБО, причем, как в отношении дикого, так и клинически значимых мутантных штаммов ВИЧ-1.
При этом, активность полученных веществ возрастает при переходе от 2,6дихлорбензил- к 2,6-дифторбензилзамещенным соединениям. Кроме этого, было установлено, что возрастанию противовирусной активности способствует введение метильной группы в положение 5 пиримидинового гетероцикла. При этом, в случае дополнительного введения метильного радикала в -положение 2,6-дигалогенбензильного заместителя, удается получить максимально активные противовирусные агенты. При этом, введение метильного радикала в 5-незамещенные аналоги, как правило, не приводит к радикальному росту противовирусной активности. Сравнительная оценка влияния замещения экзоциклического атома азота показала, что максимум активности приходится на несимметрично замещенные соединения: 2[метил(пропил)амино]-, 2-[изопропил(метил)амино]- и 2[метил(этил)амино]пиримидин-4(3Н)-оны. Эти вещества практически одинаково эффективно угнетают репликацию дикого и мутантных штаммов ВИЧ-1 в пикомолярном и одноразрядном наномолярном диапазоне концентраций. Данные об их активности представлены в таблице.
Анти-ВИЧ-1 активность и цитотоксичность соединений-лидеров O Me HN Me R N F F ЭК5021 ЭК50 (ФР22) Дикий штамм Вещество R ЦК5020 Мутантные штаммы вируса ИСвируса NL4-3 IRLL98 K103N Y181C Y188L 0.003 0.185 Me(Et)N 81 0.0003 0.02 (67) 0.002 (7) 270 0(10) (100) 0.00186 Me(i-Pr)N >81 0.0005 0.001 (2) 0.006 (12) 0.04 (80) >162 0(1.4) 0.0187 Me(n-Pr)N > 78 0.0006 0.01 (17) 0.0006 (1) 0.03 (50) >130 0(1.7) Невирапин >7 0.08 9.9 (124) 1.8 (23) 0.87 (11) 5.6 (70) >Ифавиренц >0.3 0.004 0.08 (20) 0.09 (22) 0.006 (1.5) 0.23 (57) >Близкими по активности являются аналоги, в которых экзоцикилческий атом азота изоцитозина включен в состав пиперидинового или биоизостерического ему - тиоморфолинового гетероцикла.
Производные ряда N,N-ДАБО 140-194 были изучены на предмет ингибирующей активности, в отношении рекомбинантной ревертазы дикого Цитотоксическая концентрация вещества, приводящая к гибели 50% клеток, выражена в мкмоль.
Эффективная концентрация вещества, подавляющая цитопатические эффекты вируса на 50%, выражена в мкмоль.
Фактор резистентности - отношение ЭК50 для мутантного штамма вируса к ЭК50 для дикого штамма NL4-3, безразмерная величина.
Индекс селективности - отношение ЦК50 к ЭК50 для дикого штамма NL4-3, безразмерная величина.
штамма ВИЧ-1 (WTIIIB) наряду с изоформами, устойчивыми к ННИОТ:
K103N, L100I, V106A, V179D, Y181I и Y188L.
В кинетических исследованиях, ряд производных N,N-ДАБО (180, 185, 189, и 193) показали более низкие константы ассоциации (Kас) и значительно более низкие константы диссоциации (Kдис), чем Ифавиренц и препарат UC781, использованные в качестве стандартов сравнения, работая, как медленные, прочно связывающиеся ингибиторы ревертазы ВИЧ-1. В этой связи, ингибирующая активность новых производных ДАБО оценивалась после 10 минутной преинкубации с ревертазой дикого или мутантного штамма ВИЧ-1.
Из числа изученных производных изоцитозина и 5-метилизоцитозина, только производное 152 в некоторой степени сохраняло умеренную ингибирующую активность в отношении изофермента K103N. В то же время, соединения содержащие две метильные группы: в -положении бензильного фрагмента и в положении С5 фрагмента изоцитозина, в сочетании с N,Nдиметиламино- (180), N-метил-N-алкиламино-группой (185-187), или остатком пиперидина (189) в положении C2 пиримидинового гетероцикла, проявили ингибирующую активность в субмикромолярном диапазоне концентраций, что в 87-37 раз выше, чем у стандартов сравнения - Ифавиренца и Невирапина.
