 Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по разным специальностям
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи Иванов Максим Сергеевич ФОСФАТАЗА PPZ1P И ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОНСЕНС-СУПРЕССИИ У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.00.15- генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета. Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук Людмила Николаевна Миронова Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук Михаил Давидович Тер-Аванесян кандидат биологических наук Ольга Всеволодовна Невзглядова Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН Защита диссертации состоится "___" _______ 2009 г. в ___ часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1. С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета Автореферат разослан "___" ______ 2009 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Д.212.232.12 кандидат биологических наук Л. А. Мамон ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Считывание триплетов мРНК аппаратом белкового синтеза в соответствии с генетическим кодом - основополагающее свойство живой клетки, обеспечивающее ее стабильное функционирование. Как и другие матричные процессы, трансляция характеризуется некоторым уровнем неточного считывания, в результате которого может происходить переосмысление значащих триплетов, считывание стоп-кодонов как значащих, сдвиг рамки считывания. В соответствии с принципом поливариантности матричных процессов, способность к прочтению одного и того же триплета более чем одним способом является неотъемлемым свойством белок-синтезирующей системы клетки (Инге-Вечтомов, 1969). Наиболее простой моделью для изучения генетического контроля точности трансляции является изучение супрессии нонсенс-мутаций, приводящих к появлению преждевременного стоп-кодона в открытой рамке считывания. Такие изменения в точности трансляции могут быть обнаружены на фенотипическом уровне, так как считывание стоп-кодонов как значащих восстанавливает синтез полноразмерного белка, прерванный нонсенс-мутацией. Увеличение или уменьшение эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов может быть вызвано факторами как генетической, так и эпигенетической природы. Большинство мутаций, влияющих на эффективность нонсенс-супрессии, изолированы в генах, кодирующих тРНК, рРНК, белки рибосомы, факторы элонгации и терминации трансляции (см. Valente a. Kinzy, 2003). Хорошо изученным примером эпигенетического фактора, приводящего к усилению нонсенс-супрессии, является дрожжевой прион [PSI+] - продукт прионного превращения фактора терминации eRF3 (Sup35p) (Cox, 1965; Wickner et al., 1995). Многие белки, прямо или косвенно участвующие в трансляции, являются фосфобелками, и их функциональная активность регулируется специфическими киназами и фосфатазами. Для некоторых из этих белков показано, что уровень их фосфорилированности оказывает влияние на процесс трансляции. Например, фосфорилирование -субъединицы фактора инициации трансляции IF-2 киназой Gcn2p снижает эффективность инициации трансляции в ответ на некоторые стрессовые условия (Hinnebusch, 1993). Фосфорилирование белков Р0, Р1 и Р2, входящих в состав "стебля" рибосомы, оказывает влияние на трансляцию некоторых мРНК (Zambrano et al., 1997). Фосфорилирование белка Upf2p оказывает влияние на функционирование системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (Wang et al., 2006). Таким образом, изменение уровня экспрессии определенных киназ и фосфатаз может влиять на работу аппарата трансляции. Действительно, показано, что в генетический контроль трансляции у дрожжей вовлечены гомологичные фосфатазы Ppz1p и Ppq1p. Делеция гена PPQ1 приводит к аллосупрессии, а сверхэкспрессия - к антисупрессии на фоне различных нонсенс-супрессорных факторов (Vincent et al., 1994). Делеция гена PPZ1 приводит к увеличению частоты считывания стоп-кодонов как значащих в 3-4 раза (de Nadal et al., 2001). Роль фосфатазы PPZ1 в регуляции эффективности нонсенс-супрессии была также подтверждена в нашей лаборатории в ходе исследования антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+]. Было показано, что изменение уровня экспрессии гена PPZ1 (а также гена HAL3, кодирующего негативную регуляторную субъединицу Ppz1p) влияет на проявление детерминанта [ISP+] (Aksenova et al., 2007). Кроме того, было показано, что сверхэкспрессия и делеция генов HAL3 и PPZ1 влияют на эффективность нонсенс-супрессии и в [isp-] штаммах. Эти данные подтверждают участие белкового комплекса Hal3/Ppz1p в контроле считывания стоп-кодонов. Однако механизмы влияния этой и других фосфатаз на считывание стоп-кодонов в настоящее время практически не изучены. В частности, неизвестны белки-мишени фосфатазной активности Ppz1p и Ppq1p, участвующие в