ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ И МОДЕЛИРОВАНИЕ МУТАЦИЙ, ОБЛЕГЧАЮЩИХ РЕНАТУРАЦИЮ И ПОВЫШАЮЩИХ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТА 03.00.02 - Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва - 2006 Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ) Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Долгих Дмитрий Александрович кандидат биологических наук Гаспарян Марине Эдуардовна Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Ефремов Роман Гербертович доцент доктор физико-математических наук Бычкова Валентина Егоровна Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ Защита состоится 20 декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, тел.: (495) 408-57-00, 408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан л17 ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент Брагин В.Е.

2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Энтеропептидаза - ключевой фермент пищеварения млекопитающих. Она управляет каскадом пищеварительных ферментов, превращая трипсиноген в трипсин, который, в свою очередь, активирует другие зимогены, а также сам активно участвует непосредственно в протеолизе белковой пищи. Благодаря крайне редко встречающейся в других белках последовательности сайта узнавания (-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-) энтеропептидаза является широко используемым в биотехнологии инструментом для получения рекомбинантных гибридных белков, которые она расщепляет в этом сайте. Тем не менее, нередко наблюдаются случаи сниженной ферментативной активности энтеропептидазы по отношению к определенным гибридным белкам, а также потеря целевого продукта в результате неспецифического гидролиза.

В связи с этим важно оценить в полной мере специфичность энтеропептидазы. В последние годы подобная работа проделана в отношении десятков ферментов. Для многих из них определена специфичность по отношению не только к остатку, идущему непосредственно перед разрезаемой связью (Р1), но и к более удаленным остаткам, как с N-конца сайта узнавания (Р2-Рn), так и с С-конца (Р1Т-PnТ). Для подобного исследования необходим многосторонний подход к изучению специфичности фермента, включая использование широких наборов или библиотек пептидных субстратов, а также исследование неспецифического гидролиза различных белков.

Не менее важной проблемой является понимание роли дистальных по отношению к разрезаемой связи аминокислотных остатков в ферментативном катализе. Считается, что их связывание с субстратом может понижать барьер реакции ферментативного расщепления путем передачи энергии по сети водородных связей. Кроме того, предполагается, что взаимодействия дистальных остатков с сайтами связывания протеиназы может влиять на внутренние движения фермента и субстрата, необходимые для осуществления некоторых этапов протеолитической реакции. Для проверки этого предположения необходимо накопление большого объема данных по подобным взаимодействиям, включая каталитические константы, энергетику процесса и молекулярную динамику взаимодействия фермент-субстрат.

Для полноценного исследования рекомбинантных белков очень важно наличие эффективных систем экспрессии, позволяющих нарабатывать белки в значительных количествах. В случае энтеропептидазы потребности современной науки довольно широки: помимо интереса ее изучения как важного элемента физиологии человека, энтеропептидаза стала важным инструментом биотехнологии, где используется для расщепления рекомбинантных гибридных белков. В связи со значительной трудностью получения в E. coli правильно сложенного белка с несколькими дисульфидными связями в цитоплазме, периплазме или секретированного в культуральную среду, часто используют такие условия экспрессии, при которых происходит агрегация белка и образование телец включения. В этом случае для получения правильно сложенного белка производят его ренатурацию из телец включения. Разработка и оптимизация процедуры ренатурации важна не только для получения конкретного белка, но и для выявления элементов структуры, важных для фолдинга родственных белков.

Цели исследования.

Целью данной диссертационной работы является получение рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека, исследование ее ферментативных и физико-химических свойств, моделирование структурных изменений, облегчающих ее ренатурацию, и исследование структурных элементов, ответственных за специфичность фермента при расщеплении пептидных субстратов.

Задачи исследования.

1) Получить эффективную экспрессионную конструкцию для продукции рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP) в виде гибридного белка с тиоредоксином в E. coli и оптимизировать процедуру экспрессии.

2) Разработать и оптимизировать методики очистки и ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP и очистки целевого белка L-HEP.