Изофермент L100I ингибировался на субмикромолярном уровне производным цитозина 152 и производными 5-метилизоцитозина 171, 175, 1и 187 содержащими также метильную группу в -положении бензильного фрагмента. В том же исследовании, производное 5-метилизоцитозина 172, наряду с этил-замещенным производным 179, и веществами 180, 184, 185, 188, 192 проявили активность в микромолярном диапазоне концентраций.
В отношении изоферментов V106A и V179D, наблюдался неожиданный уровень активности изученных производных N,N-ДАБО: эти изоферменты оказались гораздо более восприимчивы по отношению к изученным производным, чем ревертаза дикого штамма ВИЧ-1. Например, вещества 146, 159, 172, 173, 176 и 185-187, 189, 194, оказались гораздо активнее в отношении изофермента V106A, чем в отношении ревертазы дикого штамма ВИЧ-1, а вещества 179, 180 и 184, одинаково эффективно подавляли активность двух изоферментов и ревертазы дикого штамма ВИЧ-1. Интересно, что такое поведение в корне отличается от изученных ранее производных S-ДАБО.
Более того, изофермент V179D возникал как следствие мутации ВИЧ-1, вызванной обработкой зараженных колоний клеток производными S-ДАБО в хроническом эксперименте.
В отношении изофермента Y181I, производные ДАБО 152 и 186, наряду со стандартом сравнения - Ифавиренцом, сохраняли ингибирующие свойства в субмикромолярных концентрациях, а вещества 178, 180, 184, 185 и 1проявляли активность в низком микромолярном диапазоне. Ингибирование изофермента Y188L, производным изоцитозина 152, 5-метилизоцитозина 176, и всеми изученными соединениями серии 180-194, за исключением 1достигалось в микромолярном и субмикромолярном диапазоне.
4.5. Среди производных 6-бензилизоцитозина, вещество 187 проявившее высокую активность в отношении ННИОТ-устойчивых изоформ ревертазы ВИЧ-1 [ИД50, мкмоль: 0.03 (WT), 0.17 (K103N), 0.18 (L100I), 0.02 (V106A), 1.26 (Y181I), и 1.43 (Y188L)] проявило и пиковую активность в отношении дикого и мутантных штаммов ВИЧ-1 [EC50, мкмоль: 0.0006 (WT), 0.0(IRLL98), 0.01 (K103N), 0.0006 (Y181C), и 0.03 (Y188L)]. В этой связи, вещество 187 было выбрано в качестве модельного объекта из ряда полученных производных F2-N,N-ДАБО и использовано для проведения кроссдокинговых экспериментов. Для выполнения этих исследований, также, как и в случае производных фенацил-S-ДАБО, был применен программный пакет Autodock, а из Банка Данных Белков (PDB) были взяты комплексы соответствующих ревертаз с ненуклеозидным ингибитором - Невирапином (для производных F2-N,N-ДАБО).
Как следствие того, что продукт 187 является рацемической смесью, для проведения исследований по молекулярному моделированию был взят R изомер данного соединения, как предположительно более активный (по аналогии с описанными ранее производными S-ДАБО и NH-ДАБО).
Экспериментальные 3D-координаты 65 комплексов лигандов с ревертазами ВИЧ-1 (дикого штамма вируса и изоферментами: K103N, Y181C, Y188L, Y188C, V106A, V108I, и L100I) были получены из Research Collaboratory for Structural Bio-informatics (RCSB) и PDB. Для проверки структурной роли перехода от вторичного экзоциклического атома азота изоцитозинового фрагмента, к третичному, кроме выбранного из полученного ряда вещества 187, для молекулярного моделирования использовалось также описанное ранее вещество ряда F2-NH-ДАБО - 5-метил-2-(пропиламино)-6-[1-(2,6дифторфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-он (N-деметилированный аналог вещества 187 - нор-187). Анализ результатов докинга позволил заключить, что производное нор-187 имеет общий тип связывания, как в случае ревертазы дикого, так и мутантных штаммов ВИЧ-1: Y181C, Y188C, и L100I, сходный, с описанным ранее для других производных F2-NH-ДАБО для ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 и ее изофермента Y181C:
A B C D Рис. 10. Конформации веществ нор-187 и 187 в связи с ревертазами ВИЧ-1:
А - нор-187 в связи с ревертазой дикого штамма ВИЧ-1 (углеродный скелет голубого цвета), изоферментами: L100I (оранжевый), Y181C (красный), Y188C (зеленый);
В - нор-187 в связи с изоферментами: V106A (углеродный скелет голубого цвета), Y188L (бледно-пурпурный), K103N (бирюзовый).
