На правах рукописи

ГОЛОВНИНА КСЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ВИДОВ В РОДАХ TRITICUM L. И IRIS L.

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск - 2008

Работа выполнена в секторе молекулярной эволюции, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Блинов Александр Геннадьевич,

Институт цитологии и генетики

СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Салина Елена Артемовна,

доктор биологических наук, профессор

Цильке Регинальд Александрович

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский

Институт растениеводства

им. Н.И. Вавилова, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится л__ ________ 2008г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел. (383)-333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан л__ __________2007г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Проблема построения естественной классификации живых существ, отражающей их филогенетическую историю, всегда была важна для эволюционных биологов, так как нередко возникают спорные моменты, и их разрешение является одной из задач современной филогении. Ранее традиционным было построение филогенетических и классификационных систем на основании сравнения морфо-анатомических признаков и кариологических данных. Но высокий уровень гомоплазии, чрезвычайное разнообразие морфо-экологических характеристик и многочисленные хромосомные вариации приводят к усложнению работы с этими признаками. В настоящее время основным подходом таксономистов становятся многочисленные методы с использованием молекулярных маркеров, а также анализ непосредственно нуклеотидных последовательностей ДНК и построение на основе полученных данных филогенетических деревьев для тех или иных таксонов, что позволяет существенно дополнить и уточнить традиционные классификационные системы.

Выбор того или иного метода и молекулярного маркера, вариабельность которого будет положена в основу работы, является одной из важных задач для исследователя. Скорость эволюционных изменений определенного сегмента ДНК определяет уровень филогенетического разрешения и может быть различной у разных организмов. Поэтому каждая новая группа организмов требует от молекулярных биологов индивидуального подхода и анализа различных участков на роль молекулярно-генетического маркера.

Объектами настоящего исследования стали сибирские виды рода Iris L. (семейство Iridaceae Juss.) и виды рода Triticum L. (семейство Poaceae Barnhart). Оба рода из класса Monocotyledons обладают уникальными качествами для практической селекции, несмотря на то, что цели, которые преследуют исследователи в программах по выведению новых сортов, различны. Для садоводов-любителей, ландшафтных дизайнеров и селекционеров ирисы интересны, прежде всего, своим неисчерпаемым потенциалом в качестве декоративных растений. Виды рода Iris занимают одно из первых мест в мире среди цветочных культур по количеству сортов. По количеству входящих видов род Iris является самым обширным в семействе и при этом не имеет согласованной классификации. Представления об эволюционной истории рода также неоднозначны (Родионенко, 1988; Mathew, 1989).

Филогения пшениц изучается очень давно (McFadden, Sears, 1946; Mandy, 1970; Tsunewaki, Ogihara, 1983; Гончаров, 2002). Известно, что эволюция пшениц шла в два этапа: а) накопление нуклеотидных замен на диплоидном уровне, б) полиплоидия, с последующей дивергенцией уже на полиплоидном уровне. Такая филогенетическая картина сильно усложняет стандартные схемы эволюционного анализа, так как требует дополнительного этапа клонирования, обусловленного наличием нескольких близкородственных геномов в одном растении. Поэтому хлоропластный геном в данном случае является очень удобным и часто используется в подобных работах (Yang et al., 2002; Kim et al., 2007). Однородность всех молекул хлоропластов (последовательности подвержены процессам ректификации), их многочисленность, материнское наследование (установлено для всех синтетических видов, включенных в работу) делает хлоропластную ДНК важным объектом молекулярных работ с полиплоидными видами. Более того, полностью установленная нуклеотидная последовательность генома и информация о скорости эволюции определенных участков позволяет выбирать наиболее подходящие молекулярные маркеры (Matsuoka et al., 2002, Наряду с развитием современных технологий и увеличением объема знаний остается еще много вопросов в филогении злаковых, где процессы эволюции происходили в тесном контакте с доместикацией. До сих пор до конца не выяснены вопросы происхождения геномов культурных и диких полиплоидов, как происходили процессы доместикации, какие механизмы ответственны за возникновение того или иного хозяйственно важного признака.

