На правах рукописи

Непряхина Ольга Константиновна Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе 03.00.25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: директор НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, академик РАН В.П. Скулачёв Научный консультант: зав. лабораторией биоэнергетики клетки НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, кандидат биологических наук Б.В. Черняк

Официальные оппоненты: профессор биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, доктор биологических наук Г.Е. Онищенко зав. лабораторией мембранологии Научного центра здоровья детей РАМН, доктор медицинских наук В.Г. Пинелис

Ведущая организация: Институт биохимии А.Н. Баха

Защита состоится 21 апреля 2009 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ, в аудитории М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ Изучение митохондриальной динамики занимает значительное место в современных научных исследованиях. Накоплен большой массив данных, описывающих механизм фрагментации митохондрий при апоптозе, известны основные белки, участвующие в этом процессе. В то же время, изменения динамического состояния митохондрий играют важную роль во многих физиологических реакциях клетки, не связанных с апоптозом. Большинство реакций клетки на внешние стимулы, а также начальные этапы апоптоза сопровождаются изменениями окислительно-восстановительного статуса клетки. Такие изменения всегда связаны с образованием активных форм кислорода внутри клетки. Роль активных форм кислорода в фрагментации митохондрий на данный момент неизвестна, и ее исследование представляет большой научный интерес.

Генетические нарушения, затрагивающие белки, участвующие в фрагментации и слиянии митохондрий, приводят к развитию наследственных заболеваний, например синдрома Шарко-Мари-Тут. Окислительный стресс, сопровождающийся повреждением митохондрий, является причиной многих серьезных патологий, в частности инфарктов, инсультов. Патофизиология многих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, также связана с окислительным стрессом. Изучение механизма фрагментации митохондрий при окислительном стрессе, возможно, позволит разработать более эффективные методы борьбы с этими заболеваниями.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью данной работы было исследование фрагментации митохондрий при окислительном стрессе, не приводящем к гибели клеток. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вторичную продукцию АФК при окислительном стрессе.

Используя митохондриально-направленные антиоксиданты, выяснить роль митохондрий в этом процессе.

2. Изучить роль АФК, образующихся в митохондриях, в фрагментации митохондриального ретикулума.

3. Исследовать роль белка Drp-1 в фрагментации митохондрий при окислительном стрессе.

4. Проанализировать изменение распределения белка BAX в клетке при окислительном стрессе и роль в этом процессе АФК.

5. Изучить взаимосвязь фрагментации митохондрий и транслокации белка BAX из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ В работе мы исследовали окислительный стресс в клетках HeLa, вызываемый пероксидом водорода в нетоксических концентрациях. Использование специфических митохондриально-направленных антиоксидантов позволило установить, что основным источником АФК при окислительном стрессе служат митохондрии. Показано, что АФК образуемые в митохондриях играют основную роль в индукции фрагментации митохондриального ретикулума. Было обнаружено, что при окислительном стрессе происходит транслокация Вах из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий. Этот процесс зависит от продукции АФК в митохондриях и предшествует фрагментации митохондриального ретикулума, но не является ее причиной. Впервые было показано, что распределение Вах зависит от конформации переносчика адениновых нуклеотидов в мембране митохондрий, которая может изменяться под действием АФК. Эффективное защитное действие митохондриально-направленных антиоксидантов при окислительном стрессе позволяет надеяться на их терапевтический эффект при патологиях, связанных с нарушением митохондриальной динамики.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Изучение митохондриальной динамики в последнее время приобретает все большее значение. Было обнаружено, что многие наследственные заболевания - такие как синдром Шарко-Мари-Тут, оптическая атрофия, болезнь Паркинсона и даже наследственная шизофрения - вызваны мутациями в генах, играющих важную роль в поддержании нормальной морфологии митохондрий. Многие из этих заболеваний, а также другие патологические состояния, такие как инсульт, инфаркт, воспаление, диабет, ассоциированы с окислительным стрессом. Изучение процесса фрагментацией митохондрий при окислительном стрессе может пролить свет на многие вопросы, связанные с патогенезом этих заболеваний, и, возможно, позволит разработать новые эффективные средства их лечения. Так эффективное защитное действие митохондриально-направленных антиоксидантов на структуру митохондрий позволяет надеяться на их терапевтический эффект при подобных патологиях.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме Биология клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2006); на международной научной конференции Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах памяти проф. М.В. Гусева (Москва, 2006); на 14ой Европейской конференции по биоэнергетике EBEC (Москва, 2006); на курсе Передовые разработки в области молекулярной биохимии митохондрий (Варшава, 2006); 14 и 15 Европейских конференциях по апоптозу ECDO (Сардиния, Италия, 2006 и Портороз, Словения, 2007), 32ом Конгрессе Международного общества биохимиков и молекулярных биологов Молекулярные машины (Вена, Австрия, 2007), на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и на Международном симпозиуме по митохондриальной физиологии и патологии (Бари, Италия, 2008).