C - 187 в связи с ревертазой дикого штамма ВИЧ-1 (углеродный скелет голубого цвета), изоферментами: L100I (оранжевый), Y181C (красный), Y188C (зеленый);
D - 187 в связи с изоферментами: V106A (углеродный скелет голубого цвета), Y188L (бледно-пурпурный), K103N (бирюзовый).
Эти наблюдения подтвердили, что введение дополнительной якорной точки в молекулу S-ДАБО и переход к NH-ДАБО является важным элементом модификации структуры как в отношении изофермента Y181C, так и изоферментов Y188C и L100I. Принимая во внимание модель связывания вещества нор-187 с изоферментами V106A, Y188L, и K103N, связанные конформации показывают различные варианты расположения лиганда в соответствующем участке связывания.
O O Ревертаза Me Me HN HN Me Me Me Me NH N N N F F Me F F Дикий штамм K103N L100I V106A Y181C Y188C Y188L Рис. 11. Расчетные конформации веществ 187 и нор-187 в комплексе с ревертазой дикого штамма ВИЧ-1 и ее изоферментами.
Этот факт отражает то, что для таких мутаций, введенная якорная точка F2-NH-ДАБО более не будет конфликтовать с вариациями геометрии аллостерического участка связывания ревертазы, вне зависимости от типа мутации (см. выше).
Интересно, что кросс-докинговые исследования вещества 187 не выявили ни единого общего типа связывания с нор-187 из семи изученных вариантов связанных конформаций. Более адаптивное поведение вещества 1напоминает похожее явление, описанное ранее для экспериментальных конформаций этравирина и его аналогов. В проведенных кросс-докинговых исследованиях, вещество 187, в сравнении с нор-187, имеет более высокий уровень конформности по отношению к аллостерическому участку связывания ревертазы. Это явление основано на комбинации конформационных подгонок ("ерзанье и извивание") в сочетании с вращательными и поступательными движениями ("покачивание и тряска") ингибитора в кармане связывания.
Жесткая суперпозиция связанных конформаций веществ нор-187 и 1предполагает, что конформационные вариации в ряду производных F2-N,NДАБО являются, в значительной степени, следствием изменения углов вращения диалкиламиногруппы и связи атома азота и пропильного радикала, так как углы вращения фенильного и бензильного радикалов заданы заранее за счет внутренней энергии (рис. 12).
Рис. 12. Жесткая суперпозиция связанных конформаций нор-187 (слева) и 1(справа).
Более того, компактные структуры веществ нор-187 и 187 также открывают возможности для вращательных и поступательных движений в пределах кармана связывания фермента. Очевидно, производные F2-N,N-ДАБО могут изменять конформацию (извиваться), а также - давать нужную ориентацию и репозиционировать (покачиваться и трястись) в ответ на изменение конфигурации участка связывания фермента, вызванного мутациями. Такая адаптивность помогает объяснить высокую активность этих веществ в отношении ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 и ее изоформ.
Глава 5. Экспериментальная часть. Содержит подробное описание методов синтеза (Раздел 5.1.), изучения биологической активности (Раздел 5.2.) и докинговых исследований (Раздел 5.3.) новых производных 6бензилпиримидин-4(3Н)-она.
Основные выводы 1. На основании изучения взаимосвязи химической структуры и противовирусной активности в ряду производных ДАБО были теоретически спрогонозированы структуры и осуществлен химический синтез двух новых высокоактивных ингибиторов репликации ВИЧ-1: 5-метил-2[метил(пропил)амино]-6-[(2,6-дифторфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-она и 5метил-2-[изопропил(метил)амино]-6-[(2,6-дифторфенил)этил]пиримидин4(3Н)-она, подавляющих репликацию дикого штамма вируса в пикомолярном диапазоне концентраций и обладающих выгодным профилем резистентности в отношении клинически значимых (в том числе - полирезистентных) штаммов ВИЧ-1, таким образом, являющихся подлинными ННИОТ второго поколения.