Для ответа на такие вопросы необходимо изучать именно ядерные последовательности ДНК пшениц, и использовать геном-специфичные молекулярные маркеры для амплифицирования последовательности того или иного генома. При экспоненциальном росте геномных проектов и появлении в базах данных последовательностей ДНК различных геномов это становится возможным.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - разработка и использование молекулярных маркеров для построения филогении растительных таксонов на внутриродовом уровне.

В конкретные задачи работы входило:

1. Установление филогенетических взаимоотношений сибирских видов рода Iris на основе двух различных систем молекулярных маркеров: RAPD анализ и молекулярно-филогенетический анализ хлоропластных последовательноcтей ДНК.
2. Поиск молекулярных маркеров в хлоропластном геноме для установления родственных взаимоотношений внутри рода Triticum. Построение филогении видов этого рода.
3. Разработка на основе имеющейся в базе данных информации генм-специфичных ядерных маркеров для амплификации трех геномов пшениц (А, B, G).
4. Исследование происхождения А генома пшениц на основе вариабельности хлоропластных и ядерных последовательностей.

Научная новизна работы. Впервые с использованием как пластидных, так и ядерных молекулярных маркеров были установлены филогенетические взаимоотношения сибирских видов рода Iris и всех известных к настоящему моменту видов рода Triticum. Среди включенных в работу пшениц 22 вида и подвида рода Triticum охарактеризованы на молекулярном уровне впервые, их кластеризация с остальными изученными видами пшениц соответствует их геномным формулам. Установлен хлоропластный филогенетический маркер, позволяющий различать эволюционные линии Emmer и Timopheevii. Разработаны геном-специфичные ядерные маркеры на основе последовательностей Acc-1 и Pgk-1 генов для амплификации A, B и G геномов пшениц. Использование таких маркеров позволило уточнить происхождение трех различных геномов пшениц (А,B и G) и выявить полиморфизм A генома у диплоидных видов рода Triticum.

Научно-практическое значение. Эволюционная история тех или иных растительных таксонов всегда играла немаловажную роль для селекционеров, генетиков и ботаников. Тщательно и полно разработанные на основе родственных взаимоотношений классификации видов культурных растений важны для сбора, сохранения и оценки биоразнообразия, для прогноза возможности успешной интрогрессии полезных признаков и генов из видов-сородичей, а также для сертификации сортов. Полученные в данной работе молекулярные маркеры, специфичные для определенного генома полиплоидных пшениц, могут быть использованы для установления или подтверждения геномного состава у ископаемых растений или ранее описанных видов, в том числе и синтетических.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 8-ой молодежной и I(IX) международной конференциях молодых ботаников (Санкт-Петербург, Россия, 2004, 2006), на 5-ой конференции УБиоинформатика регуляции и структуры геномаФ (BGRSТ2006, Новосибирск, Россия, 2006), на 2-ой центрально-азиатской конференции по злаковым культурам (Чалпан-Ата, Республика Кыргызстан, 2006), на 5-ой европейской конференции по растительной геномике (Венеция, Италия, 2006), на X международной генетико-селекционной школе Реализация идей Н. И. Вавилова на современном этапе развития генетики, селекции и семеноводства сельскохозяйственных культур (Новосибирск, Россия, 2007), на международной научной конференции Современные эволюционные подходы в биологии, медицине и социологии, посвященной 90-летию со дня рождения акад. Д.К. Беляева (Новосибирск, Россия, 2007), на 11-ом конгрессе европейского общества эволюционных биологов (Упсала, Швеция, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материал и методы, результаты и обсуждения), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит 315 источников, и приложений. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 24 рисунка и 2 приложения.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

Растительный материал. Образцы ирисов были предоставлены к.б.н. В.И. Доронькиным (Центральный сибирский ботанический сад, Новосибирск), листья видов I. tenuifolia Pall., I. loczyi Katitz., I. pallasii Fisch. предоставлены сотрудниками гербария Центрального сибирского ботанического сада. Образцы различных видов и подвидов пшениц, эгилопсов, растительный материал ржи Secale cereale L. и межродовых синтетических гибридов были предоставлены для работы д.б.н. Н.П. Гончаровым (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).

