На правах рукописи

Лазарева Екатерина Алексеевна Лектины оболочки пыльцевого зерна Nicotiana tabacum L.

и их роль в активации прорастания Специальность 03.00.12 физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии растений Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Ермаков Игорь Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ковалёва Лидия Валентиновна кандидат биологических наук, доцент Глазунова Клавдия Павловна

Ведущая организация: Главный Ботанический сад имени Н.В. Цицина Российской Академии Наук

Защита состоится 11 декабря 2009 г. в 15.30 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, к. 12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

Факс: (495)939-43-09.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан л л 2009 года Учёный секретарь Диссертационного совета, Кандидат биологических наук М.А. Гусаковская 2 Актуальность. В современных исследованиях механизмов регуляции развития растительных клеток большое внимание уделяют сигнальным системам, которые обеспечивают запуск морфогенетических программ внеклеточными лигандами (Hiscock, Allen, 2008). Поведение мужского гаметофита покрытосеменных растений, в том числе на этапе его перехода в активное физиологическое состояние в прогамную фазу оплодотворения, включает подобные механизмы.

При этом важную роль играют белки и пептиды, которые диффундируют из пыльцевого зерна в окружающую среду. Они участвуют в процессах взаимодействия пыльцевых зёрен друг с другом и с клетками рыльца, но вместе с тем с помощью таких лигандов вегетативная клетка и пыльцевая трубка могут осуществлять мониторинг своего состояния и готовности к выполнению своих функций.

Особый класс белков, которые могут выступать в качестве внеклеточных лигандов, составляют лектины белки, специфически и обратимо взаимодействующие с углеводными детерминантами без их модификации.

Исследования последних лет, проведенные на клетках животных, показали, что лектины участвуют в контроле внутриклеточного транспорта и эндоцитоза, регулируют процессы адгезии (межклеточные и клетки к её матриксу), узнавания и миграции клеток, осуществляют позитивный и негативный контроль ростовых процессов и тем самым контролируют дифференциацию тканей и органов (Gabius et al., 2004). Быстрое накопление знаний в области исследования лектинов животных привело к формированию концепции "углеводного кода".

Сформулирована новая парадигма поливалентных белок-углеводных взаимодействий с образованием супрамолекулярных ансамблей, осуществляющих трансдукцию сигналов (Garner, Baum, 2008).

Вопрос о роли лектинов в регуляции прорастания пыльцевого зерна до настоящего времени не решён, хотя уже давно обсуждается в литературе (Southworth, 1975; Dumas et al., 1984). Данные о влиянии экзогенных лектинов на прорастание немногочисленны и противоречивы. Вопрос об эндогенных лектинах пыльцевого зерна почти не изучен. Есть сведения о лектинах, прочно связанных с оболочкой (Carratu, Giannattasio, 1990; Ковалева и др., 1999). Однако с точки зрения участия в запуске прорастания, наибольший интерес представляют подвижные белки внеклеточного матрикса, которые могли бы взаимодействовать с гликопротеинами плазмалеммы.

Цели и задачи исследования. Цель работы выявить водорастворимые лектины оболочки и установить их роль в регуляции активации и прорастания пыльцевого зерна на примере Nicotiana tabacum L.

Для её достижения были поставлены следующие задачи.

Х Изучение действия экзогенного лектина конканавалина А (Кон А) на активацию и прорастание пыльцы.

Х Изучение роли водорастворимых компонентов оболочки (диффузатов) пыльцевого зерна табака в регуляции запуска его прорастания.

Х Выявление лектинов в составе диффузатов оболочки методом гемагглютинации.

Х Выделение лектинов из диффузатов оболочки пыльцевого зерна методом аффинной хроматографии.

Х Изучение действия выделенных лектинов на запуск активации и прорастание пыльцевого зерна.

Научная новизна. Впервые обнаружено действие экзогенного лектина на величину мембранного потенциала и внутриклеточный рН растительной клетки. Установлена взаимосвязь между прорастанием пыльцевого зерна и гиперполяризацией плазмалеммы его вегетативной клетки.

Показано, что диффузаты оболочки пыльцевого зерна включают лектины, существенно влияющие на активацию и прорастание пыльцы. Эти эндогенные регуляторные лектины впервые выделены и охарактеризованы.