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работа изложена на 112 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 31 рисунками.

Список литературы содержит 132 источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Реагенты Все использованные реагенты (если не указано иначе) были производства Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Для исследования продукции АФК в митохондриях были использованы новые митохондриально направленные антиоксиданты SkQ(10-(6Т-пластохинолил)децилтрифенилфосфоний) и его флуоресцентный аналог SkQR1, а также MitoQ (10-(6Т-убихинолил)децилтрифенилфосфоний) и контрольное соединение децилтрифенилфосфоний (C12TPP), синтезированные в НИИ ФХБ им.

А. Н. Белозерского под руководством В.П. Скулачева.

Объект исследования В работе использовали клетки карциномы человека HeLa. Культуры клеток выращивали в среде DМЕМ с высоким содержанием глюкозы (25 мМ), без пирувата, с добавлением 100 ед/мл стрептомицина и 100 ед/мл бензилпенициллина (Gibco) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone) в атмосфере 5% СО2 при 37 С. Клетки HeLa-Bcl-2 c гиперэкспрессией белка Bcl-были предоставлены Г.А. Беловым (ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) и подробно охарактеризованы в нашей лаборатории ранее (Щепина и др., 2002).

Измерение продукции АФК методом проточной цитофлуориметрии Для изучения содержания АФК клетки окрашивали раствором CM-DCFH2-DA (диацетиловый эфир 5'-6'-хлорметил-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеина, Molecular Probes, Invitrogen) 1,8 мкМ в среде DMEM без сыворотки в течение 15 минут при 37С. Флуоресценцию анализировали с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter Cytomics FC 500 (содержит однофазный аргоновый лазер, длина волны возбуждающего света которого равна 488 нм, мощность 20 мВт, узкополосный оптический фильтр 525 нм BP). Статистическую обработку результатов проводили в программах Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2003.

Визуализация митохондрий и других внутриклеточных структур Митохондрии в живых клетках окрашивали с помощью специфического флуоресцентного красителя MitoTracker Green 100 нМ 30 минут (Molecular Probes).

Для окраски с помощью антител клетки фиксировали 15 мин в 3,7% формальдегиде и пермеабилизировали с помощью 0,5% тритона Х-100 10 мин. Для окрашивания использовали антитела к цитохрому с (Pharmingen), тубулину (Sigma), белку Вах (Pharmingen) и вторичные антитела, конъюгированные с красителями Oregon Green и Texas Red-X (Pharmingen). Для окрашивания актиновых филаментов использовали фаллоидин, меченый TRITC (Sigma). Клетки на покровных стеклах заключали в среду Vectashield (Vector). Препараты анализировали с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, используя конфокальный микроскоп LSM 510 (Carl Zeiss), а также флуоресцентный микроскоп Axiovert 200M (Carl Zeiss) Анализ клеточного цикла Для изучения клеточного цикла клетки переводили в суспензию, фиксировали 100 % спиртом на льду, окрашивали раствором йодистого пропидия (50 мкг/мл) в течение 1 часа при 37оС в темноте и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение клеточной гибели Для определения апоптоза и некроза клетки переводили в суспензию, добавляли к ним 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ HEPES; 140 мМ NaCl и 2,5 мМ CaCl(рН 7,4), добавляли аннексин V, конъюгированный с AlexaFluor 488 (Invitrogen, разведение 1:100) и йодистый пропидий (1 мкг/мл), инкубировали в темноте 10-минут и анализировали на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter FC500).