Выделение ДНК. Выделение тотальной ДНК проводили стандартным CTAB методом (Rogers, Bendich,1985). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса с помощью кита ТТWizardTM Minipreps DNA Purification SystemТТ (Promega).

RAPD анализ. Выбор праймеров и условий реакции ПЦР для проведения анализа осуществляли согласно протоколам Журавлева с соавторами (1998). Профили ДНК анализировали вручную, непосредственно с фотографий гелей. Коэффициенты генетического сходства для каждой пары видов вычисляли согласно методу Нея и Ли (1979) по общей формуле: SAB=2 С число общих фрагментов / (число фрагментов в наборе А + число фрагментов в наборе B). Для проведения всех расчетов использовали пакет программ RAPD (ftp://ftp.simtel.net/pub/simtelnet/msdos/biology). Достоверность набора данных оценивали с помощью стандартного PTP (Permutation Tail of Probability) теста (Faith, Cranston, 1991). Дендрограмма была построена на основе сравнения генетических дистанций, вычисленных как d=1- SAB, методом кластерного анализа (UPGMA, Sneath, Sokal, 1973).

ПЦР-амплификация, клонирование, секвенирование. ПЦР-амплификация проводилась по стандартному протоколу с выбранными праймерами (Makarevich et al., 2003; Golovnina et al., 2007; Goncharov et al. 2008). Клонирование выделенных из геля фрагментов (ТТWizardо PCR Preps DNA Purification SystemТТ, Promega) осуществляли в плазмиде pBlueScript. Определение нуклеотидных последовательностей проводили при помощи автоматического секвенирования согласно протоколу ABI PRISMTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit.

Филогенетический анализ. Множественное и попарные выравнивания последовательностей осуществлялось при помощи программ ClustalW (Thompson et al., 2004) и Vector NTI 6.0, приложение AlignX (InforMax. Inc.; Редактирование проводили с использованием программы GenDoc Version 2.7.000 (Nicholas et al., 1997). Филогенетические деревья были построены методом соединения ближайших соседей (NJ - Neighbor Joining) при помощи программы MEGA 3.0 и 3.1 (Saitou, Nei, 1987; Kumar et al., 2001, 2004); и методом максимальной парсимонии (MP - Maximum Parsimony) при помощи программ Phylip 3.5 (Felsenstein, 1993). Для оценки достоверности топологии использовался бутстрэп-тест (bootstrap test) (Felsenstein, 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

RAPD анализ сибирских видов рода Iris.

С помощью RAPD маркеров были проанализированы 13 видов рода Iris, принадлежащие к различным филогенетическим группам. Belamcanda chinensis из близкородственного рода был использован в качестве внешней группы. Выбранные пары праймеров OPD08, OPD11, OPD13, OPB12 (Журавлев и др. 1998) успешно использовались ранее для изучения таксономических взаимоотношений дальневосточных видов рода Iris. При использовании этих праймеров в настоящей работе были получены стабильные, хорошо воспроизводимые, видоспецифичные наборы фрагментов для видов рода Iris при отсутствии внутривидовой и внутрипопуляционной вариабельности.

Топология фенограммы, построенной нами на основе данных RAPD анализа, позволяет сделать некоторые выводы о таксономических взаимоотношениях сибирских видов рода Iris. Pardanthopsis dichotoma формирует отдельную от остальных видов рода Iris ветвь, что подтверждает его отделение от ирисов и помещение в отдельный род. Все остальные виды, включенные в исследование, кластеризуются в три группы, соответствующие различным подродам по классификации Родионенко (1988): A, B, C (рис. 1).

Рисунок 1. Схема филогенетических взаимоотношений сибирских ирисов, полученная в результате RAPD анализа. Показаны показатели поддержки внутренних ветвей (Bootstrap value) только более 50%.