На правах рукописи

НОВОЖИЛОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ПРИ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2007 2

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета ГОУ ВПО Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАЕ Киселева Руфина Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Башкатов Сергей Александрович доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Самарский государственный университет

Защита диссертации состоится л ноября 2007 г. в часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан л октября 2007 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Бронхолегочные заболевания представляют собой одну из проблем медицины и биологии в целом, несмотря на значительные исследования в этой области. Изучение механизмов, способствующих развитию острых и хронических воспалительных заболеваний легких, изыскание новых подходов к терапии и профилактике этих состояний продолжает оставаться актуальным в связи с широкой распространенностью данной патологии.

Бронхолегочные заболевания сопровождаются развитием дистрофических процессов не только в тканях легких, но и в форменных элементах крови, в частности нейтрофильных гранулоцитах. Нейтрофилы привлекаются в легкое лишь в случае воспалительной реакции, для которой характерны гипоксия и ацидоз (Kiang et al., 2006). Нейтрофилы и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участников воспаления (Butterfield et al., 2006). Они играют ключевую роль в защите организма, поглощая и разрушая чужеродные клетки и бактерии. При патологических состояниях функции этих клеток усиливаются. При этом происходит интенсивное генерирование и высвобождение медиаторов воспаления в межклеточное пространство.

Немедленная адаптация, свойственная нейтрофилам, осуществляется путем модуляции активности уже имеющихся в клетке ферментов. Существенную роль в воспалении играют дегидрогеназы, участвующие как в процессах обмена веществ, так и превращений энергии. Метаболизм клетки включает множество разветвленных ферментативных реакций, которые формируют отдельные циклы: гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и т.д. Накопление лактатдегидрогеназы при бронхолегочных заболеваниях приводит к гипоксии, характеризующейся накоплением эндотоксинов мембранотропного действия, снижением активности сукцинатдегидрогеназы и показателей фагоцитоза.

егочная патология связана с увеличением в крови продуктов эндоинтоксикации, обусловленных метаболическими нарушениями на клеточном уровне.

Одним из звеньев механизма развития эндогенной интоксикации является ги поксия, вызванная нарушением тонуса периферических сосудов, реологических механизмов, кинетических и механических свойств форменных элементов крови. Эндогенная интоксикация усиливается при накоплении загруженного токсинами альбумина. Снижение функций органов естественной детоксикации, антиоксидантной системы и естественной резистентности при синдроме эндогенной интоксикации усугубляет его течение (Добротина и др., 2004).

Эндотоксикоз при инфекционных заболеваниях обусловлен действием токсинов бактериального происхождения и влиянием активных эндогенных аминов, освобождающихся из поврежденных клеток и тканей. Участие гистамина и серотонина в патогенезе бронхиальной астмы является общепризнанным (Федосеев и др., 1992; Алехин и др., 1998; Khokhlov et al., 2005; Samb et al., 2006; Chhabra et al., 2007).

Проблема возникновения и развития эндогенной интоксикации занимает одну из ведущих позиций в структуре исследований воспалительных заболеваний. При эндотоксикозе накапливается большое количество промежуточных и конечных продуктов обмена, которые оказывают деструктивное действие на важнейшие системы организма. В клинике содержание продуктов эндотоксикоза не определяется. Но по этим показателям можно не только оценить состояние здоровья, но и уловить начальные проявления заболевания, прогнозировать течение процесса и ориентироваться в эффективности проводимых лечебных мероприятий. Своевременное и регулярное определение показателей эндотоксикоза в крови позволяет контролировать состояние организма человека как в норме, так и при патологии.

В связи с этим, исследование влияния эндогенной интоксикации на дегидрогеназы нейтрофилов, динамики изменения уровня биогенных аминов, а также состояния детоксикационных систем организма при бронхолегочных заболеваниях представляет значительный интерес для пульмонологии. Представляется актуальным разностороннее исследование биохимических показателей крови при разных бронхолегочных заболеваниях для выработки целенаправленного подхода к коррекции нарушенных функций организма.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - комплексное изучение биохимических показателей крови больных и роли эндогенной интоксикации в формировании бронхолегочной патологии.