2. Впервые выявленные и обоснованные закономерности взаимосвязи химическая структура-противовирусная активность в ряду исследованных веществ открывают возможности для дальнейшей оптимизации химической структуры соединений-лидеров и получения еще более активных и менее токсичных анти-ВИЧ-1 агентов широкого спектра действия.
3. Впервые разработаны и запатентованы оригинальные и эффективные способы получения целевых веществ и полупродуктов их синтеза, пригодные для масштабного промышленного производства указанных субстанций.
4. Впервые разработан, получен и подвергнут биологическим исследованиям ряд новых 2-замещенных производных 6-бензилпиримидин4(3Н)-она, содержащих/не содержащих небольшие алкильные фрагменты в положении 5 пиримидинового гетероцикла и -положении бензильного радикала. Противовирусная активность и цитотоксичность этих веществ исследована на ВИЧ-инфицированных клетках лимфоидной ткани в остром эксперименте. Энзиматические исследования выполнены с использованием рекомбинантных ревертаз дикого и клинически значимых мутантных штаммов ВИЧ.
5. На основании данных клеточных исследований показано, что все изученные соединения обладают выраженной противовирусной активностью в наномолярном - пикомолярном диапазоне концентраций, причем большинство из них существенно превосходят по своей активности стандарт сравнения - Невирапин. Полученные соединения, также, являются менее цитотоксичными, чем Невирапин.
6. В результате энзиматических исследований установлено, что синтезированные производные пиримидина эффективно подавляют активность ревертазы дикого штамма ВИЧ-1, а многие из полученных веществ, также угнетают активность ревертаз клинически значимых мутантных штаммов ВИЧ.
7. Проведенные исследования позволили выявить ряд закономерностей химическая структура - противовирусная активность, главными из которых являются следующие:
Эссенциальными дескрипторами для проявления выраженной анти-ВИЧ активности являются пептидная группировка, включающая атомы N3 и Cпиримидинонового фрагмента, бензильный (или биоизостерический ему) радикал в положении С6 пиримидинового гетроцикла, наряду с алкилированным экзоциклическим гетероатомом в положении С2 пиримидин4(3Н)-ового фрагмента.
Модуляторами (эффекторами) анти-ВИЧ активности являются характер замещения ароматического ядра арилметильного фрагмента, характер замещения экзоциклического гетероатома в положении С2 пиримидин-4(3Н)оновой системы, наличие/отсутствие и природа алкильных групп в положении С5 пиримидинонового фрагмента и альфа-положении бензильного радикала.
8. В кинетических исследованиях полученных производных впервые показано, что в отличие от Ифавиренца, они проявляют более низкие константы ассоциации (Kас) и значительно более низкие константы диссоциации (Kдис) комплексов фермент-субстрат, работая, как медленные, прочно связывающиеся ингибиторы ревертазы ВИЧ-1.
9. Выполненные исследования по молекулярному докингу указанных производных, позволили объяснить уникальный профиль вирусингибирующей активности этих веществ, с позиции модели индуцированного соответствия.
10. Показано, что эффективное лигирование ревертазы обозначенными соединениями достигается за счет комбинации конформационных подгонок, являющейся функцией компактных структур этих молекул. Таким образом, они обладают способностью изменять конформацию (лизвиваться), а также - давать нужную ориентацию и репозиционировать (лпокачиваться и трястись) в ответ на изменение конфигурации участка связывания фермента, вызванного мутациями. Такая адаптивность помогает объяснить высокую активность этих веществ в отношении ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 и ее изоформ.
11. Впервые полученные и охарактеризованные производные 6бензилизоцитозина: 5-метил-2-[метил(пропил)амино]-6-[(2,6дифторфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-он и 5-метил-2[изопропил(метил)амино]-6-[(2,6-дифторфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-он рекомендуются для прохождения дальнейших доклинических и клинических исследований, в качестве эффективных средств этиотропной терапии ВИЧинфекции.
Список опубликованных работ Публикации в журналах:
1. Синтез и биологическая активность новых производных 6-бензилизоцитозина:
ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы / В.Т. Валуев-Эллистон, А.В.
Иванов, Б.С. Орлинсон, Е.Н. Герасимов, Л.Л. Брунилина, С.Н. Кочетков, И.А.
Новаков, М.Б. Навроцкий // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46, №4.
Ц С. 101-105.