Также гибель клеток оценивали с помощью реагента CellTiter Blue (Promega) согласно инструкции изготовителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В КЛЕТКАХ HELA Окислительный стресс является одним из важнейших изменений гомеостаза клетки. Он возникает при различных патологических состояниях организма, в частности - при воспалении, ишемии-реперфузии, инсультах, инфарктах. При окислительном стрессе происходит образование избыточного количества активных форм кислорода (АФК) внутри клетки, которые могут активизировать различные сигнальные пути, а также вызывать повреждение молекулярных компонентов клетки. В нашей работе мы исследовали окислительный стресс в культуре клеток HeLa. В качестве индуктора окислительного стресса использовали пероксид водорода, который является распространенным индуктором окислительного стресса в организме. Используя специфический флуоресцентный краситель СМ-DCF мы обнаружили, что пероксид водорода вызывает продукцию АФК в клетках. При этом в течение первого часа количество АФК не отличалось от контрольного. Через два часа оно увеличивалось и затем резко спадало (см. ниже рис. 2а). Ранее в нашей лаборатории было показано, что пероксид водорода, добавленный к культуре клеток, разрушается в среде инкубации за первые полчаса (Плетюшкина и др., 2006). Таким образом, наши данные указывают на то, что под действием пероксида в клетке индуцируется эндогенная продукция АФК. Можно предполагать, что накопление АФК в дальнейшем компенсируется благодаря увеличению активности антиоксидантных систем клетки.

Митохондрии служат в клетках важнейшим источником активных форм кислорода. Мы предположили, что именно они вырабатывают АФК в ответ на пероксид водорода. Для проверки этой гипотезы мы исследовали действие ингибитора комплекса III дыхательной цепи митохондрий миксотиазола на продукцию АФК в клетках. Миксотиазол вызывал медленное накопление АФК (максимальный уровень наблюдался через 21-24 часа), что было связано с образованием радикалов в начальных сегментах дыхательной цепи. При совместном действии пероксида водорода и миксотиазола мы наблюдали максимальный уровень АФК уже через 1 час. Тот факт, что миксотиазол ускоряет продукцию АФК, вызванную пероксидом водорода, подтверждает гипотезу об образовании АФК в митохондриях при окислительном стрессе.

Для дальнейшего изучения роли митохондриальной продукции АФК при окислительном стрессе мы использовали специфический митохондриальнонаправленный антиоксидант SkQ1. Он состоит из положительно заряженного децилтрифенилфосфония и остатка пластохинона (рис. 1). Ранее в нашей лаборатории было показано на модельных мембранных системах и на Рисунок 1. Структура изолированных митохондриях, что SkQмолекулы SkQ1.

чрезвычайно эффективен как антиоксидант (Скулачев, 2007). Его эффективность была значительно выше, чем у аналогичного антиоксиданта на основе убихинона (MitoQ). С помощью флуоресцентного аналога SkQ1 (SkQR1) мы показали, что он селективно накапливается в митохондриях клеток благодаря разности потенциалов на их мембране.

А Б Рисунок 2. Пероксид водорода вызывает продукцию АФК в митохондриях клеток HeLa.

А: Клетки HeLa инкубировали с пероксидом водорода 250 мкМ указанное время, и затем проводили окрашивание CMDCF-DA и измерение флуоресценции так, как описано в разделе Объекты и методы исследования. Представлены данные 5х независимых экспериментов. Б: Клетки преинкубировали с 20 нМ SkQ1 в течение 7 дней, затем обрабатывали H2O2 100 мкМ в течение 45 минут. Окрашивание CMDCF-DA и измерение флуоресценции проводили так, как описано в Материалах и методах. Черным контуром показано распределение клеток в контроле.

Преинкубация клеток HeLa в течение 7и дней с 20 нМ SkQ1 предотвращала накопление АФК, вызванное пероксидом водорода (Рис. 2б). Этот результат подтвердил митохондриальное происхождение вторичных АФК и показал высокую эффективность антиоксидантного действия SkQ1 на клетках в культуре.