Исходя из поставленной цели исследования, были определены следующие задачи:

1. Определить взаимосвязь между активностью дегидрогеназ нейтрофилов и содержанием эндотоксинов крови при различных бронхолегочных заболеваниях.

2. Выявить роль эндотоксинов мембранотропного действия в формировании воспаления при бронхолегочной патологии.

3. Оценить детоксикационную возможность организма.

4. Определить концентрацию биогенных аминов - гистамина и серотонина в крови и плазме больных бронхолегочными заболеваниями и выявить их роль в развитии эндогенной интоксикации.

5. Охарактеризовать фагоцитарную активность нейтрофилов у больных бронхолегочными заболеваниями.

Научная новизна. Впервые определена активность лактатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы нейтрофилов у больных бронхолегочными заболеваниями в стадии обострения и ремиссии. Впервые выявлена корреляционная зависимость между активностью дегидрогеназ нейтрофилов и накоплением эндотоксинов у больных бронхолегочными заболеваниями. Показано, что эндотоксины мембранотропного действия вносят вклад в формирование хронизации при бронхолегочных заболеваниях. Впервые с помощью корреляционного анализа выявлено отсутствие зависимости между показателями фагоцитоза и уровнем мембранотропных эндотоксинов крови при различных формах бронхолегочной патологии.

Научно-практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют представления об интегральных показателях эндотоксикоза и биогенных аминах, которые являются критериями объективной оценки состояния больных бронхолегочными заболеваниями, а также о роли НАД- и ФАД-зависимых де гидрогеназ нейтрофилов, связанных с биоэнергетикой клетки. Результаты исследований необходимы для выяснения вклада мембранотропных эндотоксинов в развитие патологии бронхолегочной системы. В условиях клиники эти показатели не определяются. Но это целесообразно учитывать в практической медицине при назначении лекарственных препаратов. Полученные данные могут быть положены в основу разработки объективных диагностических критериев фазы и течения бронхолегочных заболеваний. Отсутствие полной нормализации показателей в стадии ремиссии необходимо учитывать при проведении комплексной терапии и реабилитационных мероприятий.

Использование комплексной оценки биохимических показателей крови позволяет использовать данные показатели как в диагностике бронхолегочных заболеваний (при оценке степени нарушения биохимических процессов в организме), так и для прогноза исхода болезни. Полученные данные могут быть использованы в клинической практике в комплексе с общепринятыми исследованиями для оценки активности воспалительного процесса и эффективности проводимой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При бронхолегочных заболеваниях происходит изменение активности НАД- и ФАД-зависимых дегидрогеназ нейтрофилов, что связано с накоплением в крови эндотоксинов мембранотропного действия.

2. Интегральные показатели эндотоксикоза вносят вклад в развитие деструктивных процессов при бронхолегочной патологии.

3. При бронхолегочных заболеваниях нарушается нормальное функционирование детоксикационной системы организма, связанное с накоплением в крови продуктов эндотоксикоза.

4. В основе развития бронхолегочных заболеваний лежат аллергические реакции, что связано с изменением баланса в системе биогенных аминов.