2. 2-(Alkyl/Aryl)Amino-6-Benzylpyrimidin-4(3H)-ones as Inhibitors of Wild-Type and Mutant HIV-1: Enantioselectivity Studies / D. Rotili, A. Samuele, D. Tarantino, R. Ragno, I. Musmuca, F. Ballante, G. Botta, L. Morera, M. Pierini, R. Cirilli, M.B. Nawrozkij, E.
Gonzalez, B. Clotet, M. Artico, J.A. Est, G. Maga, A. Mai // Journal of Medicinal Chemistry. - 2012. - Vol. 55, №7. - C. 3558-3562. - Англ.
3. Одноклассовый подход: модели для виртуального скрининга ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 на основе концепции непрерывных молекулярных полей / П. В. Карпов, И. И. Баскин, Н. И. Жохова, М. Б. Навроцкий, А. Н. Зефиров, А. С. Яблоков, И. А. Новаков, Н. С. Зефиров // Известия РАН, Серия Химическая. - 2011. - №11. - С. 2371-2377.
4. Diarylpyrimidine-Dihydrobenzyloxopyrimidine Hybrids: New, Wide-Spectrum Anti-HIV1 Agents Active at (Sub)-Nanomolar Level / D. Rotili, D. Tarantino, M. Artico, M.B.
Nawrozkij, E. Gonzalez-Ortega, B. Clotet, A. Samuele, J.A. Est, G. Maga, A. Mai // Journal of Medicinal Chemistry. - 2011. - Vol. 54, № 8. - C. 3091-3096.- Англ.
5. Усовершенствованный синтез N-(3-фенилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-N-этиламина гидрохлорида (фенкамфамина) / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В. Брунилин, М.Б.
Навроцкий, А.С. Еремийчук, С.А. Думлер, Е.А. Гордеева // Химикофармацевтический журнал. - 2011. - Т. 45, № 7. - C. 41-43.
6. Взаимодействие 5-метил-6-(2-тиенилметил)-2-тиоксо-2,3-дигидропиримидин-4(1Н)она с и -хлоралкилсульфидами / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий, Л.Л. Брунилина, Е.Н. Герасимов // Журнал органической химии. - 2011. - Т. 47, вып.
2. - C. 318-320.
7. Синтез новых производных 5-алкил-6-(2,6-дигалогенбензил)-2(метилсульфанил)пиримидин-4(3Н)-она и особенности их окисления / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий, А.С. Еремийчук, Л.Л. Брунилина, Е.А. Гордеева, Е.Н. Герасимов // Журнал органической химии. - 2010. - Т. 46, вып. 11. - C. 16841687.
8. О специфике взаимодействия производных 2-тиоксо-2,3-дигидропиримидин-4(1Н)она с иодметаном и алкил(хлорметил)сульфидами / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий, А. Маи, М. Артико, Д. Ротили, А.С. Еремийчук, Е.А. Гордеева, Л.Л.
Брунилина, Х. Эсте // Химия гетероциклических соединений. - 2010. - № 2. - C. 248254.
9. Направленный стереоселективный синтез 2-замещённых производных 6-[1-(2,6дифторфенил)этил]-5-метилпиримидин-4(3Н)-она / A. Mai, M. Artico, D. Rotili, И.А.
Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий, А.С. Еремийчук, Е.А. Гордеева // Журнал органической химии. - 2009. - Т. 45, вып. 10. - C. 1546-1549.
10. Взаимодействие 6-бензил-5-метил-2-(метилсульфанил)пиримидин-4(3Н)-она с жирно-ароматическими аминами / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, A. Mai, M. Artico, D. Rotili, М.Б. Навроцкий, Е.А. Гордеева, Е.Н. Савельев // Журнал органической химии. - 2009. - Т. 45, вып. 5. - C. 786-789.
11. Новаков, И.А. Синтез новых производных 6-(1-адамантилметил)-4(3Н)пиримидинона / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий // Журнал органической химии. - 2009. - Т. 45, вып. 2. - C. 325-326.
12. Эффективный твердофазный синтез производных изоцитозина / И.А. Новаков, Б.С.
Орлинсон, Р.В. Брунилин, М.Б. Навроцкий, Е.А. Гордеева, Е.Н. Савельев, Е.Н.
Герасимов // Химия гетероциклических соединений / Латвийский ин-т орг. синтеза. - 2009. - № 11. - C. 1697-1701.