3) Охарактеризовать ферментативные свойства полученного препарата энтеропептидазы по гидролизу специфических и неспецифических пептидных субстратов, а также гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы. Исследовать устойчивость препарата к денатурирующим агентам (детергенты, высокие концентрации солей, повышенная температура, кислые и щелочные рН и пр.).

4) С помощью методов молекулярного моделирования исследовать структуру LHEP на возможность введения мутаций для улучшения выхода ренатурации и повышения специфичности фермента.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Все результаты, представленные в диссертационной работе, получены впервые, что следует из сравнения с отечественными и зарубежными публикациями.

1. Впервые осуществлена экспрессия каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP) в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры.

3. Впервые охарактеризована ферментативная активность каталитической субъединицы энтеропептидазы человека. Показано преимущество фермента человека по сравнению с ферментом быка при гидролизе рекомбинантных гибридных белков.

4. Показана высокая устойчивость ферментативной активности L-HEP к действию денатурирующих агентов, таких как детергенты, повышенная температура, отличная от физиологической кислотность буфера и восстанавливающие агенты.

Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсинподобных сериновых протеиназ.

5. Показано, что высокие концентрации NaCl и CaCl2 ингибируют расщепление специфических субстратов L-HEP, при этом не влияя на скорость гидролиза неспецифических субстратов.

6. Построена пространственная модель L-HEP. Проведено молекулярное моделирование замещения цистеинов в положениях 122, 136 и 201 с целью получения фермента с более высоким выходом ренатурации. Получен мутантный вариант L-HEP/C122S, выход ренатурации которого в 4 раза выше, чем у дикого типа. Показано, что ферментативные свойства L-HEP и L-HEP/C122S практически не отличаются.

7. Показана вторичная специфичность L-HEP к хромогенным субстратам и белкам с ароматическими и большими гидрофобными остатками в положении Р2.

8. Впервые выявлены различия ферментативных свойств каталитических субъединиц энтеропептидаз человека и быка.

9. С помощью методов молекулярного моделирования определено, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 ответственны за различие ферментативных свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Получены мутантные варианты L-HEP с заменой остатков в этих позициях на соответствующие остатки каталитической субъединицы энтеропептидазы быка (L-BEP). Показано, что остатки 96 и 219 влияют на константы связывания различных субстратов и частично определяют специфичность энтеропептидазы.

Разработанная методика получения рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека позволяет не только облегчить дальнейшие исследования этого белка, но и более широко использовать технологию получения рекомбинантных белков в составе гибридов с белком-носителем.

Апробация результатов работы.

Основные материалы, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на семинарах Лаборатории инженерии белка (ИБХ РАН), были представлены на международных конференциях, таких как Международный конгресс Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина (Москва, 2002), 15-ая зимняя молодежная научная школа Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (Москва, 2003), FEBS Форум для молодых ученых при 29-м конгрессе FEBS (Варшава, 2004), 30-й Конгресс FEBS Мир белка (Будапешт, 2005), 18-ая зимняя молодежная научная школа Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 2), материалов и методов (глава 3), результатов и обсуждения (глава 4), выводов и списка литературы.

Работы изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков, таблиц. Список литературы включает 125 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Синтез гена L-HEP, его клонирование в плазмидные вектора и подбор экспрессионной системы.

Для получения последовательности ДНК, кодирующей легкую цепь энтеропептидазы человека (L-HEP), аминокислотные остатки 801-1035 (16-243 в нумерации химотрипсина), были синтезированы из 26 перекрывающихся на концах олигонуклеотидов. Для улучшения экспрессии в гене были заменены плохоэкспрессируемые в E. coli кодоны (согласно таблице встречаемости кодонов в геноме E. coli). Все олигонуклеотиды имели по 12-14 перекрывающихся нуклеотидов на Рисунок 1. Экспрессия и очистка L-HEP. Гибридный белок Trx/L-HEP экспрессировали в штамме Escherichia coli BL21(DE3), содержащем плазмиду pET-32a/L-HEP, и анализировали с помощью 12%-ного трис-трицинового ДСН-электрофореза в ПААГ. Дорожка 1, маркер молекулярного веса;

дорожка 2, клеточный лизат до индукции. Дорожки 3-5 представляют постиндукционные фракции белков; дорожка 3, клеточный лизат и дорожки 4-5, растворимая и нерастворимая фракции, соответственно. Дорожка 6, автокаталитическое расщепление Trx/L-HEP после ренатурации нерастворимой фракции. Дорожка 7, L-HEP, очищенная на СИТ-агарозе.