Практическая значимость работы. Представленная работа является фундаментальным исследованием сложной системы регуляции прорастания пыльцевого зерна. Полученные данные могут быть использованы для разработки подходов к оптимизации условий опыления у сельскохозяйственных растений с целью повышения их продуктивности. Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и эмбриологии растений.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на семинарах кафедры физиологии растений, доложены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов (Москва, 2003, 2004, 2006);

на V и VI съездах общества физиологов растений (Пенза, 2003; Сыктывкар, 2007);

на IV международной конференции Регуляция роста, развития и продуктивности растений (Минск, 2005); на I международной школе для молодых учёных Эмбриология и Биотехнология (Санкт-Петербург, 2005); на ХIX Международном конгрессе по половому размножению растений From gametes to genes (Будапешт, 2006); на II и III международных школах для молодых учёных Эмбриология, Генетика и Биотехнология (Уфа, 2007; Саратов, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего работ (из них на иностранных языках). Работа изложена на страницах, содержит в экспериментальной части 3 таблицы и 15 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы рассмотрена роль пептидов и белков оболочки пыльцевого зерна в его прорастании и во взаимодействии пыльцевых зёрен между собой и с клетками пестика. Обсуждены функции лектинов у растений.

Проанализированы работы, посвященные изучению влияния лектинов на прорастание пыльцы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования являлись пыльцевые зёрна табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana SR1. Растения выращивали в климатической камере (25С, 16-часовой световой день). Собранную пыльцу хранили при Ц20С.

Жизнеспособность пыльцевых зёрен контролировали, окрашивая их флуоресцеиндиацетатом.

Диффузаты (водорастворимые компоненты) оболочки пыльцевых зёрен получали, инкубируя пыльцевые зёрна, предварительно промытые гексаном, в среде прорастания (СП), которая включала 1,6 мМ H3BO3, 3 мМ Ca(NO3)2, 0,8 мМ MgSO4 и 1 мМ KNO3 в 25 мМ Mes-Трис-буфере или 20 мМ Трис-HClбуфере (pH 5,9). Продолжительность инкубации составляла 15 мин при 0С. После чего отделяли диффузаты от клеток центрифугированием и последующей фильтрацией через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Контрольные измерения активности цитозольного фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (спектрофотометрия при = 340 нм) подтвердили отсутствие белков цитозоля в составе диффузатов.

Метод гемагглютинации с эритроцитами кролика использовали для выявления лектиновой активности. Реакцию агглютинации проводили в иммунологических плашках с U-образными лунками. Лектиновую активность определяли визуально по степени агглютинации. Для установления углеводной специфичности лектинов диффузатов пробы предварительно инкубировали с тестируемым углеводом, после чего к пробе добавляли эритроциты.

Выделение лектинов из диффузатов проводили на колонках методом аффинной хроматографии на двух сорбентах: сефадексе G-200 и,D-метилманнопиранозиде, иммобилизованном на агарозе (ММП-Агароза). Элюцию белков, связавшихся с сефадексом, проводили при рН 2,0 (30 мМ HCl). Белки, связавшиеся с ММП-Агарозой, элюировали 0,5 М ММП. Концентрацию белка во фракциях и диффузатах определяли флуориметрически с использованием красителя на белок NanoOrange или метода дот-блот с окрашиванием белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране, кумасси R-350.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ДДС-ПААГ) проводили в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970). Полученные гели окрашивали 0,4 % раствором AgNO3. Анализ гелей проводили с использованием программы OneDscan.

Пыльцевые зёрна культивировали в жидкой СП, которая была дополнена 10 % сахарозой. Для выявления действия диффузатов и выделенных лектинов оболочки на активацию и прорастание пыльцы в качестве тест-культуры использовали суспензии с низкой концентрацией клеток (770 кл./мл). Такие культуры характеризуются низким прорастанием и способны реагировать на действие ростовых факторов стимуляцией прорастания (Chen et al., 2000).

В качестве контроля использовали культуру с высокой их концентрацией (105 кл./мл). Действие конканавалина А на пыльцу изучали в культуре с концентрацией 105 кл./мл. Число проросших пыльцевых зёрен оценивали через 1 ч после гидратации.