13. Синтез бициклических диаминов - перспективных мономеров для полиимидов / И.А.
Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В. Брунилин, М.Б. Навроцкий, Е.А. Потаенкова, С.А.
Гуцол // Изв. ВолгГТУ. Серия "Химия и технология элементоорганических мономеров и полимерных материалов". Вып. 6 : межвуз. сб. науч. ст. / ВолгГТУ. - Волгоград, 2009. - № 2. - C. 43-46.
14. 5-Alkyl-6-benzyl-2-(2-oxo-phenylethylsulfanyl)pyrimidin-4(3H)-ones, a Series of AntiHIV-1-Agents of the Dihydro-alkoxy-benzyl-oxopyrimidine Family with Peculiar Structure - Activity Relationship Profile / M.B. Nawrozkij, D. Rotili, D. Tarantino, G.
Botta, A. S. Eremiychuk, I. Musmuca, R. Ragno, A. Samuele, S. Zanoli, M. ArmandUg n, I. Clotet-Codina, I.A. Novakov, B.S. Orlinson, G. Maga, J. A. Est, M. Artico, A.
Mai // Journal of Medicinal Chemistry. - 2008. - Vol. 51, № 15. - C. 4641-4652.- Англ.
15. Исследование взаимодействия синглетного дифторкарбена с производными 6метилпиримидин-4(3Н)-она / А.И. Рахимов, И.Ю. Каменева, М.Б. Навроцкий, Е.С.
Титова, С.В. Кудашев // Журнал общей химии. - 2008. - Т. 78, вып. 5. - C. 828-829.
16. Synthesis and Biological Properties of Novel 2-Aminopyrimidin-4(3H)-ones Highly Potent against HIV-1 Mutant Strains / A. Mai, M. Artico, D. Rotili, D. Tarantino, I. ClotetCodina, M. Armand-Ug n, R. Ragno, S. Simeoni, G. Sbardella, M.B. Nawrozkij, A.
Samuele, G. Maga, J.A. Est // Journal of Medicinal Chemistry. - 2007. - Vol. 50, No. 22. - C. 5412-5424.- Англ.
17. Синтез новых N2-адамантилпроизводных 2-амино-6-метил-4(3Н)-пиримидинона - потенциальных активаторов выработки фактора некроза опухоли / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В. Брунилин, М.Б. Навроцкий, Е.Н. Савельев, Г.А. Новикова // Химия гетероциклических соединений. - 2006. - №10. - C. 1541-1544.
18. Новаков, И.А. Особенности реакции галогенирования 2-замещенных 6-бензгидрил4(3Н)-пиримидинонов / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий // Химия гетероциклических соединений. - 2006. - №9. - C. 1418-1420.
19. Синтез и исследование новых 2-[(1-адамантил)алкил]амино-6-метил-4(3Н)пиримидинонов - перспективных иммуномодулирующих агентов / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий, Е.Н. Савельев // Изв. ВолгГТУ. Сер. Химия и технология элементоорганических мономеров и полимерных материалов: межвуз.
сб. науч. статей / ВолгГТУ. - Волгоград, 2005. - Вып.2, №1. - C. 17-19.
20. Новаков, И.А. Десульфуризация 2-тиоксо-2,3-дигидро-4(1Н)-пиримидинонов оксиранами и 2-галогенацетонитрилами / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б.
Навроцкий // Журнал органической химии / РАН. - 2005. - Т.41, вып. 4. - C. 617-619.
21. Новаков, И.А. Об особенностях протекания реакции галогенирования 6-бензгидрил4(3Н)-пиримидинонов / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий // Изв.
ВолгГТУ. Сер. Химия и технология элементоорганических мономеров и полимерных материалов: межвуз. сб. науч. статей / ВолгГТУ. - Волгоград, 2005. - Вып.2, №1. - C. 19-21.
22. Навроцкий, М.Б. Синтез и анти-ВИЧ-1 активность новых производных 2-[(2фталимидоэтил)тио]-4(3Н)-пиримидинона / М.Б. Навроцкий // Химикофармацевтический журнал. - 2005. - Т. 39, № 9. - C. 16-17.