обоих концах. Первый олигонуклеотид дополнительно кодировал сайт узнавания энтеропептидазы и сайт рестрикции Bgl II на 5Т-конце. К последнему олигонуклеотиду добавляли сайт рестрикции Hind III на 5Т-конце. Собранный с помощью полимеразной цепной реакции ген был клонирован в вектор pET-32a по рестрикционным сайтам Bgl II и Hind III. Данный вектор предназначен для продукции в E. coli гибридных белков с тиоредоксином на N-конце, целевым белком на С-конце и соединяющим их линкером, содержащим сайт узнавания энтеропептидазы (непосредственно перед целевым белком), а также два сайта для аффинной очистки: полигистидиновый и S-tag.

Полученной плазмидной ДНК pET-32/L-HEP трансформировали компетентные клетки E. coli XL-1 Blue для секвенирования последовательности и наработки плазмидной ДНК для дальнейшей экспрессии. Подбор штамма для экспрессии гибридного белка показал, что наилучшим образом для этой цели подходит штамм E.

coli BL21 (DE3), в котором экспрессия протекает под контролем Т7/lac-оперона. После проведения оптимизации условий экспрессии (подбор культуральной среды, температуры роста, концентрации индуктора IPTG) был достигнут очень высокий уровень экспрессии:

более 1 г гибридного белка Trx/L-HEP с 1 литра культуры (рис.1, дорожка 3).

Ренатурация гибридного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP.

Наработанный бактериями гибридный белок Trx/L-HEP на 80% находился в составе телец включения (рисунок 1, дорожка 5). Тельца включения после процедуры отмывки содержали на 95% экспрессированный целевой белок. Очищенный из растворимой фракции гибридный белок Trx/L-HEP не расщеплялся автокаталитически и не проявлял активности даже после расщепления экзогенной энтеропептидазой (для чего использовался препарат каталитической субъединицы энтеропептидазы быка производства фирмы New England Biolabs). Активный фермент был получен с помощью ренатурации гибридного белка Trx/L-HEP из телец включения, после их солюбилизации в 6 М гуанидин-гидрохлориде. Для образования правильных дисульфидных связей была применена система буферов, содержащих пару окисленный/восстановленный глутатион.

Процедура ренатурации состояла из нескольких этапов. Сначала белок для полного восстановления цистеинов переводили в буфер с низким рН и пониженной концентрацией гуанидина (3 М). Затем в раствор добавляли окисленный глутатион для дисульфидного обмена с восстановленными SH-группами белка. На следующем этапе с помощью диализа избавлялись от избытка окисленного глутатиона и одновременно делали рН близким к физиологическому. Окончательный фолдинг белка проходил в буфере на основе аргинина, который параллельно ингибировал появляющуюся ферментативную активность. Кроме того, в буфере содержался восстановленный глутатион, способствующий дисульфидному обмену между полуцистин-глутатионами и образованию нативных дисульфидных связей.

После ренатурации гибридного белка от него автокаталитически отщеплялась LHEP - в процессе диализа белка против буфера, содержащего 50 мМ трис-гидрохлорид, рН 8.0, и 1 мМ CaCl2, в течение 3 ч. Активный фермент был очищен с помощью аффинной хроматографии на агарозе, конъюгированной с соевым ингибитором трипсина (СИТ) (рис.1, дорожка 7). Количество белка было определено по поглощению на длине волны 280 нм. Выход продукта (отношение количества чистого активного белка к количеству гибридного белка, взятому для ренатурации) до оптимизации ренатурации составил 1%.