Величину внутриклеточного рН и мембранный потенциал вегетативной клетки пыльцевого зерна определяли методами количественной флуоресцентной микроскопии. Пыльцевые зёрна окрашивали потенциалзависимым анионным красителем DiВAC4(3) (бис-(1,3-дибутилбарбитуровой кислоты) триметин оксонол) в течение 10 мин. Расчёт абсолютного значения мембранного потенциала (Е) проводили по формуле E = (RT/F) ln(I/I0), где I - интенсивность флуоресценции пыльцевого зерна в исследуемой пробе;

I0 - интенсивность флуоресценции клеток, полностью деполяризованных посредством фиксации (по Emri et al., 1998 с модификациями). Для определения величины внутриклеточного рН использовали краситель-индикатор рН BCECF-AM (ацетоксиметилового эфира 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5(и-6)карбокси-флуоресцеин). Оценивали отношение (R) интенсивностей рН-зависимой (возб = 494 нм) к рН-независимой (возб = 445 нм) флуоресценции окрашенных пыльцевых зёрен. Калибровочную кривую, связывающую величину R и рН, строили, используя раствор ВСЕСF в буфере с диапазоном значений рН от 6,до 7,6 (Матвеева и др., 2003).

Цитологический анализ проводили с использованием моторизованного микроскопа Axioplan2 imaging MOT, оснащенного цифровой камерой AxioCam HRc. Получение и анализ изображений осуществляли с помощью пакета программ AxioVision 4.5. Часть данных получена на микроскопе Leitz-Orthoplan, снабжённом блоком PLOEMOPAK.

Статистическая обработка данных. Все опыты проводили не менее чем в пяти повторностях. Достоверность различий рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента (p < 0,01 или p < 0,05). На рисунках представлены средние значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Действие Кон А на прорастание и активацию пыльцевого зерна Пыльцевые зёрна инкубировали с экзогенным лектином Кон А в течение 10 мин, после чего их отмывали и культивировали в среде без Кон А. Такое кратковременное воздействие Кон А на начальном этапе активации стимулировало прорастание пыльцевых зёрен (Рис. 1). С увеличением концентрации Кон А его эффект постепенно возрастал. Данный эффект был обусловлен специфическим связыванием лектина с углеводными детерминантами, поскольку конкурентный сахар 0,1 М,D-метил-маннопиранозид (ММП) подавлял действие Кон А (100 мкг/мл) на прорастание на 90 %.

Рис. 1. Влияние Кон А на прорастание пыльцевых зёрен табака.

Таким образом, стимулирующее действие Кон А на прорастание реализуется, по-видимому, на начальном этапе активации. Этот вывод был подтверждён при изучении действия Кон А на такие показатели активации пыльцевого зерна, как гиперполяризация плазмалеммы и увеличение внутриклеточного рН, которые, наряду с интенсификацией дыхания, реорганизацией внутриклеточных структур, активацией ферментных систем и транспортных процессов, определяют функциональную активацию клетки при выходе из состояния покоя (Матвеева и др. 2003; Брейгина и др., 2009).

а б -15 Контроль Кон А Кон А+ММП -----0.1 1 10 100 [Кон А], мкг/мл Рис. 2. Влияние Кон А на величину мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна:

(а) гиперполяризация плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна в зависимости от концентрации Кон А;

(б) подавление эффекта Кон А (100 мкг/мл) в присутствии ММП (0,1 М).

Пыльцевые зёрна культивировали в присутствии Кон А в течение 10 мин, одновременно окрашивая их потенциал-зависимым флуоресцентным красителем DiВAC4(3). Полученные препараты микроскопировали. Показано, что Кон А вызывает гиперполяризацию плазмалеммы (Рис. 2 а).

С увеличением концентрации Кон А происходило постепенное снижение мембранного потенциала вплоть до Ц32 мВ при концентрации Кон А 1 мг/мл, что в 2 раза превышает значение в контроле (Ц16 мВ). Изменения мембранного потенциала в зависимости от концентрации Кон А (Рис. 2 а) зеркально отражали влияние этого лектина на прорастание (Рис. 1): коэффициент корреляции между величиной мембранного потенциала и числом проросших пыльцевых зёрен r = Ц0,96 (p < 0,01).

Эффект Кон А был специфичным, поскольку присутствие в среде инкубации 0,1 М ММП полностью снимало его влияние на мембранный потенциал (Рис. 2 б).

Аналогичным образом нами было изучено влияние кратковременного воздействия Кон А (5 мин) на величину внутриклеточного рН вегетативной клетки пыльцевого зерна, которую оценивали с помощью красителя индикатора рН Е, мВ Е, мВ BCECF-AM. Кон А (100 мкг/мл) вызывал возрастание этой величины на 0,3 ед.

по сравнению с контролем (Рис. 3). ММП (0,1 М) и в этом случае полностью подавлял действие Кон А.