23. Навроцкий, М.Б. Синтез и анти-ВИЧ-1 активность новых производных 6(арилметил)-2-[(циклогексилметил)тио]-4(3Н)-пиримидинона и 6-(арилметил)-2{[(метилтио)метил]тио}-4(3H)-пиримидинона / М.Б. Навроцкий // Химикофармацевтический журнал. - 2004. - Т. 38, № 9. - C. 16-18.
24. Исследование взаимодействия 1-нитро-2-(3-нитрофенил)этена и 1-нитро-2-(4нитрофенил)этена с циклопентадиеном / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В.
Брунилин, М.Б. Навроцкий, Е.А. Потаенкова // Изв. ВолгГТУ. Сер. Химия и технология элементоорганических мономеров и полимерных материалов: Межвуз.
сборник науч. статей / ВолгГТУ. - Волгоград, 2004. - Вып.1, №2. - C. 41-44.
25. Исследование взаимодействия п- и м-нитробензальдегида с нитрометаном / И.А.
Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В. Брунилин, М.Б. Навроцкий, Е.А. Потаенкова // Изв.
ВолгГТУ. Сер. Химия и технология элементоорганических мономеров и полимерных материалов: Межвуз. сборник науч. статей / ВолгГТУ. - Волгоград, 2004. - Вып.1, №2. - C. 44-48.
26. Навроцкий, М.Б. Синтез, противовирусная и цитотоксическая активность 2(алкилтио)-6-бензгидрил-4(3Н)-пиримидинонов / М.Б. Навроцкий // Химикофармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 9. - C. 22-24.
Патенты 1. Пат. 2435758 Российская Федерация, МПК C 07 D 213/79. Способ получения этилового эфира 3-оксо-3-(2,6-дихлорпиридин-3-ил)пропановой кислоты / И.А.
Новаков, Б.С. Орлинсон, Е.Н. Герасимов, А.С. Яблоков, Е.А. Шинкаренко; ВолгГТУ.
- 2011.
2. Пат. 2412154 Российская Федерация, МПК 7 С 07 С 69/738, 69/716, 67/32, 67/24.
Способ получения этиловых эфиров 2-алкил-4-арил-3-оксобутановых кислот / И.А.
Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий, Л.Л. Брунилина; ВолгГТУ. - 2011.
3. Пат. 2405766 Российская Федерация, МПК С 07 С 209/34, 211/41, B 01 J 25/00.
Способ получения производных 2-(аминометил)-3-фенилбицикло[2.2.1]гептана / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В. Брунилин, Е.А. Потаенкова, Е.Н. Савельев, М.Б.
Навроцкий, С.А. Гуцол; ВолгГТУ. - 2010.
4. Пат. 2334740 Российская Федерация, МПК С 07 D 213/30. Способ получения рацемата 1-(2-пиперидил)-1,2-этандиола / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В.
Брунилин, М.Б. Навроцкий, А.С. Еремийчук, Е.А. Гордеева; ВолгГТУ. - 2008.
5. Пат. 2307826 Российская Федерация, МПК С 07 С 209/34, 211/41, B 01 J 25/00.
Способ получения N-(3-фенил-2-норкамфанил)-N-этиламина гидрохлорида / И.А.
Новаков, Б.С. Орлинсон, Р.В. Брунилин, М.Б. Навроцкий, А.С. Еремийчук; ВолгГТУ.
- 2007.
6. Пат. 2254328 Российская Федерация, МПК 7 С 07 С 69/738, 69/716, 67/32, 67/Способ получения 4-замещенных алкил 3-оксобутаноатов / И.А. Новаков, Б.С.
Орлинсон, М.Б. Навроцкий; ВолгГТУ. - 2005.
7. Пат.2247720 Российская Федерация, МПК 7 С 07 D 213/30 Способ получения 1-(2пиридил)-1,2-этандиола / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий; ВолгГТУ. - 2005.
8. Пат.2238269 Российская Федерация, МПК 7 С 07 D 239/56 Способ получения 6замещенных 2-(алкилсульфанил)-4(3Н)-пиримидинонов / И.А. Новаков, Б.С.
Орлинсон, М.Б. Навроцкий; ВолгГТУ. - 2004.
9. Пат.2212406 Российская Федерация, МПК 7 С 07 D 239/54 Способ получения 6замещенных урацилов / И.А. Новаков, Б.С. Орлинсон, М.Б. Навроцкий; ВолгГТУ. - 2003.