5. У больных бронхолегочными заболеваниями наблюдается угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов, которая слабо зависит от влияния эндотоксинов.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены в материалах научных конференций Клиникоэкспериментальные аспекты современной медицины (г. Саранск, 1999); Современные аспекты теоретической и клинической медицины: проблемы диагностики, лечения и реабилитации (г. Саранск, 2000, 2003); Международной научно-практической конференции Окружающая природная среда и медицинская экология (г. Пенза, 2001); в материалах конференции Новые подходы в естественных исследованиях: экология, биология, сельскохозяйственные науки (г. Саранск, 2002); в материалах VIII Международного конгресса по иммунореабилитации Аллергия, иммунология и глобальная сеть (г. Канны, Франция, 2002); I Всероссийской конференции по иммунотерапии Физиология иммунной системы (г. Сочи, Дагомыс, 2003); IV Всемирного конгресса по астме (г. Бангкок, Таиланд, 2004); II Европейского конгресса по астме (г. Тбилиси, Грузия, 2004); в материалах научной конференции с международным участием Современные наукоемкие технологии (о. Тенерифе, Испания, 2005); научной конференции Естественные и технические науки (г. Саранск, 2006).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, документирована 27 таблицами и иллюстрирована 21 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), изложения и обсуждения собственных результатов (глава 3), выводов и списка литературы, включающего 249 источников, в том числе 147 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы исследования. Материалом исследования служила кровь практически здоровых людей (доноров) и кровь больных бронхолегочными заболеваниями в стадии обострения и ремиссии. Больные были разделены по клиническому диагнозу на 3 группы: больные бронхитом, пневмонией, бронхиальной астмой. Определяли активность дегидрогеназных ферментов нейтрофилов, показатели фагоцитоза, эндотоксикоза, оценивали детоксикационную систему организма, а также определяли содержание гистамина и серотонина в крови и плазме доноров и больных бронхолегочными заболеваниями.

Методы исследования. Нейтрофилы выделяли по методу Шепотиновского и др. (1979). Жизнеспособность выделенных клеток определяли по Меньшикову (1987). Кинетическое спектрофотометрическое определение активности лактатдегидрогеназы проводили по методу Sevela et al. (Скорняков и др., 1989).

Активность сукцинатдегидрогеназы исследовали по методу Пастушенкова и др. (1993). Определение концентрации белка проводили по методу Bradford (Шоно и др., 1989).

Уровень молекул средней массы оценивали спектрофотометрическим методом (Габриэлян и др., 1984) при длине волны 280 нм для определения белков, содержащих ароматические аминокислоты, и при длине волны 254 нм для определения нуклеопротеидов. Количество циркулирующих иммунных комплексов определяли по методике Вельбри и др. (1988). Для определения интенсивности свободнорадикального окисления и антиоксидантной активности сыворотки крови применяли хемилюминесцентный метод (Афонина и др., 1990).

Общую и эффективную концентрацию альбумина определяли флуоресцентным методом (Миллер и др., 1994) со стандартным набором реактивов. Резервную способность альбумина рассчитывали по формуле:

РСА = ЭКА/ОКА*100%. Индекс токсичности, определяемый как ОКА/ЭКА-1, характеризует степень интоксикации организма по альбумину.

Определение гистамина и серотонина проводили в одной пробе по Прошиной (1981) на основании образования флюоресцирующих продуктов конденсации гистамина и серотонина с ортофталевым альдегидом и нингидрином.

Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов проводили по традиционной методике (Медведев и др., 1991). Подсчет поглощенных частиц производили в 50 нейтрофилах по фагоцитарному числу и фагоцитарному ин дексу. При определении функциональной активности нейтрофилов с нитросиним тетразолием (Park B.H. et al., 1968) в каждом мазке подсчитывали 100 нейтрофилов, среди которых определяли процент клеток, содержащих фиолетовые отложения диформазана, далее подсчитывали индекс активации нейтрофилов.

Статистическую обработку результатов исследований проводили вычислением среднего арифметического (М), среднего квадратичного отклонения (), ошибки среднего (m). Достоверность различий средних величин оценивали с использованием критерия Стьюдента (t). Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента линейной корреляции Пирсона.

Все расчеты проводили с помощью персонального компьютера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проблема современной патогенетической терапии бронхолегочных заболеваний (БЛЗ) является важной в клинике в связи с широкой их распространенностью. Воспалительные заболевания бронхолегочного аппарата сопровождаются развитием гипоксии, что приводит к активации гликолиза. При развитии патологии, связанной с гипоксией, в стадии обострения наблюдалась корреляционная зависимость между активностями дегидрогеназ нейтрофилов: существенно повышалась активность НАД-зависимых ферментов - лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и снижалась активность ФАД-зависимых - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), что связано с изменением интенсивности гликолиза (Логинов, 2005).