трансляции. В связи с этим целью исследования явилось изучение связи между фосфатазой Ppz1p и эффективностью нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В ходе работы решались следующие задачи: (1) изучение влияния фосфатазы Ppz1p на проявление нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45; (2) изучение влияния фосфатазы Ppz1p и ее регуляторной субъединицы Hal3p на проявление фактора [PSI+]; (3) выяснение роли гомологичной фосфатазы Ppz2p в генетическом контроле считывания стоп-кодонов; (4) поиск белков-мишеней фосфатазы Ppz1p, опосредующих влияние этой фосфатазы на считывание стоп-кодонов. Научная новизна исследования. Получены дополнительные данные, проливающие свет на механизмы влияния фосфатазы Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов. Показана зависимость проявления некоторых нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45, а также дрожжевого приона [PSI+] от уровня экспрессии гена PPZ1. Также мы показали, что проявление фактора [PSI+] зависит и от уровня экспрессии гена PPZ2, кодирующего фосфатазу Ppz2p. При этом влияние гена HAL3 на проявление фактора [PSI+] обусловлено ингибированием фосфатазной активности как Ppz1p, так и Ppz2p. Получены данные, свидетельствующие о том, что дефосфорилирование фактора элонгации EF1B (Tef5p) фосфатазой Ppz1p играет минорную роль в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1. В соответствии с этими данными высказана гипотеза о том, что влияние Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии опосредовано дефосфорилированием как минимум двух фосфобелков, участвующих в трансляции - EF1B и какого-то другого белка, в настоящее время остающегося неизвестным. В связи с этим были проверены предположения о возможной роли ряда фосфобелков, связанных с трансляцией, в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1: (1) фактора терминации eRF1 (Sup45p); (2) белков Upf1p и Upf2p, участвующих в нонсенс-зависимой деградации мРНК; (3) белка Sla1p; и (4) шаперонов Ssb1p и Ssb2p. Показано, что эти белки не являются мишенами фосфатазной активности Ppz1p. Тем не менее, показано, что двойная делеция генов SSB1 и SSB2 блокирует аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии мутантной аллели ppz1-R451L, кодирующей каталитически неактивный белок Ppz1p. На основании этих данных высказано предположение о том, что фосфатаза Ppz1p может оказывать влияние на функционирование аппарата трансляции за счет взаимодействия с шаперонами Ssb1p и Ssb2p, причем это взаимодействие на связано с фосфатазной активностью Ppz1p. Практическая ценность. В настоящее время известно значительное количество наследственных заболеваний человека, обусловленных нарушениями в работе трансляционного аппарата клетки (синдром Уолкотта-Раллисона, лейкоэнцефалопатия, хроническая миелоидная лейкемия и др.) (см. Calkhoven et al., 2002). Кроме того, показано, что дерегуляция экспрессии факторов инициации трансляции играет важную роль в процессе онкотрансформации клетки (см. Stoneley a. Willis, 2003). Поэтому изучение механизмов регуляции точности трансляции может способствовать разработке методов лечения этих заболеваний, связанных с нарушениями трансляции. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции молодых ученых (Одесса, Украина 2007), на конференции EuroPhosphatases 2007 (Авейро, Португалия 2007), на 12-ом Международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина 2008) и на конференции по трансляционному контролю (Колд Спринг Харбор, США 2008). Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ. Структура и объем работы. Работа изложена на 152 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (210 наименований). Работа содержит 7 таблиц и 30 рисунков. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1. Таблица 1. Штаммы, использованные в работе
Плазмиды. Плазмиды pRS315-TEF5 и pRS315-TEF5-S86A получены при клонировании ПЦР-продуктов, содержащих аллель дикого типа TEF5 либо мутантную аллель tef5-T622C, в вектор pRS315 по сайту рестрикции BamHI. Центромерные плазмиды, несущие мутантные аллели sup45 и sup35, описаны ранее (Moskalenko et al., 2003; Москаленко и др., 2004; Volkov et al., 2002; Chabelskaya et al., 2004). Использованные мутации sup35 и sup45 приведены в таблице 2. Также в работе использовали мультикопийную плазмиду YEplac195 (Gietz a. Sugino, 1988) и ее производные YEplac195-HAL3, YEplac195-PPZ1 и YEplac195-PPZ1-R451L (Clotet et al., 1996). Центромерные плазмиды pDB902 и pDB858, несущие мутантные аллели sup45-S421/432A и sup45-S421/432D, а также исходный вектор pDB800 описаны ранее (Kallmeyer et al., 2006). Для получения делеций генов использовали плазмиды pFA6 (Wach et al., 1994) и pAG32 (Goldstein a. McCusker, 1999). Таблица 2. Мутации sup45 и sup35, использованные в работе
|  |
Blog
Home - Blog